Nghiên cứu thu nhận, đánh giá đặc tính của lipase thực vật và khả năng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm TT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

PHAN THỊ VIỆT HÀ

NGHIÊN CỨU THU NHẬN, ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH CỦA
LIPASE THỰC VẬT VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG
TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm
Mã số: 62 54 01 01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

ĐÀ NẴNG – 2021


Cơng trình được hồn thành tại
ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1. PGS.TS ĐẶNG MINH NHẬT
2. PGS.TS TRẦN THỊ XÔ

Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:

Luận án được bảo vệ tại hội đồng chấm luận văn tiến sĩ họp tại
Đại học Đà Nẵng vào ngày tháng năm 2021

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
- Trung tâm Thông tin- Học liệu và Truyền thông, ĐH Đà Nẵng


1
MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài
Lipase hay Triacylglycerol acylhydrolases (E.C. 3.1.1.3) là loại
enzyme xúc tác phản ứng thủy phân triacylglycerol mạch dài tạo thành
diacylglycerol, monoacylglycerol, glycerol và các acid béo tự do tại
các bề mặt liên pha giữa nước và dung mơi hữu cơ. Ngồi ra, lipase
cịn xúc tác các phản ứng chuyển vị ester và cả phản ứng tổng hợp
ester. Lipase được thu nhận từ vi khuẩn (45%), nấm (21%), động vật
(18%), thực vật (11%) và vi tảo (3%). So với lipase từ vi sinh vật,
lipase từ thực vật có những ưu điểm quan trọng như: dễ được người
tiêu dùng chấp nhận trong thực phẩm, dược phẩm hơn, ngay ở cả dạng
enzyme thô; nguồn nguyên liệu để thu nhận có sẵn trong tự nhiên,
khơng độc hại. Lipase thực vật được cho là có tiềm năng ứng dụng tốt
trong công nghệ thực phẩm, chất tẩy rửa, tổng hợp các chất hữu cơ,
dược phẩm và cả trong sản xuất biodiesel. Lipase thực vật được tìm
thấy trong các loại hạt chứa dầu, ngũ cốc cũng như mủ các loại quả.
Trên thế giới đến nay chỉ mới 29 loại lipase từ thực vật đã được xác
định khối lượng phân tử cũng như trình tự acid amin trong chuỗi
protein. Những cơng trình nghiên cứu trong nước về lipase cịn ít, đặc
biệt lipase từ thực vật là lĩnh vực hầu như không được quan tâm. Do
đó, đề tài được chọn cho luận án: "Nghiên cứu thu nhận, đánh giá đặc
tính của lipase thực vật và khả năng ứng dụng trong cơng nghiệp thực
phẩm" có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao.

2. Mục tiêu nghiên cứu
Đánh giá hoạt tính lipase thu nhận từ một số nguồn thực vật:
hạt có dầu, phụ phẩm nơng nghiệp, mủ các loại quả; Xây dựng quy
trình cơng nghệ thu nhận lipase thô từ nguồn thực vật tiềm năng; Xác
định đặc tính của lipase thơ và lipase tinh sạch; Đánh giá khả năng
ứng dụng lipase thô trong công nghiệp thực phẩm.


2
3. Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu lựa chọn nguồn nguyên liệu thực vật thích hợp để
thu nhận lipase; Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ lipase
thu được; Nghiên cứu xây dựng quy trình thu nhận lipase thơ có hoạt
độ cao từ nguyên liệu đã lựa chọn; Nghiên cứu khảo sát các đặc tính
hố sinh của lipase thơ; Nghiên cứu tinh sạch lipase thơ và xác định
đặc tính hố sinh; Nghiên cứu ứng dụng lipase thơ trong quy trình
sản xuất dầu cá giàu DHA và EPA.
4. Phƣơng pháp nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu trong luận án là phương pháp nghiên
cứu thực nghiệm kết hợp với phân tích lý thuyết và tổng hợp tài liệu.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Đánh giá được khả năng thu nhận lipase từ một số nguồn
nguyên liệu thực vật, ảnh hưởng của các yếu tố đến hoạt độ của chế
phẩm, từ đó xác định được nguồn nguyên liệu thực vật có tiềm năng
để khai thác enzyme lipase; Đề xuất được quy trình thu lipase thơ từ
nguồn thực vật có hiệu quả cao; Xác định được tính đặc hiệu đối với
cơ chất lipid của lipase thô thu nhận được từ nguồn thực vật; Đề xuất
phương pháp tinh sạch lipase thô từ mủ đu đủ và xác định khối lượng
phân tử của lipase.
Tận dụng phế phẩm của quá trình thu papain từ mủ đu đủ để

sản xuất lipase thô. Ứng dụng lipase thô từ mủ đu đủ để thủy phân
dầu cá hồi nhằm thu acid béo tạo tiền đề cho quá trình làm giàu
DHA, EPA ứng dụng trong cơng nghiệp thực phẩm.
6. Cấu trúc của luận án
Luận án gồm phần mở đầu; Chương 1. Tổng quan; Chương 2.
Phương pháp nghiên cứu; Chương 3. Kết quả và thảo luận; kết luận
và kiến nghị.


3
CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về lipase
Lipase (Triacylglycerol acylhydrolases EC 3.1.1.3) thuộc lớp
hydrolase, là enzyme xúc tác phản ứng thủy phân triglyceride để tạo
glycerol và acid béo tự do tại bề mặt liên pha dầu – nước. Ngồi ra,
lipase cịn xúc tác phản ứng chuyển vị ester và tổng hợp ester.
1.2. Lipase thực vật
Lipase thực vật có nhiều ở các hạt có dầu, chứa nhiều
triacylglycerol. Đối với các hạt ngũ cốc, lipase được xác định có
trong lớp vỏ như cám gạo, phơi lúa mì. Ngồi ra, lipase cịn được tìm
thấy trong các loại mủ các loại quả như mủ sung, mủ vả, mủ xương
rồng và mủ đu đủ.
1.3. Ứng dụng của lipase thực vật
Lipase được ứng dụng trong sản xuất thực phẩm để tạo ra các
acid béo trong các sản phẩm thực phẩm bằng phản ứng thủy phân
chọn lọc chất béo và dầu có trong thực phẩm. Lipase thơ từ mủ đu đủ
(CPL) đã được nghiên cứu ứng dụng trong tổng hợp các
triacylglycerol chuỗi ngắn và chuỗi dài dùng trong sữa công thức cho
trẻ sơ sinh, tổng hợp triacylglycerol cấu trúc. CPL còn được sử dụng

để tổng hợp bơ ca cao nhân tạo. Từ những ứng dụng trên của CPL
cho thấy nó có tiềm năng ứng dụng thương mại lớn trong ngành cơng
nghệ thực phẩm.
1.6.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trên thế giới các nghiên cứu về lipase thực vật chủ yếu là
chiết tách, xác định đặc tính, tinh sạch và xác định khối lượng phân
tử. Trong những năm gần đây, lipase từ mủ đu đủ được quan tâm
nghiên cứu nhiều về đặc tính cũng như ứng dụng. Năm 2011, Slim


4
Abdelkafi cũng đã chiết tách enzyme thủy phân từ mủ đu đủ, xác
định đặc tính hóa sinh và khẳng định enzyme chiết được thể hiện
hoạt tính esterase hơn là lipase. Lipase thô được xem là loại lipase
“cố định” tự nhiên trong mủ, mặc dù đã được nghiên cứu nhưng các
nhà khoa học chưa thể tách được lipase ra khỏi mủ đu đủ, đó là khó
khăn đang cần được nghiên cứu khảo sát. Việc nghiên cứu xây dựng
quy trình thu lipase thơ từ mủ đu đủ vẫn chưa hồn thiện. Nghiên
cứu ứng dụng lipase từ nguồn thực vật cho ngành công nghệ thực
phẩm vẫn còn hạn chế.
CHƢƠNG 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu
Đậu nành (Glycine max): giống ĐTDH.02 do Viện Khoa học
Kỹ thuật Nông nghiệp Duyên hải Nam Trung Bộ cung cấp, đậu
phộng (Arachis hypogaea L.): trồng ở Đắk Lắk, cám gạo: thu nhận từ
nhà máy xay xát lúa ở Quảng Ngãi, phơi lúa mì: thu nhận từ nhà máy
bột mì Việt Ý - Đà Nẵng, mủ đu đủ: thu từ một số vườn đu đủ
(Carica papaya) trồng tại xã Đại An, huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng

Nam, Mủ quả vả (Ficus auriculata) và mủ quả sung (Ficus
racemosa) được thu nhận từ vườn của các hộ nông dân ở các tỉnh
Thừa Thiên Huế.
2.2. Hoá chất
para-Nitrophenyl palmitate (p – NPP), p-Nitrophenol (p- NP),
n-hexan, Sodium Lauroyl sarcosine (SLS) được cung cấp bởi SigmaAldrich; 2-propanol, NaCl của hãng Merck; Triton X-100 của
Canada; Ngoài ra, KCl, MgCl2, CaCl2, NaHCO3, Na2CO3,
CH3COOH,

Gum

Arabic,

CH3COONa,

NaH2PO4.7H2O,

NaH2PO4.7H2O, acetone đều đạt tiêu chuẩn phân tích.


5
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
- Phương pháp hóa học xác định thành phần nguyên liệu: độ
ẩm và hàm lượng tro được xác định theo phương pháp của AOAC
952.08 và AOAC 938.08 (1990), hàm lượng protein thô được xác
định bằng phương pháp Kjeldahl, hàm lượng chất béo được xác định
bằng phương pháp chiết Soxhlet.
- Phương pháp thu nhận lipase từ các nguồn thực vật: đậu
phộng, đậu nành nảy mầm; cám gạo, phơi lúa mì; mủ đu đủ, mủ sung
và mủ vả. Mục tiêu: thu lipase, xác định hoạt độ, khảo sát ảnh hưởng

của các yếu tố nhiệt độ, pH, ion kim loại đến hoạt độ lipase từ đó lựa
chọn nguồn nguyên liệu để thu lipase cho nghiên cứu tiếp theo.
- Phương pháp xác định hoạt độ lipase:
+ Phương pháp chuẩn độ: Đơn vị hoạt độ lipase (U/g hoặc
U/ml) được xác định là lượng enzyme cần thiết để xúc tác giải phóng
ra 1μmol acid béo tự do trong thời gian 1 phút ở điều kiện xác định.
Cơ chất sử dụng trong phương pháp chuẩn độ gồm: dầu oliu,
dầu cá hồi, triolein, tristearin.
+ Phương pháp đo quang: Lipase xúc tác phản ứng thủy phân
cơ chất p-nitrophenyl palmitate (p-NPP) tạo ra p-nitrophenol (p-NP)
biểu hiện màu vàng đặc trưng. Hoạt độ của lipase được xác định
bằng cách đo cường độ màu của dung dịch chứa p-NP trên máy UVVIS ở bước sóng λ = 410 nm.
Đơn vị hoạt độ được tính là lượng enzyme cần thiết để xúc
tác giải phóng ra 1 µmol p-NP trong một phút.
Hiệu suất thu nhận lipase (mU/g) được xác định bằng tổng
hoạt độ lipase (mU) thu nhận được từ 1 gam nguyên liệu ban đầu.
Tổng hoạt độ lipase = hoạt độ lipase thơ ×khối lượng lipase thơ thu
được (2.1)


6
(2.2)
- Phương pháp xây dựng quy trình thu lipase thơ từ mủ đu đủ:
xác định phương pháp bảo quản mủ đu đủ bằng phơi nắng, sấy đối
lưu, sấy thăng hoa, trữ đông; nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ mủ đu đủ/
nước để rửa lượng tạp chất, nghiên cứu xác định số lần lặp rửa/ly
tâm, nghiên cứu xác định phương pháp sấy để thu lipase thô.
- Phương pháp chiết tách và tinh sạch lipase từ mủ đu đủ:
dùng dung dịch Tris HCl 0,1M pH 8 có chứa SLS 0,5% để hịa tan
lipase thô, kết hợp các phương pháp kết tủa phân đoạn lipase với

muối amoni sunfat, thẩm tách qua màn Cellophan, sắc ký trao đổi
ion trên cột sắc ký HiTrap Q Sepharose Fast flow. Mục tiêu: thu
nhận lipase tinh sạch từ mủ đu đủ.
- Phương pháp xác định tính chất của lipase tinh sạch: khối
lượng phân tử lipase được xác định bằng phương pháp điện di SDS,
giá trị Km và Vmax được xác định dựa trên phương trình Lineweaver –
Burk.
- Phương pháp nghiên cứu ứng dụng lipase thô từ mủ đu đủ:
phương pháp thu nhận dầu cá hồi, các chỉ số acid, chỉ số xà phịng
hóa, chỉ số iod của dầu cá được xác định lần lượt theo TCVN
6127:2010, TCVN 6126:2015, TCVN 6122:2010; thành phần các
acid béo có trong dầu cá hồi được xác định theo phương pháp AOAC
996.06; phương pháp thủy phân dầu cá hồi bằng CPL trong hệ nhũ
tương dầu/nước và hệ 2 pha iso-octan/nước được xác định thông qua
hiệu suất thủy phân DH %
(2.3)


7
- Phương pháp xác định năng lượng hoạt hóa (EA) của phản
ứng thủy phân dầu cá hồi bằng CPL được xác định dựa trên đồ thị
phương trình Arrhenius.
- Các phương pháp tốn học: tối ưu hóa q trình thủy phân
dầu cá hồi bằng CPL bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm tâm
xoay cấp II theo Box và Hunter, sử dụng phần mềm Minitab 18 để
xử lý số liệu thực nghiệm.
Các thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp để lấy giá trị
trung bình và xác định độ lệch chuẩn bằng Microsoft Excel. Sự khác
biệt có nghĩa giữa các kết quả thí nghiệm được đánh giá bằng kiểm
định Fisher (p  0,05) bằng phần mềm Minitab 18.

Các chữ số a, b, c, ... trên các đồ thị và các bảng thể hiện sự
khác biệt có nghĩa của các kết quả nghiên cứu.
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Đánh giá khả năng thu nhận lipase từ một số nguồn thực vật
3.1.1. Hoạt tính lipase từ các loại hạt có dầu nảy mầm
3.1.1.2. Ảnh hưởng của thời gian nảy mầm đến hoạt tính lipase của
hạt đậu nành và đậu phộng nảy mầm
Lipase từ hạt chứa dầu được tìm thấy có hoạt độ cao trong giai
đoạn nảy mầm. Kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt độ lipase tối đa từ
đậu nành nảy mầm thu được sau 3 ngày (0,82U/ml) trên cơ chất dầu
oliu. Giá trị này cao hơn so với hoạt độ lipase tối đa từ hạt đậu phộng
nảy mầm (0,72 U/ml). Do đó lipase từ hạt đậu nành nảy mầm được
lựa chọn để nghiên cứu các đặc tính tiếp theo.
3.1.1.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ lipase từ hạt đậu
nành nảy mầm
Từ 20 gam đậu nành nảy mầm thu được 2,08 gam lipase thô.


8
Kết quả nghiên cứu cho thấy lipase từ hạt đậu nành nảy mầm
hoạt động tối ưu ở 30 oC, pH 9 trên cơ chất p-NPP. Các ion kim loại
Ca2+, Mg2+ ở nồng độ 0,1M làm tăng hoạt độ của lipase từ đậu nành
nảy mầm, Na+ và K+ làm giảm hoạt độ của lipase từ đậu nành nảy
mầm.
3.1.2. Hoạt tính lipase từ phụ phẩm nơng nghiệp: cám gạo và phơi
lúa mì
Kết quả nghiên cứu cho thấy từ 40 g cám gạo thu được
176,6 ml dịch enzyme thô; từ 40 g phôi lúa mì thu được 182 ml dịch

enzyme thơ.
Lipase từ cám gạo và phơi lúa mì có cùng nhiệt độ tối ưu ở
45 °C. Lipase cám gạo hoạt động tối ưu ở pH 8 với hoạt độ lipase
0,238 mU/ml. Lipase từ phơi lúa mì hoạt động tối ưu ở pH 9,5 với
hoạt độ 0,199 mU/ml. Sự có mặt của các ion kim loại như Mg2+,
Cu2+, Na+, Mn2+ và EDTA ở nồng độ 0,1M đều làm giảm hoạt độ
lipase cám gạo, lipase phơi lúa mì.
3.1.3. Hoạt tính lipase từ mủ của các loại quả
Từ 17,25 g mủ đu đủ tươi thu được 0,58 g lipase thô. Lipase
thô từ mủ đu đủ (CPL) hoạt động tối ưu ở 45 oC, pH 8,5 với hoạt độ
lớn nhất đạt được là 120,43 mU/g trên cơ chất p-NPP.
Từ 71,58 g mủ vả thu được 49,34 ml dịch lipase thô. Từ 60,25
g mủ sung thu được 41,69 ml dịch lipase thô.
Lipase từ mủ sung và mủ vả có cùng nhiệt độ tối ưu 45 oC trên
cùng cơ chất p – NPP. Lipase từ mủ sung hoạt động tối ưu ở pH 8,5
còn lipase từ mủ vả hoạt động tối ưu ở pH 9. Sự có mặt của các ion
K+, Ca2+, Mg2+, Zn2+, EDTA ở nồng độ 0,1M đều làm giảm hoạt độ
của lipase từ mủ sung và mủ vả.


9
3.1.4. Đánh giá khả năng thu nhận lipase từ các nguồn thực vật
khác nhau
Từ các kết quả nghiên cứu thu nhận lipase và khảo sát các yếu
tố ảnh hưởng đến hoạt độ lipase từ các nguồn thực vật khác nhau ở
các thí nghiệm trên, khả năng thu nhận lipase thơ từ các nguồn thực
vật có thể được tổng kết ở Bảng 3.4.
Bảng 3.4. Hiệu quả thu nhận lipase từ các nguồn thực vật
Hiệu quả
Dạng

Điều kiện
thu nhận
Nguồn
Hoạt độ riêng
STT
chế phẩm hoạt động
lipase
thu nhận
của chế phẩm
lipase thô
tối ƣu
(mU/g nguyên
liệu)

1

Đậu nành
Bột
nảy mầm

2

Mủ đu đủ Bột

3

Cám gạo Dịch lỏng

4

Phơi lúa
mì

Dịch lỏng

5

Mủ vả

Dịch lỏng

6

Mủ sung Dịch lỏng

30 oC,
pH = 9
45 oC,
pH = 8,5
45 oC,
pH = 8
45 oC,
pH = 9,5
45 oC,
pH = 9
45 oC,
pH = 8,5

11,17 mU/g

1,16

120,43 mU/g

4,05

0,238 mU/ml

1,05

0,199 mU/ml

0,91

0,079 mU/ml

0,054

0,096 mU/ml

0,066

Từ Bảng 3.4 cho thấy ở điều kiện nhiệt độ, pH tối ưu của
từng loại lipase thì lipase từ mủ đu đủ có hoạt độ riêng cao nhất
(120,43 mU/g). Hiệu quả thu nhận lipase, tức tổng hoạt độ lipase thu
được từ 1 gam nguyên liệu của mủ đu đủ là 4,05 mU/g cũng cao
nhất. Trong số các nguồn thực vật trên, việc khai thác lipase từ mủ
đu đủ là nhiều tiềm năng nhất. Vì mủ đu đủ từ lâu đã được khai thác
để thu nhận papain ở quy mô công nghiệp, nên đây là nguồn nguyên

10
liệu dễ kiếm, rẻ tiền. Vì lipase có ở phần rắn khơng tan của mủ đu
đủ, papain có trong phần hoà tan được trong nước của mủ đu đủ,
điều này cho phép thu nhận đồng thời lipase và papain từ một nguồn
nguyên liệu và trong một quy trình kết hợp.
Cho đến nay, chưa có một quy trình thu nhận lipase từ mủ đu
đủ với đầy đủ các thông số tối ưu được cơng bố, do đó mủ đu đủ
được chọn là đối tượng để nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất
lipase thô và đánh giá khả năng ứng dụng của nó trong các nghiên
cứu tiếp theo của luận án.
3.2. Thu nhận enzyme lipase thô từ mủ đu đủ
3.2.1. Nghiên cứu phương pháp sấy để bảo quản mủ đu đủ
Từ nguồn mủ thô ban đầu thu nhận trực tiếp từ quả đu đủ
vào lúc sáng sớm, mủ đu đủ được đem đi làm khô đến khối lượng
không đổi theo 3 phương pháp khác nhau: phơi nắng, sấy đối lưu
(55 oC, 36 giờ), sấy thăng hoa (-40 oC, 16 giờ).
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của các phương pháp sấy khác nhau lên
hoạt độ lipase
Phương pháp sấy

Độ ẩm

Hoạt độ lipase

nguyên liệu ban đầu

(%)

(mU/g CK)

Phơi nắng

11,8

27,68 ± 1,02

Sấy đối lưu

11,3

18,22 ± 0,78

Sấy thăng hoa

9,13

120,35 ± 4,59

Mủ đu đủ sau sấy thăng hoa có hoạt độ cao nhất (120,35 mU/g
CK), cao gần gấp 4 lần so với phương pháp sấy đối lưu và hơn 6 lần
so với phơi nắng. Vậy sấy thăng hoa là phương pháp sấy tốt nhất để
làm khô mủ đu đủ trước khi bảo quản trong số các phương pháp sấy
đã nghiên cứu.
b) Nghiên cứu bảo quản mủ đu đu tươi bằng phương pháp lạnh đông


11
Kết quả theo dõi hoạt độ lipase sau các khoảng thời gian trữ đông
được thể hiện ở Bảng 3.6.

Bảng 3.6. Sự thay đổi hoạt độ lipase của mủ đu đủ
theo gian trữ đông
Thời gian trữ đông (tuần)
Hoạt độ lipase (mU/g CK)
Mẫu đối chứng
129,61 ± 7,08a
1
128,88 ± 7,46ab
2
127,00 ± 7,35ab
3
126,08 ± 8,64ab
4
123,51 ± 5,86ab
5
117,37 ± 7,30bc
6
109,74 ± 8,64c
Kết quả cho thấy hoạt độ lipase thu được từ mủ đu đủ tươi
cấp đơng đến 5 tuần có hoạt độ tương đương với hoạt độ lipase thu
được từ mủ khô sau khi sấy thăng hoa.
Do đó nếu thu lipase từ nguyên liệu mủ tươi thì mủ đu đủ có
thể bảo quản trữ đơng đến 5 tuần, còn nếu mủ cần để thời gian dài thì
chọn phương pháp sấy thăng hoa mủ là tối ưu.
3.2.2. Thu nhận enzyme thô
3.2.2.1. Chọn tỷ lệ mủ đu đủ/ nước
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước đến hiệu quả
thu nhận lipase thô
STT Tỷ lệ mủ đu đủ/nước Khối lượng lipase thô
(w/w)

(g)
1
1:4
1,9861±0,0343
2
1:5
1,6927±0,0082
3
1:6
1,3626±0,0376
4
1:7
1,1382±0,0125
5
1:8
1,1315±0,0148
6
1:9
1,1250±0,0110

Độ ẩm
(%)
9,54
9,56
9,57
9,54
9,55
9,54

12
Kết quả Bảng 3.7 cho thấy khi tăng dần lượng nước hòa tan
mủ đu đủ theo tỷ lệ từ 1:4 đến 1:7 thì lượng lipase thơ thu được giảm
dần chứng tỏ lượng tạp chất hòa tan được nhiều hơn. Tuy nhiên, khi
lượng nước tăng thêm đến tỷ lệ 1:9 thì khối lượng lipase thô thay đổi

80

85
80
75
70
65
60
55
50
45
40
35
30

Hoạt độ riêng lipase (mU/g)

70
60
50
40
30
20
10

0
1:4

Hoạt độ lipase tổng (mU)

không đáng kể.

1:5
1:6
1:7
1:8
1:9
Tỷ lệ mủ đu đủ/nƣớc
Hoạt độ riêng lipase (mU/g)
Hoạt độ lipase tổng (mU)

Hình 3.18. Ảnh hưởng của tỷ lệ mủ đu đủ/nước đến
hoạt độ riêng và hoạt độ tổng của CPL
Trong khi đó, kết quả ở Hình 3.18 cho thấy hoạt độ riêng của
lipase thơ cũng tăng dần khi lượng nước hòa tan tăng nhưng hoạt độ
tổng vẫn giảm không đáng kể. Điều này chứng tỏ ở tỷ lệ mủ đu
đủ/nước là 1:7 là lượng nước thích hợp cho q trình hịa tan mủ đu
đủ thu lipase thơ.

3.2.2.2. Chọn số lần lặp rửa-ly tâm
Q trình rửa mủ đu đủ nếu lặp lại nhiều lần có thể làm tăng
khả năng hòa tan các enzyme tan trong nước cũng như lượng tạp
chất có trong mủ. Dựa vào kết quả nghiên cứu trên, chọn tỷ lệ mủ đu
đủ/ nước là 1:7 để rửa lipase.

13
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của số lần lặp rửa – ly tâm đến hiệu quả thu
nhận lipase thô
STT

Số lần lặp rửa - ly tâm

Khối lượng lipase thô

Độ ẩm

1

1

1,1378±0,0107

9,59

2

2

0,8959±0,0195

9,55

3

3

0,6386±0,0154

9,56

4

4

0,6333±0,0176

9,54

5

5

0,6324±0,0068

9,57

Kết quả ở Bảng 3.8 cho thấy cho thấy nếu số lần lặp rửa ly
tâm tăng từ 1 đến 3 lần thì khối lượng lipase thơ thu được cũng giảm
từ 1,1378g xuống cịn 0,6386g. Dễ dàng nhận thấy số lần lặp tăng thì
khả năng hòa tan tạp chất trong nước của mủ đu đủ cũng tăng. Nếu
tăng số lần lặp rửa – ly tâm lên 4 lần thì lượng lipase thơ thu được

Hoạt độ riêng lipase (mU/g)

140

80
75
70
65
60
55
50
45
40
35
30

120
100
80
60
40
20
0
1

2

3

4

5

Hoạt độ lipase tổng (mU)

thay đổi không đáng kể.

Số lần lặp rửa - ly tâm
Hoạt độ riêng lipase (mU/g)

Hoạt độ lipase tổng (mU)

Hình 3.19. Ảnh hưởng của số lần lặp rửa – ly tâm đến
hoạt độ riêng và hoạt độ tổng của CPL.
3.2.2.3. Nghiên cứu phương pháp sấy để thu lipase thô


14
Phần rắn thu được sau ly tâm cần được sấy khô đến độ ẩm
bảo quản để thu chế phẩm enzyme thơ. Mục đích nghiên cứu nhằm
đánh giá hoạt độ của chế phẩm lipase thô từ mủ đu đủ theo 2 phương
pháp sấy khơ khác nhau. Từ đó đề xuất được quy trình thu nhận chế
phẩm lipase thơ từ mủ đu đủ.
Bảng 3.9. Hoạt độ của chế phẩm lipase thô thu bằng 2 phương
pháp sấy khác nhau
Phương pháp sấy
Độ ẩm
Hoạt độ
kết thúc
(%)
(mU/ g enzyme khô)
Sấy thăng hoa

9,13
120,349
(-40 oC, 24 giờ)
Sấy đối lưu
9,55
32,069
(55 oC, 36 giờ)
Kết quả cho thấy hoạt độ lipase thô thu được của mẫu sau
khi sấy thăng hoa (120,349 mU/g) cao hơn nhiều so với mẫu lipase
thô sau khi sấy đối lưu (32,069 mU/g). Do đó lipase thu nhận được
bằng phương pháp sấy thăng hoa sẽ bảo toàn được hoạt tính lipase.
3.2.2.4. Đề xuất quy trình thu lipase thơ
Dựa vào kết quả nghiên cứu trên, quy trình thu lipase thơ từ
mủ đu đủ có thể được đề xuất trên Hình 3.21.


15

Mủ đu đủ

Bảo quản lạnh đông
Rã đông
Nƣớc cất
Ngâm, rửa tạp chất (5 phút)

Tỷ lệ mủ đu đủ/nƣớc
Lặp lại 3 lần
(1:7; w/w)

o

Ly tâm (6000 vòng, 20 phút, 4 C)

Dịch thải

o

Sấy thăng hoa (-40 C, 16 giờ )

Lipase thơ CPL)

Hình 3.21. Quy trình thu lipase thơ từ mủ đu đủ
3.3. Tinh sạch enzyme lipase từ mủ đu đủ
3.3.1. Chiết tách lipase mủ đu đủ bằng muối sodium lauroyl
sarcosinate (SLS)
Tiến hành hòa tan lipase thơ trong dung dịch Tris HCl 0,1M,
pH 8 có SLS 0,5%, kết quả của quá trình thu được ở Bảng 3.11.
Bảng 3.11. Hoạt tính của CPL sau hịa tan mà khơng loại lipid
Mẫu

Phần rắn

Phần lỏng

Khối lượng/thể tích 1,016 g

0,498g

97mL

Hoạt độ riêng

115,07mU/g

20,83mU/g 50,16mU/mL

Hoạt độ tổng

116,91mU

10,37mU

Lipase thô

4865,5mU


16
Kết quả cho thấy hoạt tính của lipase có cả ở phần rắn và phần
lỏng. Hoạt tính cịn lại trong phần rắn (10,37 mU) chỉ chiếm 8,87% so
với hoạt tính ban đầu của lipase thơ. Tuy nhiên, hoạt tính lipase trong
phần dịch lỏng cao gấp 40 lần so với dịch lỏng có loại lipid ở phương
pháp trước. Sự tăng vượt trội về hoạt độ lipase cho thấy rằng một lượng
lipase đáng kể trong mủ đã được SLS hòa tan ra khỏi mủ.
3.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ SLS lên hoạt độ lipase
Kết quả dung dịch Tris HCl pH 8 có SLS 0,5% sử dụng để hòa
tan mủ đu đủ thu lipase có hoạt độ cao nhất.
3.3.3. Tủa lipase bằng dung dịch amoni sunfat (AS)
Dịch thu được sau khi hòa tan mủ đu đủ trong dung dịch Tris
HCl pH 8 có SLS 0,5% được tủa bằng dung dịch AS ở các nồng độ

khác nhau. Kết quả cho thấy ở phân đoạn 50-60% AS có hoạt tính
thủy phân tốt và khối lượng lipase tủa lớn nhất nên phân đoạn này
được chọn để tinh sạch bằng sắc ký trao đổi ion.
3.3.5. Kết quả tinh sạch enzyme lipase từ mủ đu đủ bằng sắc ký
trao đổi ion
Mẫu ở phân đoạn tủa 50-60% AS được thẩm tách muối qua
màn Cellophan trong 48 giờ sau đó được nạp vào cột sắc ký trao đổi
ion. Sử dụng cột Q Sepharose Fast Flow với điều kiện tách phân
đoạn như sau: cột được cân bằng trong đệm Tris-HCl 0,01M, pH 9;
tốc độ chảy 0,1ml/phút với gradient nồng độ 1M NaCl.

Hình 3.27. Sắc ký đồ của phân đoạn lipase tủa ở 50-60% AS


17
Kết quả trên Hình 3.27 cho thấy có xuất hiện 2 peak chứng tỏ
có ít nhất 2 loại protein có trong mẫu. Peak đầu tiên được rửa giải từ
2,58 phút đến 6,87 phút, tiếp theo peak thứ 2 xuất hiện từ 6,87 phút
đến 11,29 phút. Hoạt độ của lipase được xác định tương ứng với 2
peak là 0,316mU/mL và 0,338mU/mL.
3.4. Nghiên cứu tính chất của lipase tinh sạch
3.4.1. Xác định khối lượng phân tử lipase
Kết quả Hình 3.28 cho thấy có 2 loại lipase có khối lượng
phân tử trong khoảng 35-55 kDa trong phân đoạn tủa với AS
50-60%.

M: standard proteins (10-170 kDa)
1-3: mẫu lặp ở phân đoạn tủa AS 50-60%

Hình 3.28. Hình ảnh điện di SDS

3.4.2. Xác định Km và Vmax
Theo đồ thị Lineweaver-Burk
trên Hình 3.29, giá trị Km và
Vmax của lipase tinh sạch từ
mủ đu đủ khi thủy phân cơ
chất p – NPP được xác định
tương ứng là 1,12mM và
1,2×10-6 mM/min.mL.
Hình 3.29. Đồ thị Lineweaver-Burk


18
3.5. Đánh giá khả năng ứng dụng lipase mủ đu đủ trong quy
trình sản xuất dầu cá giàu DHA và EPA
3.5.3.1. Khảo sát đặc tính thủy phân của CPL trên cơ chất dầu cá
hồi
Bảng 3.1. Phần trăm acid béo có trong dầu cá hồi trước
và sau khi thủy phân
ST
T

Acid béo methyl ester
Kí
hiệu

Tên thơng thường

%
trong
mẫu

ban
đầu

% trong
phân đoạn
dầu khơng
bị thuỷ
phân

1

C14:0

Myristic acid methyl ester

3,23

2,64

2

C16:0

Palmitic acid ester

12,17

10,59

3

C16:1

Palmitoleic acid methyl ester

3,22

2,96

4

C18:0

Stearic acid methyl ester

2,99

2,9

5

C18:1

Oleic acid methyl ester

40,89

40,93

6

C18:2

Linoleic acid methyl ester

16,78

15,96

7

C20:0

Arachidic acid methyl ester

0,36

0

8

C18:3

Linolenic acid methyl ester

6,08

5,83

9

C20:1

cis-11-Eicosenoic acid methyl ester

0,99

2,59

2,52

0,95

5,1

4,97

5,66

7,73

0

0,25

0

0,83

cis-11,14-Eicosadienoic acid methyl

ester
cis-5,8,11,14,17-Eicosapentaenoic
acid methyl ester (EPA)
Cis-4,7,10,13,16,19-Docosahexaenoic
acid methyl ester (DHA)
cis-8,11,14-Eicosatrienoic acid
methyl ester
cis-11,14,17-Eicosatrienoic acid
methyl ester

10

C20:2

11

C20:5

12

C22:6

13

C20:3

14

C20:3

15

C22:1

Erucic acid methyl ester

0

0,32

16

C20:4

Arachidonic acid methyl ester

0

0,56


19
Thành phần của các acid béo có trong dầu cá hồi trước và
sau khi thủy phân được xác định bằng phương pháp sắc ký khí thể
hiện ở Bảng 3.15. Sau thời gian thủy phân 24 giờ, cho thấy tỷ lệ %
của các acid béo cịn lại trong mẫu triglyceride khơng bị thủy phân
so với mẫu dầu ban đầu khác nhau không đáng kể. Điều này cho thấy
CPL xúc tác thủy phân khơng đặc hiệu với các acid béo có trong dầu
cá hồi.
3.5.3.2. Tối ưu hóa q trình thủy phân dầu cá hồi bởi CPL

a. Xác định nhiệt độ và pH tối ưu cho hiệu suất của quá trình thủy
phân dầu cá hồi bằng CPL
Thực hiện tối ưu hóa điều kiện thủy phân dầu cá bởi CPL bằng
công cụ tối ưu hoá của phần mềm Minitab 18.0 cho kết quả nhiệt độ
tối ưu là 290C và pH tối ưu là 7,6.
b. Xác định tỷ lệ nước/cơ chất và nồng độ enzyme tối ưu cho hiệu
suất của quá trình thủy phân dầu cá hồi bằng CPL
Kết quả tối ưu hóa bằng phần mềm Minitab 18.0 cho biết ở
điều kiện thủy phân với tỷ lệ nước/cơ chất 4,36 và nồng độ enzyme
1,34% hiệu suất thủy phân đạt cao nhất 49,4%.
c. Thí nghiệm kiểm chứng
Tiến hành thủy phân dầu cá hồi bằng CPL với các điều kiện
tối ưu: nhiệt độ 29 oC, pH đệm 7,6; tỷ lệ nước/cơ chất 4,36% và nồng
độ enzyme 1,34%. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần cho kết quả hiệu
suất thủy phân là 48,2% ± 0,3%. Kết quả này gần giống với tính tốn
theo lý thuyết.
3.5.3.5. Tối ưu hóa quá trình thủy phân dầu cá hồi bởi CPL trong hệ
2 pha iso-octan/nước
Q trình tối ưu hóa 3 yếu tố: nồng độ enzyme, tỷ lệ dung
môi/cơ chất, nhiệt độ đến quá trình thủy phân dầu cá hồi bằng CPL


20
được thực hiện theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm tâm xoay
Box-Hunter. Thời gian thủy phân là 1 giờ, kết quả hiệu suất thủy
phân thể hiện ở Bảng 3.21.
Bảng 3.21. Hiệu suất của phản ứng thủy phân qua các thí nghiệm
Biến thực
Số thí
nghiệm Nồng độ

enzyme
(x1)

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
T1
T2
T3

1,8
1,6
1,4
1,6
1,4
1,94
1,8
1,4
1,4

1,26
1,6
1,8
1,8
1,6
1,6
1,6
1,6

Tỷ lệ dung
mơi/cơ chất
(x2)

1,5
1,84
1,5
1
1,5
1
0,5
0,5
0,5
1
1
1,5
0,5
0,16
1
1
1

Biến mã hố
Nhiệt độ
X1
(x3)

30
35
30
26,6
40
35
40
30
40
35
43,4
40
30
35
35
35
35

+1
0
-1
0
-1
+α

+1
-1
-1
-α
0
+1
+1
0
0
0
0

Hiệu
suất
(%)

X2

X3

Y

+1
+α
+1
0
+1
0
-1
-1

-1
0
0
+1
-1
-α
0
0
0

-1
0
-1
-α
+1
0
+1
-1
+1
0
+α
+1
-1
0
0
0
0

30,8
32,4

27,5
25,9
31,3
31,9
33,4
26,4
31,9
27,1
32,0
33,1
33,9
30,4
35,0
35,5
36,1

Kết quả thu được phương trình hồi quy thể hiện ảnh hưởng
của các yếu tố đến mục tiêu như sau:
Y = -265,4 + 189,2x1 + 7,42x3 – 44,8x12 – 4,62x22 - 0,081x32
Sử dụng cơng cụ tìm điểm tối ưu của phần mềm Minitab, kết
quả thu được nồng độ enzyme tối ưu là 1,68% tương ứng với 0,084g


21
enzyme cho 1g dầu cá hồi, tỷ lệ dung môi/cơ chất tối ưu là 0,97 và
nhiệt độ tối ưu là 36,4oC. Hiệu suất thủy phân đạt 35,98% ở điều
kiện tối ưu sau khoảng thời gian 1 giờ.
3.5.3.6. Xác định các thơng số động học của q trình thủy phân dầu
cá hồi bởi CPL trong hệ 2 pha iso-octan/nước
a. Xác định Km và Vmax

Các thông số động học Km và Vmax của CPL khi thủy phân cơ
chất dầu cá hồi được xác định tương ứng là 293,3 µmol FAs/ml và
266,4 (µmol FFAs/giờ.ml).
b. Xác định năng lượng hoạt hóa EA
Năng lượng hoạt hóa (EA) của phản ứng thủy phân dầu cá
hồi bằng CPL đã được xác định dựa trên đồ thị phương trình
Arrhenius thể hiện ở Hình 3.38.
-0.8
0.00315

0.0032

0.00325

0.0033

0.00335

lnk

-1
-1.2
-1.4

y = -4873.6x + 14.646
R² = 0.9811

-1.6

1/T (K-1)

Hình 3.38. Đồ thị Arrhenius thủy phân dầu cá bằng CPL
Phương trình ln k  ln A0    E A  tương ứng với
 RT 
y = -4873,6x + 14,646. Từ đây, năng lượng hoạt hóa được xác định
EA = 40,5 kJ/mol. Một phản ứng có năng lượng hoạt hóa càng nhỏ
thì tốc độ phản ứng càng lớn.


22
3.5.3.7. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất của q trình thủy
phân dầu cá trong hệ có iso octan ở điều kiện tối ưu
cho thấy, hiệu suất phản ứng
thủy phân dầu cá hồi xúc tác
bởi CPL ở chế độ thủy phân

Hiệu suất (%)

Từ đồ thị Hình 3.39
80
57d

63.9c 64b 63.9a

60
40

đã chọn tăng dần theo thời

20

gian. Sau thời gian này thì

0

e
0

24

48

hiệu suất thủy phân tăng rất

72

96

120

Thời gian (giờ)

ít và gần như khơng đổi.

Hình 3.39. Biểu đồ ảnh hưởng của

Ngun nhân có thể do hệ

thời gian đến hiệu suất của quá

phản ứng đã đạt trạng thái

trình thủy phân.

cân bằng.
Vì vậy quá trình thủy phân dầu cá hồi bởi CPL trong hệ isooctan/nước không cần kéo dài quá 48 giờ.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
A. KẾT LUẬN
1/ Đã thu nhận được lipase thô từ một số nguồn nguyên liệu
thực vật ở Việt Nam và xác định được điều kiện hoạt động tối ưu của
chúng trên cơ chất p-NPP. Lipase từ mủ đu đủ có nhiệt độ tối ưu
45 oC, pH tối ưu khoảng 8-9. Kết quả so sánh hoạt độ lipase từ các
nguồn nguyên liệu thực vật được khảo sát ở điều kiện hoạt động tối
ưu của chúng cho thấy lipase từ mủ đu đủ có hoạt độ cao nhất, có
tiềm năng nhất để khai thác ở quy mô công nghiệp.
2/ Đã xây dựng được quy trình sản xuất lipase thơ từ mủ đu đủ
(CPL). Sản phẩm thu được có độ ẩm 9,13%, hoạt độ riêng 120,349
mU/g, có khả năng thủy phân dầu cá hồi tốt hơn so với dầu đậu


23
nành, triolein, tristearin.
3/ Lần đầu tiên, lipase từ mủ đu đã được chiết tách bằng
cách sử dụng dung dịch đệm Tris – HCl chứa SLS 0,5%. Bước đầu
phân lập được một phân đoạn chứa 2 loại lipase có khối lượng phân
tử khoảng 35 – 55 kDa. Các thông số động học Km và Vmax của phân
đoạn lipase này trên cơ chất p –NPP được xác định tương ứng là
1,22mM và 1,2.10-6 mM.min-1.ml-1
4/ Bằng kỹ thuật sắc ký khí đã xác định được CPL thủy phân
không đặc hiệu các acid béo có trong dầu cá hồi.

5/ Điều kiện tối ưu của quá trình thủy phân dầu cá hồi bởi
CPL trong hệ nhũ tương dầu/ nước đã được xác định ở 29 oC, pH tối
ưu 7,6, tỷ lệ lượng nước/cơ chất 4,36, nồng độ enzyme 1,34%, hiệu
suất thủy phân tối ưu đạt 49,4% sau 24 giờ. Điều kiện tối ưu của quá
trình thủy phân dầu cá hồi bởi CPL trong hệ 2 pha iso- octan/nước đã
được xác định ở 36,4 oC, nồng độ enzyme 1,68%, tỷ lệ dung môi/ cơ
chất 0,97, hiệu suất thủy phân tối ưu đạt 57% sau 24 giờ.
6/ Các thông số động học Km, Vmax và năng lượng hoạt hóa
của q trình thủy phân dầu cá hồi bởi CPL trong hệ 2 pha isooctan/nước đã được xác định lần lượt tương ứng là 15,8mol
FFAs/ml, 270,6mol FFAs/h.ml và 40,5 kJ/mol.
B. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
Các kết quả nghiên cứu của luận án đã được xác định có
những đóng góp cho khoa học về mặt học thuật và thực tiễn như sau:
- Đã chiết được phần lớn lipase ra khỏi cấu trúc mủ đu đủ
nhờ vào 3 điểm cải tiến so với các quy trình trước đây được công bố:
tiến hành đông khô nhanh mủ đu đủ, không sử dụng dung môi hữu
cơ để loại lipid và sử dụng chất hoạt động bề mặt SLS 0,5%. Đã
phân lập được 2 lipase từ mủ đu đủ có khối lượng phân tử trong