Nghiên cứu tạo cây dứa cayenne in vitro sạch virus gây bệnh héo đỏ đầu lá

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC





KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP




NGHIÊN CỨU TẠO CÂY DỨA CAYENNE IN VITRO
SẠCH VIRUS GÂY BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ
(PMWaV- Pineapple mealybug wilt associated virus)







NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NIÊN KHÓA: 2001 – 2005
SINH VIÊN THỰC HIỆN: TÔN BẢO LINH

Thành phố Hồ Chí Minh
2005
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC












NGHIÊN CỨU TẠO CÂY DỨA CAYENNE IN VITRO
SẠCH VIRUS GÂY BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ
(PMWaV- Pineapple mealybug wilt associated virus)

GVHD: TS. TRẦN THỊ DUNG SVTH: TÔN BẢO LINH
CN. LƢU PHÚC LỢI












Thành phố Hồ Chí Minh
2005
iii
LỜI CẢM ƠN

Xin chân thành cảm ơn:
- Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều
kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập.
- Các thầy cô trong Bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng các thầy cô đã trực tiếp
giảng dạy trong suốt bốn năm qua.
- TS. Trần Thị Dung và CN. Lƣu Phúc Lợi đã tận tình hƣớng dẫn và động viên
trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp.
- TS. Bùi Minh Trí và các anh chị phụ trách phòng CNSH thuộc Trung tâm

phân tích thí nghiệm Đại học Nông Lâm Tp. HCM.
- Thầy Trần Ngọc Hùng cùng các chị thuộc Trung tâm Công nghệ sinh học Đại
học Nông Lâm Tp.HCM.
- Trung tâm phân tích môi trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. HCM.
- Hai bạn Nguyễn Phú Dũng, Lê Thái Bảo Ngọc, chị Trƣơng Bùi Nguyệt Hảo
cùng toàn thể lớp CNSH27 thân yêu đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong
suốt thời gian làm đề tài.
Thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những ngƣời thân trong gia đình luôn tạo điều kiện
và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trƣờng.
Tháng 08 năm 2005
Tôn Bảo Linh











iv
TÓM TẮT

TÔN BẢO LINH, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 08/2005.
“NGHIÊN CỨU TẠO CÂY DỨA CAYENNE IN VITRO SẠCH VIRUS GÂY BỆNH
HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ (PMWaV- Pineapple mealybug wilt associated virus)”

Hội đồng hướng dẫn:

 TS. Trần Thị Dung
 CN. Lưu Phúc Lợi

Đề tài được thực hiện tại Bộ môn Công nghệ sinh học và Trung tâm phân tích thí
nghiệm Đại học Nông Lâm Tp. HCM trên đối tượng cây dứa Cayenne in vitro thuộc 3
giống Trung Quốc, Thái Lan và Lâm Đồng bắt nguồn từ chồi ban đầu nhiễm virus gây
bệnh héo đỏ đầu lá (PMWaV). Tiến hành tạo chồi dứa Cayenne in vitro sạch PMWaV từ
chồi in vitro bị nhiễm virus bằng phương pháp xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy đỉnh sinh
trưởng (ĐST). Nguồn chồi tái sinh theo phương pháp tạo cây sạch virus sẽ được kiểm
chứng bằng kĩ thuật RT-PCR với mồi đặc hiệu cho PMWaV. Trên cơ sở tạo chồi sạch
virus, tiến hành nghiên cứu khả năng tái sinh của ĐST nuôi cấy với 12 nghiệm thức, mỗi
nghiệm thức 3 lần lặp lại với các chỉ tiêu theo dõi như thời gian tái sinh, tỉ lệ tái sinh và hệ
số nhân chồi; nghiên cứu sự sinh trưởng của chồi tái sinh từ ĐST với các chỉ tiêu theo dõi
như chiều cao chồi, số lá, số rễ và chiều dài rễ. Bằng kĩ thuật RT – PCR, thực hiện kiểm
tra PMWaV – 1 và PMWaV – 2 đối với 12 mẫu lá của chồi tái sinh từ ĐST sau 70 ngày
nuôi cấy.
Những kết quả thu được:
1. Khả năng tái sinh của ĐST: thời gian và tỉ lệ tái sinh chủ yếu do kích thước mẫu
cấy quyết định. Mẫu cấy có kích thước từ 0,5 – 1 mm tái sinh trong vòng 14 – 15
ngày và tỉ lệ tái sinh vào khoảng 79,63%.
2. Sự sinh trưởng của chồi tái sinh từ ĐST: sự khác biệt có ý nghĩa của các chỉ tiêu
theo dõi chủ yếu do giống quyết định, giống Cayenne Trung Quốc và Thái Lan
sinh trưởng nhanh hơn so với giống Cayenne Lâm Đồng. Nhìn chung, quá trình xử
lí nhiệt (37
0
C, 30 ngày) không ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của chồi tái sinh.
v
3. Việc tạo cây sạch virus bằng phương pháp xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy ĐST hiệu
quả hơn so với phương pháp đối chứng chỉ nuôi cấy ĐST. Với phương pháp kết
hợp xử lí nhiệt và nuôi cấy ĐST, tỉ lệ cây sạch PMWaV -1 đạt 66,67% và PMWaV

– 2 đạt 100%, trong khi chỉ nuôi cấy ĐST chồi tái sinh vẫn còn nhiễm PMWaV –
1.

vi
SUMMARY

TON BAO LINH, Nong Lam University Ho Chi Minh City. August, 2005.
“Study of producing in vitro free PMWaV (Pineapple mealybug wilt associated virus)
Cayenne pineapple plants”.

Two free – virus plant producing methods involving heat treatment followed by
meristem culture and simply meristem culture were used to eliminate PMWaV-1 and
PMWaV-2 from in vitro PMWaV infected pineapple plants. Three Smooth Cayenne
cultivars originated from China, Thailand and Lam Dong were used as culturing
materials. With the completely randomized design, factors that influenced on the
regeneration and growth of propagated meristem tip, especially heat treatment at 37
0
C in
30 days was also studied.
The experiment result showed that meristem regeneration was mainly influenced
by the size of the excised tissue. Meanwhile, the growth of the regenerative shoots were
influenced by cultivar factors. Heat treatment did not considerably influence on the
regeneration and subsequent growth of propagated meristem. All samples (3/3) without
heat treatment were still infected with PMWaV-1 and one third of samples (3/9) with heat
treatment showed negative infection results with PMWaV-1. Finally, all samples (12/12)

had negative results when tested for PMWaV-2 with RT-PCR.














vii
MỤC LỤC
Trang tựa ...................................................................................................................... i
Lời cảm ơn .................................................................................................................... iii
Tóm tắt .......................................................................................................................... iv
Summary ...................................................................................................................... vi
Mục lục ...................................................................................................................... vii
Danh sách các bảng ..................................................................................................... xi
Danh sách các hình và sơ đồ ...................................................................................... xii
Danh sách các chữ viết tắt xiii
PHẦN 1. MỞ ĐẦU .......................................................................................... 1
1.1.Cơ sở tiến hành và ý nghĩa của nghiên cứu...................................................... 1
1.2. Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................... 2
1.3.Giới hạn của đề tài .............................................................................................. 2
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3

2.1.Nguồn gốc của cây dứa ....................................................................................... 3
2.2. Đặc điểm thực vật học và sinh thái cây dứa .................................................... 3
2.2.1. Đặc điểm thực vật học .................................................................................... 3
2.2.2.Sinh thái cây dứa ............................................................................................. 4
2.3.Phân loại .............................................................................................................. 5
2.4.Các nhóm dứa chính và các giống dứa phổ biến ở Việt Nam ....................... 6
2.4.1.Các nhóm dứa chính ....................................................................................... 6
2.4.1.1. Nhóm Cayenne ............................................................................................. 6
2.4.1.2. Nhóm Queen ................................................................................................. 7
2.4.1.3. Nhóm Spanish .............................................................................................. 7
2.4.2. Các giống dứa phổ biến ở Việt Nam ............................................................. 7
viii
2.4.2.1. Dứa hoa Phú Thọ ......................................................................................... 7
2.4.2.2. Dứa hoa Na Hoa (Hoa Bali) ........................................................................ 8
2.4.2.3. Dứa Kiên Giang và dứa Bến Lức (từ địa phƣơng là “khóm”) ............... 8
2.4.2.4. Nhóm dứa Cayenne .................................................................................... 8
2.5. Tình hình sản xuất và sản lƣợng dứa ............................................................. 9
2.5.1. Tình hình sản xuất và sản lƣợng dứa trên thế giới .................................... 9
2.5.2. Tình hình sản xuất và sản lƣợng dứa ở Việt Nam ...................................... 9
2.5.2.1. Tình hình sản xuất ...................................................................................... 9
2.5.2.2. Sản lƣợng dứa .............................................................................................. 10
2.6. Tình hình sâu bệnh trên cây dứa ..................................................................... 10
2.6.1. Các loại sâu hại dứa ....................................................................................... 10
2.6.2. Bệnh hại dứa và phòng trừ ............................................................................ 11
2.6.2.1. Bệnh thối lõi và thối rễ ............................................................................... 11
2.6.2.2. Bệnh thối mềm ............................................................................................ 11
2.6.2.3. Bệnh “luộc lá” .............................................................................................. 12
2.6.2.4. Tuyến trùng hại dứa .................................................................................... 12
2.7.Bệnh héo do virus ............................................................................................... 13
2.8. Phƣơng pháp tạo cây sạch virus ....................................................................... 14

2.8.1. Sơ lƣợc về hình thái, cấu tạo và sự di chuyển của virus thực vật ............. 14
2.8.2. Cơ sở của các phƣơng pháp tạo cây sạch virus ........................................... 15
2.8.3. Các phƣơng pháp tạo cây sạch virus ............................................................ 15
2.8.3.1. Xử lí nhiệt ..................................................................................................... 16
2.8.3.2. Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng .......................................................................... 16
ix
2.8.3.3 Xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy ĐST ............................................................... 19
2.8.3.4 Tạo chồi bất định kết hợp nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng ............................... 20
2.8.3.5. Vi ghép .......................................................................................................... 21
2.9. Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh cây do virus ............................................. 21
2.9.1. Các phƣơng pháp kiểm tra dựa trên quá trình huyết thanh học ............. 21
2.9.1.1. Cơ sở khoa học của kĩ thuật huyết thanh học ........................................... 21
2.9.1.2. Phƣơng pháp ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) ............... 21
2.9.1.3. Phƣơng pháp TBIA (Tissue blot immunoassay) ...................................... 22
2.9.2. Phƣơng pháp hiển vi quang học và vi điện tử ............................................. 22
2.9.2.1. Quan sát bằng kính hiển vi quang học ..................................................... 22
2.9.2.2. Quan sát bằng kính hiển vi điện tử ............................................................ 22
2.9.3. Phƣơng pháp chẩn đoán sinh học phân tử ................................................... 23
2.9.3.1. Cơ sở khoa học của các phƣơng pháp chẩn đoán sinh học phân tử ....... 23
2.9.3.2. Polymerase chain reaction (PCR) và Reverse transcription-polymerase chain
reaction (RT-PCR) .................................................................................................. 23
2.9.3.3. Phƣơng pháp sử dụng các đoạn đa dạng về chiều dài hạn chế (Restriction
fragment length polymorphism – RFLP) .................................................. 23
2.9.3.4. Probe đánh dấu (Labelled probes) ............................................................. 24
2.10. Các nghiên cứu về bệnh héo đỏ đầu lá (bệnh wilt) ....................................... 24
2.10.1. Các nghiên cứu ngoài nƣớc ......................................................................... 24
2.10.2. Các nghiên cứu trong nƣớc ......................................................................... 26
PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 28
3.1. Nội dung.............................................................................................................. 28
3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .................................................................... 28

x
3.3. Nội dung 1: Tạo cây dứa Cayenne in vitro sạch virus bằng cách kết hợp xử lí
nhiệt và nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng ......................................................................... 28
3.3.1. Vật liệu ............................................................................................................. 28
3.3.1.1 Mẫu nuôi cấy ................................................................................................. 28
3.3.1.2. Thiết bị và dụng cụ ...................................................................................... 28
3.3.1.3. Hóa chất ........................................................................................................ 29
3.3.1.4. Phƣơng pháp tiến hành ............................................................................... 29
3.3.1.5. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................ 30
3.4. Nội dung 2: Kiểm tra PMWaV trên chồi dứa in vitro tái sinh từ đỉnh sinh trƣởng
.................................................................................................................................... 32
3.4.1. Vật liệu ............................................................................................................. 32
3.4.2. Phƣơng pháp tiến hành .................................................................................. 32
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 35
4.1.Khảo sát khả năng tái sinh của ĐST nuôi cấy trên môi trƣờng MS .............. 35
4.1.1Thời gian tái sinh ............................................................................................. 35
4.1.2. Tỷ lệ tái sinh .................................................................................................... 36
4.1.3. Hệ số nhân chồi .............................................................................................. 36
4.2.Khảo sát ảnh hƣởng của giống và quá trình xử lí nhiệt lên sự sinh trƣởng của cây
tái sinh từ ĐST .......................................................................................................... 38
4.2.1 Chiều cao chồi ............................................................................................... 38
4.2.2. Số lá .................................................................................................................. 39
4.2.3. Số rễ ................................................................................................................. 40
4.2.4 Chiều dài rễ ...................................................................................................... 41
4.3. Kết quả kiểm tra PMWaV chồi tái sinh từ ĐST ............................................ 43
4.3.1. Kết quả kiểm tra PMWaV-1 ......................................................................... 43
xi
4.3.2. Kết quả kiểm tra PMWaV-2 ........................................................................ 44
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................. 47
5.1.Kết luận ............................................................................................................... 47

5.2.Đề nghị ................................................................................................................. 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

xii
DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng Trang
Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tái sinh của ĐST
chồi dứa Cayenne ........................................................................................... 30
Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của giống và quá trình xử lí nhiệt lên sự
sinh trưởng của chồi tái sinh từ ĐST ............................................................. 31
Bảng 3.3 Thành phần mix phản ứng RT – PCR .................................................... 33
Bảng 3.4 Các mẫu lá của chồi dứa tái sinh từ ĐST được kiểm tra PMWaV bằng kĩ thuật
RT-PCR .......................................................................................................... 34
Bảng 4.1 Ảnh hưởng các yếu tố giống, xử lí nhiệt và kích thuớc mẫu đến TGTS của ĐST
chồi dứa Cayenne ........................................................................................... 35
Bảng 4.2 Ảnh hưởng của các yếu tố giống, xử lí nhiệt và kích thước mẫu đến tỉ lệ tái sinh
(TLTS) của ĐST chồi dứa Cayenne ............................................................... 36
Bảng 4.3 Ảnh hưởng của các yếu tố giống, xử lí nhiệt đến hệ số nhân chồi (HSNC) của
ĐST chồi dứa Cayenne ................................................................................. 37
Bảng 4.4 Ảnh hưởng của các yếu tố giống và xử lí nhiệt đến chiều cao chồi dứa tái sinh
từ ĐST ............................................................................................................ 38
Bảng 4.5 Ảnh hưởng của các yếu tố giống và xử lí nhiệt đến số lá của chồi dứa tái sinh từ
ĐST ................................................................................................................ 40
Bảng 4.6 Ảnh hưởng của các yếu tố giống và xử lí nhiệt đến số rễ của chồi dứa tái sinh từ
ĐST ................................................................................................................ 41
Bảng 4.7 Ảnh hưởng của các yếu tố giống và xử lí nhiệt đến số rễ của chồi dứa tái sinh từ
ĐST ................................................................................................................ 42

Bảng 4.8 Kết quả kiểm tra PMWaV ở chồi dứa Cayenne tái sinh từ ĐST sau 70 ngày nuôi
cấy .................................................................................................................. 46






xiii
]
DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ

Hình Trang
Hình 2.1 Cấu tạo cơ bản của đỉnh sinh trưởng ...................................................... 16
Hình 2.2 Qui trình nuôi cấy ĐST ........................................................................... 19
Sơ đồ 2.3 Qui trình tạo cây sạch bệnh bằng phương pháp xử lí nhiệt kết hợp nuôi
cấy ĐST .......................................................................................................... 20
Hình 4.1 Chồi dứa trước khi tách ĐST và ĐST được tách quan sát dưới kính hiển vi soi
nổi SZ40 ................................................................................................................. 36
Hình 4.2 Chồi dứa tái sinh từ ĐST sau 30 ngày nuôi cấy ..................................... 39
Hình 4.3 Chồi dứa tái sinh từ ĐST sau 70 ngày nuôi cấy ..................................... 39
Hình 4.4 Kết quả điện di sản phẩm RT - PCR của chồi dứa Cayenne tái sinh từ ĐST
không qua xử lí nhiệt sử dụng primer đặc trưng cho PMWaV-1 ................ 43
Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm RT - PCR của chồi dứa Cayenne tái sinh từ ĐST đã
qua xử lí nhiệt sử dụng primer đặc trưng cho PMWaV-1 ........................... 44
Hình 4.6 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR của chồi dứa Cayenne tái sinh từ ĐST sử
dụng primer đặc trưng cho PMWaV-2 ........................................................ 45

xiv
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Tp. HCM: Thành phố Hồ Chí Minh
c.s.: cộng sự
PMWaV: Pineapple mealbug- wilt associated virus
TT PTTN: Trung tâm phân tích thí nghiệm
ĐST: đỉnh sinh trưởng
RT-PCR: Reverse transcription-polymerase chain reaction
MWP: mealybug wilt of pineapple
GLRaV-3: Grape leafroll associated virus
TMV: Tobacco mosaic virus
ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay
TBIA: Tissue blot immunoassay
QCM: Quartz crystal microbalance

PCR: polymerase chain reaction
cDNA: complementary deoxynucleic acid
DNA: deoxy nucleic acid
RT: Reverse transcription
RFLP: Restriction fragment length polymorphism
RNA: ribose nucleic acid
HSPA: Heat- shocked protein A
PCV: pineapple closterovirus


1

PHẦN 1. MỞ ĐẦU

1.1. Cơ sở tiến hành và ý nghĩa của nghiên cứu
Dứa là một trong những loại cây ăn quả được ưa chuộng trên thị trường thế giới
bởi hương vị đặc trưng và giàu chất dinh dưỡng (vitamin C, tiền vitamin A, acid hữu
cơ…). Enzyme bromelin chiết xuất từ dứa có nhiều ứng dụng trong công nghệ thực
phẩm, thuộc da và nhiều ngành khác. Với những đặc điểm về dinh dưỡng và mùi vị,
dứa được gọi là “Nữ hoàng” của các loại trái cây. Trên thế giới, cây dứa đứng hàng
thứ 9 về tầm quan trọng sau nho, chuối, táo [7]…
Riêng ở Việt Nam, cây dứa có ưu thế về tính chống chịu với ngoại cảnh như:
không kén đất, có thể trồng trên những vùng đất phèn hay vùng đất không thể canh tác
cây rau quả nào khác. Từ những điều kiện thuận lợi trên, trong 5 năm qua dứa
Cayenne với đặc điểm đạt tiêu chuẩn về năng suất, chất lượng cũng như các yêu cầu
cần thiết khác cho chế biến đồ hộp đã được ưu tiên phát triển. Năm 2004 được Bộ
Nông nghiệp và phát triển Nông thôn xác định là năm tập trung cho phát triển vùng
nguyên liệu dứa [25]. Từ đó, các Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn các tỉnh
thực hiện qui hoạch phát triển dứa và rà soát lại vùng nguyên liệu phục vụ các nhà
máy chế biến. Sở Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn Thành phố Hồ Chí Minh

(Tp. HCM) đã thực hiện chương trình giống cây - con chất lượng cao (gồm bò sữa,
tôm, rau an toàn và cây dứa Cayenne) từ năm 2003- 2005 [30]. Ngoài Tp. HCM, các
tỉnh thuộc vùng Đông Nam bộ (Đồng Nai, Bình Dương), Tây Nguyên (Gia Lai) và
miền Trung cũng dự kiến qui hoạch vùng nguyên liệu quả các loại gắn với xây dựng
nhà máy chế biến các sản phẩm quả đạt tiêu chuẩn xuất khẩu, sản phẩm chủ lực là các
sản phẩm từ cây dứa [29,31,32].
Tuy nhiên, một khi tăng diện tích gieo trồng và sản lượng thì bệnh hại trên dứa
cũng bắt đầu phát triển. Theo kết quả điều tra của nhóm nghiên cứu bệnh hại trên dứa
thuộc trường Đại học Nông Lâm Tp. HCM năm 2003 [3,6,8,9], trên hầu hết các ruộng
dứa tại Tp. HCM, Long An, Tiền Giang, Lâm Đồng xuất hiện những bệnh như: bệnh
héo đỏ đầu lá (bệnh wilt), thối trái, thối nõn làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng
suất và chất lượng dứa, gây thiệt hại về mặt kinh tế. Một trong những nguyên nhân lây


2
lan bệnh hại là nguồn chồi giống ban đầu không sạch các mầm bệnh, đặc biệt là virus
gây bệnh đỏ đầu lá PMWaV (Pineapple mealybug wilt – associated virus). Giống dứa


3
Cayenne nhập nội mẫn cảm với bệnh đỏ đầu lá hơn dứa Queen; giống nhập từ Thái
Lan, Trung Quốc có mức độ nhiễm cao và lây lan nhanh hơn giống của Lâm Đồng
[1]. Chồi dứa nhiễm PMWaV không thể nhận biết bằng mắt thường ở giai đoạn đầu và
hiện nay không có loại hóa chất nào để diệt trừ virus hiệu quả.
Để cây dứa Cayenne ngày càng mở rộng và chuyên canh hơn nhằm đáp ứng
nhu cầu quả tươi và nguyên liệu phục vụ cho việc chế biến đồ hộp xuất khẩu, cần phải
có cây giống sạch bệnh đảm bảo chất lượng để cung cấp cho các khu vực trồng dứa.
Với đề tài “Nghiên cứu tạo cây dứa Cayenne in vitro sạch virus gây bệnh héo đỏ đầu
lá” chúng tôi hi vọng sẽ góp phần tạo được nguồn dứa Cayenne sạch bệnh.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu của đề tài nhằm tạo ra các chồi dứa Cayenne sạch virus thông qua xử
lí nhiệt kết hợp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (ĐST) và kiểm tra virus PMWaV – 1 và
PMWaV – 2 ở chồi dứa in vitro bằng kĩ thuật RT-PCR.
1.3. Giới hạn của đề tài
Do giới hạn về thời gian và điều kiện trang thiết bị phục vụ thí nghiệm, đề tài
chỉ giải quyết được các vấn đề cơ bản về mặt kĩ thuật nuôi cấy ĐST chồi dứa in vitro
mà chưa thực hiện nuôi cấy ĐST của chồi dứa ngoài đồng đã qua xử lí nhiệt; chưa
thực hiện được thí nghiệm xử lí nhiệt chồi dứa nhiễm virus ở các mức nhiệt độ và thời
gian khác nhau.
Do giới hạn về kinh phí nên thí nghiệm chỉ thực hiện với qui mô nhỏ; không
kiểm tra PMWaV cho toàn bộ số chồi tái sinh từ ĐST.
Mặt khác do hạn chế về kinh nghiệm nên đề tài chưa khai thác hết các mối
tương quan giữa các yếu tố thí nghiệm. Đề tài chỉ khái quát một trong những qui trình
tạo chồi dứa sạch virus từ mẫu chồi ngoài đồng bị nhiễm virus PMWaV và bước đầu
chứng minh hiệu quả loại trừ virus của phương pháp xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy ĐST.


4
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Nguồn gốc của cây dứa[4]
Cây dứa có nguồn gốc từ Nam Mỹ, được người Châu Âu phát hiện vào năm
1493. Cây dứa thuộc loài A. comosus var ananassoides được thuần hóa bởi những
người thổ dân Tupi-Guarani và được phát tán đến Antilles, bắc Andes và trung Mỹ
(Bertoni, 1919; trích dẫn bởi [4]).
Theo khảo sát của Baker và Colin (1939; trích dẫn bởi [4]) nguồn gốc cây dứa
có thể là vùng tứ giác nằm giữa vĩ tuyến nam 15
0
- 30
0

và kinh tuyến tây 40
0
- 60
0
bao
gồm miền trung và nam Brazil, miền bắc Argentina và Paraguay. Trong khu vực này
dạng hoang dại các loài dứa được tìm thấy theo những hoàn cảnh thích hợp riêng cho
từng loài:
o A. ananasoides trong rừng khô của Brazil, cây mọc rải rác và thấp lùn.
o A. bracteatus dưới bóng cây thưa thớt thường ưa mọc ven rừng.
o Pseudananas sagenarius trong những vùng ẩm ướt hơn, dọc theo bờ
sông hay trong những khu rừng ẩm ướt.
o A. erectifolius ở lưu vực sông Amazon trong những vùng nóng ẩm.
2.2. Đặc điểm thực vật học và sinh thái cây dứa
2.2.1. Đặc điểm thực vật học[4,22]
Dứa là cây thân thảo lâu năm, thuộc lớp đơn tử diệp. Sau khi thu hoạch quả các
mầm nách ở thân tiếp tục phát triển và hình thành một cây mới giống như cây trước;
quả thứ hai thường bé hơn quả trước. Cây dứa trưởng thành cao đến 1 m và rộng 0,5 m
trong khi cây dứa Smooth Cayenne trưởng thành cao 1,5 m và có đường kính từ 1,3 –
1,5 m. Đây là giống dứa được trồng nhiều nhất trên thế giới.
Hoa
Hoa gồm có 3 lá đài, 3 cánh hoa, 6 nhị đực xếp thành 2 vòng tròn, 1 nhị cái có 3
tâm bì và bầu hạ. Cánh hoa màu xanh, đỏ tía, gốc có màu trắng nhạt và trên mặt cánh
hoa có những vảy. Tràng hoa dạng ống dài hơi loe ở phía đầu, ở giữa lồi lên 3 núm
nhụy tím mờ của vòi nhụy. Hoa tự bất thụ (self-sterile) và phát triển quả không hạt;
thụ phấn nhờ gió không xảy ra và sinh sản hữu tính hiếm thấy trong tự nhiên. Nhân


5
giống vô tính là hình thức sinh sản tiêu biểu sử dụng chồi bao gồm chồi đỉnh, chồi bên

và chồi rễ.
Quả
Quả dứa thuộc loại quả tụ do 100 – 200 quả nhỏ hợp lại. Các giống khác nhau
thì hình dạng quả và mắt quả cũng khác nhau. Bộ phận ăn được của dứa là do trục của
chùm hoa và lá bắc phát triển nên. Sau khi hoa tàn thì quả bắt đầu phát triển.
Hạt
Hạt dứa nhỏ, màu tím đen, có vỏ và nội nhủ rất cứng, tỉ lệ nảy mầm thấp và bất
thường nếu không qua tiền xử lí. Mỗi quả con chỉ có vài hạt. Dứa thường không hạt
nếu để thụ phấn tự do. Hạt dứa thường do thụ phấn nhân tạo và được sử dụng trong
các chương trình lai tạo giống mới.
Thân
Thân cây dứa chia làm 2 phần: một phần trên mặt đất và một phần dưới mặt đất.
Phần ở trên thường bị các lá che kín nên khó nhìn thấy. Khi cây đã phát triển đến mức
độ nhất định, có thể dùng các mầm ngủ trên các đốt để nhân giống.
Lá
Lá dứa mọc trên thân cây theo hình xoắn ốc. Lá thường dày, không có cuống,
hẹp ngang và dài. Bề mặt và lưng lá thường có một lớp phấn trắng hoặc một lớp sáp có
tác dụng làm giảm độ bốc hơi nước ở lá. Các giống dứa thường có gai nhọn và cứng ở
mép lá, nhưng cũng có giống lá không gai như Cayenne. Tùy theo giống, một cây dứa
trưởng thành có khoảng 60 – 70 lá.
Rễ
Rễ dứa gồm rễ cái và rễ nhánh (mọc ra từ phôi hạt); rễ bất định (mọc ra từ mầm
rễ trên các đốt của các loại chồi dứa trước khi đem trồng). Rễ dứa thuộc loại ăn nông,
phần lớn do nhân giống bằng chồi nên mọc từ thân ra, rễ nhỏ và phân nhiều nhánh. Bộ
rễ dứa thường tập trung ở tầng đất 10 – 26 cm và phát triển rộng đến 1 m.
2.2.2. Sinh thái cây dứa [4,7]
Dứa là cây ăn quả nhiệt đới thích nhiệt độ cao, nhiệt độ thích hợp cho sinh
trưởng 28 – 32
0
C, nhiệt độ giới hạn 15 – 40

0
C. Nhiệt độ có ảnh hưởng đặc biệt quan
trọng đến quá trình hình thành quả chín của quả do đó là yếu tố đầu tiên ảnh hưởng
đến phẩm chất của quả.



6
Yếu tố quan trọng không kém là chế độ nước bao gồm lượng mưa hàng năm và
phân bố mưa. Dựa vào 2 chỉ tiêu trên, các vùng sinh thái thích hợp được thiết lập đảm
bảo việc trồng dứa trên diện rộng đạt năng suất cao. Theo kinh nghiệm, lượng mưa
thích hợp nhất cho dứa là 1000 – 1.500 mm. Tuy nhiên dứa vẫn phát triển tốt ở những
vùng có lượng mưa thấp nhưng thuộc khí hậu đại dương, quanh năm ấm mát.
Cây dứa ưa ánh sáng tán xạ hơn ánh sáng trực xạ. Lượng chiếu sáng thích hợp
làm tăng năng suất và cải thiện phẩm chất hương vị quả. Độ chiếu sáng còn ảnh hưởng
đến màu sắc quả.
Dứa có bộ rễ tập trung ở lớp đất mặt do đó yêu cầu đất phải tơi xốp, thoáng, có
kết cấu hạt, không có nước đọng vào mùa mưa. Về pH, các giống khác nhau có yêu
cầu khác nhau. pH 5,6 – 6,0 có thể lên đến 7,5 đối với giống Cayenne; nhóm dứa
Queen có thể sinh trưởng tốt trên đất phèn pH 4,0 trong khi giống Spanish (các
giống dứa ta) thích nghi với pH từ 4,5 – 5,0.
2.3. Phân loại [7,35]
Dứa có tên khoa học là Ananas comosus (L.) Merr thuộc:
o Phân lớp: Magnoliophyta
o Lớp: Liliopsida
o Bộ: Poales
o Họ: Bromeliaceae
o Giống: Ananas
o Loài: A. comosus
Giống này cùng với giống lân cận Pseudananas khác biệt với các giống khác

trong họ ở chỗ quả dứa là một quả kép trong khi đó các giống khác có quả nhỏ đứng
rời nhau.
Smith (1939; trích dẫn bởi [7]) đề nghị cách phân loại rõ hơn giữa các chi
Ananas và Pseudananas:
i. Quả kép khi chín mang một chùm nhỏ lá bắc giống như vảy ở cuống quả
không có chồi cuống, trên thân có các chồi ngầm, cánh hoa có nhiều u nổi
như những nếp thịt là chi Pseudananas (P. sagenarius).
i. Quả kép khi chín mang một chùm lá bắc rất dễ nhận, ở gốc cuống quả có
các chồi, trên thân không có chồi ngầm, hoa có 2 vảy hình phễu là chi
Ananas.


7
ii. Quả kép khi chín dài hơn 15 cm, thịt quả thơm ngon, cuống quả chắc chắn
và ngắn.
ii. Quả kép ngắn, dài tối đa 15 cm, quả ít thịt, hương vị kém, cuống quả nhỏ
và dài.
iii. Gai lá mọc chĩa lên, lá bắc có màu sắc khi quả chín, cánh hoa hình vảy
(A. bracteatus).
iii. Gai lá cong xuống, lúc quả chín lá bắc có màu xanh nhạt. Cánh hoa có nếp
nhăn dọc (A. fritzmuelleri).
iii. Lá bắc không biểu hiện rõ, để lộ sớm đầu nhị cái, ít hoặc không có răng
cưa, không có hoặc rất ít hạt; quả dùng để ăn (A. comosus).
iv. Lá mọc đứng, cứng, không gai trừ 1 gai ở đầu lá, lá rộng 35 cm (A.
erectiflius).
iv. Lá cong, nhiều răng cưa nhỏ ở biên lá, lá rộng không quá 25 cm
(A. ananassoides).
2.4. Các nhóm dứa chính và các giống dứa phổ biến ở Việt Nam [1,4,7]
2.4.1. Các nhóm dứa chính
Dứa gồm khoảng 50 giống và 2000 loài phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt

đới châu Mỹ [38]. Các giống dứa đang được trồng trọt hiện nay được chia thành 3
nhóm: nhóm dứa Cayenne, nhóm dứa Queen (còn gọi là hoàng hậu) và nhóm Spanish
(nhóm Tây Ban Nha).
2.4.1.1. Nhóm Cayenne
Lá dài, không có gai hoặc có một ít ở đầu chóp lá, dày, lòng máng lá sâu, có thể
dài hơn 100 cm, hoa có màu xanh nhạt, hơi đỏ, quả có dạng hình trụ, mắt rất nông, quả
nặng bình quân 1,5 – 2,0 kg rất phù hợp cho việc chế biến làm đồ hộp. Khi chưa chín
quả màu xanh đen, sau đó chuyển dần và đến lúc chín quả có màu đỏ hơi pha da đồng.
Cây đẻ yếu, trung bình chỉ cho 1 – 2 chồi một gốc trong một năm. Trong điều kiện
chăm sóc kém có thể không có chồi cuống.
Quả dứa Cayenne chứa nhiều nước và vỏ mỏng nên rất dễ thối khi vận chuyển.
Vì thế việc chọn vùng, địa điểm trồng và qui hoạch đồng ruộng phải quan tâm đến đặc
điểm này.


8
2.4.1.2. Nhóm Queen
Lá hẹp, cứng, có nhiều gai ở mép. Mặt trong của lá có 3 đường vân trắng hình
răng cưa chạy song song theo chiều dài, hoa có màu xanh hồng. Quả có nhiều mắt,
mắt nhỏ và lồi, cứng do đó tương đối dễ vận chuyển. Thịt quả vàng, ít nước và có vị
thơm hấp dẫn.
Ưu điểm của nhóm dứa này là không kén đất, có thể trồng trên các loại đất
nghèo dinh dưỡng, cây có hệ số nhân giống cao, trung bình 4 – 6 chồi/gốc, có thể chịu
được bóng râm. Thịt quả dòn, có màu sắc và hương vị phù hợp để ăn tươi.
Nhược điểm: quả bé, trọng lượng bình quân chỉ đạt từ 500 – 700 g. Dạng quả
hơi bầu dục khó thao tác trong khi chế biến. Thịt quả có nhiều khe hở, không chặt nên
khó đạt tiêu chuẩn để làm đồ hộp xuất khẩu.
2.4.1.3. Nhóm Spanish
Lá mềm, mép lá cong, hơi ngả về phía lưng, hoa tự có màu đỏ nhạt. Quả ngắn,
kích thước to hơn so với nhóm Queen nhưng bé hơn so với nhóm Cayenne. Trọng

lượng quả trung bình xấp xỉ 1kg. Khi chín vỏ quả có màu nâu đỏ, sẫm hơn nhiều so
với quả Cayenne và cũng có dạng hình trụ cân đối. Thịt quả màu vàng trắng không
đều, mắt quả sâu, vị hơi chua. Chồi ngọn và đặc biệt là chồi cuống nhiều, ảnh hưởng
đến phẩm chất quả.
Nhìn chung, các giống dứa trong nhóm Spanish tuy dễ trồng, chịu được bóng
nhưng phẩm chất kém nên được trồng chủ yếu ở qui mô hộ gia đình, không nên tập
trung thành vùng lớn.
Ngoài ba nhóm dứa trên, còn có nhóm Abacaxi tách ra từ nhóm Spanish nhưng
mức độ phổ biến còn thấp.
2.4.2. Các giống dứa phổ biến ở Việt Nam
2.4.2.1. Dứa hoa Phú Thọ
Còn được gọi là Queen cổ điển. Nó có những đặc tính điển hình nhất của giống
Queen như quả nhỏ; mắt nhỏ, lồi; gai ở rìa lá nhiều và cứng…Đây là giống nhập nội
vào Việt Nam khoảng đầu thế kỉ XX, được trồng rải rác ở các tỉnh phía Bắc và miền
Trung.
Ưu điểm nổi bật của dứa hoa Phú Thọ là thịt vàng giòn, rất thơm và hấp dẫn
nên nó được dùng để pha trộn vào nước dứa ép từ các giống khác hay các loại quả


9
khác để tạo ra mùi thơm đặc trưng. Giống này dễ trồng, chịu được đất xấu, đất chua,
dễ ra hoa trái vụ.
Nhược điểm là quả nhỏ, năng suất nhìn chung thấp, khó chế biến đồ hộp nên
hiệu quả kinh tế không cao.
2.4.2.2. Dứa hoa Na Hoa (Hoa Bali)
Giống dứa này có đặc tính của nhóm mắt nhỏ, lồi, khi chín vỏ và thịt quả đều
có màu vàng. So với dứa hoa Phú Thọ, giống này có lá ngắn và to, quả cũng to hơn.
Bình quân trọng lượng từ 0,9 – 1,2 kg/quả. Khi chín kĩ, nước trong thịt quả cũng nhiều
hơn.
Đây là giống dứa khá phổ biến ở các vùng trồng tập trung với ưu điểm dễ canh

tác, có thể duy trì năng suất đến vụ thứ 2, thứ 3 nếu áp dụng kĩ thuật chăm sóc thích
hợp; hệ số nhân giống tương đối cao. Tuy nhiên, do có mắt sâu, quả hơi bầu dục nên
khó đạt tỉ lệ cái cao khi chế biến đồ hộp, hiệu quả kinh tế thấp.
2.4.2.3. Dứa Kiên Giang và dứa Bến Lức (từ địa phƣơng là “khóm”)
Một số tác giả liệt kê các giống này vào cùng với giống dứa Na Hoa. Trong
điều kiện khí hậu miền Nam, cây sinh trưởng mạnh, quả có kích thước lớn hơn so với
trồng ở miền Bắc, đồng thời một số đặc điểm cũng khác đi.
So với dứa Bến Lức, dứa Kiên Giang có dạng hình trụ hơn, mắt quả to hơn và
thịt quả có nhiều nước hơn. Đây là những giống trồng khá phổ biến ở vùng đồng bằng
sông Cửu Long.
2.4.2.4. Nhóm dứa Cayenne
Đặc điểm của nhóm dứa này là lá không gai ngoài một vài gai ở đầu mút lá, lá
dày, lòng máng sâu, có nhiều phấn ở mặt dưới nhất là ở phía gốc.
Giống này du nhập vào nước ta cuối những năm ba mươi, đầu những năm bốn
mươi ở một số địa phương miền Bắc chủ yếu trong những đồn điền do người Pháp
quản lí. Chân Mộng (thuộc Vĩnh Phú) là một trong những nơi tiếp nhận giống đầu tiên,
về sau người ta quen gọi là Cayenne Chân Mộng.
Các giống Cayenne được trồng phổ biến hiện nay là giống Cayenne Thái Lan,
Cayenne Trung Quốc và Cayenne Lâm Đồng. Theo tài liệu của Viện cây ăn quả miền
Nam [1], giống Cayenne Thái Lan và Trung Quốc đều cho trái to và phát triển tốt; tuy
nhiên là giống mới nhập nội nên cần có thời gian để kết luận. Giống Cayenne Lâm


10
Đồng đã phát triển lâu đời ở Việt Nam, chống chịu bệnh wilt và phẩm chất tốt nên
phát triển trong giai đoạn hiện nay.
Với ưu điểm năng suất cao, quả to và dễ thao tác trong chế biến làm đồ hộp, có
chất lượng cao cả về hóa sinh lẫn tỉ lệ cái nên giống Cayenne đang được chú ý phổ
biến ra diện rộng. Các vùng trồng dứa nguyên liệu được hình thành nhằm cung cấp
nguyên liệu cho các nhà máy chế biến dứa.

2.5. Tình hình sản xuất và sản lƣợng dứa
2.5.1. Tình hình sản xuất và sản lƣợng dứa trên thế giới
Theo thống kê năm 2001 [26] sản lượng dứa của thế giới đạt 13.739.000 tấn,
phân bố theo các châu lục và khu vực như sau: Châu Phi 2.229.000 tấn, Bắc Mỹ
1.512.000 tấn, Nam Mỹ 2.556.000 tấn, Châu Á 7.275.000 tấn, Châu Phi 2.000 tấn và
Châu Đại Dương 164.000 tấn. Các nước có sản lượng dứa cao như Thái Lan 2.300 tấn,
Philipin 1.572 tấn, Brazil 1.442 tấn, Trung Quốc 1.284 tấn, Nigeria 881 tấn…
2.5.2. Tình hình sản xuất và sản lƣợng dứa ở Việt Nam
2.5.2.1. Tình hình sản xuất
Theo tài liệu thống kê [27], diện tích trồng dứa cả nước năm 1995 là 25.734 ha
đến năm 2000 lên đến 36.541 ha. Tính đến năm 2000 diện tích trồng dứa của miền Bắc
là 9.675 ha chiếm 26,48% diện tích trồng dứa cả nước, chủ yếu ở vùng Đông Bắc và
đồng bằng sông Hồng; trong khi diện tích gieo trồng của miền Nam là 26.866 ha
chiếm 73,52% diện tích trồng dứa cả nước, chủ yếu tập trung ở vùng đồng bằng sông
Cửu Long.
Các tỉnh có diện tích gieo trồng dứa khá lớn là Kiên Giang (9.200 ha), Tiền
Giang (7.803 ha), Bạc Liêu (3.625ha), Cần Thơ (1.338 ha), Long An (661 ha), Quảng
Nam (2.320 ha), Bình Định (500 ha), Thanh Hóa (2.900 ha), Ninh Bình (1.572 ha),
Nghệ An (600 ha), Bắc Giang (657 ha)…
Bên cạnh đó, các tỉnh miền Đông Nam Bộ có diện tích dứa tăng đáng kể trong
khoảng thời gian từ năm 1998 đến năm 2000: Tp. HCM tăng từ 76 ha lên đến 150 ha,
Đồng Nai tăng từ 61 ha lên 123 ha, Bình Thuận tăng từ 12 ha lên 40 ha. Hiện nay cây
dứa Cayenne được các nhà nông học đánh giá cao do phù hợp với đất đai thổ nhưỡng
của các tỉnh miền Trung, Tây Nguyên và các vùng đất nhiễm phèn khác. Nhiều dự án
mở rộng vùng trồng dứa Cayenne được thực hiện ở khu vực Đông Nam Bộ như
Chương trình phát triển cây dứa Cayenne ở Tp. HCM thời kì 2003 – 2005 [30], ở khu


11
vực Tây Nguyên (Gia Lai, Đaklak) [32]. Một số tỉnh miền Trung như Bình Định, Phú

Yên …cũng đề nghị Tp. HCM cung cấp giống dứa Cayenne để nhân rộng [29].
2.5.2.2. Sản lƣợng dứa
Theo tài liệu thống kê [27] sản lượng dứa của cả nước năm 2000 là 291.428 tấn
phân bố trên các khu vực trồng dứa cả nước như sau: miền Bắc đạt 57.246 tấn, khu
vực Bắc trung bộ 25.218 tấn, miền Nam 234.164 tấn trong đó các tỉnh thuộc khu vực
Duyên Hải Nam Trung Bộ đạt 20.832 tấn, Tây Nguyên 2.357 tấn, khu vực Đông Nam
Bộ 1.417 tấn và khu vực có sản lượng dứa lớn nhất trong nước – Đồng Bằng Sông
Cửu Long 209.558 tấn. Các tỉnh có sản lượng dứa cao là Kiên Giang (89.094 tấn),
Tiền Giang (79.880 tấn), Bạc Liêu (24.860 tấn), Ninh Bình (20.315 tấn), Quảng Nam
(15.724 tấn), Thanh Hóa (11.107 tấn), Hà Tây (1.725 tấn), Bắc Giang (1.495 tấn), Phú
Thọ (1.159 tấn)…
2.6. Tình hình sâu bệnh trên cây dứa
2.6.1. Các loại sâu hại dứa
Theo Trần Thế Tục và Vũ Mạnh Hải (2000), dứa ít bị côn trùng gây hại so với
nhiều loại cây trồng khác.
Đối tượng sâu hại quan trọng và phổ biến hầu hết khắp các vùng trồng dứa trên
thế giới là rệp sáp (Dysmicoccus hoặc Pseudococcus brevipes). Rệp sáp và bệnh wilt
thường xuất hiện cùng lúc và có quan hệ mật thiết với nhau. Rệp sáp thường tiết ra
một chất hơi dính như mật ong nên thường có nhiều loài kiến sống kết hợp chặt chẽ
với rệp. Kiến sống bằng chất mật do do rệp tiết ra và làm tổ cho rệp ở, mang rệp phân
tán đi khắp nơi. Nhờ có các tổ này mà rệp được bảo vệ chắc chắn, ít bị ảnh hưởng của
biến đổi thời tiết bên ngoài, tạo nên một tiểu khí hậu rất thích hợp cho việc sinh sản.
Vì vậy, muốn tiêu diệt rệp sáp một cách triệt để và có hiệu quả, phải tiến hành phòng
trừ rệp đồng thời với các loại kiến và phải tiến hành ngay từ đầu.
Ngoài rệp sáp, một số vùng trồng dứa ở Việt Nam còn có một loại côn trùng
gây hại rễ là một loại sâu non có tên Adoretus chinensis Thanber thuộc họ
Scarebicideae, bộ cánh cứng (Coleopera). Loại côn trùng này trực tiếp phá hoại rễ, tạo
vết thương cơ giới giúp tuyến trùng và nấm bệnh (chủ yếu là Thiellaviopsis paradoxa)
xâm nhập và làm vườn dứa tàn lụi nhanh chóng. Có thể phòng trừ loại sâu hại rễ này
bằng hóa chất trên thị trường. Tuy nhiên, đối với những vườn dứa bị hại nặng phải

luân canh cây trồng khác từ 1 – 2 năm.