Enzyme bromelin chiết xuất từ dứa

1
PHẦN 1. MỞ ĐẦU

1.1. Cơ sở tiến hành và ý nghĩa của nghiên cứu
Dứa là một trong những loại cây ăn quả được ưa chuộng trên thị trường thế giới
bởi hương vị đặc trưng và giàu chất dinh dưỡng (vitamin C, tiền vitamin A, acid hữu
cơ…). Enzyme bromelin chiết xuất từ dứa có nhiều ứng dụng trong công nghệ thực
phẩm, thuộc da và nhiều ngành khác. Với những đặc điểm về dinh dưỡng và mùi vị,
dứa được gọi là “Nữ hoàng” của các loại trái cây. Trên thế giới, cây dứa đứng hàng
thứ 9 về tầm quan trọng sau nho, chuối, táo [7]…
Riêng ở Việt Nam, cây dứa có ưu thế về tính chống chịu với ngoại cảnh như:
không kén đất, có thể trồng trên những vùng đất phèn hay vùng đất không thể canh tác
cây rau quả nào khác. Từ những điều kiện thuận lợi trên, trong 5 năm qua dứa
Cayenne với đặc điểm đạt tiêu chuẩn về năng suất, chất lượng cũng như các yêu cầu
cần thiết khác cho chế biến đồ hộp đã được ưu tiên phát triển. Năm 2004 được Bộ
Nông nghiệp và phát triển Nông thôn xác định là năm tập trung cho phát triển vùng
nguyên liệu dứa [25]. Từ đó, các Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn các tỉnh
thực hiện qui hoạch phát triển dứa và rà soát lại vùng nguyên liệu phục vụ các nhà
máy chế biến. Sở Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn Thành phố Hồ Chí Minh
(Tp. HCM) đã thực hiện chương trình giống cây - con chất lượng cao (gồm bò sữa,
tôm, rau an toàn và cây dứa Cayenne) từ năm 2003- 2005 [30]. Ngoài Tp. HCM, các
tỉnh thuộc vùng Đông Nam bộ (Đồng Nai, Bình Dương), Tây Nguyên (Gia Lai) và
miền Trung cũng dự kiến qui hoạch vùng nguyên liệu quả các loại gắn với xây dựng
nhà máy chế biến các sản phẩm quả đạt tiêu chuẩn xuất khẩu, sản phẩm chủ lực là các
sản phẩm từ cây dứa [29,31,32].
Tuy nhiên, một khi tăng diện tích gieo trồng và sản lượng thì bệnh hại trên dứa
cũng bắt đầu phát triển. Theo kết quả điều tra của nhóm nghiên cứu bệnh hại trên dứa
thuộc trường Đại học Nông Lâm Tp. HCM năm 2003 [3,6,8,9], trên hầu hết các ruộng
dứa tại Tp. HCM, Long An, Tiền Giang, Lâm Đồng xuất hiện những bệnh như: bệnh

héo đỏ đầu lá (bệnh wilt), thối trái, thối nõn làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng
suất và chất lượng dứa, gây thiệt hại về mặt kinh tế. Một trong những nguyên nhân lây
lan bệnh hại là nguồn chồi giống ban đầu không sạch các mầm bệnh, đặc biệt là virus
gây bệnh đỏ đầu lá PMWaV (Pineapple mealybug wilt – associated virus). Giống dứa


2
Cayenne nhập nội mẫn cảm với bệnh đỏ đầu lá hơn dứa Queen; giống nhập từ Thái
Lan, Trung Quốc có mức độ nhiễm cao và lây lan nhanh hơn giống của Lâm Đồng
[1]. Chồi dứa nhiễm PMWaV không thể nhận biết bằng mắt thường ở giai đoạn đầu và
hiện nay không có loại hóa chất nào để diệt trừ virus hiệu quả.
Để cây dứa Cayenne ngày càng mở rộng và chuyên canh hơn nhằm đáp ứng
nhu cầu quả tươi và nguyên liệu phục vụ cho việc chế biến đồ hộp xuất khẩu, cần phải
có cây giống sạch bệnh đảm bảo chất lượng để cung cấp cho các khu vực trồng dứa.
Với đề tài “Nghiên cứu tạo cây dứa Cayenne in vitro sạch virus gây bệnh héo đỏ đầu
lá” chúng tôi hi vọng sẽ góp phần tạo được nguồn dứa Cayenne sạch bệnh.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu của đề tài nhằm tạo ra các chồi dứa Cayenne sạch virus thông qua xử
lí nhiệt kết hợp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (ĐST) và kiểm tra virus PMWaV – 1 và
PMWaV – 2 ở chồi dứa in vitro bằng kĩ thuật RT-PCR.
1.3. Giới hạn của đề tài
Do giới hạn về thời gian và điều kiện trang thiết bị phục vụ thí nghiệm, đề tài
chỉ giải quyết được các vấn đề cơ bản về mặt kĩ thuật nuôi cấy ĐST chồi dứa in vitro
mà chưa thực hiện nuôi cấy ĐST của chồi dứa ngoài đồng đã qua xử lí nhiệt; chưa
thực hiện được thí nghiệm xử lí nhiệt chồi dứa nhiễm virus ở các mức nhiệt độ và thời
gian khác nhau.
Do giới hạn về kinh phí nên thí nghiệm chỉ thực hiện với qui mô nhỏ; không
kiểm tra PMWaV cho toàn bộ số chồi tái sinh từ ĐST.
Mặt khác do hạn chế về kinh nghiệm nên đề tài chưa khai thác hết các mối
tương quan giữa các yếu tố thí nghiệm. Đề tài chỉ khái quát một trong những qui trình

tạo chồi dứa sạch virus từ mẫu chồi ngoài đồng bị nhiễm virus PMWaV và bước đầu
chứng minh hiệu quả loại trừ virus của phương pháp xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy ĐST.


3
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Nguồn gốc của cây dứa[4]
Cây dứa có nguồn gốc từ Nam Mỹ, được người Châu Âu phát hiện vào năm
1493. Cây dứa thuộc loài A. comosus var ananassoides được thuần hóa bởi những
người thổ dân Tupi-Guarani và được phát tán đến Antilles, bắc Andes và trung Mỹ
(Bertoni, 1919; trích dẫn bởi [4]).
Theo khảo sát của Baker và Colin (1939; trích dẫn bởi [4]) nguồn gốc cây dứa
có thể là vùng tứ giác nằm giữa vĩ tuyến nam 15
0
- 30
0
và kinh tuyến tây 40
0
- 60
0
bao
gồm miền trung và nam Brazil, miền bắc Argentina và Paraguay. Trong khu vực này
dạng hoang dại các loài dứa được tìm thấy theo những hoàn cảnh thích hợp riêng cho
từng loài:
o A. ananasoides trong rừng khô của Brazil, cây mọc rải rác và thấp lùn.
o A. bracteatus dưới bóng cây thưa thớt thường ưa mọc ven rừng.
o Pseudananas sagenarius trong những vùng ẩm ướt hơn, dọc theo bờ
sông hay trong những khu rừng ẩm ướt.
o A. erectifolius ở lưu vực sông Amazon trong những vùng nóng ẩm.

2.2. Đặc điểm thực vật học và sinh thái cây dứa
2.2.1. Đặc điểm thực vật học[4,22]
Dứa là cây thân thảo lâu năm, thuộc lớp đơn tử diệp. Sau khi thu hoạch quả các
mầm nách ở thân tiếp tục phát triển và hình thành một cây mới giống như cây trước;
quả thứ hai thường bé hơn quả trước. Cây dứa trưởng thành cao đến 1 m và rộng 0,5 m
trong khi cây dứa Smooth Cayenne trưởng thành cao 1,5 m và có đường kính từ 1,3 –
1,5 m. Đây là giống dứa được trồng nhiều nhất trên thế giới.
Hoa
Hoa gồm có 3 lá đài, 3 cánh hoa, 6 nhị đực xếp thành 2 vòng tròn, 1 nhị cái có 3
tâm bì và bầu hạ. Cánh hoa màu xanh, đỏ tía, gốc có màu trắng nhạt và trên mặt cánh
hoa có những vảy. Tràng hoa dạng ống dài hơi loe ở phía đầu, ở giữa lồi lên 3 núm
nhụy tím mờ của vòi nhụy. Hoa tự bất thụ (self-sterile) và phát triển quả không hạt;
thụ phấn nhờ gió không xảy ra và sinh sản hữu tính hiếm thấy trong tự nhiên. Nhân


4
giống vô tính là hình thức sinh sản tiêu biểu sử dụng chồi bao gồm chồi đỉnh, chồi bên
và chồi rễ.
Quả
Quả dứa thuộc loại quả tụ do 100 – 200 quả nhỏ hợp lại. Các giống khác nhau
thì hình dạng quả và mắt quả cũng khác nhau. Bộ phận ăn được của dứa là do trục của
chùm hoa và lá bắc phát triển nên. Sau khi hoa tàn thì quả bắt đầu phát triển.
Hạt
Hạt dứa nhỏ, màu tím đen, có vỏ và nội nhủ rất cứng, tỉ lệ nảy mầm thấp và bất
thường nếu không qua tiền xử lí. Mỗi quả con chỉ có vài hạt. Dứa thường không hạt
nếu để thụ phấn tự do. Hạt dứa thường do thụ phấn nhân tạo và được sử dụng trong
các chương trình lai tạo giống mới.
Thân
Thân cây dứa chia làm 2 phần: một phần trên mặt đất và một phần dưới mặt đất.
Phần ở trên thường bị các lá che kín nên khó nhìn thấy. Khi cây đã phát triển đến mức

độ nhất định, có thể dùng các mầm ngủ trên các đốt để nhân giống.
Lá
Lá dứa mọc trên thân cây theo hình xoắn ốc. Lá thường dày, không có cuống,
hẹp ngang và dài. Bề mặt và lưng lá thường có một lớp phấn trắng hoặc một lớp sáp có
tác dụng làm giảm độ bốc hơi nước ở lá. Các giống dứa thường có gai nhọn và cứng ở
mép lá, nhưng cũng có giống lá không gai như Cayenne. Tùy theo giống, một cây dứa
trưởng thành có khoảng 60 – 70 lá.
Rễ
Rễ dứa gồm rễ cái và rễ nhánh (mọc ra từ phôi hạt); rễ bất định (mọc ra từ mầm
rễ trên các đốt của các loại chồi dứa trước khi đem trồng). Rễ dứa thuộc loại ăn nông,
phần lớn do nhân giống bằng chồi nên mọc từ thân ra, rễ nhỏ và phân nhiều nhánh. Bộ
rễ dứa thường tập trung ở tầng đất 10 – 26 cm và phát triển rộng đến 1 m.
2.2.2. Sinh thái cây dứa [4,7]
Dứa là cây ăn quả nhiệt đới thích nhiệt độ cao, nhiệt độ thích hợp cho sinh
trưởng 28 – 32
0
C, nhiệt độ giới hạn 15 – 40
0
C. Nhiệt độ có ảnh hưởng đặc biệt quan
trọng đến quá trình hình thành quả chín của quả do đó là yếu tố đầu tiên ảnh hưởng
đến phẩm chất của quả.



5
Yếu tố quan trọng không kém là chế độ nước bao gồm lượng mưa hàng năm và
phân bố mưa. Dựa vào 2 chỉ tiêu trên, các vùng sinh thái thích hợp được thiết lập đảm
bảo việc trồng dứa trên diện rộng đạt năng suất cao. Theo kinh nghiệm, lượng mưa
thích hợp nhất cho dứa là 1000 – 1.500 mm. Tuy nhiên dứa vẫn phát triển tốt ở những
vùng có lượng mưa thấp nhưng thuộc khí hậu đại dương, quanh năm ấm mát.

Cây dứa ưa ánh sáng tán xạ hơn ánh sáng trực xạ. Lượng chiếu sáng thích hợp
làm tăng năng suất và cải thiện phẩm chất hương vị quả. Độ chiếu sáng còn ảnh hưởng
đến màu sắc quả.
Dứa có bộ rễ tập trung ở lớp đất mặt do đó yêu cầu đất phải tơi xốp, thoáng, có
kết cấu hạt, không có nước đọng vào mùa mưa. Về pH, các giống khác nhau có yêu
cầu khác nhau. pH 5,6 – 6,0 có thể lên đến 7,5 đối với giống Cayenne; nhóm dứa
Queen có thể sinh trưởng tốt trên đất phèn pH 4,0 trong khi giống Spanish (các
giống dứa ta) thích nghi với pH từ 4,5 – 5,0.
2.3. Phân loại [7,35]
Dứa có tên khoa học là Ananas comosus (L.) Merr thuộc:
o Phân lớp: Magnoliophyta
o Lớp: Liliopsida
o Bộ: Poales
o Họ: Bromeliaceae
o Giống: Ananas
o Loài: A. comosus
Giống này cùng với giống lân cận Pseudananas khác biệt với các giống khác
trong họ ở chỗ quả dứa là một quả kép trong khi đó các giống khác có quả nhỏ đứng
rời nhau.
Smith (1939; trích dẫn bởi [7]) đề nghị cách phân loại rõ hơn giữa các chi
Ananas và Pseudananas:
i. Quả kép khi chín mang một chùm nhỏ lá bắc giống như vảy ở cuống quả
không có chồi cuống, trên thân có các chồi ngầm, cánh hoa có nhiều u nổi
như những nếp thịt là chi Pseudananas (P. sagenarius).
i. Quả kép khi chín mang một chùm lá bắc rất dễ nhận, ở gốc cuống quả có
các chồi, trên thân không có chồi ngầm, hoa có 2 vảy hình phễu là chi
Ananas.


6

ii. Quả kép khi chín dài hơn 15 cm, thịt quả thơm ngon, cuống quả chắc chắn
và ngắn.
ii. Quả kép ngắn, dài tối đa 15 cm, quả ít thịt, hương vị kém, cuống quả nhỏ
và dài.
iii. Gai lá mọc chĩa lên, lá bắc có màu sắc khi quả chín, cánh hoa hình vảy
(A. bracteatus).
iii. Gai lá cong xuống, lúc quả chín lá bắc có màu xanh nhạt. Cánh hoa có nếp
nhăn dọc (A. fritzmuelleri).
iii. Lá bắc không biểu hiện rõ, để lộ sớm đầu nhị cái, ít hoặc không có răng
cưa, không có hoặc rất ít hạt; quả dùng để ăn (A. comosus).
iv. Lá mọc đứng, cứng, không gai trừ 1 gai ở đầu lá, lá rộng 35 cm (A.
erectiflius).
iv. Lá cong, nhiều răng cưa nhỏ ở biên lá, lá rộng không quá 25 cm
(A. ananassoides).
2.4. Các nhóm dứa chính và các giống dứa phổ biến ở Việt Nam [1,4,7]
2.4.1. Các nhóm dứa chính
Dứa gồm khoảng 50 giống và 2000 loài phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt
đới châu Mỹ [38]. Các giống dứa đang được trồng trọt hiện nay được chia thành 3
nhóm: nhóm dứa Cayenne, nhóm dứa Queen (còn gọi là hoàng hậu) và nhóm Spanish
(nhóm Tây Ban Nha).
2.4.1.1. Nhóm Cayenne
Lá dài, không có gai hoặc có một ít ở đầu chóp lá, dày, lòng máng lá sâu, có thể
dài hơn 100 cm, hoa có màu xanh nhạt, hơi đỏ, quả có dạng hình trụ, mắt rất nông, quả
nặng bình quân 1,5 – 2,0 kg rất phù hợp cho việc chế biến làm đồ hộp. Khi chưa chín
quả màu xanh đen, sau đó chuyển dần và đến lúc chín quả có màu đỏ hơi pha da đồng.
Cây đẻ yếu, trung bình chỉ cho 1 – 2 chồi một gốc trong một năm. Trong điều kiện
chăm sóc kém có thể không có chồi cuống.
Quả dứa Cayenne chứa nhiều nước và vỏ mỏng nên rất dễ thối khi vận chuyển.
Vì thế việc chọn vùng, địa điểm trồng và qui hoạch đồng ruộng phải quan tâm đến đặc
điểm này.

7
2.4.1.2. Nhóm Queen
Lá hẹp, cứng, có nhiều gai ở mép. Mặt trong của lá có 3 đường vân trắng hình
răng cưa chạy song song theo chiều dài, hoa có màu xanh hồng. Quả có nhiều mắt,
mắt nhỏ và lồi, cứng do đó tương đối dễ vận chuyển. Thịt quả vàng, ít nước và có vị
thơm hấp dẫn.
Ưu điểm của nhóm dứa này là không kén đất, có thể trồng trên các loại đất
nghèo dinh dưỡng, cây có hệ số nhân giống cao, trung bình 4 – 6 chồi/gốc, có thể chịu
được bóng râm. Thịt quả dòn, có màu sắc và hương vị phù hợp để ăn tươi.
Nhược điểm: quả bé, trọng lượng bình quân chỉ đạt từ 500 – 700 g. Dạng quả
hơi bầu dục khó thao tác trong khi chế biến. Thịt quả có nhiều khe hở, không chặt nên
khó đạt tiêu chuẩn để làm đồ hộp xuất khẩu.
2.4.1.3. Nhóm Spanish
Lá mềm, mép lá cong, hơi ngả về phía lưng, hoa tự có màu đỏ nhạt. Quả ngắn,
kích thước to hơn so với nhóm Queen nhưng bé hơn so với nhóm Cayenne. Trọng
lượng quả trung bình xấp xỉ 1kg. Khi chín vỏ quả có màu nâu đỏ, sẫm hơn nhiều so
với quả Cayenne và cũng có dạng hình trụ cân đối. Thịt quả màu vàng trắng không
đều, mắt quả sâu, vị hơi chua. Chồi ngọn và đặc biệt là chồi cuống nhiều, ảnh hưởng
đến phẩm chất quả.
Nhìn chung, các giống dứa trong nhóm Spanish tuy dễ trồng, chịu được bóng
nhưng phẩm chất kém nên được trồng chủ yếu ở qui mô hộ gia đình, không nên tập
trung thành vùng lớn.
Ngoài ba nhóm dứa trên, còn có nhóm Abacaxi tách ra từ nhóm Spanish nhưng
mức độ phổ biến còn thấp.
2.4.2. Các giống dứa phổ biến ở Việt Nam
2.4.2.1. Dứa hoa Phú Thọ
Còn được gọi là Queen cổ điển. Nó có những đặc tính điển hình nhất của giống
Queen như quả nhỏ; mắt nhỏ, lồi; gai ở rìa lá nhiều và cứng…Đây là giống nhập nội

vào Việt Nam khoảng đầu thế kỉ XX, được trồng rải rác ở các tỉnh phía Bắc và miền
Trung.
Ưu điểm nổi bật của dứa hoa Phú Thọ là thịt vàng giòn, rất thơm và hấp dẫn
nên nó được dùng để pha trộn vào nước dứa ép từ các giống khác hay các loại quả


8
khác để tạo ra mùi thơm đặc trưng. Giống này dễ trồng, chịu được đất xấu, đất chua,
dễ ra hoa trái vụ.
Nhược điểm là quả nhỏ, năng suất nhìn chung thấp, khó chế biến đồ hộp nên
hiệu quả kinh tế không cao.
2.4.2.2. Dứa hoa Na Hoa (Hoa Bali)
Giống dứa này có đặc tính của nhóm mắt nhỏ, lồi, khi chín vỏ và thịt quả đều
có màu vàng. So với dứa hoa Phú Thọ, giống này có lá ngắn và to, quả cũng to hơn.
Bình quân trọng lượng từ 0,9 – 1,2 kg/quả. Khi chín kĩ, nước trong thịt quả cũng nhiều
hơn.
Đây là giống dứa khá phổ biến ở các vùng trồng tập trung với ưu điểm dễ canh
tác, có thể duy trì năng suất đến vụ thứ 2, thứ 3 nếu áp dụng kĩ thuật chăm sóc thích
hợp; hệ số nhân giống tương đối cao. Tuy nhiên, do có mắt sâu, quả hơi bầu dục nên
khó đạt tỉ lệ cái cao khi chế biến đồ hộp, hiệu quả kinh tế thấp.
2.4.2.3. Dứa Kiên Giang và dứa Bến Lức (từ địa phƣơng là “khóm”)
Một số tác giả liệt kê các giống này vào cùng với giống dứa Na Hoa. Trong
điều kiện khí hậu miền Nam, cây sinh trưởng mạnh, quả có kích thước lớn hơn so với
trồng ở miền Bắc, đồng thời một số đặc điểm cũng khác đi.
So với dứa Bến Lức, dứa Kiên Giang có dạng hình trụ hơn, mắt quả to hơn và
thịt quả có nhiều nước hơn. Đây là những giống trồng khá phổ biến ở vùng đồng bằng
sông Cửu Long.
2.4.2.4. Nhóm dứa Cayenne
Đặc điểm của nhóm dứa này là lá không gai ngoài một vài gai ở đầu mút lá, lá
dày, lòng máng sâu, có nhiều phấn ở mặt dưới nhất là ở phía gốc.

Giống này du nhập vào nước ta cuối những năm ba mươi, đầu những năm bốn
mươi ở một số địa phương miền Bắc chủ yếu trong những đồn điền do người Pháp
quản lí. Chân Mộng (thuộc Vĩnh Phú) là một trong những nơi tiếp nhận giống đầu tiên,
về sau người ta quen gọi là Cayenne Chân Mộng.
Các giống Cayenne được trồng phổ biến hiện nay là giống Cayenne Thái Lan,
Cayenne Trung Quốc và Cayenne Lâm Đồng. Theo tài liệu của Viện cây ăn quả miền
Nam [1], giống Cayenne Thái Lan và Trung Quốc đều cho trái to và phát triển tốt; tuy
nhiên là giống mới nhập nội nên cần có thời gian để kết luận. Giống Cayenne Lâm


9
Đồng đã phát triển lâu đời ở Việt Nam, chống chịu bệnh wilt và phẩm chất tốt nên
phát triển trong giai đoạn hiện nay.
Với ưu điểm năng suất cao, quả to và dễ thao tác trong chế biến làm đồ hộp, có
chất lượng cao cả về hóa sinh lẫn tỉ lệ cái nên giống Cayenne đang được chú ý phổ
biến ra diện rộng. Các vùng trồng dứa nguyên liệu được hình thành nhằm cung cấp
nguyên liệu cho các nhà máy chế biến dứa.
2.5. Tình hình sản xuất và sản lƣợng dứa
2.5.1. Tình hình sản xuất và sản lƣợng dứa trên thế giới
Theo thống kê năm 2001 [26] sản lượng dứa của thế giới đạt 13.739.000 tấn,
phân bố theo các châu lục và khu vực như sau: Châu Phi 2.229.000 tấn, Bắc Mỹ
1.512.000 tấn, Nam Mỹ 2.556.000 tấn, Châu Á 7.275.000 tấn, Châu Phi 2.000 tấn và
Châu Đại Dương 164.000 tấn. Các nước có sản lượng dứa cao như Thái Lan 2.300 tấn,
Philipin 1.572 tấn, Brazil 1.442 tấn, Trung Quốc 1.284 tấn, Nigeria 881 tấn…
2.5.2. Tình hình sản xuất và sản lƣợng dứa ở Việt Nam
2.5.2.1. Tình hình sản xuất
Theo tài liệu thống kê [27], diện tích trồng dứa cả nước năm 1995 là 25.734 ha
đến năm 2000 lên đến 36.541 ha. Tính đến năm 2000 diện tích trồng dứa của miền Bắc
là 9.675 ha chiếm 26,48% diện tích trồng dứa cả nước, chủ yếu ở vùng Đông Bắc và
đồng bằng sông Hồng; trong khi diện tích gieo trồng của miền Nam là 26.866 ha

chiếm 73,52% diện tích trồng dứa cả nước, chủ yếu tập trung ở vùng đồng bằng sông
Cửu Long.
Các tỉnh có diện tích gieo trồng dứa khá lớn là Kiên Giang (9.200 ha), Tiền
Giang (7.803 ha), Bạc Liêu (3.625ha), Cần Thơ (1.338 ha), Long An (661 ha), Quảng
Nam (2.320 ha), Bình Định (500 ha), Thanh Hóa (2.900 ha), Ninh Bình (1.572 ha),
Nghệ An (600 ha), Bắc Giang (657 ha)…
Bên cạnh đó, các tỉnh miền Đông Nam Bộ có diện tích dứa tăng đáng kể trong
khoảng thời gian từ năm 1998 đến năm 2000: Tp. HCM tăng từ 76 ha lên đến 150 ha,
Đồng Nai tăng từ 61 ha lên 123 ha, Bình Thuận tăng từ 12 ha lên 40 ha. Hiện nay cây
dứa Cayenne được các nhà nông học đánh giá cao do phù hợp với đất đai thổ nhưỡng
của các tỉnh miền Trung, Tây Nguyên và các vùng đất nhiễm phèn khác. Nhiều dự án
mở rộng vùng trồng dứa Cayenne được thực hiện ở khu vực Đông Nam Bộ như
Chương trình phát triển cây dứa Cayenne ở Tp. HCM thời kì 2003 – 2005 [30], ở khu


10
vực Tây Nguyên (Gia Lai, Đaklak) [32]. Một số tỉnh miền Trung như Bình Định, Phú
Yên …cũng đề nghị Tp. HCM cung cấp giống dứa Cayenne để nhân rộng [29].
2.5.2.2. Sản lƣợng dứa
Theo tài liệu thống kê [27] sản lượng dứa của cả nước năm 2000 là 291.428 tấn
phân bố trên các khu vực trồng dứa cả nước như sau: miền Bắc đạt 57.246 tấn, khu
vực Bắc trung bộ 25.218 tấn, miền Nam 234.164 tấn trong đó các tỉnh thuộc khu vực
Duyên Hải Nam Trung Bộ đạt 20.832 tấn, Tây Nguyên 2.357 tấn, khu vực Đông Nam
Bộ 1.417 tấn và khu vực có sản lượng dứa lớn nhất trong nước – Đồng Bằng Sông
Cửu Long 209.558 tấn. Các tỉnh có sản lượng dứa cao là Kiên Giang (89.094 tấn),
Tiền Giang (79.880 tấn), Bạc Liêu (24.860 tấn), Ninh Bình (20.315 tấn), Quảng Nam
(15.724 tấn), Thanh Hóa (11.107 tấn), Hà Tây (1.725 tấn), Bắc Giang (1.495 tấn), Phú
Thọ (1.159 tấn)…
2.6. Tình hình sâu bệnh trên cây dứa
2.6.1. Các loại sâu hại dứa

Theo Trần Thế Tục và Vũ Mạnh Hải (2000), dứa ít bị côn trùng gây hại so với
nhiều loại cây trồng khác.
Đối tượng sâu hại quan trọng và phổ biến hầu hết khắp các vùng trồng dứa trên
thế giới là rệp sáp (Dysmicoccus hoặc Pseudococcus brevipes). Rệp sáp và bệnh wilt
thường xuất hiện cùng lúc và có quan hệ mật thiết với nhau. Rệp sáp thường tiết ra
một chất hơi dính như mật ong nên thường có nhiều loài kiến sống kết hợp chặt chẽ
với rệp. Kiến sống bằng chất mật do do rệp tiết ra và làm tổ cho rệp ở, mang rệp phân
tán đi khắp nơi. Nhờ có các tổ này mà rệp được bảo vệ chắc chắn, ít bị ảnh hưởng của
biến đổi thời tiết bên ngoài, tạo nên một tiểu khí hậu rất thích hợp cho việc sinh sản.
Vì vậy, muốn tiêu diệt rệp sáp một cách triệt để và có hiệu quả, phải tiến hành phòng
trừ rệp đồng thời với các loại kiến và phải tiến hành ngay từ đầu.
Ngoài rệp sáp, một số vùng trồng dứa ở Việt Nam còn có một loại côn trùng
gây hại rễ là một loại sâu non có tên Adoretus chinensis Thanber thuộc họ
Scarebicideae, bộ cánh cứng (Coleopera). Loại côn trùng này trực tiếp phá hoại rễ, tạo
vết thương cơ giới giúp tuyến trùng và nấm bệnh (chủ yếu là Thiellaviopsis paradoxa)
xâm nhập và làm vườn dứa tàn lụi nhanh chóng. Có thể phòng trừ loại sâu hại rễ này
bằng hóa chất trên thị trường. Tuy nhiên, đối với những vườn dứa bị hại nặng phải
luân canh cây trồng khác từ 1 – 2 năm.


11
Biện pháp phòng trừ
Khi làm đất, tất cả tàn dư thực vật (cả cây trồng cữ và cỏ dại) phải được
gom lại, phơi khô rồi đốt đi, làm mất chỗ ẩn náu của các loại sâu hại .
Chồi giống phải được lấy từ các vườn sạch bệnh và không có rệp, xử lí
chồi bằng dung dịch chống rệp và sâu hại.
Trong thời kì cây chưa ra hoa, nên phun định kì 5 – 6 tuần một lần các
loại thuốc diệt rệp và nên phun tập trung vào mùa mưa ẩm để diệt rệp triệt
để.
2.6.2. Bệnh hại dứa và phòng trừ

2.6.2.1. Bệnh thối lõi và thối rễ
Nguyên nhân
Bệnh do Phytopthora parasitica và P. cinnamonii gây ra [7]. Một số tác giả
khác ở Costa Rica và Hawaii cho rằng tác nhân gây thối nõn là vi khuẩn Erwinia
chrysanthemi. Theo Viện nghiên cứu cây công nghiệp – cây ăn quả phối hợp với cục
bảo vệ thực vật (Đinh Văn Đức và Vũ Khắc Nhượng; trích dẫn bởi [7]) vi khuẩn gây
bệnh thối nõn là Pseudomonas ananas. Tuy nhiên, sự thiếu cân bằng về dinh dưỡng
cũng góp phần tạo điều kiện cho sự xâm nhập của nấm bệnh và vi khuẩn.
Triệu chứng
Bệnh gây hại nghiêm trọng trên các chân đất úng, thường kết hợp với Pythium
sp. Bắt đầu thối từ tâm hoa thị của cây do đất bùn có mang mầm bệnh bắn vào. Cây bị
bệnh lá từ màu xanh ngả vàng rồi qua đỏ và sau đó đầu lá trở nên nâu xám, gốc lá thối
tỏa mùi hôi, dễ bứt lá ra khỏi thân.
Biện pháp phòng trị
Xử lí cây con, thoát nước tránh để líp thơm ẩm thấp, bón vôi nâng pH, vệ sinh
đồng ruộng nhổ bỏ cây bệnh, phun thuốc quanh các cây bị bệnh.
2.6.2.2. Bệnh thối mềm
Nguyên nhân
Bệnh do Thielaviopsis paradoxa gây ra.


12
Triệu chứng
Đây là bệnh cần kiểm dịch khi xuất quả tươi. Nấm gây thối trên chồi, trên thân,
lá và đặc biệt trên quả. Nấm theo vết xây xát xâm nhập vào bên trong. Trên quả có thể
nhận biết nấm này do màu xám đen và mùi thối của vị trí bị bệnh.
Biện pháp phòng trừ
Tránh làm xây xát quả, giảm tối đa thời gian từ thu hoạch tới lúc trữ lạnh xuất
khẩu, nhiệt độ bảo quản khoảng 8
0

C.
Trừ ruồi, phun thuốc trừ nấm; phun, nhúng quả, cuống quả vào thuốc trừ nấm
để sát trùng các vết thương.
2.6.2.3. Bệnh “luộc lá”
Khi nhiệt độ không khí dưới 15
0
C và kéo dài, cây dứa có hiện tượng lá bị mất
dần diệp lục, từ màu xanh chuyển dần sang trắng nhạt rồi bạc hẳn như bị luộc trong
nước sôi. Nguyên nhân bệnh là do sự thiếu hụt magie và sự mất cân bằng về các yếu tố
đa lượng và vi lượng nên chỉ cần bón đạm, lân, kali cân đối kết hợp với magie và canxi
( N:P:K:Mg:Ca = 8:4:12:4:3 g/cây) là có thể làm giảm bệnh rất đáng kể.
2.6.2.4. Tuyến trùng hại dứa
Các loại tuyến trùng phổ biến
Tuyến trùng là nguyên nhân thường xuyên gây thiệt hại lớn thông qua phá hoại
bộ rễ của cây. Theo Trần Thế Tục và Vũ Mạnh Hải (2000) trên các vùng trồng dứa lớn
có các loại tuyến trùng chủ yếu sau đây:
- Pratylenchulus brachyurus: đây là loài phá hoại mạnh nhất. Kết quả điều tra
của Guerout cho thấy ở vụ dứa thứ 2, riêng loài này đã chiếm 75% động vật kí sinh ở
rễ dứa.
- Meloidogyne incognita acaita: tương đối phổ biến đối với tất cả các loại đất
trồng dứa nhưng chỉ gây tổn thất trên những vườn trước đó trồng cây lương thực, thực
phẩm.
Ngoài ra còn có Helicotylenclus dihptera Cabb và Criconemoides onoeusis
nhưng tác hại không đáng kể.
Phòng trừ tuyến trùng
Xử lí đất trước khi trồng một cách hiệu quả như cày bừa đất trước khi
trồng một tháng, tiêu diệt tất cả mọi tàn dư thực vật có trên đồng ruộng.


13

Vùng trồng dứa phải được luân canh với các cây trồng khác mà tuyến
trùng hại dứa không có hoặc ít xuất hiện.
2.7. Bệnh héo do virus
Theo Sether và cộng sự (1998) [16], bệnh héo do virus (Mealybug wilt of
pineapple- MWP) là bệnh gây thiệt hại ở nhiều khu vực trồng dứa trên thế giới. Bệnh
biểu hiện đầu tiên trên các lá già nhất, sau đó đến các lá già và lá bên trên; các lá đỏ
dần lên, vỏ lụa bung ra, lá kém trương nước, mép lá và đầu lá bị héo, hóa nâu và khô
dần [13]. Tùy theo giống từ khi cây bị nhiễm bệnh tới khi biểu hiện triệu chứng mất từ
2 tuần đến 6 tháng. Nhiều cây con bị nhiễm trong vườn ươm không có dấu hiệu bệnh,
sau một thời gian trồng mới biểu hiện. Bệnh trở nên nặng hơn khi cây ra hoa, nuôi quả
và ở các mùa gốc.
Nguyên nhân gây bệnh
Các nghiên cứu đã chứng minh rằng một yếu tố tiềm tàng liên quan đến bệnh là
virus. Một dạng closterovirus hình que gấp khúc được phân lập từ những cây có triệu
chứng MWP ở Hawaii. Tuy nhiên sau đó những tiểu phần closterovirus cũng được tìm
thấy ở cả cây dứa có và không có thể hiện triệu chứng trên phạm vi thế giới. Virus liên
quan đến bệnh héo ở dứa (PMWaV) thực chất là phức hợp của 2 loại virus PMWaV-1
và PMWaV-2. Dựa vào các đặc điểm về di truyền, hai loại virus này được xếp vào họ
Closterovirus, loài Ampelovirus, giống Vinivirus [14]. Các phân tích về phát sinh loài
ở trình tự gen cho thấy PMWaV-1 và PMWaV-2 có độ tương đồng trung bình 50%.
PMWaV-2 liên quan rất mật thiết với virus gây bệnh cuốn lá ở nho (GLRaV-3) có độ
tương đồng từ 64% - 72% thông qua 4 khung đọc (open reading frame-ORF) [14].
Tác nhân lây truyền bệnh
PMWaV-1 và PMWaV-2 được truyền bởi 2 loài rệp sáp: Dysmicoccus brevipes
(rệp màu hồng) và D. neobrevipes (rệp màu xám) [18]. Rệp sáp có kích thước khoảng
2 – 3 mm, mình phủ một lớp sáp để tự vệ. Rệp sáp bám vào các lá non, vào gốc là già,
vào mắt quả, vào rễ cây để hút dịch cây. Rệp thực chất không chứa virus; chúng sống
trên cây dứa nhiễm PMWaV và thu được virus. Rệp tiếp thu và truyền virus trong suốt
quá trình dinh dưỡng. Không có kí chủ khác của virus được tìm thấy ngoài cây dứa
mặc dù nhiều loài cỏ cũng là kí chủ của hai loài rệp này. Điều đó cho thấy cây dứa

nhiễm PMWaV là nguồn chứa virus duy nhất cho rệp truyền sang các cây khác.


14
Kiến thường xuất hiện đồng thời với rệp tạo điều kiện thuận lợi cho rệp phát
triển. Với sự che chở của kiến cùng chu kì sinh sản ngắn từ 35 – 45 ngày, rệp mắn đẻ
và phát triển rất nhanh.
Cách phòng trị
Chọn giống kháng bệnh
Lấy giống từ vùng ít bệnh
Chú trọng sản xuất cây con sạch bệnh.
Phòng chống kiến và rệp sáp qua việc bóc các lá vảy rồi khử con giống
bằng thuốc trừ rệp sáp; phun định kì và phun kĩ các lô mới trồng vì thời
gian đầu lá còn ít và nhỏ nên chỗ ẩn núp của kiến và rệp ít hơn.
Làm cỏ sạch, phủ bạt, khử đất trước khi trồng
2.8. Phƣơng pháp tạo cây sạch virus
2.8.1. Sơ lƣợc về hình thái, cấu tạo và sự di chuyển của virus thực vật [2]
Hình thái
Virus thực vật có hình thái và kích thước rất đa dạng. Virus có thể có dạng hình
gậy (virus khảm thuốc lá - TMV, virus khảm sọc lá lúa mạch…), hình cầu (virus
khảm dưa chuột, virus khảm súp lơ), hình khối đa diện, hình sợi (virus X khoai tây,
Closterovirus…)…
Cấu tạo
Thông thường mỗi virus đều được cấu tạo từ protein và acid nucleic. Trường
hợp đặc biệt một số virus có chứa polyamin, lipid hay enzyme đặc hiệu (ở
Bacteriophage). Các phân tử protein cấu tạo nên vỏ (capside) của virus. Lớp vỏ bao
lấy phần lõi là các chuỗi acid nucleic. Phần lớn virus thực vật có cấu tạo lõi là RNA
(ribonucleic acid). Một số ít (khoảng 25 virus) virus thực vật có lõi DNA
(deoxyribonucleic acid).
Sự di chuyển của virus

Ở góc độ tế bào, virus di chuyển theo dòng tế bào chất hay di chuyển theo dòng
nhựa nguyên và nhựa luyện của cây. Theo các mạch dẫn, virus được truyền trong cây
từ vùng này sang vùng khác. Nhờ cầu nối nguyên sinh virus có thể di chuyển từ tế bào
này sang tế bào khác.


15
Trong phạm vi quần thể bao gồm những cây nhiễm virus và những cây không bị
nhiễm virus, virus chỉ có thể truyền sang cây khỏe nhờ vào môi giới truyền bệnh
(vector). Ngoài ra, virus có thể lan truyền trên diện rộng (không nhờ môi giới) do
nguồn giống, nguyên liệu nhân giống ban đầu không sạch virus. Trên thực tế, diện tích
cây trồng bị nhiễm virus ngày càng lan rộng vì nguồn giống ban đầu chưa đảm bảo
sạch virus nói riêng và các mầm bệnh khác nói chung; từ đó, các loại môi giới tiếp tục
truyền virus sang cây khỏe giúp virus thực hiện quá trình xâm nhiễm, gây bệnh.
2.8.2. Cơ sở của các phƣơng pháp tạo cây sạch virus
“Sạch virus” có nghĩa là không có sự hiện diện của loài virus đã được xác định
thông qua các thí nghiệm kiểm tra (Quak, 1966; trích dẫn bởi [15]). Mô phân sinh là
mô sạch virus nhất. Mô phân sinh gồm các tế bào chưa phân hóa, có hoạt động phân
chia tế bào mạnh. DNA polymerase có trong quá trình phân chia tế bào này sẽ ức chế
sự nhân lên của virus. Virus sẽ không theo kịp sự tăng trưởng của ĐST và không thể di
chuyển đến các tế bào ở ĐST [36]. Nhiệt độ cao cũng có thể làm virus bất hoạt và
chết. Do đó, trong qui trình tạo cây sạch virus phương pháp xử lí nhiệt và nuôi cấy
ĐST được áp dụng.
2.8.3. Các phƣơng pháp tạo cây sạch virus
Sự nhiễm bệnh do virus, mycoplasma, vi khuẩn và nấm rất khó loại trừ. Hầu
như không thể tiêu diệt các tác nhân gây bệnh kí sinh trên cây bằng hóa chất, đặc biệt
là virus.
Theo Pierik (1987) có 5 phương pháp tạo cây sạch virus:
Xử lí nhiệt (heat treatment)
Nuôi cấy ĐST (meristerm culture)

Xử lí nhiệt sau đó nuôi ĐST
Tạo chồi ngẫu nhiên kết hợp nuôi cấy ĐST
Ghép ĐST lên cây sạch virus (micro grafting)
Khi nghi ngờ cây bị nhiễm virus cần thực hiện các bước sau (Quak, 1977; trích
dẫn bởi [15]):
Xác định virus
Thực hiện các biện pháp loại trừ virus
Tiến hành thí nghiệm xác định cây nghi ngờ có nhiễm virus hay không


16
Ngăn chặn bất kì sự tái nhiễm nào
2.8.3.1. Xử lí nhiệt
Xử lí nhiệt là một cách hiệu quả nhằm bất hoạt một số virus (Quak, 1972; và
Houten và c.s., 1968; trích dẫn bởi [15]). Đôi khi xử lí nhiệt không hiệu quả do cây
quá mẫn cảm với nhiệt độ hay virus không bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ với lí do chưa
được xác định. Cần xét đến nhiệt độ và thời gian xử lí, đảm bảo cây (chồi, cành) sống
sót trong khi virus bị bất hoạt.
Phương pháp này đã được áp dụng và mang lại kết quả tốt chống lại virus và
mycoplasma hiệu quả ở cây ăn quả, cây mía, sắn dây và cây khoai mì (Morel, 1964;
Quak, 1966, 1977; và Kartha và Gamborg, 1975; trích dẫn bởi [15]). Phương pháp này
rất thuận tiện đối với cây ăn quả vì nuôi cấy ĐST khó áp dụng cho đối tượng này.
Ở cây thân gỗ, chỉ xử lí nhiệt chồi bên rồi ghép với cây con (cây từ hạt được vô
mẫu). Thường thời gian xử lí nhiệt dao động từ 20 – 40 ngày hay vài tháng với nhiệt
độ cố định hay thay đổi từ 37 – 38
0
C. Với phương pháp này có thể thu được cây sạch
bệnh với một tỉ lệ cao (Fridlund, 1980; trích dẫn bởi [15]).
2.8.3.2. Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng
Đỉnh sinh trƣởng [5]

Mô phân sinh ngọn chứa những tế bào ĐST, được bao bọc bởi một lớp vỏ cutin
để hạn chế tối đa sự mất nước. Lớp cutin này bao bọc luôn cả chồi ngọn.






Hình 2.1 Cấu tạo cơ bản của đỉnh sinh trưởng
(Nguồn: tài liệu internet [36])
Ở thực vật, sự hình thành mới cơ quan bắt đầu từ trong các mô phân sinh ngọn,
các mô này được phân hóa ngay từ những giai đoạn phát triển đầu tiên của phôi do sự


17
phân hóa của các tế bào sơ khởi. Tất cả các tế bào còn lại đều xuất phát từ tế bào sơ
khởi.
Vì mô phân sinh có kích thước tương đối ổn định nên các tế bào sinh ra từ tế
bào sơ khởi qua vài lần phân chia sẽ tách rời khỏi mô phân sinh. Quá trình sinh trưởng
của đỉnh sinh trưởng được chia thành 3 giai đoạn:
i. Giai đoạn thứ nhất thường được gọi là giai đoạn khởi sinh, trong các điểm
sinh trưởng (trong các mô phân sinh ngọn) xảy ra sự hình thành mầm cơ
quan và sự phân chia đầu tiên của nó thành các mô riêng biệt.
ii. Giai đoạn thứ hai là giai đoạn kéo dài do sự tăng trưởng nhanh chóng, mầm
cơ quan đạt đến kích thước tối đa và trở nên có hình dạng nhất định.
iii. Giai đoạn thứ ba, kết thúc sự phân hóa tế bào, bắt đầu dẫn đến sự hóa gỗ
các thành tế bào, và kết quả là mô không còn khả năng sinh trưởng.Trước
hết các u lồi dần dần được tạo thành và được gọi là những u lá. Thể tích và
chiều dài của u lá tăng rất nhanh kéo theo phần lớn của ĐST. U lồi chuyển
dần thành phác thể lá (thể nguyên thủy của lá) và phác thể lá phát triển

nhanh về chiều dài. Sau khi lá được tách ra, sự phân chia tế bào sẽ được lặp
lại. Kết quả là ĐST được khôi phục nhanh chóng và sự hình thành lá mới
lại bắt đầu.
Ở mỗi nách lá đều có chồi nách (chồi bên). Chồi bên thực chất có cấu tạo không
khác ĐST thân. Do hiện tượng ưu thế ngọn, chồi bên không phát triển, nhưng khi thoát
khỏi sự áp chế của chồi ngọn thì chúng bắt đầu tăng trưởng và có lá đầy đủ như thân
chính.
Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng [5,14]
White (1943; trích dẫn bởi [5]) cho rằng virus khảm thuốc lá (TMV) có mặt
trong các phần khác nhau trên rễ cây thuốc lá, mật độ virus giảm dần khi đến chóp rễ,
và ngay ở chóp rễ hoàn toàn không có virus. Limasset và Cornuet (1949; trích dẫn bởi
[5]) cho rằng có một khuynh độ về mật độ virus trong chồi ngọn cây thuốc lá và ở mô
phân sinh thì hoàn toàn sạch virus. Các nghiên cứu cho rằng ĐST ngọn và chóp rễ
không mang virus. Tuy nhiên ở một số loài thực vật virus cũng hiện diện trong ĐST
của cây (Pierik, 1987) . Theo Quak (1966; trích dẫn bởi [15]) ở ĐST có sự canh tranh
giữa sự sinh sản của virus và sự phân chia của tế bào mô phân sinh (Pierik, 1987).
Trong quá trình phân chia của tế bào, quá trình sinh tổng hợp acid nucleic được tăng


18
cường do đó gây bất lợi cho sự tăng sinh của virus. Lúc này các tế bào phía dưới ĐST
chủ yếu gia tăng kích thước do đó virus có thể sản sinh được. Quak (1966) còn cho
rằng trong ĐST không có sự hiện diện của bó mạch và cầu liên bào nên gây trở ngại
cho sự chuyển động của virus. Có nhiều giả thuyết về yếu tố gây trở ngại cho sự xâm
nhập của virus vào ĐST như nồng độ auxin và cytokinin, enzym cần thiết cho sự tăng
sinh của virus…nhưng các giả thuyết trên chưa được chứng minh.
Morel và Martin (1952; trích dẫn bởi [15]) đã đưa ra sáng kiến cô lập ĐST cây
thược dược bị nhiễm virus đưa vào nuôi cấy in vitro và thu được cây sạch bệnh. Họ
cũng là những người đầu tiên tạo được cây thược dược và khoai tây sạch bệnh bằng
cách nuôi cấy ĐST. Sau đó, phương pháp này được áp dụng với những cây trồng quan

trọng như khoai tây, Trifolium, mía … và những cây thân gỗ.
Khi nuôi cấy ĐST nên chọn những cây đang tăng trưởng để thu ĐST. Nếu ĐST
cô lập đang ở trong trạng thái hoạt động (gồm vùng mô phân sinh và cả phần dưới
ngọn) thì cơ hội loại trừ virus sẽ lớn hơn.
Nên tách lấy vòm mô phân sinh (meristematic dome) và 1 cặp lá đầu tiên. Nếu
lấy đoạn lớn hơn sẽ tạo điều kiện truyền virus. Kích thước của mô phân sinh và lá từ
0,1 – 0,5 mm [36]. Vòm đỉnh (apical dome) có kích thước từ 0,1 – 0,25 mm phụ thuộc
vào loài và sự cân bằng về kích thước. ĐST phải đủ nhỏ để đảm bảo sạch virus và các
tác nhân gây bệnh khác đồng thời đủ lớn để có thể phát triển thành chồi. Mặc dù rễ có
thể hình thành trực tiếp từ chồi trong cùng môi trường, nhưng thường chồi phải được
chuyển sang môi trường tạo rễ để phát triển.
Tỉ lệ cây sạch virus thu được phụ thuộc vào nhiều yếu tố như vật liệu khởi đầu
như ĐST của chồi ngọn hay chồi bên (Styer và Chin, 1983; trích dẫn bởi [5]), thời
gian thu mẫu trong năm (Van Os, 1964; trích dẫn bởi [5]), thành phần môi trường,
nhiệt độ nuôi cấy, nhiệt độ xử lí…
Tỉ lệ cây sạch bệnh thu được bằng phương pháp nuôi cấy ĐST thường rất nhỏ.
Nguyên nhân là do mẫu bị nhiễm, bị hư hại, bị khô nước và bị hóa nâu, môi trường
nuôi cấy không phù hợp; có khi ĐST không tăng trưởng do đang ở trong trạng thái
hưu miên. Trong trường hợp thu được cây hoàn chỉnh từ nuôi cấy ĐST thì cần kiểm
tra xem cây có thực sự sạch virus không. Nếu cây sạch virus thì sẽ được sử dụng làm
cây mẹ để nhân giống vô tính, tạo ra nhiều cây sạch virus.


19

Hình 2.2 Qui trình nuôi cấy ĐST. (A) phần mô phân sinh đỉnh được cắt.
(B) ĐST được cấy trên môi trường agar. (C) cây con tái sinh từ ĐST.
(D) cây con được chuyển ra đất đã khử trùng
(Nguồn: theo tài liệu internet [39])
2.8.3.3 Xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy ĐST

Để làm tăng cơ hội thu được cây sạch bệnh trong những trường hợp khó khăn
(cây bị nhiễm bởi nhiều loại virus) thì nên xử lí nhiệt trước khi thu ĐST để nuôi cấy
nhằm làm giảm số lượng virus hoặc làm tăng diện tích vùng không bị nhiễm virus.
Thời gian xử lí nhiệt thay đổi từ 5 – 10 tuần với nhiệt độ 35 – 38
0
C (Quak, 1977; trích
dẫn bởi [15]). Phương pháp trên đã được sử dụng thành công với khoai tây, cúc, cẩm
chướng và dâu tây. Theo Morel (1964; trích dẫn bởi [5]), khi giữ củ khoai tây ở nhiệt
độ 37 – 38
0
C trong một tháng trước khi tiến hành nuôi cấy ĐST thì sẽ thu được cây
sạch bệnh.
Xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy ĐST có thể loại bỏ virus, vi khuẩn, và nấm nhưng
không loại bỏ được viroid. Khác với virus, viroid là RNA không có vỏ protein – chúng
là RNA trần và rất khó loại bỏ. Thường những cây bị nhiễm phải bị hủy [36].



20

Sơ đồ 2.3 Qui trình tạo cây sạch bệnh bằng phương pháp xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy
ĐST.
(Nguồn: theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)
2.8.3.4 Tạo chồi bất định kết hợp nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng
Brierley (1962; trích dẫn bởi [15]) mô tả sự tạo căn hành bất định in vitro từ
vảy của Lilium longiflorum. Hildebrant (1971; trích dẫn bởi [15]) cũng có những kết
luận tương tự trên cây glaieul. Phôi soma hình thành từ mô phôi tâm Citrus khi tái sinh
thường tạo ra những cây sạch bệnh (Button và Bornman, 1971; và Bitters và c.s.,
1972; trích dẫn bởi [15]).
Việc tạo cây sạch bệnh từ phương pháp tạo chồi bất định đã được tiến hành

thành công ở Lili (Allen, 1974; và Asjes và c.s., 1974; trích dẫn bởi [5]) và cây dạ lan
hương. Trong thí nghiệm này, các mẫu cấy Lili bị nhiễm virus được kích thích để tạo
thành củ bi bất định in vitro; khi kích thước ĐST của các chồi mọc từ củ tăng đến
1mm thì được chuyển sang môi trường nuôi cấy khác để ĐST tiếp tục phát triển.
Phương pháp tạo chồi bất định được thực hiện theo một hướng khác để thu
được cây sạch bệnh ở một số loài như: Petunia, thuốc lá, bắp cải. Ở những cây này,
trên lá có những vùng đặc biệt không bị nhiễm virus trong khi toàn cây đã bị nhiễm.
Những vùng này được cô lập và kích thích để tạo chồi bất định thì sẽ tạo được những
cây sạch bệnh (Murakishi và Carlson, 1979; trích dẫn bởi [15]).
Nhân giống cây
mẹ sạch bệnh
Chồi ra rễ
Cây mẹ
Kiểm tra virus
Chuyển cây ra đất
Kiểm tra virus
Tăng sinh chồi
Xử lí nhiệt
Nuôi cấy đỉnh
sinh trưởng

Chồi hình thành
Cây bị nhiễm virus


21
2.8.3.5. Vi ghép
Nếu như không cảm ứng được sự tăng trưởng của ĐST hoặc thu hút được chồi
từ nuôi cấy ĐST thì có thể ghép ĐST vào cây con in vitro để nó có thể tăng trưởng.
Phương pháp vi ghép này rất có ý nghĩa đối với những cây thân gỗ không thể tiến hành

nuôi cấy ĐST. Phương pháp này lần đầu tiên được thực hiện bởi Morel và Martin trên
đối tượng là cây thược dược vào năm 1952. Sau đó, vi ghép được thực hiện thành công
bởi Murashige và c.s. (1972; trích dẫn bởi [5]), Navaro và c.s. (1975; trích dẫn bởi [5])
trên cây Citrus và đã loại trừ được hai loại virus. Trong một số trường hợp (mơ ghép
với nho) thì trước khi ghép, mẫu phải được xử lí nhiệt .
2.9. Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh cây do virus
Các kĩ thuật chẩn đoán virus gây hại thực vật được phân thành các quá trình
huyết thanh học, các quá trình liên quan nucleic acid và kết hợp cả hai quá trình. Yêu
cầu của các phương pháp chẩn đoán virus phải nhanh, nhạy và chính xác.
2.9.1. Các phƣơng pháp kiểm tra dựa trên quá trình huyết thanh học [21]
2.9.1.1. Cơ sở khoa học của kĩ thuật huyết thanh học
Cơ sở khoa học của phương pháp này chủ yếu dựa vào hoạt động hệ miễn dịch
ở động vật: khi có protein lạ (kháng nguyên) xâm nhập vào máu của cơ thể động vật,
hệ thống bạch huyết sẽ sinh ra protein đặc hiệu (kháng thể) để chống lại protein lạ
trên. Phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể sẽ tạo kết tủa. Đây là phản ứng tự vệ
của động vật, làm cho kháng nguyên gây bệnh bất hoạt và cơ thể động vật được bảo
vệ.
2.9.1.2. Phƣơng pháp ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)
Nguyên tắc phương pháp dựa trên khả năng gắn kết giữa kháng nguyên và
kháng thể. Kháng thể nhận biết protein của virus quan tâm (thường là protein vỏ)
được tạo ra trong cơ thể động vật. Sử dụng kháng thể phủ lên đĩa kiểm tra sau đó cho
mẫu cần kiểm tra vào giếng (nhựa cây hay mẫu bệnh phẩm đã được ly trích). Nếu
virus quan tâm có trong mẫu kiểm tra, kháng nguyên của viurs sẽ gắn vào kháng thể cố
định. Bất kì thành phần không gắn kết nào sẽ bị loại bỏ khi rửa giếng, trước khi kháng
thể thứ hai nhận biết kháng thể thứ nhất được thêm vào. Kháng thể thứ hai cho phép
phát hiện virus gián tiếp nhờ phân tử tín hiệu (reporter molecule), thường là do một
enzyme tác động lên cơ chất đổi màu. Sự đổi màu cơ chất được đánh giá bằng quang
phổ. Với sự hiệu chỉnh hợp lí, ELISA có thể định tính cũng như định lượng.

22
Phương pháp này có thể được sử dụng để kiểm tra một loại virus trên nhiều cây,
mỗi giếng một mẫu cây. Có thể kiểm tra đồng thời nhiều virus trong 1 đĩa đơn với các
kháng thể khác nhau phủ ở mỗi giếng với 2 hoặc 3 lần lặp lại.
Ưu điểm: độ chính xác cao, đơn giản và giá thành thấp.
Hạn chế : đòi hỏi huyết thanh kháng thể đơn dòng hay đa dòng đặc hiệu với
virus và không phản ứng chéo protein thực vật.
Một hình thức khác của ELISA gọi là Thí nghiệm đo điện thế miễn dịch
enzyme (Voltametric enzyme immunoassay). Phương pháp nhằm mục đích phát hiện
sự thay đổi độ dẫn điện của cơ chất khi enzyme gắn vào kháng thể thứ hai. Phương
pháp này nhạy hơn ELISA, được sử dụng để phát hiện virus khảm dưa leo (Cucumber
mosaic virus).
2.9.1.3. Phƣơng pháp TBIA (Tissue blot immunoassay)
Giống ELISA, phương pháp này sử dụng kháng thể kháng virus. Nhựa từ mô
thực vật được chuyển lên giấy thấm, màng nylon hay nitrocellulose và virus được phát
hiện nhờ các probe đã đánh dấu thường là các chất phát quang. Quá trình này ít thao
tác hơn so với ELISA, nhanh hơn, nhạy hơn, đơn giản (không đòi hỏi tách chiết virus)
và rẻ tiền hơn (cần rất ít thiết bị), thích hợp khi cần kiểm tra 1000 – 2000 mẫu mỗi
ngày.
Bên cạnh các kĩ thuật hiện đại, các phương pháp quan sát phản ứng huyết thanh
như: quan sát kết tủa của phản ứng dưới kính hiển vi có tụ quang đen, phản ứng
khuếch tán gel…[2] cũng được sử dụng để chẩn đoán virus.
2.9.2. Phƣơng pháp hiển vi quang học và vi điện tử
2.9.2.1. Quan sát bằng kính hiển vi quang học [2]
Trong quá trình kí sinh, virus thực vật thường có khả năng tạo dạng kết tinh vô
định hình hoặc dạng đặc trưng do vô số cá thể virus kết hợp lại với nhau. Virus khảm
thuốc lá thường tạo dạng kết tinh trong suốt ở mô tế bào cây bệnh. Tinh thể virus có
thể nhuộm màu và quan sát được trên kính hiển vi quang học thông thường ở độ
phóng đại 80 lần.
2.9.2.2. Quan sát bằng kính hiển vi điện tử

Nhờ kính hiển vi điện tử, sợi virus hay hạt virus có thể được quan sát chính xác
hình thái và cấu tạo. Hình thái virus có thể được mô tả một cách chính xác ở độ phóng


23
đại hàng vạn lần. Ngày nay, kính hiển vi điện tử tia xuyên được sử dụng như một công
cụ rất tích cực để tìm hiểu hình thái và cấu tạo của virus thực vật.
2.9.3. Phƣơng pháp chẩn đoán sinh học phân tử
2.9.3.1. Cơ sở khoa học của các phƣơng pháp chẩn đoán sinh học phân tử
Các kĩ thuật sinh học phân tử dựa trên vật chất di truyền của virus (RNA/DNA)
và quá trình tái tổ hợp của chúng.
Khi xâm nhập vào tế bào kí chủ, RNA virus được phóng thích khỏi lớp vỏ
protein. Các enzyme cảm ứng tổng hợp RNA (RNA replicase, RNA synthetase) cùng
với RNA virus (sợi +) đóng vai trò là sợi khuôn mẫu giúp cho sự tổng hợp RNA virus
(sợi - và sợi +). Với các loại virus có RNA (sợi -) thì chúng buộc phải chuyển sang
dạng mRNA (sợi +). Khi xâm nhiễm vào tế bào kí chủ, virus đã đưa RNA (sợi -) và
enzyme vào tế bào. Các virus có RNA sợi kép thì quá trình hình thành RNA (sợi – và
sợi +) được thực hiện nhờ RNA polymerase. Với các virus chứa DNA thì sự tổng hợp
vật chất di truyền được sự trợ giúp của enzyme từ tế bào kí chủ.
2.9.3.2. Polymerase chain reaction (PCR) và Reverse transcription-polymerase
chain reaction (RT-PCR)
PCR và RT-PCR là các kĩ thuật phổ biến để phát hiện và xác định RNA và
DNA của virus thực vật. Phương pháp này cực kì nhạy, không quá đắt tiền và đòi hỏi
ít kĩ năng thực hiện. Trong trường hợp RNA virus, một sợi cDNA bổ sung với RNA
virus được tổng hợp với xúc tác reverse transcriptase (RT). Các primer được kéo dài
bởi DNA polymerase bền nhiệt trong một chuỗi các bước biến tính và kéo dài, làm
tăng DNA mục tiêu theo cấp số nhân. Hiện nay có 3 loại primer cơ bản được sử dụng
để khuếch đại RNA virus (xem Phụ lục 3)[12]. Đối với DNA virus thì bước RT không
cần thiết.
Có nhiều dạng khác nhau phát triển trên kĩ thuật cơ bản nhằm tăng độ nhạy,

thay đổi tính đặc hiệu hay cho phép tự động phát hiện. Các dạng thường gặp:
Multiplex RT-PCR, Fluorescence RT-PCR using Taqman
TM
technology, Competitive
flourescence PCR (CF-PCR), Immunocapture PCR (IC-PCR), Nested PCR.
2.9.3.3. Phƣơng pháp sử dụng các đoạn đa dạng về chiều dài hạn chế (Restriction
fragment length polymorphism – RFLP)
RFLP được sử dụng kết hợp với PCR để xác định sự khác nhau giữa các virus
dựa trên sự hiện diện của các vị trí nhận biết của enzyme cắt giới hạn. Sau khi khuếch


24
đại PCR, các mẫu được phân cắt bởi enzym cắt giới hạn và các kích thước của đoạn
phân cắt được phân tích bằng điện di.
RFLP là một phương pháp phân biệt các dòng virus không cần thực hiện
cloning và sequencing. Hiệu của quả phương pháp này phụ thuộc vào sự đa hình trong
phạm vi vị trí nhận biết của enzyme cắt giới hạn.
2.9.3.4. Probe đánh dấu (Labelled probes)
Việc lai probe DNA hay RNA giúp cho việc phát hiện nucleic acid virus ở cả
hai dạng, sợi đơn và sợi đôi. cDNA probe có thể được gắn nhãn với các isotope hay
probe không có chất phóng xạ. cDNA probe thường được sử dụng để phát hiện RNA
virus vì dạng lai giữa RNA/RNA bền vững hơn dạng lai DNA/RNA. Dịch ly trích
RNA từ mô nhiễm được chuyển lên màng, cho lai với probe và phát hiện RNA virus.
2.10. Các nghiên cứu về bệnh héo đỏ đầu lá (bệnh wilt)
2.10.1. Các nghiên cứu ngoài nƣớc
Bệnh wilt lần đầu tiên được mô tả bởi các nhà khoa học thuộc phòng thí
nghiệm Hiệp hội những người trồng mía Hawaii (HSPA) năm 1910. Năm 1900 bệnh
này gây thiệt hại nặng nề cho công nghiệp trồng dứa ở Hawaii; cho đến nay bệnh xuất
hiện ở hầu hết các khu vực trồng dứa trên thế giới [11,13].
Sự liên hệ giữa bệnh wilt-rệp-kiến

Những nghiên cứu bước đầu về bệnh wilt trên cây dứa bắt đầu từ mối liên hệ
giữa bệnh wilt-rệp sáp-kiến được thực hiện bởi Kenneth G. Rohrbach và cộng sự
(1988). Ở cây bệnh wilt luôn có sự hiện diện của rệp sáp và kiến. Không có kiến quần
thể rệp sáp không thể gia tăng số lượng (Rohrbach và c.s., 1988). Sự có mặt của kiến
cho phép 2 loài rệp sáp Dysmicoccus brevipes (Cockerell) và D. neobrevipes
Beardsley phát triển. Kiến bảo vệ rệp sáp tránh các loài kí sinh và các loài tấn công rệp
đồng thời kiến tiêu thụ chất “mật” do rệp tiết ra giúp cho quá trình xâm nhập của rệp
diễn ra thuận lợi.
Nguyên nhân gây bệnh
Năm 1989, các tiểu phần tương tự closterovirus được tinh sạch từ mô dứa
Hawaii bệnh và phân loại. Đến năm 1997, các virion tương tự closterovirus (PCV) liên
quan về mặt huyết thanh với quần thể PCV Hawaii được tinh sạch từ cây dứa bệnh ở
Australia. Kháng thể đơn dòng (Mab) đặc hiệu closterovirus dứa được sử dụng trong
thử nghiệm miễn dịch mô (TBIA) để phát hiện PCV ở dứa.


25
Hu và c.s. (1997) đã thực hiện nghiên cứu kiểm tra sự hiện diện của PCV trên
hơn 20.000 mẫu dứa bằng phương pháp TBIA. PCV được phát hiện trên những cây
dứa không thể hiện triệu chứng bệnh. Phân tích các kiểu bệnh PMW ở Sri Lanka được
G. Hughes và S. Samita (1997) [10] thực hiện tìm ra sự tương quan giữa triệu chứng
và các yếu tố lây nhiễm. Các kết quả này góp phần quan trọng cho lời giải đáp nguyên
nhân gây bệnh héo lá liên quan đến rệp sáp. Nguyên nhân gây bệnh là virus PMWaV,
được xếp vào họ Closteroviridae dựa vào đặc tính lây truyền.
Yếu tố lây truyền virus
Sether và c.s. (1998) thực hiện thí nghiệm về sự lây truyền virus của 2 loài rệp
sáp Dysmicoccus spp. thông qua tỉ lệ giữa cây nhiễm virus (-) và cây không nhiễm
virus (+) trước và sau khi tiếp xúc với rệp trong trường hợp có kiến và không có kiến.
Tình trạng PMWaV của cây thí nghiệm được xác định bằng phương pháp TBIA và
ISEM (immunosorbent electron microscopy).

Thí nghiệm sự lan truyền virus của D. brevipes khi không có kiến
Nghiệm thức 1(NT1): cây (-) trồng xen kẽ cây (+), không chủng rệp.
NT 2: cây (-) được chủng rệp không mang virus.
NT 3: cây (-) trồng xen kẽ cây (+) được chủng rệp mang virus.
Kết quả ở nghiệm thức 1 và 2 tỉ lệ cây ban đầu không thay đổi trong khi ở
nghiệm thức 3 có sự gia tăng số cây nhiễm virus.
Thí nghiệm sự lan truyền virus bởi D. brevipes khi có kiến
NT 1: cây (-) trồng xen kẽ cây (+) và không chủng rệp
NT 2: cây (-) được chủng rệp không mang virus
NT 3: cây (-) trồng xen kẽ cây (+) , chủng rệp không mang virus
Kết quả cho thấy ở NT 1 và 2 tỉ lệ cây ban đầu không đổi; ở NT 3 tỉ lệ cây
nhiễm virus cao hơn và thời gian lây nhiễm ngắn hơn so với trường hợp không có
kiến.
Nghiên cứu trên cho thấy rõ vai trò chính của rệp trong việc lây lan virus và yếu
tố thúc đẩy sự lây lan là kiến.
Ở thí nghiệm với D. neobrevipes cũng cho kết quả tương tự.