So sánh và chọn lọc các quy trình pcr phát hiện vi khuẩn corynebacterium diptheriae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SO SÁNH VÀ CHỌN LỌC CÁC QUY TRÌNH PCR
PHÁT HIỆN VI KHUẨN
CORYNEBACTERIUM DIPTHERIAE
GÂY BỆNH BẠCH HẦU

Ngành học: Công Nghệ Sinh Học
Giảng viên hƣớng dẫn: THS.PHAN VĂN THÀNH
BS.HỒ NGUYỄN LỘC THÙY
Sinh viên thực hiện:
MSSV: 1311100546

NGUYỄN ĐỖ KHÁNH NHƢ
Lớp: 13DSH03

TP. Hồ Chí Minh, 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
SO SÁNH VÀ CHỌN LỌC CÁC QUY TRÌNH PCR PHÁT
HIỆN VI KHUẨN
CORYNEBACTERIUM DIPTHERIAE
GÂY BỆNH BẠCH HẦU

Ngành học: Công Nghệ Sinh Học
Giảng viên hƣớng dẫn: THS.PHAN VĂN THÀNH
BS.HỒ NGUYỄN LỘC THÙY
Sinh viên thực hiện:
MSSV: 1311100546

NGUYỄN ĐỖ KHÁNH NHƢ
Lớp: 13DSH03

TP. Hồ Chí Minh, 2017


LỜI CAM ĐOAN
Khóa luận tốt nghiệp là cơng trình nghiên cứu của bản thân tôi dƣới sự
hƣớng dẫn khoa học của THS. Phan Văn Thành và Bác sĩ Hồ Nguyễn Lộc
Thùy (Chun viên nghiên cứu phịng Vi khuẩn hơ hấp, khoa Vi sinh miễn
dịch, viện Pasteur TP Hồ Chí Minh)
Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chƣa từng
đƣợc ai công bố trong bất kỳ cơng trình nào khác. Tơi xin chịu trách nhiệm về
khóa luận tốt nghiệp của mình.
TP.HCM, ngày 26 tháng 07 năm 2017
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Đỗ Khánh Nhƣ

i


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ, ngƣời đã nuôi nấng

dạy dỗ con trong 22 năm qua, cảm ơn anh chị trong gia đình đã định hƣớng và
ủng hộ con đƣờng học tập của em.
Em xin cảm ơn Thạc sĩ Võ Thị Trang Đài, Thạc sĩ Phạm Thị Hoan đã
tận tâm chỉ dạy và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt q trình thực hiện
khóa luận.
Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến Thạc sĩ
Phan Văn Thành và Bác sĩ Hồ Nguyễn Lộc Thùy ngƣời ln nhiệt tình giúp
đỡ em, ln định hƣớng và cung cấp những kiến thức bổ ích cho chúng em,
ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn em thực hiện tốt khóa luận tốt nghiệp này.
Đồng thời, xin cảm ơn đến chị Nguyễn Hoàng Vân Anh, anh Nguyễn
Gia Kỳ, bạn Phạm Trần Diệu Huyền, Trƣơng Khánh Duy, Lê Thị Thùy
Trang, Hồ Thị Thu Trang đã hổ trợ mình thực hiện tốt khóa luận tốt nghiệp,
cảm ơn tất cả các bạn trên phịng thí nghiệm đã giúp đỡ mình trong suốt q
trình làm thí nghiệm.
Em xin chân thành cảm ơn !
TP.HCM, ngày 26 tháng 07 năm 2017
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Đỗ Khánh Nhƣ

ii


MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................... v
DANH MỤC HÌNH ẢNH ........................................................................................... vi
DANH MỤC CÁC BẢNG ......................................................................................... vii
Phần I: MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
Phần II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................................. 3
2.1 Sơ lược về bệnh Bạch hầu .................................................................................... 3

2.1.1 Tác nhân gây bệnh ......................................................................................... 3
2.1.2 Cơ chế gây bệnh ............................................................................................. 4
2.1.3Tình hình bệnh bạch hầu trên thế giới ............................................................ 5
2.1.5

Biện pháp phòng bệnh ............................................................................... 8

2.2 Corynebacterium Diphtheriae ............................................................................ 10
2.2.1Hình thái và cấu trúc ..................................................................................... 10
2.2.2Tính chất ni cấy ......................................................................................... 11
2.2.3Đặc điểm sinh hóa ......................................................................................... 12
Phần III: PHƢƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ...................................... 16
3.1 Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................. 16
3.1.1Dụng cụ cần thiết .......................................................................................... 16
3.1.3 Đối tượng nghiên cứu ................................................................................... 18
3.2 Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 19
3.2.3 Khảo sát nồng độ của mồi trong phản ứng Real time PCR ......................... 21
3.2.4 Khảo sát nồng độ của mẫu dò trong phản ứng Realtime PCR .................... 22
3.2.5 Khảo sát độ nhạy ( ngưỡng phát hiện dưới) của phản ứng Realtime PCR . 22
3.2.6

Khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng PCR và Realtime PCR ................... 23

PHẦN IV: KẾT QUẢ .................................................................................................. 24
4.1 Khảo sát độ nhạy (ngưỡng phát hiện dưới) của phản ứng PCR: ...................... 24
4.2 Khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng PCR: ........................................................ 25
4.3 Khảo sát nồng độ mồi trong phản ứng Realtime PCR ....................................... 26
4.4 Khảo sát nồng độ mẫu dị quy trình Realtime PCR ............................................ 27
4.5 Khảo sát độ đặc hiệu quy trình Realtime PCR ................................................... 27

iii


4.6 Khảo sát độ nhạy quy trình Realtime PCR ......................................................... 28
PHẦN V: KẾT LUẬN ................................................................................................ 31
Phần VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 32
PHẦN VII: PHỤ LỤC ................................................................................................. 34

iv


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
AE

Elution buffer

AL

Lysis buffer

AW1

Wash buffer 1

AW2

Wash buffer 2

DNA

Deoxyribose Nucleic Acid

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

EtBr

Ethidium Bromide

PCR

Polymerase Chain Reaction

RT-PCR

Real Time - Polymerase Chain Reaction

TBE

Tris-Borate EDTA

µL

Microlitter

µM

Micromole

v


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1: Theodor Albrecht Edwin Klebs1883 (bên phải), Friedrich Loeffler1884
(bên trái) ................................................................................................................... 11
Hình 2.1: Số liệu thống kê tình hình bệnh Bạch hầu ở Mỹ từ năm 1940-1980 ....... 14
Hình 2.2: Số liệu thống kê tình hình bệnh Bạch hầu ở Mỹ từ năm 1980-2010 ....... 15
Hình 2.3: Tình hình bệnh Bạch hầu trên thế giới ..................................................... 15
Hình 2.4: Tình hình bệnh bạch hầu ở Việt Nam từ năm 2005-2015........................ 16
Hình 2.5: Mơ phỏng vi khuẩn Gram dƣơngC.diphtheriae khi dùng kĩ thuật nhuộm
Xanh methylene. (Nguồn: public health image library-PHLI) ................................. 18
Hình 2.6: Hình dạng vi khuẩn khi dùng kĩ thuật nhuộm Albert (Nguồn: public
health image library-PHLI) ....................................................................................... 18
Hình 2.7: Hình dạng khuẩn lạc trên mơi trƣờng BA (bên phải), hình dạng khuẩn lạc
trên mơi trƣờng HA (bên trái). (Nguồn: public health image library-PHLI) ........... 19
Hình 2.8: Thử nghiệm Elek ...................................................................................... 21
Hình 4.1: Kết quả điện di độ nhạy của mồi trong phản ứng PCR xử dụng cặp mồi
DT1, DT2 .................................................................................................................. 32
Hình 4.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR, quy trình sử dụng cặp mồi Tox1, Tox2
khơng bổ sung MgCl2................................................................................................................................................ 32
Hình 4.3: Kết quả điện di độ nhạy của mồi trong phản ứng PCR xử dụng cặp mồi
Tox1, Tox2 có bổ sung MgCl2 ........................................................................................................................... 33
Hình 4.4, 4.5, 4.6: Kết quả điện di trên gel, thí nghiệm kiểm tra độ đặc hiệu cuả mồi
DT1, DT2 .................................................................................................................. 33
Hình 4.8: Kết quả khảo sát nồng độ mồi trong Realtime PCR ................................ 34
Hình 4.9: Kết quả khảo sát nồng độ mẫu dị trong Realtime PCR .......................... 35
Hình 4.10: Kết quả khảo sát độ đặc hiệu. trong Realtime PCR ............................... 35
Hình 4.11: Kết quả khảo sát độ nhạy trong Realtime PCR ...................................... 36
Hình 4.12: Kết quả chạy Realtime-PCR trên mẫu. trong Realtime PCR ................ 36

vi


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Phản ứng sinh hóa của vi khuẩn bạch hầu và giả bạch hầu ...................19
Bảng 2.2: Khả năng tan huyết của các biotype ......................................................20
Bảng 3.1: Các cặp mồi và đầu dò đƣợc dùng để thực hiện phản ứng PCR ...........25
Bảng 3.2: Các cặp mồi và đầu dò đƣợc dùng để thực hiện phản ứng Realtime PCR
.................................................................................................................................26
Bảng 3.3: Các chủng vi khuẩn trong thí nghiệm kiểm tra độ đặc hiệu ..................26
Bảng 3.4: Thành phần phản ứng cho cặp mồi DT1, DT2 ......................................28
Bảng 3.5: Thành phần phản ứng cho cặp mồi Tox1, Tox2 ....................................28
Bảng 3.6: Chu trình nhiệt cho cặp mồi DT1, DT2 .................................................29
Bảng 3.7: Chu trình nhiệt cho cặp mồi Tox1, Tox2 ...............................................29
Bảng 3.8: Chu trính nhiệt của phản ứng Realtime PCR .........................................30
Bảng 3.9: Thành phẩn phản ứng của phản ứng Realtime PCR ..............................30
Bảng 4.1: Kết quả chạy trên 39 mẫu .....................................................................37

vii


CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU
Bệnh bạch hầu do khuẩn C. Diphtheriae gây ra. Biểu hiện lâm sàng thông
thƣờng nhất là nhiễm trùng khu trú ở niêm mạc hô hấp, với đặc điểm là màng giả
xuất hiện ở nơi nhiễm trùng. Một số vi trùng có thể tạo ra độc tố, do đó nếu nhiễm
độc tố, bệnh có thể diễn tiến nặng với nhiều biến chứng nhƣ viêm cơ tim, viêm dây
thần kinh, viêm thận... trong đó biến chứng tim gây tử vong rất cao. Trong thế chiến
thứ II ở Na Uy, chỉ trong vòng 2 năm sau khi Đức xâm lƣợc số trƣờng hợp nhiễm
bệnh tăng lên đến 50000 ca [3]. Ở Việt Nam, thời kỳ chƣa thực hiện tiêm vắc xin

bạch hầu trong Chƣơng trình tiêm chủng mở rộng (TCMR) thì bệnh bạch hầu
thƣờng xảy ra và gây dịch ở hầu hết các tỉnh, đặc biệt là ở các thành phố có mật độ
dân cƣ cao. Do thực hiện tốt việc tiêm vắc xin bạch hầu nên tỷ lệ mắc bạch hầu ở
Việt Nam đã giảm dần từ 3,95/100.000 dân năm 1985 xuống 0,14/100.000 dân năm
2000. Nhƣng đến năm 2015 ở tỉnh Quảng Nam dịch lại xuất hiện, phát hiện 2 ca
dƣơng tính với vi khuẩn C.diphtheriae. Năm 2016 trong vụ dịch Bình Phƣớc phát
hiện 5 ca trong đó có 1 ca tiếp xúc dƣơng tính với khuẩn [15].
Phƣơng pháp ni cấy đang là “ Tiêu chuẩn vàng” trong phịng thí nghiệm
tuy nhiên phƣơng pháp này tốn nhiều thời gian do khơng phải lúc nào các sinh vật
sống cũng cịn trong mẫu bệnh phẩm sau quá trình vận chuyển và bảo quản mẫu.
Để phân biệt các chủng bạch hầu sinh độc tố và không sinh độc tố bằng các phƣơng
pháp ni cấy truyền thống là rất khó, vì C.diphtheriae và C.ulcerans giống nhau
đến 95% axit amin và nucleotic . Thử nghiệm Elek cũng là một trong những
phƣơng pháp phát hiện đƣợc độc tố bạch hầu. Nhƣng vì tình hình bệnh ngày càng ít
đi và các sinh hóa phẩm dùng cho thử nghiệm này chỉ sử dụng riêng biệt mà lại
không tận dụng đƣợc nhiều nên thử nghiệm này hiện nay ít đƣợc dùng đến hơn [13].
Sự phát triển của sinh học phân tử - phƣơng pháp PCR giúp ích rất nhiều trong việc
nghiên cứu, chữa trị cũng nhƣ kiểm soát bệnh bạch hầu. Ƣu điểm của phƣơng pháp
PCR là có thể phát hiện chính xác chủng bạch hầu sinh độc tố chỉ trong thời gian
ngắn, độ đặc hiệu cao. Để đáp ứng nhanh nhu cầu phát hiện, chẩn đoán và chữa trị,
Real time – PCR ra đời rút ngắn hơn nữa thời gian xét nghiệm bệnh do chỉ thực

1


hiện một phản ứng cho ra kết quả chính xác vi khuẩn gây bệnh và loại bỏ đƣợc
bƣớc điện di sản phẩm của PCR chuẩn. Realtime-PCR sử dụng mẫu dò giúp đọc
đƣợc kết quả chính xác ngay sau khi phản ứng kết thúc. Trên cơ sở đó, đề tài “ So
sánh và chọn lọc các quy trình PCR phát hiện vi khuẩn C.diphtheriae gây bệnh bạch
hầu ” đƣợc thực hiện nhằm khảo sát chọn lọc ra phƣơng pháp PCR phù hợp với

điều kiện nghiên cứu của phòng xét nghiệm Vi khuẩn hô hấp, khoa Vi sinh miễn
dịch, Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh.

2


CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Sơ lược về bệnh Bạch hầu

Hình 1.1: Theodor Albrecht Edwin Klebs1883 (bên phải), Friedrich Loeffler1884 (bên trái)

2.1.1 Tác nhân gây bệnh
Tác nhân gây bệnh C. diphtheriae, đƣợc Klebs tìm thấy và Loeffler phân
lập. C. diphtheriae là trực khuẩn bắt màu Gram dƣơng, khơng có vỏ, khơng có
lơng và khơng có nha bào, đƣờng kính từ 0.3 -0.8µm, dài từ 1-8µm, có những
hạt nhiễm sắc khi nhuộm bằng phƣơng pháp đặt biệt nhƣ Albert hoặc Neisser.Vi
khuẩn dễ dàng mọc trên huyết thanh đông, mọc thành những khuẩn lạc sau 1218 giờ, vƣợt nhanh sự phát triển của các loại vi khuẩn kèm theo. Dựa trên hình
thái học của cụm vi trùng trên thạch tellurite, dựa vào phản ứng lên men và khả
năng tán huyết, vi khuẩn Bạch hầu đƣợc chia làm 4 biotype: mitis, intermedius,
gravis và belfanti [1].

3


Sức đề kháng của vi khuẩn ở ngoài cơ thể rất lớn. Trên các đồ vật, trực
khuẩn bạch hầu sống vài ngày, trong những điều kiện thuận lợi (đƣợc chất nhày
trong họng bảo vệ) vi khuẩn sống đƣợc vài tuần. Trên đồ vải vi khuẩn sống đƣợc
40-50 ngày,trên cát sống đƣợc đến 100 ngày, trên các đồ chơi bằng gỗ chúng
sống đƣợc 3 tháng, trên quản bút mà học sinh ngậm vào miệng đã phát hiện thấy
trực khuẩn bạch hầu sau 15 ngày [1].

Tác nhân gây bệnh bạch hầu rất nhạy cảm với bất kì yếu tố hóa lý nào, ánh
sáng mặt trời giết chúng sau vài giờ, ánh sáng khuếch tán giết trong vài ngày. Ở
nhiệt độ 60oC chúng chết sau 10 phút, dƣới tác dụng của dung dịch clorua thủy
ngân 1% hoặc phenol 5% chúng chết sau 1 phút [1].

2.1.2 Cơ chế gây bệnh
Ngƣời là nguồn bệnh duy nhất của vi khuẩn Bạch hầu. Bệnh lây lan chủ yếu
qua tiếp xúc thân mật giữa bệnh nhân hoặc ngƣời mang vi trùng qua các chất
tiết đƣờng hô hấp hoặc qua các chất dịch ở sang thƣơng ngồi da có chứa vi
trùng gây bệnh, và trong rất ít trƣờng hợp bệnh có thể lây qua đồ chơi của trẻ
em [4].
Cơ chế gây bệnh của vi khuẩn phụ thuộc khả năng xâm nhập vào hệ thống
đƣờng hô hấp trên hoặc qua da và khả năng sinh ngoại độc tố bạch hầu. Trong
đó khả năng sinh ngoại độc tố đóng vai trị quan trọng trong quá trình gây bệnh
[4].
Tại họng, độc tố vi khuẩn giải phóng gây phản ứng viêm nhiễm dẫn đến hình
thành các giả mạc. Các giả mạc bao gồm khối sợi huyết, bạch cầu, hồng cầu,
các tế bào biểu mô bị hoại tử ở đƣờng hô hấp và vi khuẩn. Giả mạc có thể ở tại
chỗ (amidan, họng, mũi) hoặc lan rộng xuống thanh, khí phế quản gây tắc
nghẽn khí đạo, phù nề mơ mềm. Màng giả gây bít tắc chính là nguyên nhân
thƣờng gây tử vong nhất ở ngƣời lớn và trẻ em. Hiện tƣợng mang vi trùng ở
vùng cổ họng là nguồn truyền lây nhiễm quan trọng để duy trì và lan truyền
bệnh trong cộng đồng [5].

4


Độc tố ức chế quá trình tổng hợp protein của tế bào chủ, gây ảnh hƣởng lên
tất cả toàn tế bào cơ thể nhƣng tác động chủ yếu trên cơ tim, trên thần kinh và
trên thận. Liều độc tố nhỏ hơn 0.1mg/kg có thể gây chết với các động vật nhạy

cảm [5].

2.1.3Tình hình bệnh bạch hầu trên thế giới
Theo một số tác giả Mỹ (Youmans và cộng sự 1975) bệnh thƣờng xảy ra ở
phía nam Hoa Kỳ, tại đây số đông ngƣời dân sống trong điều kiện thiếu vệ sinh
và cơ sở vật chất. Môi trƣờng sống không đủ vệ sinh tạo điều kiện thuận lợi cho
các bệnh về hô hấp phát triển, ngƣời dân đa phần không đƣợc dùng vắc xin.
Bệnh cũng thƣờng xảy ra ở nơi có khí hậu ẩm ƣớt dễ dàng cho sự phát triển
bạch hầu da [3].
Thời kỳ tiền vắc xin, bạch hầu là một căn bệnh giết ngƣời hàng đầu trên
thế giới. Trong những năm 1940-1950, việc áp dụng phổ cập tiêm chủng cho trẻ
em ở trẻ sơ sinh đã đƣợc loại bỏ hầu hết các bệnh bạch hầu ở đa số các nƣớc
công nghiệp hóa. Ở các nƣớc đang phát triển, mức tiêm chủng cao của trẻ sơ
sinh với ba liều vắc xin bệnh đậu mùa - bạch hầu (DTP) đã đạt đƣợc sau khi
thực hiện Chƣơng trình Mở rộng Chƣơng trình Tiêm chủng Tổ chức Y tế Thế
giới (WHO) vào những năm 1970 [12].
Tại Belarus, Estonia, Latvia, Lithuania, Nga và Ukraine, tỷ lệ mắc bệnh
bạch hầu ở ngƣời nhỏ hơn 15 tuổi dao động từ 64% đến 82%. Ngƣời lớn 40-49
tuổi có tỷ lệ mắc bệnh và tử vong rất cao, ở một số quốc gia, nhóm tuổi này
chiếm gần một nửa số ngƣời chết. Trẻ em và thanh thiếu niên ở độ tuổi đi học
cũng có tỷ lệ mắc bệnh cao, đặc biệt là ở Liên bang Nga. Tuy nhiên, những
nhóm tuổi này có tỉ lệ tử vong thấp, số bệnh nhân tử vong xảy ra chủ yếu ở trẻ
em không đƣợc tiêm vắc xin đầy đủ. Tại Moldova, các nƣớc thuộc khu vực
Caucasus (Armenia, Azerbaijan và Georgia), Trung Á (Kyrgyzstan, Tajikistan,
Turkmenistan và Uzbekistan) và Kazakhstan, tỷ lệ ngƣời lớn bị bệnh dao động
từ 38% đến 59% [12].

5

Năm 1990, dịch bệnh bạch hầu đã tái hiện ở Liên Bang Nga, phần lớn là ở
ngƣời lớn. Trong giai đoạn 1991-1993, đại dịch lan rộng nhanh chóng, vào cuối
năm 1994, do sự bất cập trong các biện pháp y tế cộng đồng, tất cả các Quốc
gia Mới độc lập (NIS) và các quốc gia Baltic của Liên bang Cộng hịa Xã hội
Chủ nghĩa Liên Xơ (Liên Xơ cũ) đều xảy ra dịch. Dịch bệnh đạt đỉnh điểm vào
năm 1994-1995, với tỷ lệ hàng năm là 17 ca / 100.000 dân và tỷ lệ mắc bệnh
cao nhất là 73 ca / 100.000 dân ở Tajikistan năm 1995. Từ năm 1990 đến năm
1998, 1157.000 trƣờng hợp và 5000 trƣờng hợp tử vong đƣợc công bố ở các
quốc gia thuộc Liên Xô cũ, chiếm 180% số ca tử vong do bệnh bạch hầu ở
ngƣời. Ba phần tƣ các trƣờng hợp đƣợc công bố từ Liên bang Nga. Đây là vụ
dịch bệnh bạch hầu lớn nhất kể từ những năm 1950, bắt đầu thời kỳ tiêm chủng
bạch hầu mở rộng [12].
Từ năm 1980 đến năm 2011 ở Mỹ đã xảy ra 55 ca. Năm 1990 dịch xảy ra ở
Liên xô cũ gây tổn thất nghiêm trọng về ngƣời. Năm 1994 bệnh xảy ra ở 15
quốc gia độc lập từ Liên Xơ có 157.000 ca mắc và hơn 5,000 ca tử vong,
nguyên nhân dẫn đến hậu quả này là do điều kiện sống của ngƣời dân không
đƣợc bảo đảm, vắc xin chƣa đƣợc phổ cập rộng rãi [12].

Diphtheria - United States
1940-1980

Hình 2.1: Số liệu thống kê tình hình bệnh Bạch hầu ở Mỹ từ năm 1940-1980

6


Hình 2.2: Số liệu thống kê tình hình bệnh Bạch hầu ở Mỹ từ năm 1980-2010
( />
.
Hình 2.3: Tình hình bệnh Bạch hầu trên thế giới.

7


2.1.4 Tình hình bệnh bạch hầu ở Việt Nam
Trƣớc khi có chƣơng trình tiêm chủng, bệnh bạch hầu là bệnh của trẻ em,
thỉnh thoảng gây dịch lẻ tẻ, do thực hiện tốt việc tiêm vắc xin bạch hầu nên tỷ lệ
mắc bạch hầu ở Việt Nam đã giảm dần từ 3,95/100.000 dân năm 1985 xuống
0,14/100.000 dân năm 2000 [15].
Đến năm 2015 bạch hầu lại xuất hiện ở Quảng Nam trong đó phát hiện hai
ca dƣơng tính với khuẩn C.diphtheriae. Năm 2016 dịch xảy ra ở Bình Phƣớc 5
ca đƣợc xác định, 1 ca tiếp xúc dƣơng tính với khuẩn C.diphtheriae.

40
30
20

Số ca BH

10
Số ca
chết

0

Hình 2.4: Tình hình bệnh bạch hầu ở Việt Nam từ năm 2005-2015

2.1.5 Biện pháp phòng bệnh
Đối với ngƣời nhiễm bệnh:
Bệnh xảy ra chủ yếu của trẻ nhỏ. Lứa tuổi càng tăng sự nhạy cảm với

bệnh càng giảm. Bệnh có thể xảy ra ở mọi lứa tuổi nếu thiếu miễn dịch bạch
hầu [3]. Nguy hiểm nhất là bệnh đe dọa các trẻ em nhỏ tuổi (từ 1 đến - 4
tuổi). Nhất thiết phải cách ly ở bệnh viện, ở cách li riêng biệt, khi xác định
chuẩn đoán bằng xét nghiệm, nhân viên phải đeo khẩu trang, trang bị bảo hộ
an toàn. Nếu điều trị sớm và đúng cách thì tỉ lệ tử vong rất thấp. Phải dùng

8


huyết thanh chống bạch hầu ngay từ ngày đầu tiên của bệnh (trƣớc ngày thứ
6).
Những ngƣời mang vi khuẩn không sinh độc tố có thể trở lại tập thể
và sinh hoạt nhƣ bình thƣờng. Bắt buộc phải khử trùng trong thời kì phát
bệnh và thời kì khỏi bệnh, năng rửa cổ họng cho ngƣời bệnh. Trƣớc đây,
ngƣời ta dùng nhiều loại thuốc (huyết thanh khô giải độc tố, trypallavis,
sulfamide) nhƣng không mang lại kết quả tốt, trẻ em vẫn mang vi khuẩn
hàng tháng. Hiện nay ngƣời ta dùng penicillin hoặc tyrotricin cho kết quả tốt
hơn. Chất tyrotrixin không tan trong nƣớc, cho nên thƣờng dùng với nƣớc,
trong glycerine hoặc trộn tyrotrixin bột với natri bitmutbazic [6]. Phải khử
trùng buồng và đồ vật bằng cloramin 0.5% trong 1 giờ, khử trùng bát đũa
bằng cloramin 1% và đồ vải bằng cloramin 5% trong một giờ rƣỡi.( Ramon,
1944).
Đối với ngƣời tiếp xúc với ca bị nhiễm bệnh:
Tất cả những ngƣời tiếp xúc với ngƣời bệnh đều phải xét nghiệm 2
lần cách nhau 2 ngày, lấy bệnh phẩm trƣớc khi dùng thuốc súc miệng. Nếu
xét nghiệm có kết quả dƣơng tính (có trực khuẩn bạch hầu sinh độc tố) thì
phải theo dõi ít nhất là 7 ngày kể từ khi đƣa ngƣời vào bệnh viện [6].
Tiêm ngừa phòng bệnh
Phải tiêm chủng đúng độ tuổi quy định và tiêm mũi nhắc lại cho trẻ
em. Ngày nay ngƣời ta tiêm giải độc tố bạch hầu hoặc vắc xin phối hợp bạch

hầu – ho gà hoặc vắc xin phối hợp bạch hầu – uốn ván – thƣơng hàn, hay là
vắc xin phối hợp bạch hầu – uốn ván – ho gà. Trong chƣơng trình tiêm chủng
mở rộng, chúng ta sử dụng vắc xin tam liên DPT có kết quả rất tốt, đến năm
2000 tỷ lệ mắc chỉ còn 0.14/100000 dân.

9


2.2 Corynebacterium Diphtheriae
Phân loại khoa học

Giới (regnum)

Bacteria

Ngành (phylum)

Actinobacteria

Bộ (ordo)

Actinomycetales

Họ (familia)

Corynebacteriaceae

Chi (genus)

Corynebacterium

Lồi (species)

C. diphtheriae

2.2.1Hình thái và cấu trúc
C.diphtheriae là trực khuẩn Gram dƣơng, đƣờng kính từ 0.3 -0.8µm, dài từ
1-8µm, mảnh , cong hoặc hình chùy, khơng di động, khơng sinh bào tử, khơng
có vỏ, khơng có nha bào.

Hình 2.5: Mơ phỏng vi khuẩn Gram dƣơng C.diphtheriae khi dùng kĩ thuật nhuộm
Xanh methylene. (Nguồn: public health image library-PHLI)

Nhuộm Gram C.diphtheriae có hình trực khuẩn bắt màu Gram dƣơng, hình
hơi cong, có một đầu nhỏ xếp thành hình chữ V, T, Y hay nhƣ hình hàng rào.
Khi nhuộm Albert vi khuẩn có hình dài, thân bắt màu xanh nhạt, có 2-3 hạt màu
đỏ tím, 2 đầu to hơn bắt màu xanh đậm.

10


Hình 2.6: Hình dạng vi khuẩn khi dùng kĩ thuật nhuộm Albert
(Nguồn: public health image library-PHLI)

2.2.2Tính chất ni cấy
Trực khuẩn Bạch hầu ƣa các mơi trƣờng có máu, huyết thanh đơng và
pepton, thích hợp với pH trung tính hoặc hơi kiềm, nhiệt độ mơi trƣờng là 370C vì
vậy các mơi trƣờng ni cấy và phân lập phải có đủ các điều kiện trên. Trên môi
trƣờng thạch máu thƣờng, khuẩn lạc mọc sau sau 24h, nhỏ, màu trắng, có thể quan
sát đƣợc tan huyết. Môi trƣờng chọn lọc cho C.diphtheriae là mơi trƣờng thạch

máu có tellurite ở 35-370C/24-48 giờ. Khuẩn lạc nhỏ li ti, bắt màu xám đen.
C.diphtheriae mọc sau 12-18 giờ trên môi trƣờng huyết thanh đông Loffle, ở điều
kiện 370C (một số vi khuẩn khác mọc chậm hơn). Khuẩn lạc nhỏ, trơn, hơi đục,
đƣờng kính 1-2 mm, dễ tan trong nƣớc muối đẳng trƣơng

Hình 2.7: Hình dạng khuẩn lạc trên mơi trƣờng BA (bên phải), hình dạng khuẩn lạc
trên môi trƣờng HA (bên trái). (Nguồn: public health image library-PHLI)

11


2.2.3Đặc điểm sinh hóa
Cần phân biệt bạch hầu với giả bạch hầu, dựa vào sự lên men hai loại
đƣờng glucose và sacarose, khả năng làm tan hồng cầu cừu [5].
Bảng 2.1: Phản ứng sinh hóa của vi khuẩn bạch hầu và giả bạch hầu
Chủng vi khuẩn

Glucose

Sacarose

Tan hồng cầu cừu

C.diptheriae
C.hoffmanni
C.cutis

+
+
-

+
-

+hoặc-

Bảng 2.2: Khả năng tan huyết của các biotype
C.diphtheriae
Gravis
Intermedius
Mitis

Tan máu tế bào
hồng cầu bị
+

Tan máu tế bào
hồng cầu thỏ
+
+

Tính chất lên men
đƣờng
+
-

2.2.4 Độc tố vi khuẩn
C.diphtheriae chủ yếu sinh ngoại độc tố, gồm có 2 phần: A là độc tố,
B là phần gắn vào các thụ cảm trên tế bào. Sau khi B bám vào tế bào, quá
trình phân giải protein xẩy ra giúp cho phần A xâm nhập vào tế bào, tại đó

ức chế q trình tổng hợp chuỗi acid amin của protein.
Độc tố bạch hầu ức chế sự tổng hợp protein ở tất cả các tế bào có
nhân điển hình bằng việc gắn ADP vào yếu tố kéo dài 2 (EF-2) làm cho các
ribosom sẽ dịch xuống bộ ba tiếp theo để đọc mã trên RNA thông tin.
Độc tố này đƣợc mã hóa bởi phage ly giải, phage này tích hợp vào
trong DNA của vi khuẩn. Độc tố là một protein [6].
Các chủng vi khuẩn đều sinh độc tố (ngoại độc tố), có trọng lƣợng
phân tử 62kDa. Việc sản sinh độc tố phụ thuộc vào sự có mặt của thực khuẩn
thể gây ly giải mang gen mã hóa độc tố (tox +). Nó tác động lên tế bào vật
chủ giải phóng gen độc tố và sản sinh độc tố. Sự sản sinh độc tố tăng khi cơ
thể vật chủ thiếu yếu tố sắt.

12


Chủng vi khuẩn khơng có thể thực khuẩn sẽ khơng sản sinh độc tố do
vậy khơng có khả năng gây bệnh. Chúng có thể trở thành chủng có độc tố khi
bị nhiễm trùng với thể thực khuẩn có độc tố ly giải.
Xác định độc tố vi khuẩn bằng cách tiêm truyền chuột lang, làm phản
ứng trung hòa hoặc làm phản ứng Elek [5]. Thử nghiệm này dựa trên sự
khuếch tán kép của độc tố bạch hầu và kháng độc tố trong môi trƣờng thạch.
Giấy lọc vô trùng ngâm tẩm chất kháng độc tố bạch hầu đƣợc đặc trong môi
trƣờng nuôi cấy. Cấy các chủng nghi bạch hầu theo đƣờng thẳng vng góc
90 ° với dải kháng độc. Toxigenic C.diphtheriae đƣợc phát hiện bởi vì độc tố
tiết ra từ khu vực tăng trƣởng, phản ứng với chất chống độc để tạo thành các
dịng precipitin

Hình 2.8: Thử nghiệm Elek

Vi khuẩn nhạy cảm với penicillin nhƣng độc tố gây ra các triệu chứng

lâm sàng không bị bất hoặt bởi kháng sinh. Điều trị và phòng bệnh đều phụ
thuộc vào việc trung hòa độc tố. Nếu trên lâm sàng có triệu chứng của bạch
hầu, cần dùng kháng độc tố. Bạch hầu là bệnh cấp tính, địi hỏi xử lý sớm và
nhanh kể trƣớc khi có xét nghiệm [6].

13


2.3 Phương pháp PCR và Realtime PCR trong nghiên cứu phát hiện
bệnh bạch hầu
Phát hiện bệnh bạch hầu phụ thuộc vào việc nuôi cấy C.diphtheriae
và thực hiện thử nghiệm Elek để xác định độc tính là chủ yếu. Tuy nhiên, do
quá trình bảo quản và vận chuyển số lƣợng vi khuẩn cịn sống khơng phải lúc
nào cũng có trong mẫu bệnh phẩm hoặc thƣờng nằm dƣới mức giới hạn phát
hiện. Do đó các xét nghiệm PCR tiêu chuẩn phát hiện ra gen độc tố bạch hầu
đang là phƣơng pháp phổ biến nhất trong việc chẩn đoán phân tử bệnh bạch
hầu [8]. PCR chuẩn phát hiện đƣợc C.diphtheriae dù tỉ lệ cịn sống của vi
khuẩn trong bệnh phẩm sau q trình vận chuyển là rất ít. Các nghiên cứu
trƣớc đó khơng đánh giá độ nhạy của PCR, một thời gian sau đó họ mới bắt
đầu đánh giá độ nhạy của phƣơng pháp này sau khi vận chuyển và lƣu trữ
các mẫu lâm sàng trong silica gel một thời gian dài (7-14 tháng). Ở Indonesia
một nghiên cứu cho thấy rằng khi bảo quản và vận chuyển mẫu bệnh phẩm
trong túi silica gel, 11 trong số 17 bệnh nhân đƣợc chẩn đoán lâm sàng đã
đƣợc chẩn đoán bằng bạch hầu cổ họng dƣơng tính với C.diphtheriae sau khi
chúng đƣợc bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 2 tuần [10]. Tỉ lệ tử vong do
nhiễm trùng gây ra chủ yếu là do độc tố bạch hầu, vì vậy ngƣời dùng cặp mồi
DT1

Fw

5’-

CGGGGATGGTGCTTCGCG-3’,

DT2

Rev

5’-

CGCGATTGGAAGCGGGGT-3’ trong phản ứng PCR để phát hiện gen độc
tố. Nhƣng độc tố bạch hầu ở C.ulcerans và C.diphtheriae giống nhau đến
95% ở nucleotide và acid amin nên PCR chuẩn phải lặp lại đến 2 lần để phân
biệt đƣợc 2 chủng vi khuẩn này [14].
So sánh giới hạn phát hiện giữa Realtime PCR và các xét nghiệm
PCR thƣờng, các thử nghiệm Realtime PCR phát hiện đƣợc các nồng độ
DNA thấp hơn so với các xét nghiệm PCR tiêu chuẩn. Với sự xuất hiện của
cơng nghệ khuếch đại gen dị huỳnh quang mới, phƣơng pháp này đã có thể
cải thiện đáng kể hơn phƣơng pháp PCR chuẩn. Mƣời lăm DNA chiết xuất từ
các mẫu bệnh phẩm đƣợc thu thập từ năm 1997 đến năm 1998, đƣợc lƣu trữ

14


ở -70 ° C kể từ thời điểm thu thập ban đầu (24 đến 36 tháng), đƣợc xác định
là dƣơng tính theo PCR chuẩn (bốn là dƣơng tính yếu) Một hoặc cả hai tiểu
đơn vị tox khi đƣợc kiểm tra tại thời điểm thu mẫu. Hai năm sau, trong
nghiên cứu này, PCR chuẩn đƣợc lặp lại trên 15 chiết xuất này, và gen độc tố
đƣợc phát hiện chỉ trong hai mẫu. Khi phân tích bằng Realtime PCR, 13
trong số 15 mẫu dƣơng tính đối với một hoặc cả hai tiểu đơn vị của gen độc

tố [8].
Trong phƣơng pháp pha loãng Realtime PCR phát hiện thấy gen độc
tố chỉ với 2 CFU nhạy hơn rất nhiều so với 1.500 CFU đƣợc phát hiện bởi
PCR chuẩn. Bằng cách này, Realtime PCR có độ nhạy cảm gấp 10 lần so với
các kết quả PCR truyền thống đƣợc báo cáo trong nghiên cứu của Nakao và
Popovic [8]. Real time PCR cho phép xác định độc tính trong mẫu bệnh
phẩm khi PCR tiêu chuẩn tỏ ra khơng thích hợp. Realtime PCR có độ nhạy
cao hơn, cụ thể, nhanh chóng và làm giảm nhu cầu sử dụng PCR. Các nghiên
cứu trƣơc chỉ ra rằng, mặc dù nhiều mẫu lâm sàng chỉ chứa một lƣợng nhỏ
DNA nhƣng Realtime PCR có thể phát hiện đƣợc độc tố khi có tới hai đến ba
bản sao của gen mục tiêu. Tuy nhiên, một lợi thế lớn của phƣơng pháp này là
loại bỏ đƣợc bƣớc điện di, chụp hình kết quả điện di và dễ dàng đọc đƣợc kết
quả sau khi phản ứng kết thúc. Realtime PCR là sự cải tiến đáng kể so với
các xét nghiệm PCR chuẩn hiện có để phát hiện độc tố. Do đó có thể cung
cấp những kiên thức dịch tễ học quan trọng để phát hiện nhanh chóng các
trƣờng hợp nhiễm bệnh trong nƣớc và nhập cƣ cũng nhƣ kiểm sốt đƣợc tình
hình cấp bách của bệnh bạch hầu trên toàn thế giới [8].

15


CHƢƠNG 3: PHƢƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
3.1 Vật liệu nghiên cứu
3.1.1Dụng cụ cần thiết
-

Kính hiển vi điện tử

-

Máy ly tâm

-

Máy PCR

-

Máy điện di

-

Tủ chụp UV sản phẩm điện di

-

Máy RT-PCR

-

Tủ âm 80oC, âm 20oC

-

Tủ mát

-

Tủ an toàn sinh học

-

Bình ủ CO2, tủ ấm 37oC

-

Pipet vi lƣợng các loại

-

Đĩa petri đƣờng kính 90mm

3.1.2 Mơi trường, sinh hóa phẩm
-

Bộ nhuộm Gram

-

Thuốc nhuộm Albert’A
Toludine blue

0.15gr

Malachite green

0.20gr

Glacial acetic acid

1ml

Alcohol (95% ethanol)

2ml

16