Phương pháp xác định trình tự của acid nucleic

CÁC PHƯƠNG PHÁP
CÁC PHƯƠNG PHÁP
XÁC
XÁC
ĐỊNH TRÌNH TỰ
ĐỊNH TRÌNH TỰ
CỦA acid nucleic
CỦA acid nucleic
Các phương pháp phân tích acid nucleic đã đề cập trong
Các phương pháp phân tích acid nucleic đã đề cập trong
các chương vừa qua cung cấp nhiều thông tin về acid nucleic
các chương vừa qua cung cấp nhiều thông tin về acid nucleic
nghiên cứu nhưng chưa cho phép kết luận về bản chất của
nghiên cứu nhưng chưa cho phép kết luận về bản chất của
nó, cụ thể là acid nucleic ấy tương ứng với gen gì, có chức
nó, cụ thể là acid nucleic ấy tương ứng với gen gì, có chức
năng điều hòa hay mã hóa cho protein nào. Thông tin này chỉ
năng điều hòa hay mã hóa cho protein nào. Thông tin này chỉ
có thể rút ra được từ việc xác định trình tự nucleotide của acid
có thể rút ra được từ việc xác định trình tự nucleotide của acid
nucleic.
nucleic.
Hai phương pháp xác định trình tự chính là phương
Hai phương pháp xác định trình tự chính là phương
pháp hóa học của Macxam và Gilbert (1977) và phương pháp
pháp hóa học của Macxam và Gilbert (1977) và phương pháp
enzyme học của Sanger và cộng sự (1977). Dù rất khác nhâu

enzyme học của Sanger và cộng sự (1977). Dù rất khác nhâu
về nguyên tắc hai phương pháp này đều có một số điểm
về nguyên tắc hai phương pháp này đều có một số điểm
chung : hình thành một tập hợp nhiều oligonucleotide có chiều
chung : hình thành một tập hợp nhiều oligonucleotide có chiều
dài khác nhau, mỗi olygonucleotide có sác xuất xuất hiện
dài khác nhau, mỗi olygonucleotide có sác xuất xuất hiện
bằng nhau trong phản ứng. Các trình tự này sau đó được
bằng nhau trong phản ứng. Các trình tự này sau đó được
phân tách dựa vào kích thước bằng phương pháp điện di trên
phân tách dựa vào kích thước bằng phương pháp điện di trên
gel polyacrylamide có khả năng phân tách hai trình tự chỉ
gel polyacrylamide có khả năng phân tách hai trình tự chỉ
cách nhau một nucleotide. Kết quả đọc được trên bản phóng
cách nhau một nucleotide. Kết quả đọc được trên bản phóng
xạ tự ghi hoặc nhờ một máy dò tự động.
xạ tự ghi hoặc nhờ một máy dò tự động.

I-Nguyên tắc hóa học : Phương pháp Macxam và Gilbert.
Phương pháp này dựa vào sự thủy giải đặc trưng phân tử ADN
cần xác định trình tự bằng phương pháp hóa học.
Trước hết phân tử ADN được đánh dấu bằng
32
P ở một đầu. Sau
đó, chúng được chia thành 5 phân đoạn, mỗi phân đoạn chịu một xử lý
hóa học chuyên biệt có khả năng làm biến đổi đặc trưng một loại
nucleotide và sau đó cắt phân tử AND ngay tại nnucleotide ấy. Năm
nhóm nucleotide bị tạc động là : G, A, C , G + A , T + C. Kết quả của sự
xử lý hóa học lả sự hình thành nên năm tập hợp olygonucleotide, các
olygonucleotide trong một tập hợp có kích thước khác nhau nhưng lại

cung chấm dứt tại cùng một loại nucleotide. Cuối cùng năm phân đoạn
trên được đen đi phân tách trên gel polyacrylamide. Vị trí của các
oligonucleotide trên gel tương ứng với kích thước của chúng và được
phát hiện nhờ đầu đánh phóng xạ. Kết quả được đọc trên bảng phóng
xạ tự ghi



II-Phương pháp enzyme học thông qua việc sử dụng các
dideoxynucleotide của Sanger
Phương pháp này dựa vào sự tổng hợp nhờ enzyme ADNpolymerase
mạch bổ xung cho trình tự ADN mạch đơn cần xác định. Đặc trương của
phương pháp là ngoài bốn loại nucleotide thông thường còn sử dụng thêm bốn
loại dideoxynucleotide là những loại deoxynucleotide trong đó nhóm 3′OH
được thay bằng H. Điều này khiến các didoxynucleotide không còn khả năng
hình thành các nối phosphatdiester và do đó sẽ làm ngừng quá trình tổng hợp.
Trình tự ADN cần được xác dịnh phải được tạo dòng trong một vecter
mạch đơn (phage M 13). ADN polymerase sử dụng có thể là đoạn Klenow của
ADN polymerase I, Taq polymerase hay Sequanase. Sự tổng hợp mạch mới
bắt đầu từ một mồi bắt cặp với một trình tự chuyên biệt trên phage M 13, với
sự hiện diện của bốn loại nucleotide trong đó một loại được đánh dấu đồng vị
phóng xạ (35S). Phản ứng tổng hợp được tiến hành trong bốn phân đoạn
riêng. Người ta lần lượt cho vào mỗi phân doạn một trong bốn loại
dideoxynucleotide với hàn lượng rất nhỏ. Do hàm lượng thấp nên thỉnh thoảng
mới có một dideoxynucleotide được sử dụng vào phản ứng tổng hợp một
oligonucleotide; và lập tức sự tổng hợp oligonucleotide đó ngùng lại. Tính xác
suất thì trong mỗi phân đoạn sẽ có mặt tất cả các cỡ oligonucleotide ứng với
tất cả các nucleotide cùng loại hiện diện trên ADN. VD : nếu trình tự DNA cần
xác định là AATCGATAGGCTTGCATG thì trong phân đoạn có mặt
dideoxynucleotide ddC sẽ có sự tổng hợp các oligonucleotide sau:

AATC
AATCGATGGC
AATCGATGGCTTGC
Sau đó, bốn phản ứng tổng hợp sẽ được đem phân tách trên gel
polyacrylmide và kết quả dược đọc trên bản phóng xạ tự ghi.

III-Các phương pháp cải biên từ phương
pháp của Sanger
Trong thực nghiệm, việc sử dụng phương
pháp chính thống nêu trên đòi hỏi thao tác phức
tạo vì phải tạo dòng trở lại đoạn DNA cần xác định
trình tự vào một vecter mạch đơn (phage 13). Do
đó, để đơn giản hóa, ngay từ đầu người ta tạo
dòng với vecter là các plasmid thế hệ thứ ba. Ở
hai bên của đoạn DNA được tạo dòng, các
plasmid này có mang hai trình tự chuyên biệt, mỗi
trình tự nằm trên một mặt. khi cần xác định trình tự
của mạch nào, trước hết người ta tách rời hai
mạch (biến tính bằng NaOH) rồi sử dụng mồi bắt
cặp với trình tự chuyên biệt nằm trên mạch đó.
Phản ứng tổng hợp xảy ra thoe nguyên tắc đã nêu
ở phần trên.

1-Xác định trình tự bằng máy tự động
Trong kỹ thuật này, người ta không đánh dấu
bằng đồng vị phóng xạ mà bằng hóa chất –các
fluochrome. Mỗi loại dideoxynucleotide được đánh
dấu bằng một fluochrome có màu khác nhau. Như
vậy, tất cả các oligonucleotide cùng chấm dứt tại
một loại dideoxynucleotide sẽ có cùng một màu.

Sau khi điện di trên gel polyacryl amide, kết quả sẽ
được đọc qua một hệ thống vi tính.
Tất cả các phương pháp vừa kể đều dùng để
xác định trình tự của một DNA đã được tạo dòng.
Sự ra đời của phương pháp PCR cho phép xác
định trực tiếp trình tự của một DNA khuyếch đại
bằng PCR không qua tạo dòng.