Phân lập nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa non và xác định dòng nấm tạo Giberelin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
  





KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP




PHÂN LẬP NẤM Fusarium moniliforme GÂY BỆNH
LÖA VON VÀ XÁC ĐỊNH DÕNG NẤM TẠO GIBERELIN






Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khoá: 2003 - 2007
Sinh viên thực hiện: DIỆP TUYẾT CHÂU

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 09/2007


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
  





KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP




PHÂN LẬP NẤM Fusarium moniliforme GÂY BỆNH
LÖA VON VÀ XÁC ĐỊNH DÕNG NẤM TẠO GIBERELIN

Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện
TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN DIỆP TUYẾT CHÂU







Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 09/2007

i
LỜI CẢM ƠN
Xin chân thành cảm ơn:
Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi
điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường.
Các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học cùng các thầy cô trực tiếp
giảng dạy luôn tận tình hướng dẫn, giảng dạy, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt
bốn năm qua.
TS. Lê Đình Đôn không những đã tận tình hướng dẫn, dạy dỗ con trong
trong nghiên cứu khoa học mà thầy còn dạy con nhiều bài học quí giá trong cuộc
sống. Những lời thầy nói, thầy dạy là những bài học mà con sẽ nhớ mãi.
Anh Nguyễn Kinh Long, Nguyễn Văn Lẫm đã giúp đỡ, động viên, chia sẽ
những vui buồn trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Chị Vy, chị Kiều và chị Vân ở phòng Bảo Vệ Thực Vật (Phòng 118, 105)
khu Phượng Vỹ Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM đã nhiệt tình giúp đỡ tôi vượt
qua giai đoạn đầu của quá trình thực hiện đề tài.

Chị Ly, anh Điền, anh Khang, anh Hưởng phụ trách phòng Hóa Lý và các
anh chị phụ trách phòng Hóa Sinh thuộc Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ
Môi Trường, Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM đã tận tình giúp đỡ tôi trong thời
gian làm đề tài.
Toàn thể lớp CNSH 29 đã giúp đỡ, chia sẽ và động viên tôi trong suốt thời
gian làm đề tài.
Thành kính ghi ơn ba mẹ đã nuôi nấng, dạy bảo điều hay lẽ phải cho con cũng như
đã động viên, hỗ trợ con về tinh thần, vật chất để con có thể hoàn thành tốt khóa
luận này. Ba mẹ là nguồn động viên là người tạo thêm sức mạnh để con vượt qua
mọi khó khăn trở ngại trong cuộc sống.
Tp. Hồ Chí Minh ngày 01 tháng 09 năm 2007
Diệp Tuyết Châu

ii
TÓM TẮT LUẬN VĂN

DIỆP TUYẾT CHÂU, Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, tháng
08/2007. “Phân lập nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von và xác định
dòng nấm tạo giberelin”.

Giáo viên hướng dẫn: TS. Lê Đình Đôn

Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 03/2007 đến tháng 08/2007, tại Phòng
bệnh cây, Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM và Viện
Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi Trường, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM.
Cây lúa là cây gắn liền với lịch sử hình thành và phát triển nước ta. Cùng với
quá trình phát triển của cây lúa thì các loại dịch bệnh cũng hình thành và gây hại
ngày càng nghiêm trọng. Đặc biệt bệnh lúa von đã xuất hiện trở lại trong hai năm
gần đây trên các ruộng lúa ở Đồng Bằng Sông Cửu Long làm giảm năng suất đáng
kể. Để hiểu rõ hơn về nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von và tác nhân làm

cho cây lúa phát triển cao lên là do giberelin nên chúng tôi tiến hành các nghiên cứu sau:
Phân lập và tách đơn bào tử các dòng nấm Fusarium moniliforme gây bệnh
lúa von trên các ruộng lúa ở một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long.
Phát hiện vùng gen tef của nấm Fusarium moniliforme bằng kỹ thuật PCR.
Nuôi cấy các dòng nấm Fusarium moniliforme trong môi trường sản xuất
GA
3
và định tính GA
3
bằng TLC.
Các kết quả đạt được:
Phân lập được 20 dòng nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von.
Khuếch đại thành công vùng tef của 14 dòng nấm bằng cặp mồi ef1-ef2
bằng kỹ thuật PCR.
Trong 20 dòng nấm, chưa phát hiện được dòng nào sản xuất GA
3
trong môi
trường 20% ICI bằng TLC.

iii
SUMMARY

The title of graduation thesis is “Isolation the causal agent of bakanae
disease, Fusarium moniliforme, and identification isolates’ production of
gibberellin”. This thesis was conducted by Dr. LE DINH DON from 03/2007 to
08/2007 at Nong Lam university.
In recent years, bakanae disease has broken out and caused the loss of yields.
In order to understand clearly the fungi causing bakanae disease in different
geographic regions in Mekong Delta, we based on symptoms and morphological
characteristics to isolate 20 samples. However, one of the greatest impediments to

study of Fusarium has been the incorrect and confused application of species names
to toxigenic and pathogenic isolates, owing in large part to intrinsic limitations of
morphological species recognition. Thus, we used molecular technique as PCR to
make the base inferre the relationships among well-defined Fusarium as well as
showing a great deal of species diversity that was vastly under-estimated by all
previous morphological treatments. We sucessfully amplified tef gene region of 14
isolates with ef1 and ef2 primers. Moreover, we cultured 20 isolated Gibberella
fujikuroi in gibberrellin-produced medium (20% ICI). Then we used TLC method to
identify GA
3
but our experiment did not go as well as planned.



iv
MỤC LỤC

Lời cảm tạ ................................................................................................................. i
Tóm tắt luận văn ....................................................................................................... ii
Summary ................................................................................................................. iii
Mục lục .................................................................................................................... iv
Danh sách các chữ viết tắt ...................................................................................... vii
Danh sách các bảng, hình, sơ đồ ........................................................................... viii
Chƣơng 1. MỞ ĐẦU .............................................................................................. 1
1.1 Đặt vấn đề .......................................................................................................... 1
1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu ....................................................................... 2
1.2.1 Mục tiêu .......................................................................................................... 2
1.2.2 Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 2
Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 3
2.1 Giới thiệu về bệnh lúa von ................................................................................. 3

2.1.1 Phân bố và thiệt hại ......................................................................................... 3
2.1.2 Triệu chứng ..................................................................................................... 3
2.1.3 Tác nhân .......................................................................................................... 5
2.1.4 Hình dạng và kích thước ................................................................................. 6
2.1.5 Đặc tính sinh lý ............................................................................................... 6
2.1.6 Điều kiện phát sinh và phát triển .................................................................... 7
2.2 Đại cương về nấm Gibberella fujikuroi ............................................................. 8
2.2.1 Phân loại học ................................................................................................... 8
2.2.2 Sơ lược về Gibberella fujikuroi ...................................................................... 8
2.2.3 Sinh tổng hợp giberelin ở Gibberella fujikuroi .............................................. 9
2.3 Giới thiệu về gen tef ......................................................................................... 10
2.4 Tổng quát về giberelins .................................................................................... 11
2.4.1 Đại cương về các chất giberelins .................................................................. 11
2.4.2 Chức năng và vai trò sinh hóa ....................................................................... 13

v
2.4.2.1 GAs kích thích sự phát triển thân ở những cây lùn và cây hoa thị ............ 13
2.4.2.2 GAs điều hòa sự chuyển hóa cây con sang giai đọan trưởng thành .......... 14
2.4.2.3 GAs ảnh hưởng giai đọan bắt đầu ra hoa và sự xác định giới tính ............ 14
2.4.2.4 GAs đẩy mạnh “fruit set” ........................................................................... 14
2.4.2.5 GAs thúc đẩy sự nảy mầm của hạt ............................................................. 14
2.4.3 Ứng dụng GAs trong thương mại ................................................................. 15
2.4.3.1 Trong trồng trọt .......................................................................................... 15
2.4.3.2 Sản xuất bia ................................................................................................ 15
2.4.3.3 Tăng sản lượng mía .................................................................................... 15
2.4.3.4 Sử dụng trong chọn giống thực vật ............................................................ 16
2.5 Sắc ký lớp mỏng .............................................................................................. 16
2.5.1 Tổng quát về sắc ký lớp mỏng ..................................................................... 16
2.5.2 Ưu điểm của sắc ký lớp mỏng ...................................................................... 20
2.5.3 Một số ứng dụng thông thường của TLC ...................................................... 20

2.6 Ứng dụng của kỹ thuật PCR............................................................................. 20
Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ......................... 21
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện ....................................................................... 22
3.1.1 Thời gian nghiên cứu .................................................................................... 22
3.1.2 Địa điểm thực hiện ....................................................................................... 22
3.2 Vật liệu nghiên cứu .......................................................................................... 23
3.3 Vật liệu và phương pháp thí nghiệm ................................................................ 23
3.3.1 Phân lập, tách đơn bào tử và thu sinh khối nấm ........................................... 23
3.3.1.1 Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm ................................................................. 24
3.3.1.2 Phương pháp phân lập nấm ....................................................................... 25
3.3.1.3 Phương pháp cắt đơn bào tử ...................................................................... 25
3.3.1.4 Phương pháp nhân sinh khối ..................................................................... 25
3.3.2 Phương pháp ly trích DNA của nấm ............................................................ 26
3.3.2.1 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm ................................................................ 26
3.3.2.2 Phương pháp ly trích DNA ....................................................................... 26

vi
3.3.2.3 Định tính DNA ........................................................................................... 27
3.3.2.4 Tinh sạch sản phẩm ly trích ...................................................................... 28
3.3.3 Khuếch đại vùng tef ...................................................................................... 28
3.3.3.1 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm ................................................................. 28
3.3.3.2 Thực hiện phản ứng ................................................................................... 29
3.3.3.3 Đánh giá sản phẩm PCR ............................................................................ 29
3.4 Sắc ký lớp mỏng (TLC) phát hiện GA
3
........................................................... 29
3.4.1 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm .................................................................... 29
3.4.2 Phương pháp sản xuất GA
3
.......................................................................... 30

3.4.3 Phương pháp trích GA
3
................................................................................. 30
3.4.4 Định tính GA
3
bằng TLC ............................................................................. 31
Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 32
4.1 Kết quả thu mẫu bệnh lúa von ở ĐBSCL ....................................................... 32
4.2 Kết quả phân lập và tách đơn bào tử ................................................................ 33
4.3 Kết quả nhân sinh khối .................................................................................... 35
4.4 Kết quả ly trích và tinh sạch DNA của nấm ................................................... 36
4.5 Kết quả PCR .................................................................................................... 38
4.6 Kết quả định tính GA
3
bằng TLC .................................................................... 39
Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................... 41
5.1 Kết luận ............................................................................................................ 41
5.2 Đề nghị ............................................................................................................. 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 42
PHỤ LỤC







vii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AcOH: acid acetic.
AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism.
BVTV: bảo vệ thực vật.
bp: base pair.
CHCl
3
: chloroform.
dNTPs: deoxyribonucleotide-5-triphosphate.
ĐBSCL: Đồng Bằng Sông Cửu Long.
EtOAc: ethyl acetate.
HPLC: high performance liquid chromatography.
ITS: Internal Transcribed Spacer.
GAs: giberelins.
GA
3
: acid giberelic.
Gf: Gibberella fujikuroi
MP: mating population.
PCR: polymerase chain reaction.
PDA: potato dextrose agar.
RAPD: Random Amplified Polymorphism DNA.
rDNA: ribosome Deoxynucleotide acid.
Rf: ratio of fronts.
STT: số thứ tự.
TAE: TrisAcetic Ethylene diamine tetra acetate.
TE: Tris Ethylene diamine tetra acetate.
tef : translation elongation factor.
TLC: thin-layer chromatography.
Tm: melting temperature.
UV: ultra violet.

WA: water agar.

viii
DANH SÁCH CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ, BẢNG

Hình 2.1 Ruộng lúa ở Trà Vinh bị nhiễm bệnh lúa von .............................................. 4
Hình 2.2 Bào tử nấm trên thân lúa bệnh ..................................................................... 5
Hình 2.3 Chu kỳ gây bệnh của nấm Fusarium moniliforme ...................................... 5
Hình 2.4 Cấu tạo axít giberelic ................................................................................ 11
Hình 2.5 Cấu tạo ent-Kaurene ................................................................................... 11
Hình 2.6 Cấu tạo ent-Gibberellane............................................................................ 12
Hình 2.7 GA
3
kích thích cây bắp cải ra hoa và phát triển cao ................................. 13
Hình 2.8 Ảnh hưởng của GA
3
đến giống nho không hạt của Thompson ................. 15
Hình 2.9 Sơ đồ các bước thực hiện TLC .................................................................. 19
Hình 4.1 Ruộng lúa bị nhiễm bệnh lúa von ở Càng Long – Trà Vinh ..................... 33
Hình 4.2 Mẫu bệnh sau 3 ngày ủ trên môi trường WA ............................................ 33
Hình 4.3 Khuẩn lạc nấm Fusarium moniliforme sau 7 ngày cấy ............................. 34
Hình 4.4 Màu khuẩn lạc trên môi trường PDA sau 7 ngày cấy ................................ 34
Hình 4.5 Đại bào tử Fusarium moniliforme ............................................................. 35
Hình 4.6 Tiểu bào tử Fusarium moniliforme ........................................................... 35
Hình 4.7 Kết quả ly trích DNA theo qui trình 1 ....................................................... 36
Hình 4.8 Kết quả ly trích DNA của 20 dòng nấm theo qui trình 2 ........................... 37
Hình 4.9 Sản phẩm PCR vùng tef ............................................................................. 39
Hình 4.10 Kết quả sắc ký .......................................................................................... 40

Sơ đồ 2.1 Con đường sinh tổng hợp GA

3
ở Gibberella fujikuroi .............................. 9
Sơ đồ 2.2 Bản đồ vùng gen tef Fusarium ................................................................. 10
Sơ đồ 3.1 Qui trình trích GA
3
................................................................................... 30
Sơ đồ 3.2 Qui trình TLC phát hiện GA
3
................................................................... 31

Bảng 3.1 Các dòng nấm được thu thập trên các giống lúa ở các tỉnh ĐBSCL ........ 23
Bảng 3.2 Thành phần một phản ứng PCR................................................................. 29
1

Chƣơng 1
MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề
Việt Nam là một trong những nước Đông Nam Á có lịch sử lâu đời về sản
xuất lúa. Cây lúa không những đã gắn bó với con người, đất nước ta từ hàng ngàn
năm mà cây lúa còn tạo nên lịch sử, văn hóa Việt Nam, bảo vệ con người Việt Nam
trong những năm chiến tranh, là niềm tự hào của Việt Nam vươn lên trong hòa bình.
Điều đó thể hiện rõ ở chỗ nước ta trước năm 1985 là nước nhập khẩu gạo sau đó đã
trở thành nước xuất khẩu gạo thứ hai trên thế giới. Nó được xem là nguồn cung cấp
lương thực chủ yếu của người Châu Á nói chung cũng như là người Việt Nam nói riêng.
Cùng với quá trình phát triển của cây lúa thì các loại dịch bệnh cũng đã xuất
hiện và gây hại ngày càng nghiêm trọng. Các loại dịch bệnh này có thể do nhiều tác
nhân như nấm, sâu bệnh, vi khuẩn, vi rút hay kí sinh trùng gây ra.
Các loại dịch bệnh phổ biến do nấm gây ra trên lúa có thể kể như lúa von,
đạo ôn, khô vằn. Những năm gần đây bệnh lúa von đã xuất hiện trở lại trong vụ

Đông Xuân ở các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long, đặc biệt trên đồng ruộng An
Giang. Theo thống kê của chi cục BVTV An Giang trong tháng 02/2007 toàn tỉnh
có hơn 8000 ha lúa bị nhiễm lúa von trên các trà lúa đang từ đẻ nhánh đến đang làm
đòng () và đã làm giảm năng suất đáng kể.
Bệnh lúa von đã được những nhà khoa học Nhật mô tả cách đây hơn 100
năm nhưng vẫn chưa xác định rõ các loài Fusarium gây triệu chứng của bệnh lúa
von như thối gốc và ngọn, cây lúa phát triển cằn cỗi, triệu chứng thường thấy nhất
là cây lúa cao lên đột biến do nấm tạo giberelin gây ra. Các nhà nghiên cứu Nhật đã
xác định tác nhân gây bệnh là “Fusarium moniliforme” tuy nhiên hiện nay tên gọi
này bao gồm nhiều loài khác nhau bây giờ được gọi chung là phức hệ loài
2

Gibberella fujikuroi (Gibberella fujikuroi species complex). Sự hình thành giai
đoạn hữu tính Gibberella chỉ ra sự khác biệt các quần thể giao phối hay các loài
sinh học trong nhóm này (A. E. Desjardins và ctv., 2000). Từ đó, để hiểu rõ hơn về
nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von trên các ruộng lúa ở Đồng Bằng Sông
Cửu Long và nhằm xác định tác nhân làm cho cây lúa cao vống lên là giberelin nên
chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu “Phân lập nấm Fusarium moniliforme
gây bệnh lúa von và xác định dòng nấm tạo giberelin”.
1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu
Tiến hành các nghiên cứu để xác định các dòng nấm gây bệnh lúa von và tác
nhân làm cho cây lúa cao đột biến là giberelin từ đó là cơ sở để chọn ra các dòng
nấm tạo nhiều giberelin nhất để tiến hành nuôi cấy, lên men sản xuất giberelin.
1.2.2 Nội dung nghiên cứu
Phân lập và tách đơn bào tử các dòng nấm Fusarium moniliforme gây bệnh
lúa von trên các ruộng lúa ở một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long.
Phát hiện vùng gen tef của nấm Fusarium moniliforme bằng kỹ thuật PCR.
Nuôi cấy các dòng nấm Fusarium moniliforme trong môi trường sản xuất
GA

3
và định tính GA
3
bằng TLC.
3

Chƣơng 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về bệnh lúa von
2.1.1 Phân bố và thiệt hại
Bệnh đã được biết đến ở Nhật từ năm 1828, nhưng mãi đến năm 1898 mới
được Hori mô tả lần đầu tiên. Bệnh khá phổ biến trên thế giới. Ở Trung Quốc bệnh
được gọi là „white stalk‟; còn ở Philippines và Guyana bệnh được gọi là „lúa đực‟
(palay lalake hay man rice). Thất thu do bệnh có thể rất đáng kể ở nhiều nơi, 20% ở
Hokkaido, 40 – 50% ở Kinki Chugoku, Nhật (Ito, Kimura, 1931; Kinki – Chugoku
Regional Agriculture Committee, 1975), 15% ở Đông Uttar Pradesh, Ấn Độ
(Pavgi, Singh, 1964), 3,7 – 14,7% ở Trung và Bắc Thái Lan (Kanjanasoon, 1965).
Bệnh cũng phổ biến ở nhiều nước Đông Nam Á nhưng thiệt hại không lớn. Ở
Đồng Bằng Sông Cửu Long bệnh cũng có mặt ở nhiều nơi, nhất là vụ Đông Xuân,
mức độ thiệt hại tùy giống và tùy năm. Trên giống IR-42 ở Huyện Mỹ Xuyên, Sóc
Trăng, tỉ lệ chồi nhiễm có thể đến 10 – 20%. Bệnh có khi thành dịch trên diện rộng,
như vào năm 1980 ở Đồng Tháp.
2.1.2 Triệu chứng
Bệnh có thể xuất hiện ngay từ giai đoạn mạ. Triệu chứng dễ thấy và thông
thường nhất là cây mạ bị bệnh có chiều cao hơn cây bình thường, mảnh và có màu
xanh vàng nhạt. Cây mạ bị bệnh có thể chết trước khi nhổ cấy hay sau khi cấy.
Những cây này nổi bật lên rất dễ thấy, nó phân bố khắp cánh đồng. Tuy vậy cũng có
một số cây mạ bị bệnh không có triệu chứng von mà lại thấp lùn còi cọc, phụ thuộc
vào dòng nấm gây bệnh và các điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ và ẩm độ.

4

















Ghi chú: Các mũi tên chỉ cây lúa bị nhiễm bệnh.
Yamanaka và Honkura (1978) đã phân ra có 5 loại triệu chứng.
Vươn dài.
Vươn dài sau đó phát triển bình thường.
Vươn dài sau đó bị còi cọc.
Cây bị còi cọc.
Cây không phát triển.
Trên lúa bệnh phát sinh từ khi bắt đầu đẻ nhánh đến có đòng. Những cây bị
bệnh nặng sinh ra các rễ phụ ở đốt thân, đôi khi xuất hiện lớp sợi nấm màu trắng
hay màu hồng ở các đốt phía dưới, đó là khuẩn ty và bào tử của nấm, lớp mốc này
lan dần lên trên khi cây chết. Nấm có thể thành lập quả nang bầu trên cây bệnh nếu
điều kiện thuận lợi.

Hình 2.1 Ruộng lúa ở Càng Long -Trà Vinh bị nhiễm
bệnh lúa von tại thời điểm 01/05/2007.

5










Hình 2.2 Bào tử nấm trên thân lúa bệnh.
(Nguồn
)
2.1.3 Tác nhân
Bệnh do nấm Fusarium moniliforme, có giai đoạn hữu tính sinh sản bằng
nang nên còn được gọi là Gibberella fujikuroi.

(Nguồn )
Hình 2.3 Chu kỳ gây bệnh của nấm Fusarium moniliforme.
6

2.1.4 Hình dạng và kích thƣớc
Giai đoạn quả tử nang của Gibberella fujikuroi có hình khối cầu hay bầu dục,
mặt ngoài xù xì, có màu xanh đậm trong chứa các bào tử nang có một vách ngăn,
250 – 330 x 220 – 280 (190 – 390 x 160 – 420) m; nang có dạng hình trụ, phần
trên hơi rộng hơn, 90 – 102 x 7 – 9 (66 – 129 x 7 – 14) m, chứa 4,6 và có khi đến 8
bào tử, một dãy hay hai hàng không rõ; nang bào tử có 1 vách ngăn, khoảng
15 x 5,2 m (đa số là 14 – 18 x 4,4 – 7 m) có khi lớn 27 – 45 x 6 – 7 m (nếu nang
chỉ chứa một bào tử) (S.H.Ou, 1985).
Giai đoạn phân sinh bào tử của Gibberella fujikuroi có hai dạng bào tử là
tiểu bào tử và đại bào tử. Tiểu bào tử có hình trứng dẹt, không có hay có một vách
ngăn, thường xếp thành chuỗi, sau đó rời nhau và phân tán thành lớp bột trắng trên
nền khuẩn ty trắng vàng hay trắng hồng. Còn đại bào tử thanh mảnh, hai đầu nhọn,
hơi cong hình lưỡi liềm hay gần thẳng có một cái móc ở đỉnh, màu xanh vàng nhạt
có 3 – 5 vách ngăn (S.H.Ou, 1985).
Nấm không có bào tử chống chịu, có hay không có hạch nấm hình cầu, màu
xanh đậm, kích thước 80 – 100 m.
Số vách ngăn của bào tử, việc thành lập tiểu bào tử, đại bào tử và hạch nấm
của nấm gây bệnh cũng rất thay đổi.
2.1.5 Đặc tính sinh lý
Theo S.H.Ou (1985) nấm dễ nuôi cấy trên nhiều loại môi trường, thường
dùng dung dịch của Richard và Knop. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của
sợi nấm được nhiều người nghiên cứu, nhiệt độ tối ưu cho nấm phát triển là

27 – 30 C, tối đa 36 – 40 C và tối thiểu 7 – 8 C. Những nguyên tố vi lượng như
borax, kẽm, mangan làm gia tăng sự phát triển của nấm.
Quá trình phân lập nấm được thực hiện dễ dàng trên những môi trường chọn
lọc như môi trường có chứa quintozene (PCNB). Việc sinh tiểu bào tử hay đại bào
tử cũng tùy thuộc vào thành phần dinh dưỡng trong môi trường, bào tử được sinh
nhiều nếu có ánh sáng liên tục. Rice straw-soybean meal agar và Sach‟s agar plus
7

rice straw giúp cho tạo tiểu bào tử trong khi glucose casamino acid agar và rice
straw casamino acid agar giúp cho việc hình thành đại bào tử. Xylose là nguồn
cacbon hydrat thích hợp nhất để tạo đại bào tử.
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển nấm sản sinh ra 2 chất là axít
fusaric và giberelin. Axít fusaric hạn chế sinh trưởng làm cây còi cọc, còn giberelin
có tác dụng kích thích làm cây phát triển theo chiều cao, cao vống lên. Sự sản sinh
ra hai chất này phụ thuộc vào dòng nấm và môi trường sinh sống của nấm. Trên môi
trường có KH
2
PO
4
hay MgSO
4
hay có nhiều kali, nấm sẽ tạo ra nhiều giberelin
trong khi glucose lại rất tốt để nấm tạo ra axít fusaric. Axít fusaric sản sinh nhiều ở
nhiệt độ cao (33 C) và môi trường kiềm (pH~9), còn giberelin sản sinh ở nhiệt độ
thấp hơn (từ 27 – 30 C) và môi trường chua. Mật độ nấm bệnh càng cao, nấm có
khuynh hướng tạo axít fusaric. Muốn sinh sản hữu tính, nấm phải cần có khuẩn ty khác
nhóm để phối hợp. Ngoài ra, nang bào tử nấm cũng có tính đực, tính cái và lưỡng tính.
2.1.6 Điều kiện phát sinh và phát triển
Bệnh lúa von chủ yếu truyền qua hạt giống. Hạt lúa bị nhiễm bệnh ở thời kì
trổ hoa và kéo dài trong ba tuần sau đó, nhưng tỉ lệ hạt bị nhiễm cũng giảm dần đi.

Nếu nhiễm nặng hạt sẽ có màu đỏ và mạ mọc lên sẽ bị lùn. Các hạt nảy mầm sẽ
sinh ra cây mạ bị von. Từ những cây mạ bị bệnh, bào tử nhờ gió và nước lan truyền
xâm nhiễm cho cây khác. Nấm phát triển trong cây phá hủy tế bào cây, đồng thời
những chất do chúng tiết ra tạo nên triệu chứng điển hình của cây lúa bị bệnh. Một
số hạt giống không bị biến màu vỏ cũng có thể mang nguồn nấm. Trên hạt giống
bảo quản khô ráo nấm tồn tại tới 3 năm.
Ngoài ra nấm còn tồn tại trong đất, tuy thời gian không lâu. Một thí nghiệm
ở Thái Lan (Kanjanosoon, 1965) cho thấy đất sau khi lây nhiễm nấm cho số cây
bệnh là 93%, sau đó tỉ lệ bệnh giảm dần, tới 90 ngày chỉ còn 0,7% và sẽ không có
cây bệnh nếu để sau 6 tháng. Đại bào tử hay khuẩn ty vách dày của nấm cũng sống
được 4 tháng trong đất (S.H.Ou, 1985).
Trên hạt và thân lúa nhiễm, nấm có thể sống 4 – 10 tháng ở nhiệt độ phòng,
nếu trữ lạnh ở 7 C nấm có thể sống hơn 3 năm.
8

2.2 Đại cƣơng về nấm Gibberella fujikuroi (giai đoạn vô tính là
Fusarium moniliforme)
2.2.1 Phân loại học
Ngành: Ascomycota
Ngành phụ: Pezizomycotina
Lớp: Sordariomycetes
Lớp phụ: Hypocreomycetidae
Bộ: Hypocreales
Họ: Nectriaceae
Giống: Gibberella
Loài: Gibberella fujikuroi complex
2.2.2 Sơ lƣợc về Gibberella fujikuroi
Năm 1931, Wollenweber đặt tên cho giai đoạn vô tính của nấm gây bệnh lúa
von là Fusarium moniliforme (Sheldon) và giai đoạn hữu tính là Gibberella
fujikuroi (Saw.) Wr. (B. Tudzynski, 1999)

Theo Stefan Malonek và ctv (2005), phức hệ loài Gibberella fujikuroi bao
gồm nhiều loài nấm gây bệnh quan trọng trên nhiều cây trồng khác nhau như ngô,
lúa, lúa mạch, mía, thông, xoài, dứa, lúa miến… Giai đoạn vô tính trong phức hệ
này thuộc giống Fusarium nhóm Liseola. Phức hệ loài này được chia thành ít nhất 9
loài hữu tính (sexually fertile biological species) (được biết như những quần thể
giao phối, MP-A đến MP-I) và có 32 loài vô tính. Trong những năm gần đây, có
nhiều nghiên cứu nhằm xác định loài trong phức hệ này như dựa vào hình thái, khả
năng giao phối (mating experiment), phân tích cây phát sinh loài dựa trên trình tự
DNA từ những loci không liên kết như tiểu đơn vị nhỏ của ti thể (mtSSU) rDNA,
nuclear 28S rDNA, -tubulin, calmodulin, EF-1 , và histon H3 gen. Những kĩ thuật
phân tử khác như RAPDs, mitochondrial RFLPs và CHEF-gel karyotypes cũng
được dùng để phân biệt những thành viên trong phức hệ loài Gibberella fujikuroi.
Ngoài ra những thành viên trong quần thể giao phối có nhiều kí chủ khác
nhau và khác nhau về khả năng tạo ra các hợp chất thứ cấp như fumonisins, axít
9

Sơ đồ 2.1 Con đƣờng sinh tổng hợp GA
3
ở Gibberella fujikuroi.
fusaric, fusaproliferin, moniliformin, fusarins và giberelin. Những dòng của những
quần thể giao phối khác nhau sẽ tạo ra những chất thứ cấp khác nhau. Vì vậy những
loài của MP-A, -C, -D và -G tạo ra fumonisins, MP-A, -C và F tạo ra moniliformin,
beauvericin và fusaprolifern được MP-D và E tạo ra. Ngược lại, chỉ có loài
F.fujikuroi (MP-C) có khả năng sản xuất giberelins (Stefan Malonek và ctv., 2005).
2.2.3 Sinh tổng hợp giberelin ở Gibberella fujikuroi
Theo Hiroshi Kawaide (2006), quá trình nấm Gibberella fujikuroi tổng hợp
giberelin có thể chia thành 3 bước như sau:
Bước 1: ent-kaurene được tổng hợp từ isopentenyl diphosphate và dimethylallyl
diphosphate thông qua geranylgeranyl diphosphate (GGDP).
Bước 2: chuyển ent-kaurene thành GA

12
-7-aldehyde dưới sự xúc tác của các
enzyme cytochrome P450 monoxygenases.
Bước 3: qua nhiều bước GA
12
-7-aldehyde sẽ tổng hợp thành GA
3.















(Nguồn www.aseanbiodiversity.info)
10

2.3 Giới thiệu về gen tef (translation elongation factor 1- )
Theo A.R.Pokalsky và ctv (1989), gen tef là gen mã hóa cho protein EF-1 .
EF-1 là một chuỗi polypeptide có vai trò quan trọng trong sự kéo dài chuỗi
polypeptide ở sinh vật nhân thật (eukaryotes). EF-1 xúc tác việc gắn nhóm
aminoacyl tRNAs vào vị trí A của ribosome, phản ứng này đòi hỏi GTP. EF-1 có

trọng lượng phân tử là 45.000 – 55.000. Nó cũng có chức năng tương đồng với
EF-Tu (prokaryotic elongation factor), cả hai yếu tố này đều hình thành phức hợp
aminoacyl tRNAs và GTP.
Gen mã hóa EF-1 của nhiều loài đã được tạo dòng và được đọc trình tự. Đó
là của các loài nấm men, tôm Artemia sanila, nấm Mucor racemosus và người. Tất
cả những gen này mã hóa các protein có độ tương đồng cao so với những protein
khác. Điều hòa sự biểu hiện EF-1 là mối quan tâm của các nhà nghiên cứu do nó
là một protein đa dạng và có vai trò quan trọng trong việc điều khiển sinh tổng hợp
protein. Khi hoạt tính EF-1 tăng thì mô phát triển do có nhiều protein được tổng
hợp. Tuy nhiên hoạt tính EF-1 được điều khiển ở mức mRNA hay protein vẫn
chưa được biết rõ (A.R.Pokalsky và ctv., 1989).
Dựa vào vùng gen tef có thể phân biệt được giữa các nhóm với nhau hay
giữa loài cùng nhóm. Vùng tef được nghiên cứu nhiều hơn vì chứa trình tự DNA
đặc trưng cho từng nhóm loài (Lại Hà Tố Hoa, 2006).

(David M.Geiser và ctv., 2004)
Sơ đồ 2.2 Bảng đồ vùng gen tef ở Fusarium trong FUSARIUM-ID.
11


2.4 Tổng quát về giberelins
2.4.1 Đại cƣơng về các chất giberelins
Giberelins (GAs) là nhóm hormon thực vật quan trọng thứ hai sau nhóm
auxin. Năm 1950 trong lúc nghiên cứu bệnh “foolish seedling” hay “bakanae disease”
các nhà khoa học Nhật Bản thấy rằng bệnh gây ra bởi một chất hóa học do nấm tiết
ra. Chất này được gọi là giberelin. Năm 1930, những nhà khoa học Nhật đã thành
công trong việc thu tinh thể của hai hợp chất có hoạt tính tăng trưởng tiết ra từ nấm,
chúng là giberelin A và B, nhưng do sự giới hạn về giao tiếp và chiến tranh thế thứ
hai nên mãi đến giữa năm 1950 cấu trúc của chất này mới được xác định và được đặt
là axít giberelic:

(Lincoln Taiz và ctv., 2002)
Sau đó, năm 1956 ở Anh, J MacMillan lần đầu tiên đã tách thành công được
giberelin từ hạt đậu Phaseolus vulgaris. Từ đó đến nay, người ta đã tách được
những giberelin khác nhau trên nhiều loài cây.
Ví dụ: Ở cây lúa chứa 14 loại giberelins, hạt ngô chứa 12 giberelins và
lúa mì chứa 5 giberelins (Đào Văn Hoằng, 2005).
Đặc điểm cấu trúc của tất cả giberelins có điểm chung là chúng được chuyển
hóa từ ent-kaurene:





Hình 2.4 Cấu tạo axít giberelic.
Hình 2.5 Cấu tạo ent-Kaurene.
(Lincoln Taiz và ctv., 2002)


12


Sau khi axít giberelic đã được tìm hiểu khá rõ, các nhà thực vật học bắt đầu
khảo nghiệm nó trên nhiều loài cây khác nhau. Có những phản ứng kì lạ được thấy
ở sự tăng trưởng của những cây lùn và thực vật hoa thị (rosette plants), đặc biệt ở
cây đậu Hà Lan lùn (Pisum sativum), cây ngô lùn (Zea mays) và nhiều cây hoa thị.

Ngược lại, ở những cây đã có đặc tính di truyền cao thì sẽ không có đáp ứng cao
hơn nữa khi dùng giberelins. Gần đây những thí nghiệm trên cây đậu Hà Lan lùn và
cây ngô lùn chứng tỏ sự tăng trưởng tự nhiên của cây được điều hòa bởi giberelins.
(Lincoln Taiz và ctv., 2002).
Không lâu sau khi phát hiện hiệu quả kích thích tăng trưởng của axít
giberelic, những hợp chất giống giberelin được tách từ nhiều loài cây khác nhau.
Hợp chất này có hoạt tính sinh học giống giberelin nhưng cấu trúc hóa học thì chưa
được xác định. Khi ngày càng nhiều GAs từ nấm và thực vật được xác định, chúng
được đánh số thứ tự là giberelin A
x
(hay GA
x
) với x là thứ tự phát hiện ra chúng. Tất
cả GAs dựa trên cấu trúc của ent-gibbrellane skeleton nhưng đối với từng chất lại có
những thay đổi tinh vi làm cho hoạt tính của từng chất trở nên khác nhau.








Axít giberelic (GA
3
) được sản sinh từ nấm Gibberella fujikuroi là giberelin
được xác định cấu trúc đầu tiên và là giberelin quan trọng nhất và được nghiên cứu
nhiều nhất. Hiện nay có khoảng 136 loại giberelins được tách và xác định cấu trúc
từ thực vật, nấm và vi khuẩn (o). Mặc dù có nhiều
Hình 2.6 Cấu tạo ent-Gibberellane.

(Lincoln Taiz và ctv., 2002)

13

loại GAs trong cây nhưng chỉ có một vài GAs có hoạt tính như một hormon, tất cả
những loại khác ở dạng tiền chất hay dạng bất hoạt.
2.4.2 Chức năng và vai trò sinh hóa (Lincoln Taiz và ctv., 2002)
Mặc dù GAs được phát hiện đầu tiên là nguyên nhân gây ra bệnh lúa von
nhưng những GAs nội sinh cũng ảnh hưởng đến nhiều quá trình phát triển của cây.
Ngoài sự kéo dài của thân, GAs còn kích thích quá trình nảy mầm của hạt bao gồm
phá vỡ trạng thái ngủ nghỉ của hạt. Trong quá trình sinh sản của thực vật, giberelin
có thể ảnh hưởng đến sự chuyển từ giai đoạn còn non sang giai đoạn trưởng thành
cũng như bắt đầu ra hoa, xác định phái tính của hoa.
2.4.2.1 Giberelins kích thích sự phát triển thân ở những cây lùn và cây hoa thị
Giberelin được dùng đẩy mạnh sự kéo dài của đốt ở nhiều loài cây. Tuy
nhiên kích thích mạnh nhất được tìm thấy ở những cây lùn và cây hoa thị (rosette
plant) cũng như những cây họ hòa thảo. GA
3

ngoại sinh gây ra sự kéo dài thân ở những cây
lùn bên cạnh đó chúng làm thân cây ốm yếu,
giảm kích thước lá và lá có màu xanh nhạt.
Dùng giberelin giúp thân cây hoa thị
phát triển trong những ngày ngắn và sự phát
triển thân bình thường được điều hòa bởi
giberelin nội sinh. Ngoài ra nhiều cây hoa thị
ngày dài đòi hỏi điều kiện lạnh cho sự phát triển
của than, ra hoa và đòi hỏi này được khắc phục
bởi việc dùng giberelin.
GA cũng đẩy mạnh sự kéo dài của đốt ở

những cây hòa thảo (lúa nước là một ví dụ dễ
thấy). Mặc dù GAs có tác động mạnh đến sự
tăng trưởng của thân nhưng nó ít ảnh hưởng
trực tiếp lên sự phát triển của rễ. Gần
đây, người ta chưa biết rõ ảnh hưởng của
Hình 2.7 GA
3
kích thích cây
bắp cải ra hoa và phát triển cao.
(Lincoln Taiz và ctv., 2002)

14

giberelin lên sự tăng trưởng của rễ một cách gián tiếp hay trực tiếp.
2.4.2.2 Giberelins điều hòa sự chuyển hóa cây con sang giai đoạn trƣởng thành
Các nhà nghiên cứu thấy rằng nhiều cây lâu năm không ra hoa cho đến khi
chúng đạt đến giai đoạn trưởng thành. Giai đoạn non và trưởng thành thường khác
nhau về hình dạng lá như cây Thường Xuân ở Anh (Hedera helix), do đó việc dùng
GAs cả hai hướng này phụ thuộc vào loài. GA
3
có thể gây chuyển hóa từ giai đọan
trưởng thành sang giai đoạn còn non ở cây Thường Xuân và việc dùng những GAs
không phân cực như GA
4
+ GA
7
có thể làm cho nhiều cây Tùng Bách non chuyển
sang giai đoạn sinh sản.
2.4.2.3 Giberelins ảnh hƣởng đến giai đoạn bắt đầu ra hoa và sự xác định giới tính
Giberelins có thể thay thế nhu cầu dài ngày hay khí hậu lạnh để ra hoa ở

nhiều cây, đặc biệt cây hoa thị do vậy giberelin được dùng để kích thích ra hoa ở
một vài cây.
Ở cây có hoa lưỡng tính thì sự xác định giới tính hoa được điều hòa bởi
giberelin. Tuy nhiên, nó cũng bị ảnh hưởng bởi những nhân tố môi trường như
quang chu kì, dinh dưỡng và các nhân tố này có thể được trung hòa bởi giberelin.
2.4.2.4 Giberelins đẩy mạnh “fruit set”
Dùng GAs có thể gây ra “fruit set” (quả bắt đầu tăng trưởng sau khi thụ
phấn) và sự tăng trưởng của một vài quả mà auxin không có tác dụng.
Ví dụ: giberelin kích thích “fruit set” ở cây táo (Malus sylvestris).
2.4.2.5 Giberelins thúc đẩy sự nảy mầm của hạt
GAs cần cho một hay nhiều bước trong quá trình nảy mầm của hạt. Giberelin
đánh thức quá trình ngủ nghỉ của hạt để bắt đầu nảy mầm. Khi hạt được ngâm vào
nước giberelin được giải phóng, đánh thức và kích thích hạt nảy mầm. Ngoài ra
giberelin còn kích thích sự tạo nhiều hydrolases, đặc biệt -amylase, kích thích tổng
hợp chất truyền tín hiệu RNA cho các men, qua đó nó tác động lên men di truyền.
Như vậy tác dụng sinh học của giberelin rất đa dạng tùy thuộc vào từng loại
giberelin cũng như loài cây.

15


2.4.3 Ứng dụng GAs trong thƣơng mại (Lincoln Taiz và ctv., 2002)
2.4.3.1 Trong trồng trọt
Sử dụng GAs chủ yếu để làm tăng chiều dài cuống của nho không hạt.
Giberelin kích thích cuống phát triển dài hơn vì vậy làm cho quả phát triển lớn hơn
và đẩy mạnh sự kéo dài của quả.
Hỗn hợp benzyladenine (cytokinin) và GA
4
+ GA
7

làm cho quả táo phát triển
dài ra và được dùng để cải thiện hình dáng của quả táo loại ngon trong một vài điều
kiện. Mặc dù việc xử lý này không làm tăng năng suất hay mùi vị, nó cũng được
mong đợi để thương mại.
Ở cây có múi, GAs làm chậm sự già yếu.










2.4.3.2 Sản xuất bia
Một trong những ứng dụng quan trọng là dùng để tăng sản lượng mạch nha
từ lúa mạch dùng làm rượu bia. GAs được sử dụng để làm nẩy mầm hạt lúa mạch
gia tăng tạo ra enzym thủy giải những chất dự trữ trong hạt thành acid amin và
đường để thành mạch nha.
2.4.3.3 Tăng sản lƣợng mía
Mía (Saccharum officinarum) là một trong số ít cây dự trữ đường thay vì tinh
bột (cây dự trữ đường quan trọng khác là củ cải đường). Có nguồn gốc từ New
Hình 2.8 Ảnh hƣởng của GA
3
đến
giống nho không hạt của Thompson.
(Lincoln Taiz và ctv., 2002)

Có xử lý GA

3

Không xử lý GA
3