luận án tiến sĩ nghiên cứu cải thiện khả năng mang thuốc chống ung thư cisplatin của chất mang nano dendrimer

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ

CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

NGUYỄN NGỌC HÒA

NGHIÊN CỨU CẢI THIỆN KHẢ NĂNG MANG

THUỐC CHỐNG UNG THƯ CISPLATIN CỦA
CHẤT MANG NANO DENDRIMER

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU

TP. HỒ CHÍ MINH – 2020


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ

CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

NGUYỄN NGỌC HÒA

NGHIÊN CỨU CẢI THIỆN KHẢ NĂNG MANG

THUỐC CHỐNG UNG THƯ CISPLATIN CỦA CHẤT
MANG NANO DENDRIMER
Chuyên ngành: Vật liệu cao phân tử và tổ hợp
Mã số: 9 44 01 25

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1.

GS. TS. NGUYỄN CỬU KHOA

2.

PGS. TS. TRẦN NGỌC QUYỂN

TP. HỒ CHÍ MINH – 2020


LỜI CAM ĐOAN

Cơng trình được thực hiện tại phịng Vật liệu Hóa dược - Viện Khoa học
Vật liệu ứng dụng - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam tại Thành
phố Hồ Chí Minh và phịng thí nghiệm Trung tâm Công nghệ Việt Đức - trường
Đại học Công nghiệp Thực phẩm Thành phố Hồ Chí Minh. Tơi xin cam đoan đây
là cơng trình nghiên cứu của tơi và được sự hướng dẫn khoa học của GS. TS.
Nguyễn Cửu Khoa và PGS. TS. Trần Ngọc Quyển. Các nội dung nghiên cứu, kết
quả trong đề tài này là trung thực, được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên
cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận
văn cùng cấp nào khác.
Tác giả luận án

Nguyễn Ngọc Hòa


LỜI CÁM ƠN

Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Nguyễn Cửu Khoa và PGS.
TS. Trần Ngọc Quyển, đã dành cho tôi sự động viên giúp đỡ tận tình và những
định hướng khoa học hiệu quả trong suốt q trình thực hiện luận án này.
Tơi xin cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi của Học viện Khoa
học và Công nghệ, Khoa Khoa học vật liệu và Năng lượng, Viện Khoa học Vật
liệu Ứng dụng đối với tơi trong q trình thực hiện luận án.
Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi của trường Đại học
Công Nghiệp Thực phẩm TP. Hồ Chí Minh đối với tơi trong q trình thực hiện
luận án.
Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ tận tình của bạn bè, sự động viên, tạo điều kiện
của những người thân trong gia đình trong suốt quá trình tơi hồn thành luận án
này.


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU............................................................................................................................................ 1
Mục tiêu của luận án...................................................................................................................... 2
Ý nghĩa khoa học của luận án..................................................................................................... 3
Đóng góp mới của luận án........................................................................................................... 4
Chương 1. TỔNG QUAN............................................................................................................ 6
1.1. Giới thiệu dendrimer............................................................................................................. 6
1.1.1. Khái niệm và phân loại..................................................................................................... 6
1.1.2. Tính tương hợp sinh học của dendrimer.................................................................. 10
1.1.2.1. Độc tính tế bào in vitro của dendrimer................................................................. 11

1.1.2.2. Độc tính tế bào in vivo của dendrimer.................................................................. 12
1.1.3. Phương pháp tổng hợp dendrimer.............................................................................. 12
1.1.3.1. Các phương pháp tổng hợp....................................................................................... 13
1.1.3.2. Tổng hợp dendrimer polyamidoamine................................................................. 14
1.1.4. Các phương pháp xác định tính chất của dendrimer........................................... 17
1.1.5. Ứng dụng của dendrimer trong trị liệu..................................................................... 18
1.1.5.1. Hoạt tính trị liệu của dendrimer.............................................................................. 18
1.1.5.2. Cải thiện độ hòa tan của thuốc................................................................................. 19
1.1.5.3. Dendrimer dùng vận chuyển thuốc qua da......................................................... 20
1.1.5.4. Dendrimer dùng vận chuyển thuốc uống............................................................. 20
1.1.5.6. Dendrimer vận chuyển gen....................................................................................... 21
1.1.5.7. Dendrimer vận chuyển vaccine............................................................................... 22
1.2. Thuốc chống ung thư chứa Platin.................................................................................. 22
1.2.1. Cisplatin............................................................................................................................... 22


1.2.1.1. Tính chất của Cisplatin............................................................................................... 22
1.2.1.2. Cơ chế tác động của Cisplatin đối với tế bào..................................................... 24
1.2.1.3. Cơ chế kháng thuốc Cisplatin.................................................................................. 27
1.2.1.4. Độc tính của Cisplatin................................................................................................ 28
1.2.2. Sử dụng Cisplatin để điều trị ung thư....................................................................... 29
1.2.3. Các thuốc chống ung thư khác có chứa Platin...................................................... 31
1.2.4. Điều trị kết hợp Cisplatin với các thuốc ung thư khác....................................... 32
1.2.5. Các hệ chất mang thuốc Cisplatin.............................................................................. 33
1.2.5.1. Liposome mang thuốc Cisplatin............................................................................. 35
1.2.5.2. Viên nang nano chứa phức Cisplatin phủ lipid................................................. 36
1.2.5.3. Các polymer mang các thuốc chứa platin............................................................ 37
1.2.5.4. Ống nano carbon mang thuốc Cisplatin............................................................... 38
1.2.5.5. Polymer mixen mang thuốc platin......................................................................... 39
1.2.5.6. Hệ chất mang dendrimer - platin............................................................................ 41

1.3. Polymer nhạy nhiệt - poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM)........................45
1.4. Polymer nhạy pH - Poly Acrylic Acid (PAA)........................................................... 46
Chương 2. NGHIÊN CỨU........................................................................................................ 48
2.1. Nội dung và phương pháp nghiên cứu......................................................................... 48
2.1.1. Nội dung nghiên cứu....................................................................................................... 48
2.1.2. Phương pháp nghiên cứu............................................................................................... 48
2.2. Thực nghiệm.......................................................................................................................... 50
2.2.1. Hóa chất............................................................................................................................... 50
2.2.2. Dụng cụ và thiết bị........................................................................................................... 51
2.3. Phương pháp thực nghiệm................................................................................................ 53


2.3.1. Tổng hợp PAMAM dendrimer đến thế hệ G4.5 từ tâm ethylenediamine
(EDA)................................................................................................................................................ 53
2.3.2. Tổng hợp phức PAMAM dendrimer G3.0, G4.0 với Cisplatin.......................56
2.3.3. Tổng hợp phức PAMAM dendrimer G2.5, G3,5, G 4.5 với Cisplatin.........57
2.3.4. Tổng hợp phức PAMAM dendrimer G2.5, G3,5, G 4.5-Cisplatin SA (có sử
dụng siêu âm)................................................................................................................................. 58
2.3.5. Tổng hợp PAMAM dendrimer G 3.0 biến tính với PNIPAM.......................... 59
2.3.6. Tổng hợp PAMAM dendrimer G 3.5 biến tính với PNIPAM..........................60
2.3.7. Tổng hợp phức PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM với Cisplatin...............61
2.3.8. Tổng hợp PAMAM dendrimer G3.0 biến tính với PAA.................................... 63
2.3.9. Tổng hợp PAMAM dendrimer G4.0 biến tính với PAA.................................... 64
2.3.10. Tổng hợp phức PAMAM dendrimer G3.0-PAA, PAMAM dendrimer G4.0-

PAA với Cisplatin......................................................................................................................... 64
2.3.11. Thử nghiệm khả năng mang thuốc 5-FU của phức PAMAM dendrimer
G3.5-PNIPAM-Cisplatin............................................................................................................ 65
2.3.12. Xác định hàm lượng Pt bằng phương pháp ICP-MS........................................ 66
2.3.13. Khảo sát giải phóng thuốc in vitro.......................................................................... 67

2.3.14. Nang hóa và giải phóng thuốc 5-FU....................................................................... 67
2.3.15. Động học và dược động học giải phóng thuốc................................................... 68
2.3.16. Kiểm tra độc tố tế bào.................................................................................................. 70
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN.............................................................................. 72
3.1. Tổng hợp PAMAM Dendrimer các thế hệ G-0.5 đến G4.5................................. 72
3.1.1. Xác định cấu trúc các dendrimer PAMAM dựa vào phổ khối lượng MS . 72

3.1.2. Xác định cấu trúc các dendrimer PAMAM dựa vào phổ 1H-NMR...............73
3.2. Phổ FTIR các sản phẩm phức của PAMAM dendrimer với Cisplatin.............80


3.2.1. Phổ FTIR PAMAM Dendrimer G2.5, G3.5, G4.5 và phức G2.5-CisPt, G3.5-

CisPt, G4.5-CisPt.......................................................................................................................... 80
3.2.2. Phổ FTIR của phức PAMAM Dendrimer G3.0-Cisplatin, G4.0-Cisplatin 83

3.3. Phổ FTIR của phức G3.0-PAA với Cisplatin............................................................ 85
3.4. Phổ FTIR của phức G4.0-PAA-Cisplatin.................................................................... 86
3.5. Kết quả phổ 1H-NMR PAMAM G3.0 và G 3.5 biến tính với PNIPAM.........87
3.6. Kết quả 1H-NMR PAMAM G3.0 biến tính với PAA............................................. 90
3.7. Kết quả 1H-NMR PAMAM G4.0 biến tính với PAA............................................. 91
3.8. Kết quả đo hàm lượng Pt................................................................................................... 92
3.8.1. Kết quả đo hàm lượng Pt của phức PAMAM dendrimer thế hệ chẵnCisplatin............................................................................................................................................ 93
3.8.2. Kết quả đo hàm lượng Pt của phức PAMAM dendrimer thế hệ lẻ– Cisplatin

(không thủy phân)......................................................................................................................... 93
3.8.3. Kết quả đo hàm lượng Pt của phức PAMAM thế hệ lẻ– Cisplatin (thủy phân)

94
3.8.4. Kết quả đo hàm lượng Pt của các phức G3.0-PAA-Cisplatin và G4.0-PAACisplatin (thủy phân) có sử dụng siêu âm........................................................................... 96

3.9. So sánh khả năng mang thuốc Cisplatin của các hệ chất mang trong điều kiện
không thủy phân và có thủy phân Cisplatin........................................................................ 96
3.10. Thử nghiệm khả năng mang đồng thời hai thuốc 5-FU và Cisplatin của hệ
chất mang PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM................................................................ 98
3.11. Kết quả đo TEM, DLS và thế zeta............................................................................ 100
3.12. Kết quả và bàn luận khả năng giải phóng thuốc in vitro.................................. 106
3.12.1. Khả năng giải phóng thuốc của phức PAMAM thế hệ lẻ - Cisplatin (thủy
phân)................................................................................................................................................ 106
3.12.2. Khả năng giải phóng thuốc 5-FU và Cisplatin của hệ chất mang hai thuốc
G3.5-PNIPAM-Cispaltin – 5FU............................................................................................ 109


3.12.3. Khả năng giải phóng thuốc Cisplatin của hệ chất mang PAMAM dendrimer

G4.0-PAA...................................................................................................................................... 111
3.13. Động học q trình giải phóng thuốc Cisplatin................................................... 112
3.14. Dự đốn mơ hình dược động học của các hệ mang thuốc............................... 115
3.15. Kết quả và bàn luận khả năng gây độc tế bào...................................................... 117
3.15.1. Kết quả và bàn luận khả năng gây độc tế bào ung thư phổi NCI-H460 của
hệ chất mang PAMAM G4.5.................................................................................................. 117
3.15.2. Kết quả và bàn luận khả năng gây độc tế bào của hệ chất mang G4.0-PAA

117
3.15.3. Kết quả và bàn luận khả năng gây độc tế bào của hệ chất mang PAMAM
dendrimer G3.5-PNIPAM mang hai thuốc cispaltin và 5-FU................................... 122
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................................... 124
KẾT LUẬN................................................................................................................................... 124
KIẾN NGHỊ.................................................................................................................................. 126
TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1. Độc tính gây ra do điện tích bề mặt dendrimer [6]...................................... 12
Bảng 1.2. Điều trị phối hợp Cisplatin và các loại thuốc ung thư khác [35]...........33
Bảng 1.3. Các hệ chất mang liposome – platin [60]........................................................ 35
Bảng 2.1. Các hóa chất tinh khiết dùng trong nghiên cứu thực nghiệm..................51
Bảng 3.1. Khối lượng phân tử các dendrimer PAMAM dựa vào phổ MS..............73
Bảng 3.2. Kết quả tính toán KLPT Dendrimer theo 1H-NMR.................................... 80
Bảng 3.3. Phổ FTIR PAMAM Dendrimer G2.5, G3.5, G4.5 và phức G2.5-CisPt,
G3.5-CisPt, G4.5-CisPt.............................................................................................................. 82
Bảng 3.4. Kết quả phổ FTIR của PAMAM dendrimer G3.0, G4.0 và phức G3.0Cisplatin, G4.0-Cisplatin........................................................................................................... 83
Bảng 3.5. Phổ FTIR của G3.0-PAA và phức G3.0-PAA-Cisplatin............................ 85
Bảng 3.6. Phổ FTIR của G4.0-PAA và phức G4.0-PAA-Cisplatin............................ 86
Bảng 3.7. Số nhóm PNIPAM gắn vào G3.0 và ước lượng KLPT.............................. 89
Bảng 3.8. Hàm lượng Pt phức PAMAM thế hệ chẵn - Cisplatin (không thủy phân)

93
Bảng 3.9. Hàm lượng Pt phức PAMAM thế hệ lẻ - Cisplatin (không thủy phân)
93
Bảng 3.10. Hàm lượng Pt trong phức G2.5-Cisplatin, G3.5-Cisplatin và G4.5Cisplatin............................................................................................................................................ 94
Bảng 3.11. Hàm lượng Pt trong phức G3.0-PAA-Cisplatin (thủy phân) và G4.0PAA-Cisplatin (thủy phân)........................................................................................................ 96
Bảng 3.12. Khả năng mang thuốc Cisplatin (không thủy phân) của các hệ chất
mang PAMAM dendrimer......................................................................................................... 97
Bảng 3.13. Khả năng mang thuốc Cisplatin (thủy phân) của các hệ chất mang
PAMAM dendrimer..................................................................................................................... 98
Bảng 3.14. Kết quả nang hóa 5-FU vào phức G3.5-PNIPAM-Cisplatin.................99


Bảng 3.15. Kết quả giải phóng thuốc in vitro của các phức PAMAM dendrimer:
G2.5-Cisplatin, G3.5-Cisplatin và G4.5 - Cisplatin...................................................... 107

Bảng 3.16. Khảo sát khả năng giải phóng thuốc 5FU của hệ chất mang G3.5PNIPAM-CisPt và PNIPAM-CisPt...................................................................................... 110
Bảng 3.17. Kết quả giải phóng thuốc Cisplatin của hệ chất mang PAMAM
dendrimer G4.0-PAA................................................................................................................ 111
Bảng 3.18. Giá trị AIC và R

2

hc

theo từng mơ hình động học của các hệ mang thuốc

Cisplatin tại pH 5,5 và pH 7,4............................................................................................... 113
Bảng 3.19. Các thông số dược động học của các hệ mang thuốc Cisplatin.........116
Bảng 3.20. Độc tính tế bào in vitro của Carboxylate PAMAM dendrimer G4.5,
Cisplatin và phức chất PAMAM G4.5-Cisplatin............................................................ 117
Bảng 3.21. Độc tính tế bào in vitro của PAMAM G4.0-PAA, Cisplatin và phức
chất PAMAM G4.0-PAA-Cisplatin..................................................................................... 118
Bảng 3.22. Tỷ lệ (%) gây độc tế bào ung thư vú MCF-7 của các mẫu..................122
Bảng 3.23. Độc tính tế bào in vitro của PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM, 5-FU

và PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-CisPt-5FU....................................................... 123


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu tạo phân tử Dendrimer...................................................................................... 6
Hình 1.2. Cấu trúc phân tử của Random Hyperbranched, dendrigraft, dendron và
dendrimer............................................................................................................................................ 7
Hình 1.4. Dendrimer cầu nối N và dendrimer cầu nối aryl............................................. 8
Hình 1.5. Dendrimer với tâm NH3 (a) và tâm BDA (b).................................................... 9
Hình 1.6. Tổng hợp divergent theo mơ hình tạo nhánh 1→2......................................... 9

Hình 1.7. Tổng hợp divergent theo mơ hình tạo nhánh 1→3...................................... 10
Hình 1.8. Tương tác sinh học giữa tế bào với dendrimer có điện tích bề mặt khác
nhau [9]............................................................................................................................................. 10
Hình 1.9. Sơ đồ tổng hợp dendrimer theo phương pháp divergent............................13
Hình 1.10. Tổng hợp dendrimer bằng phương pháp covergent................................... 14
Hình 1.11. Tổng hợp dendrimer bằng phương pháp tăng lũy thừa hai.....................14
Hình 1.12. Cơng thức phân tử của G3.0 PAMAM dendrimer..................................... 15
Hình 1.13. Phản ứng tổng hợp dendrimer PAMAM G -0.5.......................................... 16
Hình 1.14. Phản ứng tổng hợp dendrimer PAMAM G 0............................................... 16
Hình 1.15. PAMAM dendrimer G 1.0.................................................................................. 16
Hình 1.16. PAMAM dendrimer G 2.0.................................................................................. 17
Hình 1.17. Các phương pháp xác định tính chất của dendrimer................................. 18
Hình 1.18. Cấu trúc của dendrimer SPL7013 (MW 16.581 Da).............................. 19
Hình 1.19. Dendrimer vận chyển DNA tới màng tế bào................................................ 21
Hình 1.20. Cấu tạo của Cisplatin............................................................................................ 22
Hình 1.21. Một số loại thuốc chống ung thư Platin đã được chấp thuận đưa vào sử

dụng.................................................................................................................................................... 24
Hình 1.22. Quá trình hình thành và tác động của phức Pt-DNA đối với tế bào .. 25


Hình 1.23. Sơ đồ tạo phức và tác động của phức Pt-DNA đối với tế bào...............26
Hình 1.24. A-Cisplatin; B-Carboplatin; C-Oxaliplatin; D-Ormaplatin;...................31
E-Enloplatin.................................................................................................................................... 31
Hình 1.25. Các hệ chất mang khác nhau hiện đang được phát triển tiền lâm sàng
và lâm sàng...................................................................................................................................... 34
Hình 1.26. Các hệ liên hợp thuốc polymer - platin.......................................................... 38
Hình 1.27. Hệ chất mang polymer mixen mang thuốc platin...................................... 39
Hình 1.28. Sơ đồ tổng hợp phức PAMAM dendrimer thế hệ chẵn – Pt2+...............43
Hình 1.29. Sơ đồ phản ứng tổng hợp phức PAMAM G 3.5-Cisplatin...................... 43

Hình 1.30. Cơng thức cấu tạo của PNIPAM-COOH....................................................... 45
Hình 1.31. Các polymer nhạy pH có chứa các nhóm acid............................................ 47
Hình 2.1 Sơ đồ tổng hợp PAMAM dendrimer................................................................... 53
Hình 2.2. Sơ đồ qui trình tổng hợp các PAMAM dendrimer thế hệ lẻ..................... 54
Hình 2.3. Sơ qui trình tổng hợp các PAMAM dendrimer thế hệ chẵn..................... 56
Hình 2.4. Sơ đồ tổng hợp phức PAMAM G3.0-Cisplatin và PAMAM G4.0Cisplatin............................................................................................................................................ 57
Hình 2.5. Sơ đồ qui trình tổng hợp phức PAMAM dendrimer G2.5, G3.5, G4.5Cisplatin có và khơng sử dụng siêu âm................................................................................ 59
Hình 2.6. Sơ đồ quy trình tổng hợp G3.0-PNIPAM........................................................ 60
Hình 2.7. Sơ đồ quy trình tổng hợp PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM...............61
Hình 2.8. Sơ đồ quy trình tổng hợp phức PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAMCisPt................................................................................................................................................... 62
Hình 2.9. Sơ đồ qui trình tổng hợp PAMAM dendrimer G3.0-PAA và G4.0-PAA
63
Hình 2.10. Sơ đồ qui trình tổng hợp phức PAMAM dendrimer G3.0-PAACisplatin và PAMAM dendrimer G4.0-PAA-Cisplatin.................................................. 65


Hình 3.1. Cấu trúc PAMAM Dendrimer các thế hệ .............................................
Hình 3.2. Phổ 1H-NMR của PAMAM Dendrimer các thế hệ từ G-0.5 đến G4.5
79 Hình 3.3. Phổ FTIR của PAMAM dendrimer G2.5, G3.5, G4.5 và phức G2.5Cisplatin, G3.5-Cisplatin, G4.5-Cisplatin ............................................................
Hình 3.4. Phổ FTIR của PAMAM dendrimer G3.0, G4.0 và phức G3.0-Cisplatin,
G4.0-Cisplatin ......................................................................................................
Hình 3.5. Phổ FTIR của G3.0-PAA và phức G3.0-PAA-Cisplatin .....................
Hình 3.6. Phổ FTIR của G4.0-PAA và phức G4.0-PAA-Cisplatin .....................
Hình 3.7. Phổ 1H-NMR của chất mang nano G3.0-PNIPAM (tỉ lệ mol 1:8) ......
Hình 3.8. Kết quả GPC của G3.0-PINIPAM (1:8) ..............................................
Hình 3.9. Phổ 1H-NMR của G3.5-PNIPAM ........................................................
Hình 3.10. Phổ 1H-NMR PAMAM dendrimer G3.0 biến tính với PAA (tỉ lệ mol
1:12) ..................................................................................................................... 90
Hình 3.11. Phổ 1H-NMR PAMAM dendrimer G 4.0 biến tính với PAA (tỉ lệ mol
1:16) .....................................................................................................................
Hình 3.12. Đường chuẩn xác định hàm lượng Pt .................................................

Hình 3.13. Ảnh TEM phức PAMAM dendrimer thế hệ lẻ - Cisplatin ..............
Hình 3.14. Ảnh TEM mẫu PAMAM dendrimer G3.0, PAMAM dendrimer G3.0PNIPAM và DLS mẫu PAMAM dendrimer G3.0-PNIPAM ............................
Hình 3.15. Ảnh TEM của mẫu G3.5-PNIPAM-Cisplatin và DLS mẫu G3.5PNIPAM-Cisplatin và mẫu PNIPAM-Cisplatin ................................................
Hình 3.16. Ảnh TEM của PAMAM dendrimer G4.0 (A), G4.0-PAA (C) và DLS
của PAMAM dendrimer G4.0
Hình 3.17. Ảnh TEM của
PAMAM dendrimer G4.0-PAA-Cisplatin .........................................................
Hình 3.18. Thế zeta của hệ chất mang G3.0-PAA (tỉ lệ mol 1:12) tại các giá trị pH

khác nhau: a. pH 7,4; b. pH 7,0 và c. pH 5,5 .....................................................


Hình 3.19. Thế zeta của hệ chất mang G4.0-PAA (tỉ lệ mol 1:16) thay đổi theo pH:

a. pH 7,4; b. pH 7,0 và c. pH 5,5.......................................................................................... 105
Hình 3.20. Thế zeta của hệ chất mang G4.0-PAA (tỉ lệ mol 1:8) thay đổi theo pH:
a. pH 7,4; b. pH 7,0 và c. pH 5,5.......................................................................................... 105
Hình 3.21. Độ tan của các hệ chất mang phụ thuộc vào pH dung dịch.................106
Hình 3.22. Khảo sát giải phóng thuốc Cisplatin in vitro của hệ chất mang PAMAM
G2.5, PAMAM G3.5 và PAMAM G4.5 trong môi trường đệm PBS pH 7,4 và đệm

ABS pH 5,5................................................................................................................................... 107
Hình 3.23. Lượng Cisplatin giải phóng theo thời gian khỏi các hệ chất mang
PAMAM dendrimer trong môi trường đệm pH 5,5 và pH 7,4.................................. 108
Hình 3.24. Biểu đồ giải phóng thuốc 5-Flourouracil (5-FU) ở môi trường pH 7,4
và pH 5,5 tại nhiệt độ 37oC..................................................................................................... 111
Hình 3.25. Biểu đồ giải phóng thuốc Cisplatin ở mơi trường pH 7,4 và pH 5,5 112

Hình 3.26. Mơ hình giải phóng thuốc Korsmeyer-Peppas của các hệ mang thuốc
Cisplatin tại pH 5,5 và pH 7,4............................................................................................... 114

Hình 3.27. Nồng độ Cisplatin (dự đốn) trong plamsa................................................ 115
Hình 3.28. Thử nghiệm in vitro độc tế bào trên dòng tế bào MCF-7 với các chất
mang khác nhau (PAMAM G4.0, PAMAM G4.5 và G4.0-PAA). (A). Đánh giá
khả năng sống của tế bào MCF-7 khi thêm PAMAM dendrimer G4.0, PAMAM
dendrimer G4.5, G4.0-PAA và DMEM nồng độ 100 ppm trong 48 giờ, bằng kính
hiển vi huỳnh quang. (B). Nhuộm kép (AO/EB) đã được áp dụng để xác định các
tế bào sống, chết theo chương trình apoptosis sớm (E)/muộn (L) (tương ứng màu
xanh lá cây và màu cam/vàng) và hoại tử (N, màu đỏ)............................................... 119
Hình 3.29. Tỷ lệ sống sót của nguyên bào sợi người khi xử lý với các hệ mang
thuốc PAMAM dendrimer G4.0, PAMAM dendrimer G4.5, PAMAM dendrimer
G4.0-PAA, Camptothecin (kiểm sốt dương tính) và PBS 1X (kiểm sốt âm tính)
ở cùng nồng độ (100 ppm)...................................................................................................... 120


Hình 3.30. Hình ảnh huỳnh quang thu được từ kính hiển vi đồng tiêu huỳnh quang

- các nguyên bào sợi được nhuộm bằng acridine cam (AO) và ethidium bromide
(EB)................................................................................................................................................. 121


1

H-NMR

5-FU
A
ABS
ACN
AIC
ATP

AUC
CAT
Cisplatin
Da
DACHPt
DI
DL%
EDA
EDC

EE%


FTIR
GBM
GPC
GPX
GSH
HPLC
HSDB
ICP-MS
LCST
MA
MCF-7
MPEG
MW
MWCO
NCI-H460
NER
NHS

PAA
PAMAM
PAMAM
G2.0


PAMAM
G3.0
PAMAM
G4.0
PAMAM
G5.0
PBS
PNIPAM
PPI
ROS
SA
SCLCs
SEM
SOD
SRB
T
TEM
UCST
UPLC
XO


MỞ ĐẦU
Các polymer tự nhiên cũng như polymer tổng hợp luôn là đối tượng thu

hút các nhà khoa học trong các lĩnh vực nghiên cứu hiện đại. Các vật liệu nano
polymer sinh học đang được tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện để ứng dụng trong
lĩnh vực dược phẩm và y sinh học. Trong số các vật liệu này, các dendrimer đã
nổi lên như là một trong những chất mang nano polymer đầy triển vọng dùng để
mang các loại thuốc điều trị.
Dendrimer lần đầu tiên được tổng hợp từ năm 1970-1990 bởi hai nhóm
khác nhau (Buhleier và cộng sự; Tomalia và cộng sự). Ngược lại với các polymer
cao phân tử mạch nhánh và thẳng thơng thường, các dendrimer được kiểm sốt
rất chặt chẽ về cấu trúc và có các nhóm chức bề mặt có thể biến tính rất dễ dàng
tùy thuộc vào mục đích sử dụng [1], [2].
Hiện nay, số lượng các cơng trình nghiên cứu về dendrimer được cơng bố
ngày càng nhiều, tập trung vào khảo sát khả năng của dendrimer trong việc vận
chuyển các hoạt chất sinh học khác nhau, ví dụ như: thuốc, oligonucleotide,
enzyme và vaccine... [3]. Các dendrimer được thiết kế để vận chuyển thuốc nhằm
gia tăng dược động học và phân phối sinh học của thuốc cũng như tăng cường
khả năng hướng đích của thuốc. Dendrimer tương tác với các phân tử thuốc bằng
cách hấp phụ trên bề mặt, bằng các tương tác tĩnh điện hoặc liên kết với các
nhóm chức bề bằng liên kết hóa trị hoặc bằng cách bao gói thuốc vào các khoang
trống của dendrimer. Các khoang trống bên trong thường có tính chất kỵ nước,
cho phép tương tác với các loại thuốc hòa tan kém. Sự tồn tại của các nguyên tử
nitơ và oxy trong cấu trúc bên trong của dendrimer cho phép tương tác bởi liên
kết hydro với thuốc. Với số lượng lớn các nhóm chức trên bề mặt của dendrimer
(như amine - NH2 và nhóm cacboxylate -COO-) cho phép gắn lượng lớn các loại
thuốc khác nhau bằng tương tác tĩnh điện và vận chuyển chúng đến đích [4].
Cisplatin từ lâu được dùng trong điều trị lâm sàng các loại bệnh ung thư do
khả năng gây chết tế bào ung thư của thuốc. Tùy thuộc vào loại tế bào và nồng độ
Cisplatin sẽ gây độc tế bào. Ngoài ra, Cisplatin làm tổn thương các khối u thông qua
việc tác động lên hiệu ứng gây chết tế bào apoptosis theo các phương thức

1

khác nhau [4], [5]. Mặt khác, các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng Cisplatin gây ra nhiều
tác dụng phụ như thần kinh, độc tính với thận hoặc ức chế tủy xương. Hơn nữa,
Cisplatin liên kết với protein và enzyme có thể gây ra việc điều chỉnh cơ chế sinh
hóa của chúng. Quá trình điều trị ung thư bằng Cisplatin cũng dẫn tới các tế bào ung
thư có thể trở nên kháng Cisplatin và làm giảm khả năng điều trị của thuốc

[5]. Nhiều cơ chế kháng Cisplatin đã được nghiên cứu bao gồm những thay đổi
trong sự hấp thụ tế bào, tràn dịch thuốc, tăng giải độc, ức chế quá trình chết tế
bào apoptosis và tăng sửa chữa DNA.
Để giảm thiểu việc kháng thuốc Cisplatin cũng như giảm độ gây độc tế
bào của Cisplatin, liệu pháp tổ hợp đã được phát triển và đã chứng minh hiệu quả
hơn trong điều trị bệnh ung thư. Một trong các giải pháp đó là việc sử dụng các
PAMAM dendrimer làm chất mang thuốc Cisplatin.
Trong luận án này, chúng tôi sẽ tiếp tục cải thiện khả năng mang thuốc
Cisplatin của PAMAM dendrimer trên cơ sở tăng cường nhóm chức bề mặt của
dendrimer nhằm tăng khả năng mang thuốc Cisplatin của hệ chất mang này.
Mục tiêu của luận án
Tổng hợp hệ vật liệu nano mang thuốc trên nền dendrimer (PAMAM) biến
tính với PNIPAM và PAA tương hợp sinh học nhằm cải thiện hiệu quả mang
thuốc Cisplatin.

tP

Hình 1. Cơ chế mang thuốc của PAMAM dendrimer thế hệ lẻ [6]

2

Hình 2: Cơ chế mang thuốc của hệ G4.0-PAA-Cisplatin [6]

Hình 3. Cơ chế mang thuốc của hệ G3.5-PNIPAM-Cisplatin
Ý nghĩa khoa học của luận án
Kết quả nghiên cứu của luận án cho thấy một số kết luận có ý nghĩa khoa
học sau:
-

Sử dụng polymer nhạy nhiệt (PNIPAM), polymer nhạy pH (PAA) làm tác

nhân hướng đích trên cơ sở nhiệt độ và pH của tế bào để biến tính Dendrimer tạo hệ
chất vận chuyển thuốc đến tế bào ung thư. Đặc điểm hình thái của các tế bào ung thư
tạo ra khoảng không gian giữa các tế bào rộng hơn so với các mơ bình thường. Các
phức hợp chất mang thuốc sau khi đã đi vào các khe hở tế bào này sẽ bị giữ lại khi
các tế bào ung thư phát triển. Thêm vào đó, do khơng có hệ bạch huyết cần thiết, tốc
độ đào thải các phức hợp này ra khỏi mô ung thư là rất hạn chế.

3


pH = 7,4

pH = 5,5
Hình 4. Định hướng thụ động theo cơ chế EPR [7], [8].
-

Thủy phân Cisplatin bằng AgNO3 trước khi thực hiện phản ứng tạo phức

và kết hợp sóng siêu âm trong q trình tổng hợp phức dendrimer G2.5-Cisplatin,
PAMAM dendrimer G3.5-Cisplatin, PAMAM dendrimer G4.5-Cisplatin, G3.0PAA-Cisplatin và G4.0-PAA-Cisplatin làm tăng khả năng mang thuốc Cisplatin

của các hệ chất mang.
-

Các hệ chất mang carboxylate PAMAM dendrimer G2.5, G3,5, G4.5,

G3.5-PNIPAM và G4PAA cho thấy khả năng nhả thuốc Cisplatin chậm và ổn
định trong điều kiện in vitro.
-

Bước đầu thử nghiệm cho thấy hệ chất mang G3.5-PNIPAM có khả năng

mang đồng thời hai thuốc chống ung thư 5-FU (20,43%) và Cisplatin (35,22%)
và cũng có thể áp dụng để mang các loại thuốc khác.
-

Các hệ chất mang và các phức PAMAM dendrimer G3.5-Cisplatin,

G3.5-PNIPAM-Cisplatin-5FU và G4.0-PAA-Cisplatin thể hiện khả năng giảm
độc tính của thuốc chống ung thư Cisplatin đồng thời vẫn thể hiện hoạt tính ức
chế hiệu quả đối với sự phát triển của tế bào ung thư và có khả năng nhả thuốc
tốt hơn trong mơi trường acid pH 5,5.
Đóng góp mới của luận án
-

Đã tổng hợp thành công các phức PAMAM dendrimer G3.0-Cisplatin và

PAMAM dendrimer G4.0-Cisplatin.
4

-

Đã tổng hợp thành công các phức PAMAM dendrimer G2.5-Cisplatin,

PAMAM dendrimer G3.5-Cisplatin và PAMAM dendrimer G4.5-Cisplatin có và
khơng có sử dụng sóng siêu âm. Phương pháp tổng hợp có thủy phân Cisplatin
bằng AgNO3 trước khi thực hiện phản ứng tạo phức với các nhóm carboxylate
trên bề mặt của PAMAM dendrimer thế hệ lẻ kết hợp với siêu âm làm tăng đáng
kể hàm lượng Pt trong sản phẩm so với phương pháp khơng thủy phân Cisplatin.
-

Đã biến tính thành cơng PAMAM dendrimer G3.0 với Poly N-

isopropylacrylamide (PNIPAM-COOH) với các tỉ lệ mol khác nhau và tổng hợp
thành công hệ chất mang G3.5-PNIPAM. Đã tính tốn được số nhóm PNIPAM
gắn vào PAMAM dendrimer G3.0 và tính KPLPT của sản phẩm dựa trên phổ 1HNMR. Bước đầu thử nghiệm cho thấy hệ chất mang G3.5-PNIPAM cho thấy khả
năng mang đồng thời hai thuốc chống ung thư 5-FU (20,43%) và Cisplatin
(35,22%) và cũng có thể áp dụng để mang các loại thuốc khác.
-

Đã biến tính thành cơng PAMAM dendrimer G3.0 và G4.0 với acid poly

acrylic (PAA) với các tỉ lệ mol khác nhau. Tính tốn được số nhóm PAA gắn vào
PAMAM dendrimer và tính KPLT của sản phẩm dựa trên phổ 1H-NMR. Hệ chất
mang G4.0-PAA với số nhóm PAA gắn lên bề mặt PAMAM dendrimer G4.0 là
15 nhóm thể hiện khả năng mang thuốc Cisplatin tốt nhất (40,44%). Phức G4.0PAA-Cisplatin có độc tố giảm so với Cisplatin tự do (có IC 50 cao gấp 3 lần
Cisplatin tự do) khi thử nghiệm trên dòng tế bào ung thư phổi NCI-H460 nhưng
vẫn thể hiện hoạt tính ức chế hiệu quả đối với sự phát triển của tế bào ung thư và
thể hiện khả năng nhả thuốc tốt trong môi trường acid pH 5,5.
-

Các hệ chất mang carboxylate PAMAM dendrimer G2.5, G3,5, G4.5,

G3.5-PNIPAM và G4PAA cho thấy khả năng nhả thuốc chậm và ổn định trong
điều kiện in vitro.
-

Các hệ chất mang và các phức PAMAM dendrimer G3.5-Cisplatin,

G3.5-PNIPAM-Cisplatin-5FU thể hiện khả năng giảm độc tính của thuốc chống
ung thư Cisplatin đồng thời vẫn thể hiện hoạt tính ức chế hiệu quả đối với sự
phát triển của tế bào ung thư.

5


Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu dendrimer
1.1.1. Khái niệm và phân loại
Khái niệm dendrimer được Donald A. Tomalia và cộng sự đưa ra đầu tiên
vào năm 1985 [1]. Dendrimer được bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp “Dendron”, có
nghĩa là nhánh cây. Từ đó đến nay có rất nhiều cơng trình nghiên cứu về cấu trúc,
tính chất, phương pháp tổng hợp và ứng dụng của dendrimer trong nhiều lĩnh vực
khác nhau [3], [9], [10], [11], [12], [13].
Dendrimer là một nanopolymer có dạng hình cầu, cấu trúc nhánh, có
nhiều tính chất ưu việt hơn so với polymer mạch thẳng.
Cấu tạo phân tử dendrimer gồm ba phần (hình 1.1)

Hình 1.1. Cấu tạo phân tử Dendrimer
-

Một lõi (nhân hoặc core) ở trung tâm của dendrimer bao gồm (i) một

nguyên tử hoặc một phân tử có ít nhất hai nhóm chức giống nhau; (ii) nhánh, phát ra
từ lõi, được lặp đi lặp lại và có nhiệm vụ liên kết nhóm ngồi cùng với nhân; và

(iii) nhiều nhóm bên ngồi (nhóm anion, cation, nhóm trung tính, các nhóm ưa
nước hay kỵ nước) cịn gọi là nhóm bề mặt hoạt động. Những nhóm bề mặt này
rất quan trọng trong việc xác định các tính chất của các cao phân tử dendrimer.
6