Thiết kế đầu dò ADN cho kỹ thuật lai dot blot

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------

Nguyễn Thị Thu Hƣờng

THIẾT KẾ ĐẦU DÒ ADN
CHO KỸ THUẬT LAI DOT BLOT

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2013


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------

Nguyễn Thị Thu Hƣờng

THIẾT KẾ ĐẦU DÒ ADN
CHO KỸ THUẬT LAI DOT BLOT

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60 42 01 21

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Cán bộ hƣớng dẫn: PGS. TS. Võ Thị Thƣơng Lan

Hà Nội - 2013

Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học

LỜI CẢM ƠN
Để có thể hồn thành luận văn này, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất
tới PGS. TS. Võ Thị Thương Lan, người đã chỉ bảo tận tình trong suốt q trình tơi
thực hiện đề tài. Cơ khơng chỉ truyền thụ cho tôi nhiều kiến thức về chuyên môn mà
cịn giúp tơi bồi đắp lịng say mê, sự nghiêm túc, tính cẩn thận trong nghiên cứu
khoa học. Đó là nền tảng cho quá trình thực hiện luận văn, là hành trang giúp tôi
tự tin vững bước trên con đường khoa học sau này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn ThS. Tạ Bích Thuận. Cơ đã ln động viên, dành
cho tơi nhiều lời khuyên quý báu trong những lúc tôi gặp khó khăn.
Tơi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo Khoa Sinh học, Trường Đại
học Khoa học Tự nhiên đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và
nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn NCS. Ngô Thị Hà, NCS. Vương Diệu Linh, ThS.
Lê Hồng Thu, CN. Trần Tuấn Anh và các bạn sinh viên Phịng thí nghiệm Sinh Y
thuộc Khoa Sinh học, Phòng Sinh học Phân tử thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa
học sự sống và Phịng Genomic thuộc Phịng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ
Enzym - Protein đã giúp đỡ và cổ vũ tôi trong suốt thời gian qua.
Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn tới bố mẹ và anh trai, người thân và bạn bè
đã ủng hộ, giúp đỡ tôi rất nhiều về cả vật chất lẫn tinh thần để tơi có thể hồn
thành luận văn này.
Hà Nội, tháng 12 năm 2013
Học viên

Nguyễn Thị Thu Hường
Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013

Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt

Viết đầy đủ

ADN

Axit deoxyribonucleic

ARN

Axit ribonucleic

bp

Base pair (cặp bazơ)

cs.

Cộng sự

codon

Cd

Da

Dalton

dNTP

Deoxyribonucleoside triphosphate

dTTP

Deoxythymidine triphosphate

dUTP

Deoxyuridine triphosphate

H2O

Nƣớc

kb

Kilobase = 1000 bp

M

Mol/lit

PCR

Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

SDS

Sodium Dodecyl Sulfate

SSC

Saline Sodium Citrate

TBE

Đệm Tris - Borate - EDTA

Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013


Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng

Trang

Bảng 1

Đặc điểm của một số loại màng dùng trong kỹ thuật lai axit nucleic

19

Bảng 2

Thành phần các dung dịch dùng trong quy trình lai điểm và lai

27

điểm ngƣợc
Bảng 3

Trình tự các mồi dùng trong nghiên cứu và kích thƣớc sản

28

phẩm PCR tƣơng ứng
Bảng 4

Trình tự các đầu dị oligo dùng trong kỹ thuật lai điểm ngƣợc

28

Bảng 5

Thành phần và điều kiện phản ứng khuếch đại đoạn C và T

31

Bảng 6

Thành phần gel polyacrylamide 8% dùng trong phân tách ADN

38

Bảng 7

Thành phần và điều kiện phản ứng khuếch đại đầu dò M

39

Bảng 8

Thành phần và điều kiện tối ƣu phản ứng đánh dấu đầu dò M

40

với biotin và DIG
Bảng 9

Thành phần và điều kiện phản ứng PCR đa mồi sàng lọc đồng

48

thời đột biến tại Cd 17, Cd 26 và Cd 41-42 trên gen β-globin
Bảng 10

Kết quả sàng lọc đột biến tại Cd 17, Cd 26 và Cd 41-42 trên 30

50

mẫu bệnh phẩm bằng phản ứng PCR đa mồi
Bảng 11

Thành phần và điều kiện phản ứng PCR với cặp mồi CD F/R

50

khuếch đại đoạn gen β-globin kích thƣớc 700 bp
Bảng 12

Thành phần và điều kiện phản ứng đánh dấu trình tự đích cho kỹ

53

thuật lai điểm ngƣợc
Bảng 13

Tần số đột biến gây bệnh β-thalassemia ở một số quốc gia trên
thế giới

Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013

61


Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình
Hình 1

Trang
Mơ hình chuỗi xoắn kép, liên kết hydro và phosphodieste trong

03

phân tử ADN
Hình 2

Sự biến tính và hồi tính của phân tử ADN sợi kép

04

Hình 3

Các phân tử sợi kép hình thành trong phản ứng lai axit nucleic

05

Hình 4

Đánh dấu đầu dị bằng phƣơng pháp dịch chuyển điểm đứt

07

Hình 5

Đánh dấu đầu dò bằng phƣơng pháp dùng mồi ngẫu nhiên

08

Hình 6

Ngun lý chung của hệ thống đánh dấu khơng phóng xạ gián tiếp

12

Hình 7

Cấu trúc phân tử digoxigenin-11-dUTP và biotin-16-dUTP

13

Hình 8

Tính tƣơng đồng của các đoạn C, T và M

25

Hình 9

Vị trí các đầu dị oligo và cặp mồi CD F/R trên gen β-globin

30

Hình 10

Kết quả đánh dấu đầu dị M với biotin và DIG

41

Hình 11

Kết quả so sánh hiệu quả đánh dấu biotin và DIG và kiểm tra độ

42

nhạy của kỹ thuật lai điểm
Hình 12

Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại đoạn C và đoạn T

43

Hình 13

Kết quả lai điểm phân biệt đoạn C và đoạn T ở 650C

44

Hình 14

Kết quả lai điểm với các loại ADN khác nhau chứa đoạn C và

45

đoạn T
Hình 15

Kết quả lai đầu dị M với plasmid khơng mang đoạn chèn C và T

46

Hình 16

Kết quả lai điểm với plasmid pBluescript và cặp mồi M13 F/R

47

Hình 17

Sơ đồ minh họa vị trí các mồi sử dụng trong phản ứng PCR đa mồi

49

Hình 18

Kết quả điện di sản phẩm PCR đa mồi

49

Hình 19

Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR mẫu T9 với cặp mồi CD F/R

51

Hình 20

Kết quả so sánh trình tự nucleotide đoạn gen khuếch đại bằng

52

cặp mồi CD F/R với ngân hàng dữ liệu NCBI
Hình 21

Kết quả đánh dấu đoạn gen β-globin với biotin

Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013

54


Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học

Hình 22

Chuẩn hóa lƣợng đầu dò chấm lên màng trong kỹ thuật lai điểm

55

ngƣợc
Hình 23

Kết quả lai điểm ngƣợc phát hiện đột biến trên gen β-globin của

55

từng cặp đầu dị
Hình 24

Kết quả lai điểm ngƣợc phát hiện đồng thời ba đột biến trên gen
β-globin

Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013

57


Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 2
1.1. CẤU TRÚC PHÂN TỬ ADN........................................................................... 2
1.2. NGUYÊN TẮC CỦA KỸ THUẬT LAI AXIT NUCLEIC..................................... 3
1.3. ĐẦU DÒ............................................................................................................. 5
1.3.1. Đặc điểm của đầu dò trong kỹ thuật lai axit nucleic ............................... 5
1.3.2. Các phƣơng pháp đánh dấu đầu dò.......................................................... 6
1.3.3. Các chất đánh dấu đầu dò ........................................................................ 9
1.4. MỘT SỐ KỸ THUẬT LAI AXIT NUCLEIC ....................................................... 13
1.4.1. Lai tại chỗ ................................................................................................ 13
1.4.2. Lai pha lỏng ............................................................................................. 15
1.4.3. Lai pha rắn ............................................................................................... 15
1.5. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN KỸ THUẬT LAI PHA RẮN ......................... 18
1.6. ỨNG DỤNG CỦA CÁC KỸ THUẬT LAI AXIT NUCLEIC ................................ 20

Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 25
2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ ................................................. 25
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu .............................................................................. 25
2.1.2. Hóa chất ................................................................................................... 26

2.1.3. Các mồi .................................................................................................... 27
2.1.4. Các đầu dò oligo ...................................................................................... 28
Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013


Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học

2.1.5. Màng lai ................................................................................................... 29
2.1.6. Thiết bị ..................................................................................................... 29
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................................................................... 29
2.2.1. Thiết kế đầu dò ........................................................................................ 29
2.2.2. Phƣơng pháp PCR ................................................................................... 30
2.2.3. Q trình lai điểm .................................................................................... 31
2.2.3.1. Biến tính và cố định ADN trên màng nylon (Roche) ................. 31
2.2.3.2. Tiền lai và lai .............................................................................. 32
2.2.3.3. Phát hiện đầu dò ......................................................................... 33
2.2.4. Quá trình lai điểm ngƣợc ......................................................................... 34
2.2.4.1. Hoạt hóa màng nylon (Pall) ........................................................ 34
2.2.4.2. Cố định đầu dị trên màng nylon (Pall) ...................................... 34
2.2.4.3. Tiền lai và lai .............................................................................. 34
2.2.4.4. Phát hiện đầu dò đánh dấu biotin ............................................... 35
2.2.5. Tách ADN từ mẫu bệnh phẩm ................................................................. 35
2.2.6. Tách plasmid............................................................................................ 36
2.2.7. Tinh sạch sản phẩm PCR bằng kit High pure PCR cleanup micro ......... 37
2.2.8. Phƣơng pháp điện di ................................................................................ 37

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 39
A - KẾT QUẢ .......................................................................................................... 39
3.1. QUÁ TRÌNH LAI ĐIỂM .................................................................................. 39
3.1.1. Kết quả khuếch đại và đánh dấu đầu dò M .............................................. 39

Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013


Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học

3.1.2. So sánh hiệu quả đánh dấu với biotin và DIG ......................................... 41
3.1.3. Chuẩn bị trình tự đích và trình tự đối chứng ............................................ 42
3.1.4. Kết quả lai điểm phân biệt trình tự đích và trình tự đối chứng ................ 43
3.2. Q TRÌNH LAI ĐIỂM NGƢỢC .................................................................. 47
3.2.1. Sàng lọc một số đột biến trên gen β-globin ............................................. 47
3.2.2. Chuẩn bị và đánh dấu trình tự đích cho quy trình lai điểm ngƣợc........... 52
3.2.3. Kết quả lai điểm ngƣợc phát hiện đột biến trên gen β-globin .................. 54
B - THẢO LUẬN..................................................................................................... 57

Chƣơng 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................... 62
KẾT LUẬN ....................................................................................................... 63
KIẾN NGHỊ ...................................................................................................... 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 63
PHỤ LỤC............................................................................................................... 72

Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013


Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học

MỞ ĐẦU
Ngày nay, chúng ta đƣợc sống trong thời kỳ với nền y học phát triển nhanh
chóng. Sự tiến bộ của y học hiện đại ln song hành mối liên hệ khăng khít giữa tri

thức y học và sự phát triển vƣợt trội trong công nghệ hỗ trợ cận lâm sàng. Điều này
giúp chúng ta có cái nhìn tổng quan hơn về bệnh lý cùng những am hiểu sâu rộng về
cơ sở phân tử của bệnh. Trong đó, những hiểu biết về bệnh ở mức độ phân tử hỗ trợ
đắc lực trong việc chẩn đốn, phịng ngừa bệnh và có ý nghĩa đặc biệt trong nghiên
cứu các thế hệ thuốc mới - thuốc điều trị đích. Nền tảng về cơ sở học phân tử của
bệnh là yếu tố thúc đẩy những kỹ thuật di truyền phân tử phát triển không ngừng và
ngƣợc lại. Xu hƣớng trong chẩn đoán phân tử hiện nay nhắm tới những kỹ thuật
phát hiện nhanh, đồng thời nhiều trình tự đích với số lƣợng mẫu phân tích lớn nhƣ:
PCR đa mồi, lai ADN (Southern blot, dot blot, line blot) và giải trình tự gen. Đáng
chú ý trong số đó phải kể đến kỹ thuật lai điểm (dot blot) - một trong những phát
triển của phƣơng pháp lai ADN. Đây là một kỹ thuật kinh điển nhƣng vẫn đƣợc sử
dụng khá phổ biến nhờ vào những ƣu điểm vƣợt trội nhƣ thao tác đơn giản, nhanh
chóng, chi phí thấp, có thể xác định đồng thời nhiều đột biến với số lƣợng mẫu lớn
và đặc biệt phù hợp với các nƣớc đang phát triển. Ở nƣớc ta hiện nay kỹ thuật lai
điểm đã đƣợc ứng dụng trong định type virus HPV (Human Papillomavirus) liên
quan đến bệnh ung thƣ cổ tử cung. Tuy nhiên ứng dụng của kỹ thuật này trong việc
xác định những đột biến di truyền vẫn cịn rất ít hoặc chƣa đƣợc cơng bố. Do đó,
chúng tơi tiến hành đề tài "Thiết kế đầu dò ADN cho kỹ thuật lai dot blot" với
mục tiêu thiết lập quy trình lai nhằm phát hiện những sai khác ở mức độ nucleotide
trong các bệnh lý di truyền. Đề tài đƣợc thực hiện tại Phịng thí nghiệm Sinh Y,
Khoa Sinh học; Phịng Sinh học Phân tử thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự
sống và Phịng Genomic thuộc Phịng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.

Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013
1


Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.

CẤU TRÚC PHÂN TỬ ADN
Dựa vào hình ảnh nhiễu xạ tia X (Franklin R., Gosling R., 1952) và thông tin

bắt cặp các bazơ (Chargaff E., 1950), hai nhà khoa học Watson J. và Crick F. đã đề
xuất mô hình chuỗi xoắn kép của phân tử ADN (1953). Trƣớc cơng bố này đã có
một số nghiên cứu đƣợc tiến hành nhằm tìm hiểu về cấu trúc và chức năng của
ADN. Đầu tiên phải kể đến cơng trình tách chiết ADN từ nhân tinh trùng cá hồi của
Miescher F. vào năm 1869 [1]. Cùng thời điểm đó, Mendel G. phát hiện ra quy luật
phân ly và tổ hợp của các "nhân tố di truyền" thơng qua thí nghiệm lai ở cây đậu Hà
Lan. Năm 1944, Avery O., MacLeod C. và McCartey M. cung cấp bằng chứng cho
thấy ADN mang thông tin di truyền trong thí nghiệm biến nạp ở vi khuẩn [1]. Đến
nay, chúng ta đã biết rõ ADN là những phân tử axit nucleic đƣợc tìm thấy trong tế
bào của phần lớn các lồi sinh vật. Thơng tin có mặt trong ADN "chỉ dẫn" tế bào
tổng hợp các loại protein quyết định các đặc điểm sinh học và có khả năng di truyền
cho thế hệ sau. "Chìa khóa" của tất cả các chức năng đó thể hiện trong cấu trúc của
đại phân tử này.
ADN là những phân tử trùng phân (polymer) đƣợc cấu tạo từ các đơn phân
(monomer) deoxyribonucleotide. Mỗi nucleotide gồm ba thành phần cơ bản: bazơ
nitơ, đƣờng pentose và nhóm phosphate. Trong đó, bazơ nitơ là dẫn xuất của purine
gồm adenine (A) và guanine (G), hoặc dẫn xuất của pirimidine gồm thymine (T),
cytosine (C). Sự có mặt của nhóm phosphate làm cho các phân tử ADN thƣờng tích
điện âm và có tính axit [41]. Bốn loại deoxyribonucleotide trong thành phần ADN
khác nhau về loại bazơ nitơ (A, G, T, C), giống nhau về cấu trúc đƣờng pentose và
nhóm phosphate. Vị trí các ngun tử cacbon trên mạch vòng của đƣờng pentose
đƣợc đánh số từ 1' đến 5'. Các nucleotide liên kết với nhau bởi cầu nối
phosphodieste giữa nhóm hydroxyl ở vị trí 3' với nhóm phosphate ở vị trí 5' của hai
phân tử đƣờng [41].

Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013
2


Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học

Hình 1: (A) Mơ hình chuỗi xoắn kép, (B) liên kết hydro và phosphodieste trong
phân tử ADN [77].

Trong phân tử ADN sợi đôi, hai mạch polynucleotide liên kết với nhau bởi
liên kết hydro hình thành giữa các nucleotide đối diện trên hai mạch theo nguyên
tắc bổ sung: giữa A và T có hai liên kết, giữa G và C có ba liên kết (Hình 1) [1].
Liên kết hydro là liên kết hóa học yếu xảy ra giữa nguyên tử hydro và nguyên tử
tích điện âm nhiều hơn nhƣ oxy, nitơ và flo. Các nguyên tử tham gia có thể nằm
trên cùng một phân tử hoặc trên các phân tử khác. Liên kết hydro có tính định
hƣớng, trở nên mạnh nhất khi hai ngun tử tham gia ở vị trí đối diện trực tiếp với
nhau. Nếu góc liên kết vƣợt q 300 thì lực liên kết yếu đi nhiều [1]. Vì vậy, để có
cấu trúc ADN sợi kép thì một mạch phải chạy theo chiều 5' → 3', còn mạch kia
chạy theo chiều ngƣợc lại là 3' → 5'.
1.2.

NGUYÊN TẮC CỦA KỸ THUẬT LAI AXIT NUCLEIC
Phân tử ADN sợi kép có thể tách thành hai mạch đơn dƣới tác dụng của các

yếu tố gây biến tính nhƣ kiềm, urê hoặc nhiệt độ cao [68]. Khi đó các liên kết hydro
giữa hai mạch đơn bị bẻ gãy nhƣng không ảnh hƣởng tới các liên kết phosphodieste
của khung ADN. Nếu các tác nhân biến tính bị loại bỏ và duy trì điều kiện mơi
trƣờng thích hợp, hai mạch đơn có thể liên kết tạo cặp trở lại (hồi tính ADN) (Hình
Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013
3

Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học

2) [4]. Trong trƣờng hợp hai mạch đơn có nguồn gốc khác nhau và có trình tự tƣơng
đồng, chúng có thể bắt cặp tạo nên phân tử lai. Hiện tƣợng tái bắt cặp nhƣ trên đƣợc
gọi là quá trình lai phân tử [7]. Đến nay, nhiều kỹ thuật lai đã đƣợc phát triển nhằm
phát hiện trình tự quan tâm nhờ tạo ra các phân tử axit nucleic có trình tự tƣơng
đồng với nó. Mức độ tƣơng đồng giữa hai trình tự thể hiện ở nhiệt độ cần thiết để
gây biến tính 50% phân tử dạng sợi kép (nhiệt độ nóng chảy Tm - temperature
melting) [71]. Giá trị Tm của mỗi phân tử ADN phụ thuộc vào thành phần, tỷ lệ, vị
trí sắp xếp của các cặp nucleotide. Nếu có cùng số cặp bazơ, phân tử ADN có tỷ lệ
GC càng cao thì Tm càng lớn và ngƣợc lại. Ngoài ra, phân tử ADN có số đoạn trình
tự lặp lại càng nhiều thì nhiệt độ biến tính Tm càng giảm. Nồng độ muối và sự có
mặt của các chất gây biến tính nhƣ formamide cũng ảnh hƣởng đến giá trị Tm. Đối
với hệ gen của động vật có vú (chứa khoảng 40% GC), ADN bị biến tính ở giá trị
Tm xấp xỉ 870C trong điều kiện sinh lý [58]. Thông thƣờng, phản ứng tạo nên phân
tử lai đƣợc thực hiện ở nhiệt độ thấp hơn Tm 250C.

Hình 2: Sự biến tính và hồi tính của phân tử ADN sợi kép [41].

Hiê ̣n nay, kỹ thuật lai đƣợc sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và ứng dụng
để phát hiện sự có mặt , xác định vị trí hoặc định lƣợng đoạn axit nucleic quan tâm
[13, 43]. Trình tự axit nucleic quan tâm đƣợc gọi là phân tử đích. Đoạn ADN hoặc
ARN có độ tƣơng đồng cao với phân tử đích gọi là đầu dị. Đầu dò đƣợc đánh dấu

Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013
4

Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học

để phát hiện kết quả lai giữa đầu dị và phân tử đích. Trong trƣờng hợp phân tử đích
hoặc đầu dị ở dạng sợi kép, chúng phải đƣợc tách mạch tạo dạng sợi đơn trƣớc khi
tiến hành phản ứng lai. Khi đó, ngồi sự bắt cặp giữa phân tử đích và đầu dị cịn có
sự tái bắt cặp của các phân tử sợi đơi cùng nguồn gốc (Hình 3). Các bƣớc cơ bản
của kỹ thuật lai bao gồm: chuẩn bị và đánh dấu đầu dị, chuẩn bị phân tử đích, biến
tính các trình tự ở dạng sợi kép rồi tiến hành lai. Nhƣ vậy, một trong các bƣớc đầu
tiên và quan trọng nhất, quyết định đến kết quả của phản ứng lai là thiết kế đầu dị.

Hình 3: Các phân tử sợi kép hình thành trong phản ứng lai axit nucleic [58].

1.3.

ĐẦU DỊ

1.3.1. Đặc điểm của đầu dò trong kỹ thuật lai axit nucleic
Đầu dị là một phân tử axit nucleic có độ tƣơng đồng cao với trình tự đích
(ADN hoă ̣c ARN) [5, 8]. Các ADN dùng làm đầu dò phổ biến có nguồn gốc từ
ADNc (complementary DNA), ADN tƣơng đồng khác lồi hoặc trình tự nucleotide
suy diễn dựa vào trình tự axit amin đã biết [58, 65]. Thơng thƣờng, trình tự ADN
đƣợc nhân dịng trong tế bào chủ, từ đó sản xuất lƣợng lớn đầu dò [53, 65]. Đầu dò
Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013
5


Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học

đƣợc chuẩn bị theo phƣơng pháp nhƣ vậy gọi là đầu dò nhân dòng. Sự ra đời của kỹ
thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) đã hỗ trợ đắc lực cho viê ̣c sản xuất đầ u dò bởi

có thể đờ ng thời kh́ ch đaị và đánh dấ u nhờ sƣ̉ du ̣ng nucleotide đánh dấ u[31, 75].
Một phƣơng pháp khác để sản xuất đầu dị ADN là tổng hợp hóa học (đầu
dị oligo) [7, 32]. Mặc dù phƣơng pháp này yêu cầu sự hiểu biết chi tiết về trình tự
đích nhƣng đầu dị thu đƣợc ở dạng sợi đơn, không tự bắt cặp bổ sung nên chúng
đƣợc sử dụng nhiều hơn đầu dò nhân dòng [11, 37]. Đầu dò oligo đƣợc thiết kế dựa
vào các trình tự nằm trong gen hoặc những trình tự có sẵn tuỳ vào mục đích của
từng thí nghiệm và các thơng tin đã có [51, 58]. Mơ ̣t đầ u dò oligo có thể bắ t că ̣p
hoàn tồn với trình tự đích và đủ dài để ngăn chặn việc lai

khơng đặc hiệu với

những trình tự liên quan khác. Đầu dị oligo có một số đặc điểm chung nhƣ sau:
 Chiề u dài đầ u dò trong khoảng 18 – 100 bp.
 Tỷ lệ G C chiế m 40 - 60%. Hiện tƣợng lai không đă ̣c hiê ̣u có thể tăng nế u tỷ
lê ̣ GC nhỏ hơn khoảng giá trị này.
 Đảm bảo không có trin
̀ h tƣ̣ bở sung trong đầ u dò , vì nếu có chúng sẽ hình
thành cấu trúc "kẹp tóc" ức chế phản ứng lai với trình tự đích.
 Tránh trình tự lặp lại nhiều hơn 4 nucleotide.
 Không sƣ̉ du ̣ng đầ u dò có đô ̣ tƣơng đồ ng hơn 70% với vùng không phải trin
̀ h
tƣ̣ đích (để tránh hiện tƣợng lai không đặc hiệu).
1.3.2. Các phương pháp đánh dấu đầu dò
Các phƣơng pháp đánh dấu bao gồm đánh dấu ADN sợi đơn, ADN sợi kép và
ARN sợi đơn [7]. Trong quá trình đánh dấu, các nucleotide đã gắn với các chất đánh
dấu nhƣ biotin, digoxigenin hay fluorescein đƣợc sử dụng thay thế hoặc kết hợp với
các nucleotide bình thƣờng khác. Đối với đoạn ADN hoặc oligonucleotide, nucleotide
đánh dấu thƣờng dùng là dUTP, dCTP hoặc dATP; đầu dò ARN thƣờng dùng UTP
đánh dấu [34]. Có hai phƣơng pháp chính đƣợc sử dụng để đánh dấu đầu dị ADN:

Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013
6


Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học

(a) Đánh dấu đầu dị thơng qua phản ứng tổng hợp ADN in vitro [58]: ADN
polymerase đƣợc dùng để tạo ra các bản sao ADN đánh dấu. Trong phản ứng tổng
hợp ADN in vitro, ít nhất một trong bốn loại nucleotide phải mang nhóm chất đánh
dấu. Đánh dấu ADN bằng tổng hợp ADN in vitro thƣờng thực hiện theo một trong
ba phƣơng pháp: dịch chuyển điểm đứt (nick-translation), đánh dấu bằng mồi ngẫu
nhiên và đánh dấu nhờ PCR.


Phƣơng pháp dịch chuyển điểm đứt [7]: DNase I sẽ cắt phân tử ADN ở nhiều
vị trí tạo những điểm đứt phân bố một cách ngẫu nhiễu trên hai mạch. Từ
những điểm đứt này, ADN polymerase I một mặt cắt dần mạch bị đứt theo
chiều 5'-3' (nhờ hoạt tính exonuclease 5'-3'), mặt khác tổng hợp bù đoạn bị
thiếu (nhờ hoạt tính polymerase). Do trong phản ứng có sự hiện diện của một
loại nucleotide đánh dấu nên đoạn tổng hợp mới sẽ có nucleotide đánh dấu. Kết
quả cuối cùng ADN đƣợc đánh dấu trên khắp chiều dài phân tử (Hình 4).

Hình 4: Đánh dấu đầu dị bằng phƣơng pháp dịch chuyển điểm đứt [58].

Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013
7


Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học



Phƣơng pháp đánh dấu bằng mồi ngẫu nhiên [7]: Đầu dò đƣợc biến tính bằng
nhiệt, sau đó thêm vào phản ứng một hỗn hợp các oligonucleotide tổng hợp
(thƣờng là hexa hoặc octanucleotide). Lúc đó, chúng trở thành mồi cho ADN
polymerase hoạt động tổng hợp mạch bổ sung. Vì một trong bốn loại
nucleotide thêm vào phản ứng đƣợc đánh dấu nên mạch mới tổng hợp sẽ có
mặt nucleotide đánh dấu. ADN polymerase thƣờng đƣợc sử dụng là tiểu phần
Klenow của ADN polymerase I hoặc T7 ADN polymerase (Hình 5).

Hình 5: Đánh dấu đầu dị bằng phƣơng pháp dùng mồi ngẫu nhiên [58].



Phƣơng pháp đánh dấu nhờ PCR [58]: Phản ứng PCR đƣợc thay đổi theo
một trong hai cách để thu đƣợc sản phẩm đánh dấu: (1) bổ sung một loại
nucleotide đánh dấu trong quá trình tổng hợp đầu dị; (2) sử dụng mồi có gắn
nhóm đánh dấu ở đầu 5'. Trong đó cách thứ nhất cho tín hiệu tốt hơn vì chất
đánh dấu có mặt dọc theo đầu dò. Phƣơng pháp đánh dấu PCR có lợi thế đặc
biệt so với các phƣơng pháp khác [40]. Đầu dị đƣợc tạo ra một cách nhanh
chóng với kích thƣớc nằm trong phạm vi rộng; có thể thiết kế đầu dò từ bất
cứ vùng gen nào quan tâm; có thể tổng hợp chỉ với lƣợng rất nhỏ ADN đầu
vào và chiều dài của đầu dị khơng ảnh hƣởng tới độ nhạy và tính đặc hiệu
của kỹ thuật lai [6, 31]. Phƣơng pháp này có thể áp dụng cho cả đầu dò sợi
đơn (sử dụng một mồi) và sợi kép (sử dụng một cặp mồi) [6].

Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013
8

Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học

(b) Đánh dấu ở đầu tận cùng [58]: Trong hệ thống đánh dấu phóng xạ,
enzyme polynucleotide kinase đƣợc sử dụng để chuyển nhóm phosphate từ ATP
sang đầu 5' của các phân tử axit nucleic. Nếu nhƣ ATP đƣợc đánh dấu phóng xạ thì
nó sẽ tạo ra axit nucleic đƣợc đánh dấu với hoạt tính đặc hiệu tƣơng đối thấp, bởi vì
chỉ có đầu tận cùng của mỗi phân tử đƣợc đánh dấu. Oligonucleotide có thể đƣợc
đánh dấu ở đầu 3' bằng phản ứng sử dụng enzyme terminal transferase [33].
Enzyme này có hoạt tính thêm một loại deoxyribonucleotide vào đầu 3'-OH của
ADN, kết quả tạo ra phân tử ADN có phần đi trùng hợp khơng lai với trình tự
ADN đích. Trong phản ứng đánh dấu ở đầu tận cùng, oligonucleotide đánh dấu chỉ
đƣợc thêm vào phần đi; khơng có sự đánh dấu đầu dị ở vùng trình tự bên trong.
Việc gắn thêm các nucleotide đánh dấu làm tăng độ nhạy của phản ứng lai, nhƣng
làm giảm độ đặc hiệu vì trình tự đƣợc thêm vào khơng tƣơng đồng với trình tự
ADN đích.
1.3.3. Các chất đánh dấu đầu dò
Một chất đánh dấu đầu dò lý tƣởng phải thỏa mãn các yêu cầu sau [33]:
 Dễ gắn với axit nucleic bằng phƣơng pháp đơn giản và có độ lặp lại cao;
 Bền trong điều kiện lai và bảo quản;
 Không bị ảnh hƣởng và làm ảnh hƣởng đến phản ứng lai;
 Có thể thực hiện với điều kiện phản ứng lai trong pha lỏng hoặc pha rắn;
 Phƣơng pháp phát hiện nhạy và đơn giản;
 Dễ bị loại bỏ sau phản ứng lai;
 Dễ phân biệt giữa mẫu lai và mẫu chƣa lai trong cùng điều kiện;
 Có thể ứng dụng với hệ thống tự động hoá.
Chấ t đánh dấ u đầ u dò đƣơ ̣c chia thành hai nhóm lớn [33]:
(a) Chấ t đánh dấ u phóng xa :̣ đồ ng vi ̣phóng xa ̣ là những ngun tố có hạt nhân
khơng bền, dễ phân rã kèm theo bức xạ ra hạt alpha, hạt beta hoặc tia gamma. Sự

Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013

9


Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học

bức xạ này có thể đo đƣợc bằng các thiết bị đo phóng xạ nhƣ máy đo nhấp nháy
lỏng hay máy đếm Geiger-Muller. Các nguyên tố đồng vị phóng xạ hay đƣợc dùng
để đánh dấu đầu dò là

32

P, 33P, 35S, 3H, 14C,

125

I [19]. Ƣu điểm nổi bật của đầu dị

đánh dấu phóng xạ là có độ nhạy cao nhất, có thể phát hiện các gen đơn bản trong
0,5 µg ADN tổng số [55]. Hiêṇ nay chúng it́ đƣơ ̣c s ử dụng bởi một số hạn chế nhƣ
chu kỳ bán rã ngắn (chu kỳ bán rã của 32P là 14,3 ngày) do đó phải lặp lại bƣớc đánh
dấu đầu dò khi tiến hành thí nghiệm lai trong thời gian dài; nguy hiểm cho ngƣời sử
dụng; u cầu nghiêm ngặt cho phịng thí nghiệm và cá nhân sử dụng cũng nhƣ việc
xử lý chất thải [55, 58]. Vì vậy sự phát triển của các chất đánh dấu khơng phóng xạ
là cần thiết để khắc phục các vấn đề trên, đồng thời cung cấp một kỹ thuật lai có thể
áp dụng cho xét nghiệm thƣờng quy các bệnh ở ngƣời, động vật và thực vật [22,
66]. Xuất phát từ thực tế trên mà các chất đánh dấu khơng phóng xạ ngày càng đƣợc
quan tâm [23, 26].
(b) Chấ t đánh dấ u không phóng xa ̣ : có một số ƣu điểm so với chất đánh dấu
phóng xạ nhƣ an tồn , đơ ̣ bề n cao , đánh dấ u tớ t , có thể phát hiê ̣n tại chỗ và phát
hiện nhanh chóng [29, 55, 71]. Cho đến nay, các chất đánh dấu không phóng xạ đã

trở nên phổ biến và đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Các chất đánh
dấu không phóng xạ bao gồm hai loại:
Hệ thống đánh dấu khơng phóng xạ trực tiếp
Trong hệ thống này, chất đánh dấu đầu dò đƣợc phát hiện trực tiếp [58]. Các
chất đánh dấu trực tiếp phổ biến nhất là các enzyme nhƣ alkaline phosphatase hay
horseradish peroxidase, các chất huỳnh quang nhƣ fluorescein hay rhodamin. Trong
khi đầu dò gắn enzyme thƣờng đƣợc sử dụng trong lai pha rắn hoặc pha lỏng thì đầu
dị gắn huỳnh quang đƣợc dùng chủ yếu trong lai tại chỗ và lập bản đồ nhiễm sắc
thể [33]. Enzym gắn vào đầu dò cho phép phân hủy cơ chất thành sản phẩm có màu
dễ dàng quan sát [26]. Chấ t huỳnh quang gắn vào đầu dị có khả năng phát ra ánh
sáng ở bƣớc sóng nhất định khi bị kích thích bởi ánh sáng có bƣớc sóng ngắn hơn.
Ánh sáng phát ra đƣợc phát hiện bằng máy quét laser hoặc kính hiển vi huỳnh
Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013
10


Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học

quang [58]. Ba nhóm huỳnh quang phổ biến sử dụng trong đánh dấu axit nucleic là:
huỳnh quang màu xanh lam (AMCA, DAPI), huỳnh quang màu xanh lục (FITC,
fluorescein), huỳnh quang màu đỏ (CY3, TRITC, rhodamine, Texas red, CY5) [33].
Các dẫn xuất este acridinium (Acridinium ester - AE) đƣợc sử dụng rộng rãi
làm chất đánh dấu phát quang hóa học. Phản ứng tạo ánh sáng có thể dễ dàng kích
hoạt bằng cách bổ sung H2O2 [33]. Thu nhận tín hiệu ánh sáng "flash" địi hỏi thiết
bị phức tạp nhƣ các hệ thống miễn dịch thƣơng mại. Trong kỹ thuật lai HPA
(hybridization protection assay), este acridinium liên kết với đầu dị thơng qua một
cầu nối không bền với kiềm. Sự thủy phân liên kết này diễn ra ở đầu dị sợi đơn
khơng bắt cặp với phân tử đích nhƣng xảy ra rất yếu ở các phân tử lai [70, 78]. Sự
khác biệt này là do arcidinium chỉ xen vào bên trong các phân tử chuỗi kép làm bền
các liên kết chống lại sự thủy phân bởi kiềm [33].

Hệ thống đánh dấu khơng phóng xạ gián tiếp
Trong hệ thống này, chất đánh dấu đầu dò (gọi là nhóm báo cáo) khơng đƣợc
phát hiện trực tiếp mà phải thơng qua liên kết với một nhóm phát tín hiệu (gọi là
nhóm chỉ thị). Nhóm chỉ thị có ái lực liên kết cao với nhóm báo cáo (nhờ phần ái
lực) [58]. Sự phát hiện axit nucleic trong hệ thống gián tiếp bao gồm ba phản ứng: (i)
đầu dò lai với phân tử đích; (ii) nhóm báo cáo liên kết với nhóm chỉ thị; (iii) nhóm chỉ
thị phát tín hiệu (nhờ liên kết với nhóm báo cáo). Nguyên lý chung của hệ thống đánh
dấu khơng phóng xạ gián tiếp đƣợc miêu tả trên Hình 6.

Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013
11


Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học

Hình 6: Nguyên lý chung của hệ thống đánh dấu khơng phóng xạ gián tiếp [58].

Trong số các hệ thống gián tiếp, phổ biến nhất là hệ thống biotin (vitamin H)
[36, 55, 64]. Trong đó, biotin đóng vai trị là nhóm báo cáo liên kết với nhóm chỉ thị
streptavidin alkaline phosphatase (phần ái lực là streptavidin - một protein có nguồn
gốc từ vi khuẩn Streptomyces avidinii). Tƣơng tác giữa biotin và streptavidin là
tƣơng tác sinh học khơng cộng hóa trị mạnh nhất đƣợc biết đến trong tự nhiên (hằng
số phân ly Kd = 10-15) [16, 64]. Đầu dị gắn biotin có thể đƣợc chuẩn bị dễ dàng với
nucleotide đánh dấu biotin nhƣ biotin-11-dUTP hoặc biotin-16-dUTP (Hình 7) [19].
Bên cạnh biotin, digoxigenin (DIG) cũng là hê ̣ thố ng tiê ̣n lơ ̣i và hiê ̣u quả trong viê ̣c
đánh dấ u và phát hiê ̣n ADN và ARN [39]. Kháng thể anti-digoxigenin (phần ái lực)
liên kế t với alkaline phosphatase (nhóm chỉ thị) đƣơ ̣c gắ n với đầ u dò DIG . Tín hiệu
màu đƣợc phát hiện nhờ cơ chất của alkaline phosphatase là BCIP

(5-bromo-4-

chloro-3-indolyl phosphate) và NBT (nitro-blue tetrazolium) [75]. Hỗn hợp cơ chất
này tạo ra sản phẩm cuối cùng không tan là NBT diformazan có màu xanh tím, quan
sát đƣợc bằng mắt thƣờng.
Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013
12


Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học

Hình 7: (A) Cấu trúc phân tử digoxigenin-11-dUTP và (B) biotin-16-dUTP [58].

Nhƣ vậy, tuy phụ thuộc vào nhiều cặp liên kết hơn so với hệ thống trực tiếp,
nhƣng thành phần phát hiện trong hệ thống gián tiếp lại phổ biến, tức là chúng có
thể đƣợc sử dụng để phát hiện axit nucleic, protein cũng nhƣ kháng nguyên và
glycan [55]. Do đó, hệ thống gián tiếp linh hoạt hơn trong phát hiện phân tử sinh
học nói chung. Vì lý do này, các hệ thống gián tiếp không chỉ đƣợc sử dụng trong
nghiên cứu cơ bản mà còn đƣợc dùng trong nhiều lĩnh vực ứng dụng để phát hiện
các phân tử đích khác nhau, phổ biến là axit nucleic và protein [60, 61, 64].
1.4.

MỘT SỐ KỸ THUẬT LAI AXIT NUCLEIC
1.4.1. Lai tại chỗ
Lai tại chỗ (in situ hybridization - ISH) là kỹ thuật nhằm định vị trình tự axit

nucleic quan tâm mà khơng cần tách chiế t ra khỏi mô hay tế bào , cung cấp thông tin
Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013
13

Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học

về không gian và thời gian gen biểu hiện và locus gen [10, 50]. Quá trình tiến hành
lai tại chỗ trải qua các bƣớc tƣơng tự nhƣ các kỹ thuật lai khác: tổng hợp, đánh dấu
đầu dị và lai với trình tự đích.
Khi mới đƣợc đề xuất vào năm 1969, kỹ thuật lai tại chỗ sử dụng đầu dị
phóng xạ [21]. Do tính khơng an tồn và phức tạp, cùng với sự phát triển của các
chất đánh dấu khơng phóng xạ, hiện nay có hai phƣơng pháp chủ yếu để quan sát
ARN và ADN tại chỗ là sử dụng đầu dò phát hiện huỳnh quang (Fluorescence in
situ hybridization - FISH) và đầu dò phát hiện màu (Chromogenic in situ
hybridization - CISH) [76]. Mỗi phƣơng pháp có những đặc điểm phù hợp với từng
mục đích sử dụng khác nhau. Lai FISH có khả năng phân tích nhiều mục tiêu đồng
thời, quan sát và định vị trong cùng một mẫu vật [20, 79]. Sử dụng huỳnh quang
đánh dấu riêng biệt với mỗi đầu dò lai, phƣơng pháp này cho phép phân tích nhiều
yếu tố di truyền hoặc mơ hình biểu hiện đa gen trong một mẫu duy nhất với nhiều
màu hiển thị [63]. Lai FISH có thể tiến hành với lƣợng mẫu nhỏ, mẫu cố định bằng
formalin hoặc parafin. Kỹ thuật lai này cung cấp thơng tin nhanh chóng và tin cậy
để đánh giá các bất ổn di truyền phát sinh trong ung thƣ hoặc phát hiện vi sinh vật
trong nhiều loại mẫu khác nhau [20]. Tuy nhiên, việc quan sát kết quả lai đòi hỏi
phải có kính hiển vi huỳnh quang. Hơn nữa, tín hiệu huỳnh quang bị mất đi nhanh
chóng gây khó khăn cho việc lƣu trữ kết quả. Kỹ thuật lai CISH đƣợc đánh giá là
giải pháp hiệu quả với chi phí hợp lý thay thế cho lai FISH trong xét nghiệm biến
đổi gen, đặc biệt là tại các trung tâm chủ yếu làm việc với hóa mơ miễn dịch
(Immunohistochemistry - IHC). Phƣơng pháp này có thể dùng để đánh giá sự
khuếch đại gen, mất gen, chuyển đoạn nhiễm sắc thể và số lƣợng nhiễm sắc thể
[79]. CISH sử dụng phản ứng peroxidase hoặc alkaline phosphatase đƣợc quan sát
dƣới kính hiển vi ánh sáng thƣờng và có thể áp dụng với mẫu cố định bằng fomalin,
mẫu mô đúc parafin, máu hoặc mẫu phết tủy xƣơng, tiêu bản nhiễm sắc thể ở kỳ
giữa và các tế bào cố định [44]. Kỹ thuật CISH dùng trong đánh giá trạng thái gen
đồng thời với hình thái mơ, sử dụng kính hiển vi ánh sáng thƣờng và kỹ thuật tƣơng

tự IHC, kết quả có thể lƣu trữ và định lƣợng.
Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013
14


Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học

1.4.2. Lai pha lỏng
Trong kỹ thuật lai pha lỏng, cả phân tử đích và đầu dò đặc hiệu đều tồn tại
"tự do" trong dung dịch, tăng tối đa cơ hội cho chúng bắt gặp và liên kết với nhau.
Thông thƣờng, mẫu đƣợc ủ ở nhiệt độ cao (720C) trong bể ổn nhiệt và bổ sung hạt
thủy tinh để phá vỡ tế bào, từ đó giải phóng axit nucleic. Một cách khác để tách axit
nucleic ra khỏi tế bào hoặc nhân là sử dụng guanidine thiocyanate. Hợp chất này có
tác dụng biến tính protein hiệu quả hơn urê, guanidine chloride, phenol:chloroform,
ethanol hay dioxane [65]. Nếu axit nucleic quan tâm là ADN thì chúng sẽ bị biến
tính thành dạng sợi đơn. Sau đó bổ sung đầu dị đặc hiệu, duy trì điều kiện đệm và
nhiệt độ thích hợp để hình thành phản ứng lai. Phân tử lai tạo thành đƣợc tách khỏi
dung dịch nhờ hydroxyapatite, hợp chất chỉ liên kết với axit nucleic sợi kép mà
không liên kết với axit nucleic sợi đơn. Phân tử sợi kép đƣợc loại bỏ khỏi
hydroxyapatite bằng cách gia nhiệt hoặc tăng nồng độ muối. Trong một số quy
trình, sợi kép gắn hydroxyapatite đƣợc thu bằng ly tâm, rửa cặn và định lƣợng bằng
máy đo nhấp nhảy lỏng hoặc máy đo quang phổ. Trƣớc đây, kỹ thuật lai pha lỏng
thƣờng sử dụng đầu dò ADN gắn với hạt vi từ, thực hiện phản ứng lai trong dung
dịch và tách riêng phân tử lai khỏi dung dịch bằng nam châm. Nếu đầu dò đƣợc
đánh dấu biotin, phân tử lai đƣợc phân tách nhờ bổ sung hạt từ gắn streptavidin [65].
1.4.3. Lai pha rắn
Trong kỹ thuật lai axit nucleic, phân tử đích (ADN hoặc ARN) có thể đƣợc
cố định trên pha rắn còn đầu dò tồn tại tự do trong dung dịch [60]. Thông thƣờng
pha rắn là màng nitrocellulose hoặc màng nylon [55]. Một số kỹ thuật lai trên pha
rắn thƣờng dùng bao gồm: Southern blot, northern blot, dot blot và reverse dot blot.

Kỹ thuật lai Southern blot phát minh bởi Edward Southern (1975) nhằm phân
biệt một đoạn ADN cụ thể có mặt trong hỗn hợp ADN. Trong kỹ thuật này, trình tự
ADN đích bị cắt bởi một hay nhiều enzyme giới hạn tạo thành các đoạn đƣợc phân
tách trên gel agarose. Sau đó, gel điện di đƣợc xử lý với dung dịch kiềm (phá vỡ

Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013
15