xây dựng quy trình phát hiện virus PMWaV-1

1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
****0O0****






KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP



XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VIRUS PMWaV-1 GÂY
BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ (Mealybug wilt) TRÊN CÂY DỨA
CAYENNE BẰNG PHƯƠNG PHÁP RT-PCR



Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2001 – 2005
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN PHÚ DŨNG




Thành phố Hồ Chí Minh
09/2005

2
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***000***




KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP




XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VIRUS PMWaV-1 GÂY
BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ (Mealybug wilt) TRÊN CÂY DỨA
CAYENNE BẰNG PHƯƠNG PHÁP RT-PCR




Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện
Ts. TRẦN THỊ DUNG NGUYỄN PHÚ DŨNG
Cn. LƯU PHÚC LỢI

Thành Phố Hồ Chí Minh
- 09 / 2005 -


3

LỜI CẢM TẠ

ZY

Để hoàn thành cuốn luận văn này tôi đã nhận được sự hướng dẫn tận
tình, sự góp ý, giúp đỡ của các thầy cô, gia đình và bạn bè. Nay tôi xin được
bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

 Cha và Mẹ đã sinh thành, dạy dỗ con đạt được ngày hôm nay.

 Ts. Trần Thị Dung đã hết lòng hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho
tôi hoàn tất đề tài.

 Thầy Lưu Phúc Lợi đã tận tình giúp đỡ, góp ý và động viên trong suốt thời
gian tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp.

 Các Thầy – Cô bộ môn Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Nông Lâm
TP. Hồ Chí Minh.

 Các anh chị thuộc Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm trường Đại Học Nông
Lâm Tp.Hồ Chí Minh.

 Các bạn bè thân yêu lớp Công Nghệ Sinh Học 27 đã cùng tôi chia sẻ vui
buồn, thành công và thất bại trong suốt thời gian thực hiện đề tài.


Tp. Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2005
Nguyễn Phú Dũng


4
TÓM TẮT


Đề tài "Xây dựng qui trình phát hiện virus PMWaV-1 gây bệnh đỏ đầu lá trên
chồi dứa Cayenne bằng phương pháp RT-PCR" được thực hiện tại phòng thí nghiệm
CNSH – Trung tâm phân tích thí nghiệm – trường Đại học Nông Lâm TPHCM từ
ngày 15/3/2005 đến ngày 15/8/2005.
Đề tài được thực hiện bởi sinh viên Nguyễn Phú Dũng thuộc lớp CNSH khóa
27 dưới sự hướng dẫn của Ts. Trần Thị Dung - trưởng Bộ môn CNSH.
Đối tượng nghiên cứu của đề tài là virus PMWaV-1 gây bệnh héo đỏ đầu lá
trên cây dứa Cayenne. Bệnh đang hiện diện ở hầu hết các vùng trồng dứa trên thế giới,
gây thiệt hại kinh tế rất lớn cho người trồng vì chưa có thuốc phòng trị đặc hiệu.
Mục đích của đề tài là xây dựng quy trình phát hiện PMWaV-1 trên chồi giống
dứa Cayenne bằng cách khuếch đại đoạn gen HSP 70 của virus với phương pháp
RT-PCR.

Nội dung nghiên cứu bao gồm:
¾ Thu thập chồi giống dứa Cayenne.
¾ Thiết lập quy trình RT-PCR khuếch đại đoạn gene HSP 70 của PMWaV-1.
¾ Áp dụng quy trình vừa xây dựng, giám định PMWaV-1 trên 90 chồi dứa

Cayenne thuộc 3 giống: Thái Lan, Trung Quốc và Lâm Đồng.

Các kết quả thu được:
¾

Ly trích được RNA tổng số từ mẫu dứa.
¾

Xây dựng được quy trình RT-PCR phát hiện PMWaV-1 qua việc xác định
được các yếu tố chu trình nhiệt, nồng độ primer và số chu kỳ tối ưu cho
phản ứng.
¾
Sản phẩm RT-PCR được giải trình tự cho thấy nằm đúng vùng gene
HSP 70 cần nhân bản và hoàn toàn đặc hiệu cho PMWaV-1. Như vậy, quy
trình RT-PCR được xây dựng hoàn toàn đáng tin cậy trong việc phát hiện
PMWaV-1

¾
Tỷ lệ nhiễm PMWaV-1 trên cả 3 giống dứa Cayenne được giám định đều
rất cao, giống Thái Lan: 53,3%, giống Trung Quốc: 46,7% và giống Lâm
Đồng: 46,7%. Kết quả này cho thấy một nguy cơ lớn của bệnh héo đỏ đầu
lá đang đe dọa người trồng dứa và đòi hỏi cấp thiết một phương pháp
phòng trừ bệnh hiệu quả.





5
MỤC LỤC

CHƯƠNG TRANG
Trang tựa
Lời cảm tạ.................................................................................................................. iii
Tóm tắt .......................................................................................................................iv
Mục lục........................................................................................................................v
Danh sách các chữ viết tắt.........................................................................................vii
Danh sách các bảng................................................................................................. viii
Danh sách các hình.....................................................................................................ix

Phần 1: MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề ........................................................................................................1
1.2 Mục đích ..........................................................................................................2
1.3 Yêu cầu ............................................................................................................2

Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Đặc điểm chung của cây dứa. ..........................................................................3
2.2 Phân loại...........................................................................................................4
2.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ dứa trên thế giới và ở Việt Nam......................7
2.4 Bệnh héo đỏ đầu lá trên cây dứa......................................................................9
2.5 Một số nghiên cứu về bệnh héo đỏ đầu lá trên thế giới và ở Việt Nam. .......13
2.6 Các phương pháp chẩn đoán PMWaV...........................................................15
2.7 Gene HSP 70 của PMWaV-1.........................................................................16
2.8 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)..........................................17
2.8.1 Nguyên tắc của phương pháp PCR.....................................................17
2.8.2 Các yếu tố quan trọng trong phản ứng PCR .......................................19
2.8.2.1 Dung dịch đệm (Buffer).............................................................19
2.8.2.2 Mg
2+ .........................................................................................................................................

19
2.8.2.3 Deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs).............................19
2.8.2.4 Primer (đoạn mồi) ......................................................................20
2.8.2.5 Taq – polymerase .......................................................................20
2.8.2.6 Số chu kỳ của phản ứng PCR.....................................................21
2.9 Phương pháp RT-PCR (Reverse transcription PCR)...................................21
2.10 Kỹ thuật giải trình tự DNA. (Sequencing)...................................................24





6
Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Vật liệu nghiên cứu. ......................................................................................25
3.1.1 Mẫu .......................................................................................................25
3.1.2 Dụng cụ và thiết bị................................................................................25
3.1.3 Hóa chất ................................................................................................26
3.1.3.1 Hoá chất dùng cho tách chiết RNA .............................................26
3.1.3.2 Hoá chất dùng cho phản ứng RT-PCR........................................26
3.1.3.3 Hóa chất dùng cho điện di DNA .................................................27
3.1.3.4 Hóa chất dùng cho điện di RNA .................................................28
3.2 Phương pháp nghiên cứu...............................................................................28
3.2.1 Tách chiết RNA ....................................................................................28
3.2.2 Điện di sản phẩm ly trích RNA.............................................................29
3.2.3 Xây dựng quy trình RT-PCR ................................................................30
3.2.3.1 Khảo sát độ đặc hiệu của primer .................................................30
3.2.3.2 Xác định chu kỳ nhiệt tối ưu .......................................................30
3.2.3.3 Xác định nồng độ primer thích hợp.............................................31
3.2.3.4 Xác định số chu kỳ tối ưu cho phản ứng RT-PCR......................31

3.2.4 Điện di sản phẩm RT-PCR ...................................................................31
3.2.5 Giải trình tự sản phẩm RT-PCR............................................................32
3.2.6 Giám định chồi giống dứa.....................................................................32

Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả ly trích RNA.....................................................................................33
4.2 Kết quả xây dựng quy trình RT-PCR............................................................34
4.2.1 Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của primer ..............................................34
4.2.2 Kết quả xác định chu kỳ nhiệt tối ưu ....................................................36
4.2.2 Kết quả xác định nồng độ primer thích hợp..........................................38
4.2.3 Kết quả xác định số chu kỳ tối ưu cho phản ứng RT-PCR. .................39
4.3 Kết quả kiểm tra sản phẩm RT-PCR bằng phương pháp giải trình tự ..........42
4.4 Kết quả giám định chồi giống dứa ................................................................46

Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1 Kết luận. ........................................................................................................49
5.2 Đề nghị ..........................................................................................................49

TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................50

PHỤ LỤC..................................................................................................................53


7


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

bp : base pair
cDNA : Complementary deoxyribonucleic acid
dNTP : Deoxyribonucleotide triphophate
ddNTP : Dideoxyribonucleotide triphophate
DNA : Deoxyribo nucleic acid
ELISA : Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
HSP 70 : Heat shock protein 70
mRNA : messenger Ribonucleic acid
NCBI : National Center for Biotechnology Information
Nu : Nucleotide
PCR : Polymerase Chain Reaction
PCV : Pineapple Closterovirus
PMWaV-1 : Pineapple mealybug wilt associated virus – 1
RNA : Ribonucleic acid
RT-PCR : Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction
TBIA : Tissue Blotting Immuno Assay
Taq-polymerase : Thermos aquaticus - polymerase
Tm : Melting temperature

8




DANH SÁCH CÁC BẢNG


BẢNG TRANG

Bảng 3.1: Các chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR được khảo sát............30
Bảng 4.1: Các đặc tính cơ bản của cặp primer 225, 226 ...............................34
Bảng 4.2: Các cấu trúc thứ cấp mang năng lượng tự do thấp nhất................35
Bảng 4.3: Kết quả phân tích BLAST của 2 primer 225, 226.........................36
Bảng 4.4: Trình tự của sản phẩm RT-PCR ...................................................42
Bảng 4.5: Kết quả so sánh trình tự của sản phẩm RT-PCR ..........................44
Bảng 4.6: Kết quả phân tích BLAST của 2 trình tự D1, D2..........................46
Bảng 4.7: Tổng kết giám định PMWaV-1 trên chồi dứa...............................47

9





DANH SÁCH CÁC HÌNH


HÌNH TRANG

Hình 2.1: Cây dứa ................................................................................................ 3
Hình 2.2: Dứa Cayenne........................................................................................ 7
Hình 2.3: Cây dứa Cayenne bị héo đỏ đầu lá .................................................... 10
Hình 2.4: Quả của cây dứa bị héo đỏ đầu lá ...................................................... 10
Hình 2.5: Rệp xám (Dysmicoccus neobrevipes), rệp hồng (Dysmicoccus
brevipes) và vị trí thường gặp của chúng trên cây dứa ....................... 11
Hình 2.6: Sự cộng sinh của kiến đầu to (Pheidole megacephala) với rệp sáp .. 12
Hình 2.7: Phản ứng PCR.................................................................................... 18
Hình 2.8: Phản ứng RT-PCR ............................................................................. 22
Hình 3.1: Mẫu chồi giống dứa Cayenne thương phẩm...................................... 25
Hình 3.2: Sơ đồ phản ứng RT-PCR khuếch đại đoạn gene HSP 70
của PMWaV-1 bằng cặp primer 225, 226 ......................................... 27
Hình 3.3: Thang DNA........................................................................................ 28
Hình 4.1: Kết quả điện di sản phẩm ly trích RNA............................................. 33
Hình 4.2: Sản phẩm RT-PCR của 5 chu trình nhiệt........................................... 37
Hình 4.3: Kết quả khảo sát nồng độ primer thích hợp....................................... 39
Hình 4.4: Kết quả khảo sát số chu kỳ RT-PCR thích hợp ................................. 40
Hình 4.5: Sơ đồ phản ứng RT-PCR phát hiện PMWaV-1................................. 41
Hình 4.6: Kết quả giám định PMWaV-1 trên 10 mẫu chồi dứa Thái Lan......... 47







10
Phần 1: MỞ ĐẦU

1.1

Đặt vấn đề
Cây dứa (
Ananas comosus
) là loại cây ăn quả nhiệt đới rất được ưa chuộng
trên thế giới. Ngoài giá trị dinh dưỡng và hàm lượng vitamin cao, cây dứa còn được
xem là hoàng hậu của các loại quả vì có hương vị thơm ngon và rất hợp khẩu vị của
người phương Tây. Bên cạnh đó, dứa còn được dùng làm nguyên liệu cho rất nhiều
sản phẩm chế biến: dứa hộp, dứa khoanh, nước dứa cô đặc, điều chế bromelin... nên
hiện nay, dứa đang được xem là một loại cây ăn quả có giá trị kinh tế cao. Về mặt
trồng trọt, cây dứa vốn không kén đất, các vùng gò, đồi, đất xấu, nghèo dinh
dưỡng... đều có thể trồng dứa. Vì vậy ở nước ta, từ những vùng đồi khô hạn đến các
vùng chịu nhiều thiên tai, gió bão, nắng nóng, từ vùng trung du bán sơn địa ở miền
Bắc đến những vùng đất nhiễm phèn, chua, mặn ở miền Nam đâu đâu cũng trồng
được dứa.
Chính vì vừa là một loại cây công nghiệp có giá trị cao, vừa thích hợp phát
triển qui mô ở những vùng đất xấu, kén cây trồng nên có thể nói, đối với nước ta cây
dứa chứa đựng một tiềm năng kinh tế - xã hội rất lớn. Trong các giống dứa chính,
cây dứa Cayenne mang nhiều đặc điểm phù hợp với công nghệ chế biến đồ hộp (quả
lớn, mắt cạn, cùi nhỏ) nên đang được trồng rất phổ biến trên thế giới. Hiện nay, dứa
Cayenne chiếm 80% diện tích trồng dứa trên toàn thế cầu. Ở nước ta, do trước đây
dứa Cayenne ít được trồng phổ biến nên từ năm 1998 đến nay, Chính phủ và các địa
phương đã đầu tư nhiều tỷ đồng để nhập chồi dứa Cayenne từ Trung Quốc, Thái
Lan... nhằm tăng diện tích trồng dứa, mở rộng các vùng dứa nguyên liệu cho chế
biến trong nước. Ở miền Nam, cây dứa nói chung và dứa Cayenne nói riêng đang
nằm trong chương trình cung cấp giống cây, con chất lượng cao của Sở Nông
Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn thành phố Hồ Chí Minh. Tuy nhiên, cây dứa
Cayenne có nhược điểm chính là có nhiều sâu bệnh phá hoại, đặc biệt là khả năng
nhiễm bệnh wilt - bệnh héo đỏ đầu lá rất cao.

11
Bệnh héo đỏ đầu lá là một bệnh rất nghiêm trọng và phổ biến ở các vùng
trồng dứa nói chung, đặc biệt gây hậu quả nặng nề đối với dứa Cayenne nói riêng.
Theo những nghiên cứu gần đây, bệnh do 1 loại virus thuộc họ Closterovirus được
gọi là Pineapple Mealybug Wilt associated Virus (PMWaV) gây ra. Tuy tác nhân lây
truyền của virus này là rệp sáp (mealybug) nhưng mầm bệnh vẫn có thể truyền sang
đời sau qua chồi giống. Hiện nay, các phương pháp thông thường không thể xác
định được chồi giống mang mầm bệnh mà chỉ khi trồng đến giai đoạn sắp thu hoạch,
cây mới phát bệnh, gây thiệt hại rất lớn cho người trồng. Chính vì vậy, chúng tôi tiến
hành thực hiện đề tài "Xây dựng qui trình phát hiện virus PMWaV-1 gây bệnh đỏ
đầu lá trên chồi dứa Cayenne bằng phương pháp RT-PCR" nhằm xây dựng một
phương pháp hữu hiệu để kiểm tra virus PMWaV gây bệnh héo đỏ đầu lá trên cây
dứa, đồng thời là cơ sở cho những nghiên cứu kế tiếp hướng tới mục tiêu cung cấp
chồi giống dứa sạch bệnh cho việc và phát triển các vùng dứa Cayenne.

1.2


Mục đích
Xây dựng qui trình phát hiện virus PMWaV-1 gây bệnh héo đỏ đầu lá trên
cây dứa Cayenne bằng phương pháp RT-PCR.

1.3


Yêu cầu
-

Tách chiết RNA tổng số từ mẫu dứa.

-

Khảo sát các yếu tố chu trình nhiệt, nồng độ primer, số chu kỳ thích hợp để
thiết lập quy trình RT-PCR khuếch đại đoạn gene HSP 70 của PMWaV-1
.

-

Giải trình tự đoạn khuếch đại để kiểm tra tính đặc hiệu của sản phẩm.

-

Giám định PMWaV-1 trên chồi dứa các giống Thái Lan, Trung Quốc, Lâm
Đồng




12
Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Đặc điểm chung của cây dứa
Cây dứa có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới Châu Mỹ, được tìm thấy lần đầu tiên
bởi Christopher Columbus khi ông cùng các thủy thủ đặt chân lên đảo Guadeloupe
năm 1943. Ở cuối thế kỷ 16, cây dứa được du nhập vào châu Á và đến cuối thế kỷ
17, nó đã được trồng phổ biến ở hầu hết các nước nhiệt đới trên thế giới. Ở Việt
Nam, cây dứa đã được du nhập và trồng từ hơn 130 năm trước. Dứa được trồng
nhiều ở các tỉnh phía Nam (75,43% tổng diện tích dứa cả nước), trong đó các tỉnh
Đồng Bằng Sông Cửu Long chiếm 69,36% diện tích dứa cả nước (Đường Hồng Dật,

2003)
Cây dứa có lá hình ống máng, có gai, chiều dài lá tương đối đồng đều, phân
bố đều, xòe ra tứ phía hình hoa thị. Do có nguồn gốc là cây khí sinh nên hệ rễ dứa
cắm xuống đất khá cạn và yếu. Trên thân ở nách lá có một số chồi. Chồi dứa cũng
như thân chính có nhiều rễ khí sinh sẽ bật thành rễ ngầm khi tiếp xúc với đất, do đó
người ta dùng chồi dứa để nhân giống, không dùng hạt. Quả dứa phức hợp hình chóp
cụt, giữa có lõi (thực chất là phần nối tiếp của thân chính), trên đầu quả còn có chồi
gồm nhiều lá ngắn (gọi là chồi ngọn) cũng được dùng để nhân giống.








Hình 2.1: Cây dứa

13
Dứa là cây thân thảo lâu năm. Sau khi thu hoạch trái thứ nhất, các mầm nách
ở thân tiếp tục phát triển và hình thành một cây mới giống như cây trước, cũng cho
một trái. Nhiều thế hệ sinh trưởng có thể tiếp nối nhau như vậy, nhưng trong thực tế
đối với nhiều giống dứa, thu hoạch hai hay ba lứa thường không có lợi lắm do cây
thoái hóa, trái nhỏ dần và không đồng đều.
Dứa sinh trưởng và ra hoa tốt ở 20 – 30
o
C, lượng mưa hàng năm khoảng
1000 - 2000 mm nên rất thích hợp với điều kiện khí hậu của nước ta với nhiệt độ
bình quân là 22
o

C và lượng mưa bình quân 1300 - 1500 mm/năm. Về thổ nhưỡng,
dứa thích hợp với đất đồi, đất badan, thậm chí đất xấu. Đặc biệt với đất phèn, không
thể trồng lúa, trồng hoa màu nhưng trồng dứa lại rất tốt. Dứa có khả năng chống xói
mòn, giữ màu cho đất nếu trồng với mật độ hợp lý (45.000 - 65.000 cây/ha). Cây
dứa lại bảo đảm cho thu hoạch chắc chắn vì dứa không có hiện tượng ra hoa khó,
rụng đài như nhiều loại cây ăn quả khác nên năng suất ổn định, không có hiện tượng
mất mùa.
Như vậy, ngoài vùng đồng bằng chúng ta có thể trồng dứa trên toàn bộ vùng
đất đồi có độ dốc dưới 20 độ với khoảng 8.700 ha ở miền Bắc, hơn 10.000 ha ở miền
Trung, Tây Nguyên và hàng ngàn hecta đất phèn ở Nam Bộ.

2.2 Phân loại
Dứa có tên khoa học là
Ananas comosus
thuộc:
Chi:
Ananas
Merr
Họ:
Bromeliaceae

Bộ:
Farinosae

Theo Trần Thế Tục (2001), các giống dứa đang được trồng hiện nay được
chia thành 3 nhóm chính: dứa Cayenne, dứa Queen và dứa Spanish.
*

Nhóm dứa Cayenne
Lá dài và dày, không gai hoặc có ít ở đầu chóp lá. Quả dứa Cayenne chứa

nhiều nước, vỏ mỏng nên dễ dập, cây đẻ yếu, xử lý ra hoa khó và dễ nhiễm bệnh.

14
Tuy nhiên, quả to (nặng bình quân 1,5 - 2,0 kg) có dạng hình trụ, mắt rất nông nên
rất phù hợp cho việc chế biến đồ hộp. Thịt vàng nhạt, có vị chua.
*

Nhóm dứa Queen
Lá hẹp, cứng, có nhiều gai ở mép. Quả có nhiều mắt, mắt nhỏ và lồi cứng, do
đó ít hư hỏng khi vận chuyển xa. Thịt quả vàng, ít nước và có vị thơm hấp dẫn. Cây
có hệ số nhân giống cao nhưng có khuyết điểm là quả nhỏ, dạng hơi bầu dục nên
khó xử lý trong chế biến, đóng hộp, hạn chế khả năng xuất khẩu.
*

Nhóm dứa Spanish
Lá mềm, mép lá cong, hơi ngả về phía lưng. Quả ngắn, kích thước to hơn dứa
Queen nhưng bé hơn so với nhóm dứa Cayenne. Thịt quả màu vàng trắng không
đều, mắt quả sâu, vị hơi chua. Dứa Spanish có chồi cuống nhiều làm ảnh hưởng đến
phẩm chất quả.
Cũng theo tài liệu "Kỹ thuật trồng dứa " của Trần Thế Tục và Vũ Mạnh Hải
(2001), thì ở nước ta có các giống dứa phổ biến sau:
*

Dứa Phú Thọ
Viện Cây Ăn Trái ở Phú Hộ gọi giống này là giống Queen cổ điển, vì có
những đặc tính điển hình nhất của Queen, trái nhỏ dù bón nhiều phân, nặng trung
bình 700 - 800g / trái. Mắt nhỏ, gai ở rìa lá nhỏ và cứng. Thịt vàng giòn rất thơm,
cho nên là nguyên liệu tốt để chế biến đồ hộp. Thậm chí ép các giống dứa khác
người ta cũng thường pha thêm nước dứa Hoa Phú Thọ để cho vàng hấp dẫn hơn. Có
rất nhiều chồi nách và không có chồi cuống nhưng gầy yếu, khó ra hoa vụ sau nên

vườn dứa Phú Thọ chóng bị còi, ngay vụ thứ hai năng suất đã thấp và phá đi để
trồng lại có thể kinh tế hơn. Dứa Phú Thọ chịu được đất xấu, giỏi chịu đất chua, rất
dễ ra hoa, có khi chỉ 4 - 5 tháng sau khi trồng đã ra hoa, 4 - 5 tháng sau khi ra hoa sẽ
chín. Xử lý bằng ethylen dễ đạt 100% cây ra hoa. Xử lý xong một vài giờ sau gặp
mưa vẫn ra hoa tốt. Nhược điểm lớn nhất là trái nhỏ, năng suất thấp, độ chua cao và
ít nước nên dùng để ép nước thì không có lợi. Giống dứa Hoa Phú Thọ trồng phổ
biến ở vùng trung du Bắc Bộ, và được coi là một giống quảng canh.


15
*

Dứa Na Hoa (Hoa Bali)
Giống này có đủ đặc tính của dứa hoa, tức là có mắt nhỏ lồi, khi chín da trái
màu vàng, thịt vàng. Lá ngắn và to, trái to hơn dứa Hoa Phú Thọ, nặng trung bình 1
kg/trái ở miền Bắc và 1 - 1,5 kg/trái ở miền Nam. Nước cũng nhiều hơn và khi chín
muồi thì thịt dứa hơi có mùi thối. Nhiều chồi cuống và ít chồi nách, chỉ cần tỉa chồi
một cách thích đáng vụ thứ hai vẫn cho trái to. Ở Phú Hộ người ta trồng quanh nhà
giống này, có thể dễ dàng giữ 4 - 5 năm, trong khi dứa Phú Thọ chỉ sau 2 - 3 năm thì
không cho trái nữa. Chất lượng vẫn tốt nếu thu hoạch kịp thời.
*

Dứa Ta Spanish (dứa nếp, dứa mật)
Về mặt thực vật học, lá tương đối mỏng, thân dài có khi bò ngang mặt đất, ít
chồi nách và chồi cuống. Trái ngắn, khối lượng nhỏ hơn dứa Cayenne. Chất lượng
và năng suất dứa Ta thấp. Dứa Ta sống lâu, chịu được bóng râm và có vỏ dày, dễ
dàng trong vận chuyển. Năng suất dứa Ta cao hơn dứa Hoa và thấp hơn dứa
Cayenne, về chất lượng thì thấp hơn cả hai.
*

Dứa Kiên Giang và dứa Bến Lức
Dân địa phương gọi là khóm. Một số tác giả liệt giống này vào cùng giống Na
Hoa. Trong điều kiện khí hậu ở miền Nam, cây sinh trưởng mạnh và trái cũng có
kích thước lớn hơn so với ở miền Bắc. So sánh giữa khóm Kiên Giang và khóm Bến
Lức, có thể nhận ra một số đặc điểm khác nhau như trái khóm Kiên Giang có dạng
hình trụ hơn, mắt trái lớn hơn và thịt trái nhiều hơn. Đây là những giống trồng khá
phổ biến ở vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long.
*

Dứa Cayenne
Đặc điểm chung của dứa Cayenne là lá dài không gai, dày, lòng máng sâu,
chậm ra hoa, trái to (to nhất có thể đạt 3 - 4 kg/trái). Khi chưa chín, trái màu xanh
đen, khi chín chuyển sang đỏ da hồng, khác với dứa Hoa khi chín màu vàng.




16








Hình 2.2: Dứa Cayenne

Dứa Cayenne chứa rất nhiều nước, vỏ lại mỏng nên rất dễ thối khi vận chuyển
đi xa. Tuy nhiên, nước lại có tỷ lệ đường cao, vị chua nhẹ (acid trong dứa Cayenne

thấp hơn dứa Hoa), mùi thanh, rất hợp khẩu vị người phương Tây. Mắt dứa Cayenne
lại rất cạn, gọt vỏ xong không cần lấy mắt có thể ăn ngay. Những ưu điểm trên rất
thuận lợi cho việc chế biến, đóng hộp qui mô công nghiệp nên dứa Cayenne là
nguyên liệu chính cho ngành công nghịêp chế biến - xuất khẩu dứa và hầu như toàn
bộ diện tích dứa Cayenne ở nước ta hiện nay đều là vùng nguyên liệu của các nhà
máy chế biến dứa.

2.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ dứa trên thế giới và ở Việt Nam
Theo tài liệu hội thảo của Viện Nghiên Cứu cây Ăn Quả Miền Nam, trong
những năm gần đây sản lượng dứa xuất khẩu của thế giới dao động khoảng
12,15 - 13,7 triệu tấn/năm. Châu Á có sản lượng dứa xuất khẩu lớn nhất, chiếm 52%
sản lượng dứa thế giới, tiếp theo là Châu Mỹ (31%), Châu Phi (15,4%), Châu Âu và
Châu Đại Dương chỉ chiếm 1,4%.
Các sản phẩm chế biến của dứa được lưu thông trên thế giới dưới dạng dứa
hộp và nước dứa. Dứa hộp gồm có dứa khoanh, dứa rẻ quạt, dứa miếng, dứa nghiền.
Nước dứa gồm nước dứa cô đặc và nước dứa thường. Trong đó các nước sản xuất và

17
xuất khẩu dứa nhiều nhất là Philippines, Thái Lan, Dominica, Honduras, Mexico,
Costarica, Malaysia… Còn các nước là thị trường tiêu thụ dứa chính trên thế giới
gồm: Nhật, Italia, Anh, Pháp, Đức, Hà Lan, Canada, Mỹ, Tây Ban Nha, Bỉ…
Ở Việt Nam, theo Tài liệu thống kê ngành Nông Nghiệp và Phát Triển Nông
Thôn (1996) thì diện tích trồng dứa toàn quốc đạt 36.541 ha. Trong đó, diện tích của
các tỉnh miền Bắc là 9.675 ha (chiếm 26,48%), diện tích dứa của các tỉnh miền Nam
là 26.866 ha (chiếm 73,52%), trong đó diện tích dứa của các tỉnh Đồng Bằng Sông
Cửu Long lên đến 22.787 ha, chiếm đến 62,36% diện tích dứa cả nước. Một số tỉnh
trồng nhiều dứa trong nước là: Kiên Giang: 12.006 ha, Minh Hải: 4704 ha, Tiền
Giang: 3889 ha, Thanh Hoá: 3097 ha ……
Về sản lượng dứa tươi, những năm gần đây cả nước đạt 234.000 tấn/năm
(Tài liệu thống kê ngành Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, 1996). Tốc độ

tăng sản lượng đạt khoảng 10,7% / năm. Vào những năm đầu thập niên 1990, khi thị
trường tiêu thụ chính của nước ta là Đông Âu tan rã thì ngành dứa bước vào giai
đoạn suy thoái. Tuy nhiên, bất chấp sự cạnh tranh gay gắt của những nước xuất khẩu
dứa khác, sự mở rộng thì trường xuất khẩu và tốc độ tăng trưởng sản lượng đều đặn
trong những năm gần đây là những tín hiệu đáng mừng cho thấy ngành sản xuất dứa
của Việt Nam đang phục hồi dần (Đường Hồng Dật, 2003).
Dứa tươi Việt Nam hầu hết được tiêu thụ ở thị trường nội địa còn với dứa chế
biến thì xuất khẩu là chính, thị trường nội địa chiếm tỷ trọng không đáng kể (2 -
5%). Trong những năm gần đây, các sản phẩm dứa chế biến của Việt Nam đã được
xuất khẩu đi nhiều nước với nhiều mặt hàng khá đa dạng. Theo số liệu của Tổng
Công Ty Rau Quả Việt Nam (VEGETEXCO), năm 2000, Tổng Công Ty đã xuất
khẩu được 4.967 tấn, năm 2001 đạt 5.269 tấn sản phẩm.






18
2.4 Bệnh héo đỏ đầu lá trên cây dứa
*

Tác hại
Bệnh héo đỏ đầu lá hiện diện ở hầu hết các vùng trồng dứa trên thế giới. Xuất
hiện và gây thiệt hại nặng cho dứa ở Hawaii từ năm 1900, đến nay, theo Sether D.M.
và Hu J.S. (2002), bệnh đã xuất hiện ở Mỹ, Đài Loan, Singapore, Brazil, Jamaica,
Philippines, Venezuela, Thái lan, Malaysia và cả ở Việt Nam.
Đây là bệnh rất nguy hiểm, ảnh hưởng lớn đến nghề trồng dứa khi bệnh xuất
hiện và phát triển. Không như các bệnh khác trên dứa do vi khuẩn, nấm hay tuyến
trùng đều có các loại thuốc phòng trị đặc hiệu, bệnh héo đỏ đầu lá cho đến nay vẫn

chưa có biện pháp phòng trừ triệt để ngoài việc hạn chế sự lây lan là diệt môi giới
truyền bệnh (Trần Thế Tục và Vũ Mạnh Hải, 2001).
Virus gây bệnh được bảo tồn và lan truyền sang đời sau chủ yếu qua chồi
giống và tàn dư của cây bệnh. Những chồi giống mang mầm bệnh lại thường chỉ
biểu hiện triệu chứng vào giai đoạn cây đang phân hóa mầm hoa trở đi, tức là sau
một thời gian trồng rất dài (9 - 12 tháng). Chính đặc điểm này của bệnh héo đỏ đầu
lá đã gây nên những thiệt hại kinh tế to lớn cho người trồng dứa. Năm 1920, ở
Hawaii, sản lượng dứa bị giảm thấp đáng kể do sự lan tràn mạnh mẽ của bệnh đã
làm nhiều nhà sản xuất phải bỏ nghề trồng dứa. Còn ở Cuba hiện nay, bệnh héo đỏ
đầu lá đã làm giảm 40% sản lượng dứa hằng năm (Borroto E.G. và ctv, 1998).

*

Triệu chứng
Theo Nguyễn Văn Kế (2002), cây bị héo đỏ đầu lá thì lá bị đỏ, bắt đầu từ lá
phía dưới đỏ lên, lá như bị mất nước, vặn vẹo, bìa lá cuốn về phía dưới, đầu lá cong
xuống đất, chuyển qua nâu rồi hoại dần. Rễ ở những cây bị nhiễm bệnh cũng bị hư
hoại, khi nhổ lên thì thấy phần vỏ rễ tuột ra khỏi phần lõi như một cái ống.




19

Hình 2.3: Cây dứa bị bệnh héo đỏ đầu lá

Bệnh héo đỏ đầu lá thường trải qua 4 giai đoạn phát triển: xâm nhiễm, lây lan,
gây héo lá và gây chết cây. Trong chu kì của thực vật, giai đoạn cây đang phân hóa
mầm hoa và sau đó một chút là lúc cây dễ nhiễm bệnh nhất. Hậu quả là quả bị nhỏ,
chua, khô, mắt lộ rõ, không có giá trị thương phẩm (Trần Thế Tục - Vũ Mạnh Hải,
2001)

Hình 2.4: Quả của cây dứa bị héo đỏ đầu lá


20
*

Nguyên nhân
Theo Gunashinge và German (1989), bệnh héo đỏ đầu lá do 1 loại virus được
đặt tên là Pineapple mealybug wilt associated virus (PMWaV) gây ra. Virus này
thuộc họ Closterovirus phân nhóm B và có 2 dòng gây bệnh đã được phát hiện là
PMWaV-1 và PMWaV-2 (Sether D.M. và Hu J.S., 2001)
Có 2 loại rệp sáp là môi giới trung gian truyền bệnh héo đỏ đầu lá:
Dysmicoccus brevipes
và
Dysmicoccus neobrevipes
. Theo Nguyễn Văn Kế (2002),
hai loại rệp này đã được tìm thấy ở Việt Nam, loại rệp màu xám (
Dysmicoccus
neobrevipes
) hay bám ở mắt quả, ở lá. Còn loại rệp màu hồng (
Dysmicoccus

brevipes
) thường bám vào rễ, vào các phần bên dưới của cây.













Hình 2.5: Rệp xám (
Dysmicoccus neobrevipes
), rệp hồng (
Dysmicoccus
neobrevipes
) và vị trí thường gặp của chúng trên cây dứa.
(
Nguồn
: )

21
Sether D.M. và Hu J.S., (2002) còn nghiên cứu thấy nếu không có sự hiện
diện của rệp thì dù cây có mang PMWaV cũng không xuất hiện triệu chứng bệnh.
Từ đó, các ông đặt giả thuyết rằng bệnh héo đỏ đầu lá khi phát sinh có liên quan đến
chất độc trong nước bọt của rệp - rệp sáp không chỉ là trung gian lây truyền bệnh mà

còn là nguyên nhân gây bệnh.
Bên cạnh rệp sáp, một loại côn trùng khác cũng ảnh hưởng đến sự lây lan và
phát tán của bệnh héo đỏ đầu lá là kiến. Kiến và rệp có thể sống cộng sinh với nhau.
Kiến ăn các chất mật do rệp tiết ra, đổi lại kiến làm tổ cho rệp và tha rệp đi phát tán
khắp nơi. Nhờ có các tổ do kiến tạo ra, rệp được bảo vệ khá chắc chắn trước sự ảnh
hưởng của thời tiết. Với sự cộng sinh này, kiến thúc đẩy sự phát tán rệp, từ đó làm
lây lan virus gây bệnh. Có 3 loại kiến chính trên những vùng trồng dứa sống cộng
sinh với rệp sáp:
Pheidole megacephala
(kiến đầu to), loài này chiếm ưu thế ở
những vùng có cao độ dưới 700 m;
Iridomyrmex humilis
(kiến Argentina), loài này
sống ở vùng có cao độ trên 600m và ở những vùng đất thấp, khô ráo thì
Solenopsis
germinata
(kiến lửa) là loài nổi trội nhất (Rohrbach K.G. và ctv, 1988)










Hình 2.6: Sự cộng sinh giữa kiến đầu to (
Pheidole megacephala
) và rệp sáp

(Nguồn: t-star/mealybug.htm)



Mealybug


22
* Biện pháp phòng trừ
Để phòng trừ bệnh héo đỏ đầu lá, theo Nguyễn Văn Kế (2002), cần áp dụng
các biện pháp phòng trừ tổng hợp như:
-

Chọn giống từ vùng ít bệnh.
-

Khử chồi bằng cách nhúng vào dung dịch thuốc trừ sâu như: Bi58,
Supracid trong 5 phút, dựng đứng chồi lên cho thuốc tác dụng vào tận nách lá.
-

Trước khi trồng, khử đất bằng Diazon để trừ kiến và các ổ rệp. Làm sạch
cỏ và các cây dứa của mùa trước còn sót lại để hạn chế chỗ ẩn nấp của rệp và
kiến.
-

Trong quá trình dứa phát triển cần theo dõi phun thuốc trừ rệp và kiến.
Tuy nhiên, những biện pháp này chỉ có tác dụng kiểm soát trung gian gây
bệnh, tránh bệnh lây lan, phát tán chứ không thể phòng trừ bệnh triệt để.

2.5 Một số nghiên cứu về bệnh héo đỏ đầu lá trên thế giới và ở Việt Nam

Tuy bệnh héo đỏ đầu lá đã xuất hiện từ rất lâu trên thế giới, nhưng mãi đến
gần đây, các nghiên cứu về bệnh mới đạt được những thành tựu mong muốn.
-

Năm 1989, German và Gunasinghe đã tìm thấy những thể tương tự như
Closterovirus ở những cây dứa bị héo đỏ đầu lá ở Hawaii và đặt tên là Pineapple
closterovirus (PCV).
-

Kháng thể đa dòng (Polyclonal Anti-body – PAb) sản xuất ở Hawaii
(Ullman D.E. và ctv, 1989) và Australia (Wakmen W. và ctv, 1995) được dùng để
phát hiện PCV. Tuy nhiên, PAb cũng tương tác với protein của dứa nên không đem
lại kết quả chính xác với kỹ thuật ELISA.
-

Năm 1996, Hu, Sether và Ullman đã thiết kế kháng thể đơn dòng
(Monoclonal Anti-body) cho PMWaV. Tuy nhiên, thí nghiệm thiếu độ nhạy cần
thiết nên phải dùng những mẫu rễ và lá giàu virus mới thu được kết quả.

23
-

Năm 1997, Hu và cộng sự áp dụng phương pháp TBIA vào việc test PCV
cho thấy kể cả cây có triệu chứng bệnh lẫn cây không có triệu chứng bệnh đều mang
virus.
-

Năm 1998, Hu, Sether và Ullman tìm thấy PMWaV trên rệp sáp
Dysmicoccus brevipes
và

Dysmicoccus neobrevipes
. Xác định được rệp sáp là trung
gian lây truyền PMWaV.
-

Năm 2001, Sether và cộng sự xác định được PMWaV gồm 2 dòng:
PMWaV-1 và PMWaV-2. Bộ gene của chúng đã được giải trình tự và phân loại.
Cũng trong nghiên cứu này, các mẫu dứa thu thập từ 17 nước trên thế giới đã được
test PMWaV với kỹ thuật TBIA và RT-PCR với kết quả 100% các quốc gia trong thí
nghiệm đều có dứa nhiễm PMWaV.
-

Năm 2002, Sether và Hu chứng minh cây mang PMWaV nhưng không có
rệp sáp thì không xuất hiện bệnh. Tác giả đã đề ra giả thuyết độc tố trong nước bọt
của rệp sáp cũng là một tác nhân cần thiết để gây bệnh. Tiến hành xử lý nhiệt để khử
PMWaV trên các chồi dứa mang virus.
Ở Việt Nam, nhìn chung chưa có nhiều nghiên cứu về bệnh héo đỏ đầu lá.
Các thí nghiệm chỉ dừng lại ở bước xác định mối liên quan giữa mật độ rệp với mức
độ bệnh trên dứa và thống kê tình hình phân bố bệnh ở một số địa phương.
-

Theo nghiên cứu của Phan Gia Tân (1984), trên giống dứa Queen, nếu chỉ
có 6% số cây có rệp và mỗi cây có 1 – 10 con rệp thì cây chưa bị nhiễm bệnh hoặc
nhiễm rất nhẹ. Với 90 – 92% cây có rệp và lượng rệp lẫn ấu trùng trên mỗi cây là
51 – 200 con thì cây bị nhiễm bệnh ở mức độ trung bình. Với 92% cây có rệp và mật
độ ấu trùng trên 300 con/cây thì cây bị nhiễm bệnh nặng.
-

Một số thống kê về tình hình bệnh đỏ đầu lá của trường Đại học Nông
Lâm TP.HCM cho thấy bệnh héo đỏ đầu lá xuất hiện ở các vùng được nghiên cứu

với tỷ lệ bệnh cao: ở Bến Lức – Long An, Tân Phước – Tiền Giang và Đức Trọng –
Lâm Đồng, tỷ lệ bệnh lần lượt là 9.3%, 8.1% và 4.1%. Còn tỷ lệ bệnh ở các nông
trường: nông trường Phạm Văn Hai, nông trường Lê Minh Xuân – Tp.HCM và nông
trường Thọ Vực – Đồng Nai lần lượt là 6%, 7% và 12.1% (Phạm Văn Khánh, 2003,
Võ Thị Thúy Huệ, 2003, và Võ Thị Mỹ Hân, 2004).

24
Như vậy, hiện nay bệnh héo đỏ đầu lá đã xuất hiện ở nước ta với mật độ rộng
và tỷ lệ cao, khi gặp điều kiện có thể lây lan thành dịch, gây thiệt hại lớn cho người
trồng. Bên cạnh đó chúng ta vẫn chưa có biện pháp phòng trừ bệnh hữu hiệu mà chỉ
có thể hạn chế bệnh bằng cách khống chế những nguồn trung gian gây bệnh. Tuy
nhiên với những vùng chuyên canh quy mô lớn hàng trăm, hàng ngàn hecta thì các
phương pháp như: trồng giãn cách xa giữa các luống, dùng thuốc trừ rệp, kiến không
có tính khả thi cao. Vì vậy với những dự án đầu tư lớn cho cây dứa hiện nay
(chương trình 3 cây, 3 con của thành phố Hồ Chí Minh) thì rất cần phải xây dựng
một quy trình phòng trừ bệnh thật sự hiệu quả.
Từ thành quả của những nghiên cứu đã được thực hiện trên thế giới, ta có thể
đề ra một mô hình phòng trừ bệnh héo đỏ đầu lá như sau:
1.

Xử lý nhiệt chồi dứa để khử PMWaV.
2.

Test các chồi đã xử lý nhiệt để xác định những mẫu sạch PMWaV.
3.

Nhân nhanh các mẫu sạch virus bằng phương pháp nuôi cấy mô để tạo
nguồn chồi giống sạch bệnh, cung cấp cho người trồng.
Với mô hình trên, các chồi giống sạch virus khi trồng sẽ không phát bệnh dù
có xuất hiện rệp sáp. Vậy nếu xử lý nhiệt tốt và có một phương pháp phát hiện

PMWaV thật chính xác thì ta sẽ phòng chống được bệnh héo đỏ đầu lá thật sự hữu
hiệu, nâng cao năng suất của cây dứa, đem lại hiệu quả kinh tế cao cho xã hội

2.6 Các phương pháp chẩn đoán PMWaV
Từ các nghiên cứu về bệnh héo đỏ đầu lá đã thực hiện trên thế giới cho thấy,
hiện nay có 3 phương pháp chính để chẩn đoán PMWaV-1 trên cây dứa.
-

Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay): năm
1978, Clark và Adam đã lần đầu tiên áp dụng thành công phương pháp này để chẩn
đoán bệnh virus hại khoai tây. Phương pháp này hoạt động dựa trên nguyên tắc
kháng nguyên – kháng thể. Hiện nay đây là phương pháp huyết thanh hiện đại và
nhanh chóng để chẩn đoán các bệnh virus.


25
-

Phương pháp TBIA (Tissue Bloting Immuno Assay): phương pháp này
được Lin và ctv sử dụng lần đầu tiên năm 1990 cũng hoạt động dựa trên nguyên tắc
kháng nguyên – kháng thể. Phương pháp này có nhiều ưu điểm hơn ELISA vì nó
không đòi hỏi phải chuẩn bị mẫu tỷ mỉ và có thể cung cấp thông tin về sự phân bố
virus trong mẫu bệnh.
-

Phương pháp RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain
Reaction): là phương pháp nhân nhanh mRNA, gồm 2 bước: mRNA của virus được
phiên mã ngược thành cDNA, sau đó cDNA này sẽ được khuếch đại. Kỹ thuật cho
phép phát hiện và phân biệt được nhiều dòng virus gần giống nhau.
Các phương pháp trên đều có những ưu điểm riêng. Với ELISA, TBIA tuy giá

thành cao, nhưng có thể thực hiện rất dễ dàng, nhanh chóng, rất thích hợp cho việc
test cây đang trồng trên đồng ruộng với qui mô lớn. TBIA còn có thể cung cấp thông
tin về sự phân bố của virus trong mẫu bệnh nên có thể ứng dụng tốt vào những
nghiên cứu về đặc điểm của bệnh. Còn với phương pháp RT-PCR, tuy cần nhiều
thời gian thực hiện nhưng giá thành thấp và chính xác hơn 2 phương pháp trên.
RT-PCR đòi hỏi lượng mẫu bệnh cần thiết cho phản ứng ít hơn ELISA rất nhiều,
nhưng lại có thể phát hiện được những mẫu có lượng virus ban đầu rất thấp. Như
vậy, với mô hình cung cấp giống sạch bệnh tập trung mà đề tài hướng tới, một mô
hình đòi hỏi một phương pháp chẩn đoán PMWaV-1 thật chính xác thì phương pháp
RT-PCR là phương pháp phù hợp nhất.

2.7 Gene HSP 70 của PMWaV
Heat shock protein 70 kD (HSP 70) là một nhóm protein đặc biệt của sinh vật.
Chức năng ban đầu của chúng là giúp tái đóng xoắn các protein bị biến tính vì nhiệt,
giúp sinh vật có thể tồn tại được ở những điều kiện khắc nghiệt bất thường. Cũng
chính vì thế mà chúng được đặt tên là heat shock protein. Ngoài ra, chúng còn có
một số chức năng khác như giúp các protein mới được tạo ra hình thành các cấu trúc
bậc cao, vận chuyển protein xuyên qua các màng tế bào và riêng ở Closterovirus,
HSP 70 là một thành phần của protein vỏ trong quá trình tạo virion của virus. (Dolja
V.V. và ctv, 1999)