Nghiên cứu thu nhận, đánh giá đặc tính của lipase thực vật và khả năng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
 

PHAN THỊ VIỆT HÀ

NGHIÊN CỨU THU NHẬN, ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH CỦA
LIPASE THỰC VẬT VÀ KHẢ NĂNG
ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

ĐÀ NẴNG 2021


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

PHAN THỊ VIỆT HÀ

NGHIÊN CỨU THU NHẬN, ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH CỦA
LIPASE THỰC VẬT VÀ KHẢ NĂNG
ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

Chuyên ngành

: Công nghệ thực phẩm

Mã số

: 62.54.01.01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS.TS. ĐẶNG MINH NHẬT
PGS.TS. TRẦN THỊ XÔ
ĐÀ NẴNG 2021


LỜI CAM ĐOAN
Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai cơng bố trong bất kỳ
cơng trình nào khác. Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được trích dẫn và ghi
nguồn tài liệu tham khảo đúng quy định.
Người cam đoan

Phan Thị Việt Hà


MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài .....................................................................................................................1
2. Mục tiêu nghiên cứu................................................................................................................3
3. Nội dung nghiên cứu ...............................................................................................................3
4. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................................................4
4.1. Phƣơng pháp nghiên cứu lý thuyết .............................................................. 4
4.2. Phƣơng pháp nghiên cứu thực nghiệm ........................................................ 4

5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài...............................................................................5
6. Bố cục của luận án...................................................................................................................5
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 6
1.1. Tổng quan về lipase..............................................................................................................6
1.1.1. Nguồn thu nhận lipase .............................................................................. 7
1.1.2. Cấu trúc và cơ chế xúc tác của lipase ....................................................... 8
1.1.3. Tính đặc hiệu của lipase ......................................................................... 10
1.1.4. Các hệ phản ứng cho lipase xúc tác........................................................ 11
1.2. Lipase thực vật .................................................................................................................. 12
1.2.1. Khả năng xúc tác của lipase thực vật ..................................................... 12
1.2.2. Một số nguồn lipase từ thực vật ............................................................. 13
1.2.3. Phƣơng pháp chiết tách lipase từ thực vật ..................................................... 17
1.2.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt độ của lipase thực vật .......................... 19
1.2.5. Ứng dụng của lipase thực vật ................................................................. 21
1.2.5.1. Trong công nghiệp thực phẩm ........................................................ 21
1.2.5.2. Trong công nghiệp dƣợc ................................................................. 22
1.2.5.3. Trong các lĩnh vực khác .................................................................. 23


1.3. Dầu cá và ứng dụng lipase trong làm giàu DHA, EPA trong dầu cá........................... 24
1.3.1. Dầu cá ..................................................................................................... 24
1.3.2. Ứng dụng lipase trong làm giàu DHA, EPA trong dầu cá ..................... 26
1.4. Lƣợc sử vấn đề nghiên cứu .............................................................................................. 28
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ......................................................... 28
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc ........................................................... 34
CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 38
2.1. Nguyên liệu ........................................................................................................................ 38
2.1.1. Nguyên liệu hạt....................................................................................... 38
2.1.2. Nguyên liệu phụ phẩm nơng nghiệp (cám gạo, phơi lúa mì) ................. 38
2.1.3. Ngun liệu mủ từ các loại quả .............................................................. 39

2.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu........................................................................................ 40
2.2.1. Hóa chất .................................................................................................. 40
2.2.2. Thiết bị.................................................................................................... 40
2.3. Nội dung nghiên cứu......................................................................................................... 41
2.4. Bố trí thí nghiệm ................................................................................................................ 42
2.4.1. Phần 1: Đánh giá khả năng thu nhận lipase từ các nguồn thực vật: đậu
nành, đậu phộng nảy mầm, cám gạo, phơi mì, mủ sung, mủ vả, mủ đu đủ ..... 42
2.4.2. Phần 2: Nghiên cứu thu nhận lipase thô từ mủ đu đủ ............................ 49
2.4.3. Phần 3: Chiết tách và tinh sạch lipase từ lipase thô mủ đu đủ ............... 51
2.4.4. Phần 4: Nghiên cứu tính chất của lipase tinh sạch ................................. 52
2.4.5. Phần 5: Phƣơng pháp nghiên cứu ứng dụng lipase thô .......................... 53
2.5. Phƣơng pháp phân tích ..................................................................................................... 61
2.5.1. Phƣơng pháp hóa học xác định thành phần nguyên liệu ........................ 61
2.5.2. Phƣơng pháp xác định hoạt độ lipase bằng phƣơng pháp chuẩn độ ...... 61
2.5.3. Phƣơng pháp xác định hoạt độ lipase bằng phƣơng pháp đo quang ...... 62
2.5.4. Phƣơng pháp xác định hoạt độ lipase bằng phƣơng pháp khuếch tán đĩa
thạch.................................................................................................................. 62
2.5.5. Phƣơng pháp xác định điểm đẳng điện của lipase ................................. 62


2.5.6. Phƣơng pháp kết tủa phân đoạn lipase với muối amoni sunfat .............. 63
2.5.7. Phƣơng pháp tinh sạch lipase bằng sắc ký trao đổi ion .......................... 63
2.5.8. Phƣơng pháp điện di ............................................................................... 64
2.5.9. Phƣơng pháp xác định đặc tính hóa lý của dầu cá ................................. 64
2.5.10. Phƣơng pháp xác định thành phần các acid béo có trong dầu cá hồi .. 65
2.5.11. Phƣơng pháp xác định hiệu suất thủy phân dầu cá hồi xúc tác bởi
CPL ................................................................................................................... 65
2.5.12. Phƣơng pháp xác định các thông số động học Km và Vmax của phản
ứng thủy phân dầu cá hồi bằng CPL ................................................................ 65
2.5.13. Phƣơng pháp xác định năng lƣợng hoạt hóa ........................................ 66

2.5.14. Phƣơng pháp phân tích số liệu thực nghiệm ........................................ 67
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 68
3.1. Đánh giá khả năng thu nhận lipase từ một số nguồn thực vật ..................................... 68
3.1.1. Hoạt tính lipase từ các loại hạt có dầu nảy mầm .................................... 68
3.1.2. Hoạt tính lipase từ phụ phẩm nông nghiệp: cám gạo và phôi lúa mì ..... 74
3.1.3. Hoạt tính lipase từ mủ của các loại quả .................................................. 79
3.1.4. Đánh giá khả năng thu nhận lipase từ các nguồn thực vật khác nhau .... 86
3.2. Thu nhận enzyme lipase thô từ mủ đu đủ ....................................................................... 87
3.2.1. Các phƣơng pháp bảo quản mủ đu đủ .................................................... 87
3.2.2. Thu nhận enzyme thô ............................................................................. 90
3.2.3. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân của lipase thô từ mủ đu đủ trên
các cơ chất khác nhau ....................................................................................... 96
3.3. Tinh sạch enzyme lipase từ mủ đu đủ ............................................................................. 99
3.3.1. Chiết tách lipase mủ đu đủ bằng muối sodium lauroyl sarcosinate
(SLS) ................................................................................................................. 99
3.3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ SLS lên hoạt độ lipase .................................. 101
3.3.3. Tủa lipase bằng dung dịch amoni sunfat (AS) ..................................... 102
3.3.4. Kết quả xác định điểm đẳng điện của protein enzyme ......................... 103
3.3.5. Kết quả tinh sạch enzyme lipase từ mủ đu đủ bằng sắc ký trao đổi ion ...104


3.4. Tính chất của lipase tinh sạch......................................................................................... 104
3.4.1. Kết quả xác định khối lƣợng phân tử lipase ......................................... 104
3.4.2. Xác định Km và Vmax ............................................................................ 105
3.5. Đánh giá khả năng ứng dụng lipase mủ đu đủ trong quy trình sản xuất dầu cá giàu
DHA và EPA .......................................................................................................................... 106
3.5.1. Một số đặc điểm của dầu cá hồi thô ..................................................... 106
3.5.2. Xác định thành phần các acid béo có trong dầu cá hồi ........................ 107
3.5.3. Ứng dụng lipase từ mủ đu đủ để thủy phân dầu cá hồi ........................ 109
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................. 127

A. KẾT LUẬN ....................................................................................................... 127
B. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ................................................... 128
C. KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO .................................. 128
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CƠNG BỐ ........................ 129
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 130


DANH MỤC CHỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT

Ký hiệu

Tiếng Anh

Tiếng Việt
Lipase từ mủ đu đủ

CPL

Carica papaya lipase

DHA

Docosahexaenoic acid

EPA

Eicosapentaenoic acid

PUFAs

Polyunsaturated fatty acids

p-NPP

Para-nitrophenyl palmitate

p-NP

Para-nitrophenol

OD

Optical density

Mật độ quang

AS

Ammonium sulfate

Amoni sunfat

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

DH

Degree of hydrolysis

TAG

Triacylglycerol

SLS

Sodium Lauroyl Saccosine

CHAPS

EDTA

Acid béo khơng bão hịa
nhiều nối đơi

Hiệu suất thủy phân

3-[(3-Cholamidopropyl)
dimethylammonio]-1-propanesulfonate
hydrate
Ethylene Diamine Tetracetic Acid

Acid
etylenediaminetetraacetic


DANH MỤC CÁC BẢNG
Số hiệu

Tên bảng

Trang

Bảng 1.1.

Tính chất của một số lipase có nguồn gốc từ hạt [72]

14

Bảng 1.2.

Tính chất của lipase từ một số loại hạt chứa dầu

30

Bảng 1.3.

Tính chất của lipase từ một số loại hạt ngũ cốc

31

Bảng 1.4.

Tính chất của lipase từ một số loại mủ

32

Bảng 2.1.

Một số hóa chất chính d ng trong nghiên cứu

40

Bảng 2.2.

Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của các yếu tố nhiệt
độ, pH và các ion kim loại đến hoạt độ lipase

48

Bảng 2.3.

Khoảng biến thiên các yếu tố thực nghiệm

55

Bảng 2.4.

Ma trận quy hoạch thực nghiệm

55

Bảng 2.5.

Khoảng biến thiên các yếu tố thực nghiệm

56

Bảng 2.6.

Ma trận quy hoạch thực nghiệm

57

Bảng 2.7.

Khoảng biến thiên các yếu tố thực nghiệm

60

Bảng 2.8.

Ma trận quy hoạch thực nghiệm

60

Bảng 3.1.

Thành phần hóa học của hạt đậu nành, đậu phộng

68

Bảng 3.2.

Thành phần hóa học của cám gạo và phơi lúa mì

75

Bảng 3.3.

Thành phần hóa học của mủ đu đủ

79

Bảng 3.4.

Hiệu quả thu nhận lipase từ các nguồn thực vật

86

Bảng 3.5.

Ảnh hƣởng của các phƣơng pháp sấy khác nhau lên hoạt độ
lipase

88

Bảng 3.6.

Sự thay đổi hoạt độ lipase của mủ đu đủ theo thời gian trữ
đông

89

Bảng 3.7.

Ảnh hƣởng của tỷ lệ nƣớc đến hiệu quả thu nhận lipase thô

90

Bảng 3.8.

Ảnh hƣởng của số lần lặp rửa – ly tâm đến hiệu quả thu
nhận lipase thô

92

Bảng 3.9.

Hoạt độ của chế phẩm lipase thô thu bằng 2 phƣơng pháp
sấy khác nhau

93

Bảng 3.10.

Hoạt độ của CPL sau khi loại lipid và chiết tách với SLS

100

Bảng 3.11.

Hoạt tính của CPL sau hịa tan mà khơng loại lipid

100

Bảng 3.12.

Hoạt tính lipase thu đƣợc ở các phân đoạn tủa khác nhau

102

Bảng 3.13.

Các chỉ số chất lƣợng của dầu cá hồi thô

107


Bảng 3.14.

Thành phần và hàm lƣợng acid béo trong dầu cá hồi

108

Bảng 3.15.

Phần trăm acid béo có trong dầu cá hồi trƣớc và sau khi
thủy phân

110

Bảng 3.16.

Hiệu suất phản ứng thủy phân qua các thí nghiệm

111

Bảng 3.17.

Giá trị các hệ số b trong phƣơng trình hồi quy và xác suất p

112

Bảng 3.18.

Hiệu suất của phản ứng thủy phân qua các thí nghiệm

114

Bảng 3.19.

Giá trị các hệ số b trong phƣơng trình hồi quy và xác suất p

114

Bảng 3.20.

Hiệu suất thủy phân dầu cá trong các hệ phản ứng khác
nhau

116

Bảng 3.21.

Hiệu suất của phản ứng thủy phân qua các thí nghiệm

120

Bảng 3.22.

Hiệu suất của phản ứng thủy phân qua các thí nghiệm

121

Bảng 3.23.

Tốc độ ban đầu phản ứng thu đƣợc ở các nồng độ cơ chất
khác nhau trong thủy phân dầu cá hồi bằng CPL trong thời
gian 60 phút

123

Bảng 3.24.

Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hằng số tốc độ (k)

125


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Số hiệu

Tên hình

Trang

Hình 1.1.

Mơ hình cấu trúc 3D của Arabidopsis thaliana lipase

9

Hình 1.2.

Cơ chế phản ứng thủy phân liên kết ester xúc tác bởi esterase
và lipase

9

Hình 1.3.

Phản ứng xúc tác bởi lipase khơng đặc hiệu và đặc hiệu vị trí
sn 1, sn 3

11

Hình 1.4.

Cấu trúc phân tử DHA, EPA

25

Hình 1.5.

Quy trình tổng hợp glyceride giàu DHA, EPA [37]

27

Hình 2.1.

Hạt đậu nành (a) và hạt đậu phộng (b)

38

Hình 2.2.

Phơi lúa mì (a) và cám gạo (b)

38

Hình 2.3.

Vƣờn thu nhận mủ đu đủ

39

Hình 2.4.

Quả vả (a) và quả sung (b)

39

Hình 2.5.

Sơ đồ nghiên cứu tổng quát

41

Hình 2.6.

Sơ đồ quy trình thu lipase từ hạt đậu phộng, đậu nành nảy
mầm

43

Hình 2.7.

Sơ đồ quy trình thu lipase thơ từ cám gạo, phơi lúa mì

44

Hình 2.8.

Sơ đồ quy trình thu lipase thô từ mủ đu đủ Lipase thô thu
đƣợc từ mủ đu đủ đƣợc dùng trong các thí nghiệm khảo sát
các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt độ lipase.

46

Hình 2.9.

Thu nhận mủ vả

47

Hình 2.10.

Sơ đồ khảo sát quá trình thủy phân dầu cá hồi bằng enzyme
lipase thô từ mủ đu đủ

58

Hình 3.1.

Hình thái hạt đậu nành nảy mầm theo thời gian theo thứ tự từ
1 - 6 ngày

69

Hình 3.2.

Hình thái hạt đậu phộng nảy mầm theo thời gian

69

Hình 3.3.

Hoạt độ lipase trong thời gian nảy mầm của hạt đậu nành,
đậu phộng

70

Hình 3.4.

Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt độ lipase từ hạt đậu nành
nảy mầm

71

Hình 3.5.

Ảnh hƣởng của pH đến hoạt độ của lipase từ hạt đậu nành
nảy mầm

72


Hình 3.6.

Ảnh hƣởng của ion kim loại đến hoạt độ lipase từ hạt đậu
nành nảy mầm

73

Hình 3.7.

Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt độ lipase từ cám gạo và
phôi lúa mì

76

Hình 3.8.

Ảnh hƣởng của pH đến hoạt độ của lipase từ cám gạo và
phơi lúa mì

77

Hình 3.9.

Ảnh hƣởng của ion kim loại đến hoạt độ của lipase từ cám
gạo

78

Hình 3.10.

Lipase thơ từ mủ đu đủ

80

Hình 3.11.

Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt độ của lipase từ mủ đu đủ

80

Hình 3.12.

Ảnh hƣởng của pH đến hoạt độ của lipase từ mủ đu đủ

81

Hình 3.13.

Ảnh hƣởng của ion kim loại đến hoạt độ của lipase từ mủ đu
đủ

82

Hình 3.14.

Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới hoạt độ lipase mủ sung và mủ vả

83

Hình 3.15.

Ảnh hƣởng của pH tới hoạt độ lipase từ mủ sung và mủ vả

84

Hình 3.16.

Ảnh hƣởng của ion kim loại tới hoạt độ lipase từ mủ sung,
mủ vả

85

Hình 3.17.

Mủ đu đủ thu đƣợc sau khi phơi nắng, sấy đối lƣu, sấy thăng
hoa

89

Hình 3.18.

Ảnh hƣởng của tỷ lệ mủ đu đủ/nƣớc đến hoạt độ riêng và

hoạt độ tổng của CPL

91

Hình 3.19.

Ảnh hƣởng của số lần lặp rửa – ly tâm đến hoạt độ riêng và
hoạt độ tổng của CPL.

92

Hình 3.20.

Mẫu lipase từ mủ đu đủ sau khi sấy đối lƣu (a) và sấy thăng
hoa (b)

94

Hình 3.21.

Quy trình thu lipase thơ từ mủ đu đủ

95

Hình 3.22.

Hoạt độ của chế phẩm enzyme lipase thô từ mủ đu đủ đối
với các cơ chất khác nhau

96

Hình 3.23.

Khả năng thủy phân của lipase trên cơ chất dầu cá hồi

98

Hình 3.24.

Khả năng thủy phân của lipase trên cơ chất dầu cọ

98

Hình 3.25.

Ảnh hƣởng của nồng độ SLS đến hoạt độ lipase từ mủ đu đủ

101

Hình 3.26.

Đồ thị độ đục của dung dịch enzyme lipase ở pH khác nhau

103


Hình 3.27.

Sắc ký đồ của phân đoạn lipase tủa ở 50-60% AS

104

Hình 3.28.

Hình ảnh điện di SDS

105

Hình 3.29.

Đồ thị Lineweaver-Burk xác định Km (mM) và Vmax
(mM/min/mL) của lipase từ mủ đu đủ

106

Hình 3.30.

Điều kiện tối ƣu nhiệt độ, pH của phản ứng thủy phân dầu cá
trong hệ nhũ tƣơng dầu – nƣớc.

113

Hình 3.31.

Điều kiện tối ƣu tỷ lệ nƣớc/cơ chất và nồng độ enzyme của
phản ứng thủy phân dầu cá trong hệ nhũ tƣơng dầu – nƣớc.

115

Hình 3.32.

Ảnh hƣởng của nồng enzyme đến hiệu suất thủy phân

117

Hình 3.33.

Ảnh hƣởng của tỷ lệ dung mơi/cơ chất đến hiệu suất thủy
phân

118

Hình 3.34.

Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân

119

Hình 3.35.

Điều kiện tối ƣu của phản ứng thủy phân dầu cá trong hệ 2
pha iso - octan/nƣớc

122

Hình 3.36.

Biểu đồ thể hiện sự thay đổi tốc độ phản ứng theo thời gian
trong thủy phân dầu cá hồi bằng CPL.

123

Hình 3.37.

Biểu đồ Lineweaver-Burk thủy phân dầu cá bằng CPL

124

Hình 3.38.

Đồ thị Arrhenius thủy phân dầu cá bằng CPL

125

Hình 3.39.

Biểu đồ ảnh hƣởng của thời gian đến hiệu suất của quá trình
thủy phân

126


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Lipase hay Triacylglycerol acylhydrolase (E.C. 3.1.1.3) là loại enzyme có
khả năng xúc tác phản ứng thủy phân triacylglycerol mạch dài tạo thành
diacylglycerol, monoacylglycerol, glycerol và các acid béo tự do tại các bề mặt liên
pha giữa nƣớc và dung môi hữu cơ. Khác với esterase ở cơ chất thủy phân, lipase
đƣợc định nghĩa là carboxylesterase có khả năng xúc tác thủy phân acylglycerol với
gốc acyl có mạch dài trên 10 ngun tử carbon. Ngồi ra, lipase còn tham gia xúc

tác các phản ứng chuyển vị ester và cả phản ứng tổng hợp ester trong mơi trƣờng ít
nƣớc [105].
Năm 2010, thị phần enzyme tồn cầu trong cơng nghiệp đƣợc ƣớc tính
khoảng 3,3 tỷ đơ la. Lipase đứng thứ ba trong số các enzyme đang đƣợc thƣơng mại
hóa chỉ sau protease và carboxylase [35]. Đến năm 2016, thị phần enzyme trên thế
giới đƣợc sản xuất và ứng dụng trong cơng nghiệp ƣớc tính đạt 5 đến 5,5 tỷ đơ la.
Trong đó, lipase chiếm gần 10% thị phần enzyme toàn cầu, với một loạt các ứng
dụng trong các ngành công nghiệp nhƣ sản xuất chất tẩy rửa, chế biến dầu, chế biến
thực phẩm và dƣợc phẩm [56]. Điều này cho thấy ngành cơng nghệ enzyme, trong
đó có lipase đang phát triển đầy triển vọng.
Lipase đƣợc thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau nhƣ: vi khuẩn (45%), nấm
(21%), động vật (18%), thực vật (11%) và vi tảo (3%) [91]. Lipase trong công
nghiệp chủ yếu đƣợc phân lập từ vi sinh vật và một phần từ thực vật. So với lipase
từ vi sinh vật, lipase từ thực vật có những ƣu điểm quan trọng nhƣ:
- Dễ đƣợc ngƣời tiêu dùng chấp nhận trong thực phẩm, dƣợc phẩm hơn, ngay
cả ở dạng enzyme thô [75];
- Nguồn nguyên liệu để thu nhận có sẵn trong tự nhiên, khơng độc hại và
khơng cần công nghệ di truyền phân tử để sản xuất ra [75].
Lipase thực vật đƣợc cho là có tiềm năng ứng dụng tốt trong công nghệ thực
phẩm, chất tẩy rửa, tổng hợp các chất hữu cơ, dƣợc phẩm và cả trong sản xuất nhiên
liệu sinh học nhƣ biodiesel [108].

1


Do đó, lipase thực vật thu hút sự quan tâm ngày càng nhiều của các nhà
nghiên cứu.
Lipase thực vật thƣờng đƣợc tìm thấy trong các loại hạt chứa dầu, ngũ cốc
(hạt cải, đậu phộng, đậu nành, yến mạch, v.v…) cũng nhƣ các thực vật có chứa
nhiều

mủ

nhƣ

Asclepiadaceae,

Sapotaceae,

Euphorbiaceae,

Moraceae,

Papaveraceae và Asteraceae.
Nhiều nghiên cứu về đặc tính và ứng dụng lipase thực vật thu đƣợc từ mủ
cho thấy chúng có thể thay thế cho các lipase vi sinh vật. Lipase đã đƣợc tìm thấy
trong mủ xƣơng rồng, mủ sung và đã đƣợc tinh sạch và xác định đƣợc khối lƣợng
phân tử [52], [53]. Lipase từ mủ đu đủ đƣợc xác định là enzyme cố định trong mủ
[18], đƣợc sử dụng trong điều chỉnh cấu trúc của glycerolipid [50], tổng hợp ester
terpene [127], tổng hợp bơ ca cao nhân tạo [94].
Trong hạt có dầu, lipase có chức năng thủy phân triglyceride để tạo glycerol
và acid béo, cung cấp năng lƣợng cần thiết cho sự nảy mầm hạt và phát triển
cây con [25]
Trên thế giới, mặc dù đã có nhiều cơng trình nghiên cứu về lipase thực vật từ
chiết tách, khảo sát đặc tính, tinh sạch lipase đến ứng dụng. Nhƣng cho đến nay chỉ
mới 29 loại lipase từ thực vật đã đƣợc xác định khối lƣợng phân tử cũng nhƣ trình
tự acid amin trong chuỗi protein [108]. Việc nghiên cứu chiết tách và tinh sạch
lipase từ thực vật còn gặp nhiều thách thức do hàm lƣợng lipid và phenolic trong
mẫu cao dẫn đến lipase kém bền và dễ bị biến tính trong q trình chiết tách. Trong
quy trình thu lipase từ hạt nảy mầm, thời gian nảy mầm kéo dài có thể cho hoạt độ

lipase cao, nhƣng cũng có thể chịu ảnh hƣởng của sự nhiễm vi sinh vật [108]. Ngồi
ra, q trình sấy khơ hạt cũng làm lipase mất hoạt tính.
Tƣơng tự, các nghiên cứu về cấu trúc của lipase thực vật cũng gặp những
khó khăn vì khó thu đƣợc cấu trúc tinh thể và mẫu có độ đồng đều khơng cao [108].
Điển hình là trƣờng hợp lipase từ mủ đu đủ. Một số tác giả ngoài nƣớc đã nghiên
cứu chiết tách, tinh sạch để xác định cấu trúc phân tử của lipase từ mủ đu đủ, nhƣng
gặp phải những khó khăn do lipase này có bản chất cố định tự nhiên trong mủ đu

2


đủ, rất khó giải phóng ra. Tất cả các nỗ lực để chiết tách lipase này ra khỏi mủ đu
đủ đều khơng thành cơng [17].
Trong khi đó, những cơng trình nghiên cứu ở trong nƣớc về lipase cịn ít, chủ
yếu là nghiên cứu về phân lập lipase từ vi sinh vật và thu lipase từ nội tạng các loài
cá, nghiên cứu về lipase từ thực vật là lĩnh vực hầu nhƣ không đƣợc quan tâm.
Với những ƣu điểm nổi bật đƣợc trình bày ở trên, việc nghiên cứu khai thác
nguồn enzyme lipase từ thực vật đƣợc đánh giá có tiềm năng mang lại những lợi ích
lớn về mặt kinh tế cho ngành cơng nghệ enzyme.
Việt Nam có nguồn thực vật đa dạng và phong phú và lƣợng lớn phế phẩm từ
thực vật có tiềm năng thu đƣợc lipase chất lƣợng tốt, tuy nhiên chúng chƣa đƣợc
quan tâm nghiên cứu. Do đó, đề tài đƣợc chọn cho luận án: "Nghiên cứu thu nhận,
đánh giá đặc tính của lipase thực vật và khả năng ứng dụng trong công nghiệp
thực phẩm" thực sự có ý nghĩa khoa học và thực tiễn.

2. Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu của luận án là đánh giá khả năng khai thác lipase từ các nguồn thực
vật sẵn có ở Việt Nam và ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, thơng qua đó có thể
tạo ra sản phẩm có giá trị cao từ nguồn thực vật phổ biến ở Việt Nam.
Mục tiêu cụ thể nhƣ sau:

1 - Đánh giá hoạt tính lipase thu nhận từ một số nguồn thực vật:
+ Hạt có dầu
+ Phụ phẩm nơng nghiệp
+ Mủ các loại quả
2 - Xây dựng quy trình cơng nghệ thu nhận lipase thô từ nguồn thực vật;
3 - Xác định các đặc tính hố sinh của lipase thơ và lipase tinh sạch;
4 - Đánh giá khả năng ứng dụng lipase thô trong công nghiệp thực phẩm.

3. Nội dung nghiên cứu
Để đạt đƣợc những mục tiêu nghiên cứu nhƣ trên, đề tài xác định các nội
dung cần thực hiện nhƣ sau:

3


- Nghiên cứu lựa chọn nguồn nguyên liệu thực vật thích hợp để thu nhận
lipase;
- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt độ lipase thu đƣợc;
- Nghiên cứu xây dựng quy trình thu nhận lipase thơ có hoạt độ cao từ nguyên
liệu đã lựa chọn;
- Nghiên cứu khảo sát các đặc tính hố sinh của lipase thơ;
- Nghiên cứu tinh sạch lipase thơ và xác định đặc tính hoá sinh của lipase tinh
sạch;
- Nghiên cứu ứng dụng lipase thơ trong quy trình sản xuất dầu cá giàu DHA
và EPA.

4. Phƣơng pháp nghiên cứu
4.1. Phương pháp nghiên cứu lý thuyết
Thu thập, tổng hợp các tài liệu, tƣ liệu, sách báo, các cơng trình đã nghiên
cứu về enzyme lipase.

4.2. Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm
- Các phƣơng pháp xác định thành phần nguyên liệu thực vật gồm: phƣơng
pháp xác định độ ẩm, hàm lƣợng tro tổng, hàm lƣợng protein, hàm lƣợng chất béo.
- Các phƣơng pháp thu nhận lipase từ đậu phộng nảy mầm, đậu nành nảy
mầm, cám gạo, phôi lúa mì, mủ đu đủ, mủ vả và mủ sung.
- Các phƣơng pháp xác định hoạt độ lipase: phƣơng pháp chuẩn độ, phƣơng
pháp đo quang, phƣơng pháp đĩa thạch.
- Các phƣơng pháp tinh sạch lipase: xác định điểm đẳng điện, phƣơng pháp
tủa bằng amoni sunfat, phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion, phƣơng pháp điện di.
- Các phƣơng pháp hóa lý xác định chỉ tiêu chất lƣợng dầu cá hồi: chỉ số
acid, chỉ số xà phịng hóa, chỉ số ester.
- Các phƣơng pháp toán học: phƣơng pháp quy hoạch thực nghiệm, phƣơng
pháp tối ƣu hoá.

4


5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Từ những nội dung nghiên cứu đƣợc định ra trong luận án sẽ toát lên ý nghĩa
khoa học và ý nghĩa thực tiễn nhƣ sau:
* Ý nghĩa khoa học
- Đánh giá đƣợc khả năng thu nhận lipase từ một số nguồn nguyên liệu thực
vật, ảnh hƣởng của các yếu tố đến hoạt độ của chế phẩm, từ đó xác định đƣợc
nguồn nguyên liệu thực vật có tiềm năng để khai thác enzyme lipase.
- Đề xuất đƣợc quy trình thu lipase thơ từ nguồn thực vật có hiệu quả cao.
- Xác định đƣợc tính đặc hiệu đối với cơ chất lipid của lipase thô thu nhận
đƣợc từ nguồn thực vật.
- Đề xuất phƣơng pháp tinh sạch lipase thô từ mủ đu đủ và xác định khối
lƣợng phân tử của lipase.

* Ý nghĩa thực tiễn
- Tận dụng phế phẩm của quá trình thu papain từ mủ đu đủ để sản xuất
lipase thô.
- Ứng dụng lipase thô từ mủ đu đủ để thủy phân dầu cá hồi nhằm thu acid
béo tạo tiền đề cho quá trình làm giàu DHA, EPA ứng dụng trong công nghiệp
thực phẩm.

6. Bố cục của luận án
MỞ ĐẦU
Chƣơng 1: TỔNG QUAN
Chƣơng 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO

5


CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về lipase
Lipase (triacylglycerol acylhydrolases EC 3.1.1.3) thuộc lớp hydrolase, là
enzyme hoạt động tốt tại bề mặt liên pha dầu – nƣớc. Tiềm năng xúc tác của lipase
đƣợc biết đến từ năm 1930 theo cơng trình cơng bố của JBS Haldane và cộng sự
[38].
Lipase có thể tham gia xúc tác cho rất nhiều phản ứng khác nhau nhƣ thủy
phân, chuyển ester, tổng hợp ester. Lipase xúc tác phản ứng thủy phân triglyceride
tạo glycerol và acid béo, đây là phản ứng đặc trƣng của lipase. Ngoài ra, trong điều
kiện ít nƣớc, lipase cịn có khả năng xúc tác phản ứng tổng hợp ester, chuyển ester.
Các phản ứng xúc tác bởi lipase [106] đƣợc thể hiện nhƣ sau:

(1) Phản ứng thủy phân

(2) Phản ứng tổng hợp
 Phản ứng ester hóa

 Phản ứng amid hóa

 Phản ứng tổng hợp thioester

6


(3) Phản ứng chuyển ester
 Phản ứng thế gốc acid

 Phản ứng thế gốc amin

 Phản ứng thế gốc ancol

 Phản ứng chuyển vị ester

1.1.1. Nguồn thu nhận lipase
Lipase đƣợc phân bố rộng rãi ở vi sinh vật, động vật và thực vật. Lipase vi
sinh vật đã đƣợc một số tác giả thu nhận từ Pseudomonas [128], Bacillus sp. LBN 4.
[27], Staphylococcus epidermidis [63], Acinetobacter sp. CR9 [68]. Lipase chịu
nhiệt từ nấm Rhizopus homothallicus cũng đã đƣợc chiết tách bởi Diaza và cộng sự
năm 2006 [41].
Ở động vật, lipase đƣợc thu nhận chủ yếu từ tụy tạng của trâu, bò, cừu, lợn,
và một số loại cá. Lipase ở động vật đóng vai trị quan trọng trong việc tiêu hóa
lipid. Một số tác giả đã thu nhận lipase từ nội tạng cá lóc, cá tra [11], [12]. Trong

các loại cơn tr ng, lipase đƣợc tìm thấy trong cơ, huyết tƣơng, ống tiêu hóa và các
tuyến nƣớc bọt.
Thực vật có thể là nguồn cung cấp lipase quan trọng khi xét đến những ƣu
điểm nhƣ giá thành thấp, tính đặc hiệu, dễ dàng đƣợc chấp nhận và có thể ứng dụng
trực tiếp nhƣ là chất xúc tác sinh học sau quá trình tinh sạch sơ bộ [33], [75].

7


Nguồn lipase từ thực vật rất đa dạng và phong phú, có thể thu nhận từ các
nguồn thực vật có sẵn trong tự nhiên mà khơng cần quy trình ni cấy nghiêm ngặt
nhƣ lipase từ vi sinh vật. Lipase chủ yếu hiện diện ở dạng dự trữ trong các mô của
các hạt đang phát triển hoặc đặc biệt ở những nơi chứa lƣợng lớn triacylglycerol.
Hoạt động lipase của hạt tăng lên trong suốt quá trình nảy mầm vì triacylglycerol
cần đƣợc chuyển hoá thành glycerol và các acid béo bằng phản ứng thủy phân bởi
lipase, sau đó các chất này đƣợc chuyển hố tiếp thành các phân tử đƣờng hịa tan,
vận chuyển đến các mô đang phát triển để cung cấp nguồn carbon và năng lƣợng hỗ
trợ cho sự phát triển của cây non [91]. Lipase từ một số loại hạt cũng đã đƣợc các
tác giả nghiên cứu chiết tách nhƣ phôi dừa (Cocos nucifera linn) [43], hạt của hoa
hƣớng dƣơng [103], hạt lupin vàng nảy mầm [28], hạt nguyệt quế [59], hạt hạnh
nhân [126]. Lipase cũng đƣợc nghiên cứu ở một số loại ngũ cốc nhƣ các loại đậu
nành [73], yến mạch [64], cám gạo [62]. Ngoài ra lipase từ thực vật cũng có ở phần
mủ của một số loại quả nhƣ mủ đu đủ [17], mủ sung [53], mủ xƣơng rồng [52].

1.1.2. Cấu trúc và cơ chế xúc tác của lipase
Ngày nay, hàng trăm loại lipase đã đƣợc xác định cấu trúc không gian 3
chiều trong cơ sở dữ liệu protein.
Lipase từ các nguồn gốc khác nhau, thƣờng khác nhau về kích thƣớc phân tử
và có rất ít các trình tự tƣơng đồng. Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu các lipase đã
đƣợc kết tinh cho thấy hầu hết chúng là những protein có cấu trúc α/β với một trung

tâm là các cấu trúc gấp nếp β đƣợc bao quanh bởi một số dải xoắn α [106].
Theo Abdelmonaem và cộng sự (2011), mơ hình enzyme Arabidopsis
thaliana lipase đã đƣợc xác định có dạng monomer dạng α/β bao gồm 8 chuỗi gấp β
xen lẫn với 22 chuỗi xoắn α. Lipase này cũng có cấu trúc tƣơng tự nhƣ cấu trúc
lipase từ động vật và vi khuẩn, nhƣng chỉ khác nhau về số lƣợng của chuỗi xoắn α
và gấp nếp β. Hình 1.1 thể hiện cấu trúc 3D của Arabidopsis thaliana lipase [76].
Trung tâm hoạt động của lipase đƣợc hình thành bởi bộ ba xúc tác bao gồm
các acid amin: serine, histidine và acid aspartic/acid glutamic [72]. Trung tâm hoạt

8


động của cả lipase và protease tƣơng tự nhau về mặt hóa học nhƣng có cấu trúc
khác nhau.

Hình 1.1. Mơ hình cấu trúc 3D của Arabidopsis thaliana lipase [76]

Hình 1.2. Cơ chế phản ứng thủy phân liên kết ester xúc tác bởi esterase và
lipase [101]
Chú thích: (a) Tấn cơng nucleophin của nhóm –OH serine vào carbon của liên kết

9


ester; (b) tứ diện trung gian; (c) acyl-enzyme trung gian và tấn công nucleophilic
bằng nƣớc; (d) tứ diện trung gian; (e) enzyme tự do
Do sự giống nhau của bộ ba xúc tác đƣợc tìm thấy trong lipase so với những
gì đƣợc quan sát trong serine protease, nên cơ chế xúc tác lipase đƣợc cho là tƣơng
tự nhƣ xúc tác của serine protease [60].
Cơ chế phản ứng xúc tác thủy phân bởi lipase đƣợc thể hiện ở Hình 1.2. Phản

ứng bắt đầu do nhóm -OH của serine thuộc trung tâm hoạt động enzyme tấn công
nucleophin vào carbon của liên kết ester trong cơ chất tạo thành phức acyl - enzyme
và giải phóng ancol từ lipid. Sau đó, phức acyl - enzyme bị thủy phân và lipase tự
do đƣợc giải phóng trở lại.

1.1.3. Tính đặc hiệu của lipase
Mỗi loại lipase xúc tác chuyển hóa một loại cơ chất nhất định hay một kiểu
phản ứng hóa học nhất định, đó chính là tính đặc hiệu của lipase.
Theo Villeneuve (2003) và cộng sự, tính đặc hiệu của lipase có thể chia
thành 3 nhóm chính nhƣ sau:
- Đặc hiệu cơ chất: cơ chất tự nhiên của lipase là glycerol ester. Lipase
không những xúc tác thủy phân triacylglycerol (TAG), mà còn thủy phân di- và
monoacylglycerol và thậm chí là phospholipid [25]. Điều này thể hiện lipase xúc tác
trên các cơ chất glycerol ester có các chuỗi acid béo dài hoặc ngắn khác nhau. Tính
đặc hiệu cơ chất đƣợc xác định bằng cách ủ enzyme với cơ chất và xác định hoạt độ
enzyme. Cơ chất đƣợc sử dụng là các ester của p–nitrophenyl có chiều dài chuỗi
carbon khác nhau. Trong một số nghiên cứu, cơ chất triglyceride với các chuỗi acid
béo bão hòa, chƣa bão hòa khác nhau cũng đƣợc sử dụng để xác định tính đặc hiệu
cơ chất của lipase. Theo nghiên cứu của S. Abdekafi và cộng sự cho thấy enzyme
chiết tách từ mủ đu đủ có tính đặc hiệu cơ chất trên tributyrin với hoạt độ cao nhất
(168 ± 9,8 U/mg) so với cơ chất trioctanoin (14 ± 3,0 U/mg) và dầu oliu (8 ± 1,3
U/mg) [17].
- Đặc hiệu vị trí (Regioselective): lipase chỉ thủy phân triacylglycerol ở vị trí
liên kết C1 và C3 của glycerol, tạo ra acid béo, 2-monoacylglycerol và 1,2 hoặc 2,3 -

10


diacylglycerol, hai chất này khơng bền, chuyển nhóm acyl tạo sản phẩm 1,3 diacylglycerol và 1- hoặc 3–monoacylglycerol. Đối với lipase khơng có tính đặc
hiệu vị trí, chúng xúc tác thủy phân hoàn toàn triacylglycerol thành các acid béo và

glycerol một cách ngẫu nhiên, tạo mono- và diacylglycerol là sản phẩm trung gian
(Hình 1.3) [25].

Hình 1.3. Phản ứng xúc tác bởi lipase khơng đặc hiệu và đặc hiệu vị trí sn 1,
sn 3 [25]
- Đặc hiệu quang học: lipase thể hiện khả năng phân biệt các dạng đồng phân
trong hỗn hợp đồng phân quang học [25].

1.1.4. Các hệ phản ứng cho lipase xúc tác
Lipase là enzyme xúc tác thủy phân dầu/chất béo trong hệ dị thể và phản ứng
diễn ra tại bề mặt liên pha dầu và nƣớc, do đó tốc độ phản ứng phụ thuộc phần lớn
vào bề mặt liên pha [101]. Để tạo đƣợc bề mặt liên pha lớn, các hệ phản ứng khác
nhau đã đƣợc nghiên cứu trong quá trình thủy phân dầu cá sử dụng lipase để xúc tác
nhƣ hệ nhũ tƣơng và hệ 2 pha.
- Hệ nhũ tƣơng: là hỗn hợp của hai chất lỏng không tan lẫn nhau. Một chất
(pha phân tán) đƣợc phân tán trong chất kia. Chất nhũ hóa thƣờng là chất ổn định
làm bền hệ nhũ tƣơng, thƣờng là chất hoạt động bề mặt. Hạn chế chính của hệ này
đối với quá trình thủy phân lipid là cần năng lƣợng lớn cho q trình đồng hóa để
tạo hệ phân tán mịn với sự có mặt của chất hoạt động bề mặt thích hợp và cho quá

11


trình ly tâm tách sản phẩm, cơ chất sau phản ứng [58]. Hai loại chất lỏng khác nhau
có thể tạo nên hai loại hệ nhũ tƣơng, ví dụ nhƣ nƣớc và dầu có thể tạo thành các nhũ
tƣơng nhƣ nƣớc trong dầu và dầu trong nƣớc [71].
- Hệ 2 pha: là hệ trong đó tồn tại hai pha lỏng riêng biệt và các pha không
trộn lẫn với nhau, chỉ các chất phản ứng hoặc sản phẩm có thể di chuyển từ pha này
sang pha khác. Quá trình thủy phân dầu đƣợc tiến hành trong hệ 2 pha iso octan/nƣớc để khắc phục một số hạn chế của hệ nhũ tƣơng. Trong hệ này, các
enzyme thủy phân dễ dàng hơn và cần ít chi phí hơn. Vì cơ chất dầu đƣợc hòa tan

trong iso - octan và trộn với enzyme trong pha nƣớc bằng cách khuấy trộn mà
không cần năng lƣợng lớn để tạo hệ nhũ tƣơng. Ƣu điểm của hệ này là dễ dàng phân
tách chất xúc tác và sản phẩm, giảm sự ức chế của cơ chất hoặc sản phẩm. Tuy
nhiên, dung mơi hữu cơ có thể làm biến tính enzyme khi xúc tác [29].

1.2. Lipase thực vật
1.2.1. Khả năng xúc tác của lipase thực vật
Lipase thực vật đƣợc tìm thấy ở hầu hết các hạt có dầu. Lipase có khả năng
xúc tác cho các phản ứng thủy phân hoặc tổng hợp nhiều loại cơ chất khác nhau.
Lipase từ thực vật có một số ƣu điểm vƣợt trội hơn so với lipase từ động vật, vi sinh
vật bao gồm: có tính đặc hiệu cao, giá thành thấp và đƣợc thu nhận từ những nguồn
thực vật có sẵn trong tự nhiên mà không cần đến công nghệ biến đổi gen để tạo ra
[25]. Lipase thực vật đƣợc chiết tách thô từ các nguồn sẵn có nhƣ các loại hạt, mủ
các loại quả, phụ phẩm nơng nghiệp có thể đƣợc ứng dụng trực tiếp ngay trong thực
phẩm mà không độc hại đối với con ngƣời. Do đó, việc khai thác nguồn enzyme
lipase từ thực vật đƣợc đánh giá có tiềm năng đem lại những lợi ích lớn về mặt kinh
tế cho ngành công nghệ enzyme.
Lipase thực vật bao gồm các lipid acylhydrolase không đặc hiệu,
phospholipase A1, A2, B, C, D, monoacylglycerol và triacylglycerol lipase.
Triacylglycerol acylhydrolase (TAG) lipase đƣợc tìm thấy chủ yếu trong các loại
hạt có nhiều năng lƣợng nhƣ hạt có chứa nhiều chất béo. Enzyme bền trong khoảng
pH từ 4 đến 9; nhiệt độ từ 25 oC đến 60 oC và có khối lƣợng phân tử khoảng 19 -

12