Tinh chế kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC


NGUYỄN THỊ KIM HIỀN

TINH CHẾ KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT
VIRUS VIÊM GAN B

LUẬN VĂN KỸ SƢ
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2006


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC


TINH CHẾ KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT
VIRUS VIÊM GAN B

LUẬN VĂN KỸ SƢ
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giáo viên hƣớng dẫn

Sinh viên thực hiện

PGS. TS. NGUYỄN LÊ TRANG
TS. NGUYỄN NGỌC HẢI

NGUYỄN THỊ KIM HIỀN
KHĨA: 2002 – 2006

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2006


MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING
NONG LAM UNIVERSITY, HCMC
FACULTY OF BIOTECHNOLOGY


PURIFICATION OF HEPATITIS B
SURFACE ANTIGEN

GRADUATION THESIS
MAJOR: BIOTECHNOLOGY

Professor

Student

Dr. NGUYEN LE TRANG

NGUYEN THI KIM HIEN

Dr.NGUYEN NGOC HAI

TERM: 2002 - 2006

HCMC, 09/2006


LỜI CẢM ƠN
Với tất cả lịng kính trọng, em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trƣờng
Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh
học, cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học
tại trƣờng.
Con xin bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Lê
Trang - ngƣời thầy đã dạy dỗ, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho con trong suốt
q trình thực hiện khố luận tại Viện Pasteur.
Em xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Ngọc Hải đã hết lòng hƣớng dẫn dạy
dỗ, động viên, quan tâm, ủng hộ em hồn thành khố luận.
Em xin chân thành cảm ơn Th.s Nguyễn Thị Nguyệt Thu, KS Đỗ Thị Châm,
KS Võ Thị Mỹ Duyên, CN Lạc Ngọc Thêm, CN Lại Ngọc Diễm, chị Sim phòng Miễn
Dịch, Viện Pasteur đã nhiệt tình giúp đỡ, dạy bảo em nhiều điều trong suốt thời gian
thực hiện khoá luận.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Đốc Viện Pasteur – TpHCM đã cho phép
và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em học tập và nghiên cứu tại Viện.
Tôi xin cảm ơn các bạn lớp CNSH 28 đã chia xẻ cùng tôi những vui buồn trong
thời gian học cũng nhƣ hết lịng hỗ trợ, giúp đỡ tơi trong thời gian thực tập.
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Thị Kim Hiền

i

TĨM TẮT
NGUYỄN THỊ KIM HIỀN, Đại Học Nơng Lâm Tp.HCM. Tháng 7/2006. “TINH
CHẾ KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT VIRUS VIÊM GAN B”.
Hội đồng hƣớng dẫn:
PGS.TS. NGUYỄN LÊ TRANG.
TS.NGUYỄN NGỌC HẢI.
Việt Nam là một trong những nƣớc có nguy cơ cao về nhiễm virus viêm gan
Baïn, với tỷ lệ ngƣời mang HBsAg trong cộng đồng dân chúng từ 15 – 26%. Do đó,
nguồn kháng nguyên tự nhiên ở những ngƣời bệnh mang HBsAg là rất nhiều. Đồng
thời, HBsAg là kháng nguyên đƣợc sản xuất ra gấp bội so với các loại kháng nguyên
khác . Mặc khác HBsAg lại rất đặc hiệu để chẩn đốn bệnh viêm gan B .Vì vậy, chúng
tơi tiến hành tinh chế kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B để phục vụ cho nhu cầu
sản xuất kháng thể để tạo các bộ sinh phẩm chuẩn đoán cũng nhƣ dùng làm vaccine
phòng bệnh.
Sau khi tiến hành đề tài, chúng tôi đã đạt đƣợc những kết quả sau:
 HBsAg đƣợc tinh chế với hoạt tính kháng nguyên HBsAg so với hàm lƣợng
protein tổng số là 32,35.103 mUI/ OD.
 Độ tinh khiết của sản phẩm là 44 lần.
 HBsAg đƣợc tinh chế khá tốt, kết quả đƣợc thể hiện trên gel điện di: dung
dịch HBsAg thu đƣợc có chứa các băng có trọng lƣợng phân tử từ 25 – 28 kDa tƣơng
ứng với các quyết định kháng nguyên của HBsAg.
Đề tài này là một bƣớc quan trọng để tiến hành tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán
phát hiện virus viêm gan B trong máu.

ii


MỤC LỤC
CHƢƠNG

TRANG

Trang tựa
Lời cảm tạ ........................................................................................................... i
Tóm tắt ............................................................................................................... ii
Mục lục ............................................................................................................. iii
Danh sách các chữ viết tắt ................................................................................ iv
Danh sách các hình ........................................................................................... v
Danh sách các bảng .......................................................................................... vi
PHẦN 1. MỞ ĐẦU ........................................................................................ 1
1.1 Đặt vấn đề ....................................................................................... 1
1.2 Mục đích – Yêu cầu........................................................................ 2
PHẦN 2. TỔNG QUAN ................................................................................ 3
2.1 Lịch sử phát hiện của HBV ............................................................ 3
2.2 Phân loại HBV ................................................................................ 3
2.3 Hình dạng - Cấu trúc HBV ............................................................. 3
2.3.1 Hình dạng HBV ..................................................................... 3
2.3.2 Cấu trúc gen HBV.................................................................. 5
2.4 Quá trình sao chép và nhân lên của HBV ...................................... 8
2.5 Phƣơng pháp xét nghiệm để phát hiện HBV ................................ 10
2.5.1 Phƣơng pháp chẩn đoán huyết thanh học ............................ 10
2.5.2 Phƣơng pháp chẩn đoán dựa trên chức năng gan ................ 10
2.5.3 Phƣơng pháp chẩn đoán huyết thanh học và hoá miễn dịch.10
2.6 Các kiểu lây truyền HBV ............................................................. 12
2.7 Kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B (HBsAg) ....................... 12
2.7.1 Bản chất HBsAg .................................................................. 12
2.7.2 Tầm quan trọng HBsAg ....................................................... 12
2.7.3 Các phân typ HBsAg ........................................................... 13
2.7.4 Tinh khiết HBsAg ................................................................ 14

2.7.5

Định lƣợng HBsAg ............................................................. 14

iii


PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 15
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện ................................................... 15
3.2 Vật liệu nghiên cứu ...................................................................... 15
3.2.1 Dụng cụ ................................................................................ 15
3.2.2 Thiết bị ................................................................................. 15
3.2.3 Hoá chất và cách chuẩn bị các dung dịch ............................ 15
3.2.3.1 Hoá chất .................................................................... 15
3.2.3.2 Cách chuẩn bị các dung dịch .................................... 16
3.3 Bố trí thí nghiệm........................................................................... 20
3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................. 21
3.4.1 Phƣơng pháp tủa phân đoạn bằng ammonium sulfate ......... 21
3.4.1.1 Nguyên tắc ................................................................ 21
3.4.1.2 Tiến hành .................................................................. 23
3.4.2 Phƣơng pháp tinh chế protein bằng hệ thống gel lọc
- cột Sephacryl 300 .............................................................. 23
3.4.2.1 Nguyên tắc ................................................................ 23
3.4.2.2 Tiến hành .................................................................. 24
3.4.3 Phƣơng pháp tinh chế protein bằng sắc ký ái lực
- cột Sepharose CL – 4B Dextran sulfate ............................ 25
3.4.3.1 Nguyên tắc ................................................................ 25
3.4.3.2 Tiến hành .................................................................. 26
3.4.4 Phƣơng pháp định lƣợng protein bằng đo mật độ quang
– OD 280nm ......................................................................... 26

3.4.4.1 Nguyên tắc ................................................................ 26
3.4.4.2 Tiến hành .................................................................. 26
3.4.5 Phƣơng pháp điện di trên SDS - polyacrylamide gel
kiểm tra mức độ tinh chế ..................................................... 26
3.4.5.1 Nguyên tắc ................................................................ 26
3.4.5.2 Tiến hành .................................................................. 28

iv


3.4.6 Phƣơng pháp định lƣợng HBsAg ......................................... 28
3.4.6.1 Khái niệm ................................................................. 28
3.4.6.2 Nguyên tắc hoạt động ............................................... 28
3.4.6.3 Mục đích ................................................................... 29
3.4.6.4 Xác định kết quả ....................................................... 29
3.4.6.5 Đánh giá kết quả thí nghiệm ..................................... 29
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 30
4.1 Kết quả định lƣợng kháng nguyên HBsAg trong huyết thanh ...... 30
4.2 Kết quả ở giai đoạn tủa phân đoạn bằng ammonium sulfate ...... 30
4.3 Kết quả tinh chế HBsAg bằng phƣơng pháp sắc ký lọc gel
- cột Sephacryl S300..................................................................... 32
4.4 Kết quả tinh chế HBsAg bằng phƣơng pháp sắc ký ái lực
- cột Sepharose CL – 4B Dextran sulfate .................................... 34
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................... 38
5.1 Kết luận ........................................................................................ 38
5.2 Đề nghị ......................................................................................... 38
PHẦN 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................... 39

v

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮC
HBV

Hepatitis B Virus

HBsAg

Hepatitis B surface Antigen

HBcAg

Hepatitis B core Antigen

HBeAg

Hepatitis B e Antigen

kb

kilo base

kDa

kilo Dalton

p

protein

gp

glycoprotein

DNA

Desoxyribose Nucleic Acid

RNA

Ribose Nucleic Acid

TB

tế bào

KN

kháng nguyên

ALT

Alanine Aminotransfease, SGPT

SDS – PAGE

Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel

PEG

Polyethylene Glycol

DTT

Dithiothretol

APS

Ammonium persulfate

TEMED

Tetra – methylenediamine

OD

Optical Density

MW

Molecular Weight

IgG

Immunoglobulin G

IgM

Immunoglobulin M

PCR

Polymerase Chain Reaction

vi


DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH

TRANG

Hình 2.1. Các dạng HBV. .................................................................................. 4
Hình 2.2. Tổ chức genome của HBV ................................................................ 5
Hình 2.3. Mơ hình Virus tồn vẹn (virion) ....................................................... 6
Hình 2.4. Lƣợc đồ vịng đời HBV ..................................................................... 8
Hình 2. 5. Q trình sao chép và nhân lên của HBV. ....................................... 9
Hinh 3.1. Quá trình thẩm tích .......................................................................... 22
Hình 3.2. Sắc ký lọc gel................................................................................... 24
Hình 3.3. Sắc ký ái lực .................................................................................... 25
Hình 3.4. Nguyên tắc hoạt động của kit Architect®HBsAg (Abbott) ........... 28
Hình 4.1. Kết quả điện di SDS – PAGE 5 -15 % sau khi tủa phân đoạn
bằng ammonium sulfate bão hoà .................................................... 30
Hình 4.2. Đồ thị sắc ký lọc gel thực hiện trên máy AKTA với cột
Sepharyl S 300 ................................................................................. 32
Hinh 4.3. Kết quả điện di SDS – PAGE 5- 15 % sau khi qua cột
Sepharyl S 300 ................................................................................. 33
Hình 4.4. Đồ thị sắc ký ái lực thực hiện trên máy AKTA với cột Sepharose
CL – 4B dextran sulfate ................................................................... 35
Hình 4.5. Kết quả điện di 15% SDS - PAGE DTT sau khi qua cột S Sepharose

CL – 4B Dextran sulfate ................................................................. 36

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
BẢNG

TRANG

Bảng 2.1. Ý nghĩa các dấu ấn huyết thanh học của HBV ở bệnh nhân
viêm gan B .................................................................................... 11
Bảng 2.2. Các dấu ấn HBV chính trong viêm gan B cấp và mạn ................. 11
Bảng 2.3. Phân typ của HBsAg ..................................................................... 13
Bảng 4.1. Kết quả sau quá trình tủa phân đoạn bằng ammonium sulfate ..... 31
Bảng 4.2. Kết quả sau quá trình thực hiện sắc ký lọc gel trên
Sepharyl S 300 ............................................................................. 33
Bảng 4.3. Kết quả thu đƣợc sau tồn bộ q trình tinh chế HBsAg ............. 37

viii


1

PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Bệnh viêm gan virus B (HBV) là vấn đề mang tính tồn cầu, bởi đây là một trong
những bệnh truyền nhiễm hàng đầu trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng.
Virus viêm gan B cũng chính là tác nhân liên quan đến ung thƣ tế bào gan và một số
bệnh liên quan đến xơ gan, viêm gan mạn tính.

Ngồi ra, HBV cịn có thể lây truyền cho ngƣời khác qua đƣờng máu (tiếp xúc
với máu hay các sản phẩm từ máu, dụng cụ dính máu). Theo ƣớc tính, ngƣời mang
HBsAg sẽ có 40% có nguy cơ ung thƣ gan, tuy vậy có thể ngăn ngừa bệnh bằng
vaccine, đặc biệt là lúc mới sinh bệnh.
Theo phân bố dịch tễ học HBV của Tổ chức y tế Thế giới thì Việt Nam là một
trong những nƣớc có nguy cơ cao về nhiễm virus viêm gan B, với tỉ lệ ngƣời mang
HBsAg trong cộng đồng dân chúng từ 15 - 26%. Do đó, nguồn kháng nguyên tự nhiên
ở những ngƣời lành mang HBsAg là rất nhiều.
Đồng thời, HBsAg là kháng nguyên đƣợc sản xuất ra gấp bội so với các loại
kháng nguyên khác của HBV và có hoạt tính kháng ngun cao có thể sản sinh đƣợc
kháng thể bảo vệ và chống lại HBV.
Mặt khác, HBsAg lại rất đặc hiệu để chuẩn đoán bệnh HBV. Vì vậy, y học đã sử
dụng HBsAg để làm vaccine, cũng nhƣ làm kháng nguyên để sản xuất kháng thể nhằm
tạo các bộ sinh phẩm chuẩn đoán HBV.
Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành đề tài: ”Tinh chế kháng
nguyên bề mặt của virus viêm gan B”.


2

1.2. Mục đích
Tinh chế HBsAg tinh khiết từ dung dịch huyết thanh có HBsAg (+ + +) cao, xác
định những ƣu điểm trong quy trình để đạt độ tinh khiết cao nhất có thể.
1.3. Yêu cầu
 Loại bỏ lần lƣợt các thành phần protein huyết thanh qua các quá trình tủa
phân đoạn bằng ammonium sulfate, sắc ký lọc trên gel Saphacryl S300, sắc ký ái lực
trên Sepharose CL - 4B - dextran sulfate.
 Xác định tổng lƣợng protein bằng phƣơng pháp đo mật độ quang học ở bƣớc
sóng 280 nm (OD 280nm).
 Xác định hàm lƣợng kháng nguyên HBsAg bằng phƣơng pháp định lƣợng

miễn dịch.
 Kiểm tra độ tinh sạch của kháng nguyên HBsAg đã tách chiết bằng phƣơng
pháp điện di trên SDS - PAGE.


3

PHẦN 2. TỔNG QUAN
2.1. Lịch sử phát hiện HBV
 1963: Blumberg phát hiện một loại kháng thể có thể phản ứng với một loại
kháng nguyên trong mẫu huyết thanh của một thổ dân Úc bị viêm gan. Và đƣợc gọi là
kháng nguyên Úc Châu (Au).
 1967: phát hiện Au, là kháng nguyên bề mặt của virus gây viêm gan siêu vi
loại B (HBsAg).
 1970: Dane phát hiện kháng nguyên lõi (HBcAg), có đƣờng kính 42 nm trong
máu của bệnh nhân bị viêm gan siêu vi B - gọi là hạt tử Dane.
1973: phát hiện HBeAg (kháng nguyên nội sinh).
1979: nhân dòng HBV DNA và xác định chuỗi mã nucleotide DNA toàn phần.
1983: khuếch đại DNA virus bằng phƣơng pháp PCR do Mullis phát hiện.
2.2. Phân loại HBV
Hepatitis B virus (HBV) thuộc họ Hepadnaviridae do tính hƣớng gan và bộ gen
DNA kép của chúng.
Họ Hepadnaviridae có 2 nhóm phụ:
 Orthohepadnavirus: gây viêm gan B ở lồi có vú.
 Avihepadnavirus: gây viêm gan B ở lồi chim.
2.3. Hình dạng - Cấu trúc HBV [ 2 ] [ 3 ] [ 18 ]
2.3.1. Hình dạng
Khi quan sát huyết thanh của bệnh nhân ở giai đoạn hoạt động nhân lên của siêu
vi bằng kính hiển vi điện tử, ngƣời ta thấy có 3 dạng khác nhau
 Hạt tử Dane hoặc virion hồn chỉnh

 Có dạng hình cầu, đƣờng kính 42 nm.
 Khi nhuộm âm bản, virion hiện rõ cấu trúc 2 vỏ
 Vỏ bọc bên ngoài đƣợc tạo bởi các protein bề mặt (HBsAg)
 Vỏ bên trong đƣợc cấu tạo từ các protein lõi (HBcAg), tạo thành hình cầu
có đƣờng kính 28 - 34 nm; gồm khoảng 240 bản sao của protein lõi. Bên trong chứa


4

cấu trúc DNA chuỗi đôi và các enzyme nhƣ enzyme DNA polymerase và protein
kinase.
 Cấu trúc hình cầu
 Có đƣờng kính 15 - 25 nm, thƣờng có nồng độ 1013 /ml.
 Đƣợc cấu tạo từ các protein bề mặt.
 Các cấu trúc hình ống
 Có đƣờng kính 20 - 22 nm, có chiều dài thay đổi, có nồng độ 1011/ml.
 Các cấu trúc này có thể do cấu trúc hình cầu chồng chất lên nhau tạo ra.
Hai cấu trúc hình cầu và hình ống là phần kháng nguyên bề mặt của siêu vi đƣợc
sản xuất dƣ thƣờng từ tế bào gan và chúng biểu hiện những đặc tính kháng nguyên
HBsAg. Nồng độ HBsAg trong huyết thanh 10 - 1000 µg/ml.

Hình 2.1. Các dạng HBV


5

2.3.2. Cấu trúc gen
Bộ gen HBV tồn vẹn có chiều dài từ 3.182 - 3.221 base.
Bộ gen ở dạng vòng, gồm 2 sợi DNA có chiều dài khơng bằng nhau.
 DNA chuỗi âm: nằm bên ngoài, 3 - 3,3 kb (thay đổi tuỳ lồi

Hepadnavirus), mã hố cho các thơng tin di truyền, chứa nhiều gen chồng lấp lên
nhau, tạo thành vòng tròn liên tục và dƣ ra một đoạn 8 - 9 nucleotide. Đầu 5’ của mạch
DNA âm mang vị trí gắn kết DNA polymerase của virus.
 DNA chuỗi dƣơng: nằm bên trong, 1,7 - 2,8 kb, có đầu tận cùng 5’ cố
định nhƣng đầu 3’ thay đổi. Đa số các bộ gen HBV có một đoạn hổng mạch đơn có
chiều dài 300 - 2000 base. Đầu 5’ của mạch DNA dƣơng đƣợc tạo bởi một
oligoribonucleotide dài 18 base, đƣợc gắn chóp giống mRNA.
Cấu trúc vịng của DNA đƣợc đảm bảo nhờ sự ghép nối hai đầu 5’ của hai sợi
DNA trên một đoạn có chiều dài 200 nucleotide gọi là vùng liên kết.Vùng này nằm
giữa hai trình tự DR1 và DR2 có 10 - 11 nucleotide. DR1 nằm ở đầu 5’ của sợi DNA
âm và cũng hiện diện ở đoạn dƣ của đầu 3’. DR 2 nằm ở đầu 5’ của sợi DNA dƣơng.
Hai trình tự này đóng vai trị khởi sự q trình sao chép các chuỗi DNA tƣơng ứng.

Hình 2.2. Tổ chức genome của HBV
( />Trên mạch DNA âm của HBV của lồi có vú có 4 khung đọc mở mã hoá cho 4
loại protein tƣơng ứng. Các đoạn đọc mở này nằm chồng lên nhau. Quá trình đọc mã
bắt đầu bằng codon mở đầu (AUG) và kết thúc bằng codon kết thúc (TAG).


6

 Gen S
Bao gồm vùng S, pre –S1, pre-S2, mã hoá để tổng hợp các protein bề mặt.
 Đoạn gen S: mã hoá cho protein bề mặt nhỏ (Small Hepatitis B surface) gồm
226 acid amine, có trọng lƣợng phân tử 24 kD. Protein này rất kỵ nƣớc, có thể
glycosyl hố ở asp 146. Là protein chủ yếu chiếm đa số. Ngƣời ta phát hiện ở vùng S
có ít nhất 5 quyết định kháng nguyên.
Tuỳ theo sự phân bố của các quyết định kháng nguyên mà ta phân loại đƣợc các
chủng loại HBV.
Quyết định chung ở tất cả các chủng phân lập HBs là a, kế đến là d và y, cuối

cùng là w và r.
Quyết định kháng nguyên w lại gồm những biến thể w1, w2, w3, w4.

Hình 2.3. Mơ hình virus tồn vẹn (virion)
( /> Nếu trình tự đọc mã bắt đầu từ vùng pre-S2 và tiếp tục cho đến hết vùng S sẽ
tổng hợp nên protein bề mặt trung bình (Medium Hepatitis B surface) có trọng lƣợng
phân tử 33 kD, gồm 281 acid amine rất ƣa nƣớc. Protein này gồm 2 dạng glycoprotein:
gp 33 và gp 36.
Vùng pre-S2 có đoạn trùng hợp với albumin huyết thanh (serium albumin) và
trên tế bào gan có thụ quan đặc biệt cho albumin và thụ quan này là điểm xâm nhập
của virus. Do đó, các vaccine sau này có thêm kháng nguyên pre – S2.
 Gen S, pre-S1, pre S2: mã hoá tổng hợp nên protein bề mặt lớn (Large
Hepatitis B surface ) có trọng lƣợng phân tử 39 kD mã hố 389 acid amine gồm 2
dạng protein p 39 và gp 42. Chuỗi protein pre - S1 có chiều dài thay đổi tuỳ theo từng


7

chủng loại khác nhau.Đây là vùng chủ yếu mà các thụ thể trên bề mặt tế bào gan sẽ
liên kết với siêu vi, giúp siêu vi xâm nhập vào trong tế bào. Kháng thể anti - pre - S1
có thể trung hồ và ức chế siêu vi kết dính vào tế bào gan.
 Gen C
Gồm 2 vùng pre-C và C. Nếu quá trình đọc mã đƣợc bắt đầu từ codon AUG thứ
nhất ở vị trí 1814 và đọc suốt chiều dài của đoạn gen pre-C và C sẽ tổng hợp nên
HBeAg.
Các nucleotide đầu tiên của vùng pre-C và C sẽ mã hoá cho việc tạo nên một
đoạn peptide gồm 19 acid amine gọi là peptide tín hiệu. Peptide này giúp cho HBeAg
đƣợc bài tiết qua hệ thống lƣới nội chất của tế bào gan dƣới dạng hoà tan trong huyết
thanh. HBeAg là một protein không tham dự vào cấu trúc của virion và chức năng
chƣa biết rõ. Tuy nhiên sự hiện diện của nó liên quan đến tính lây nhiễm và phản ánh

tình trạng đang nhân đơi của siêu vi.
Nếu quá trình dịch mã bắt đầu từ codon AUG thứ 2 ở vị trí 1901 đi suốt đoạn gen
C sẽ tổng hợp nên HBcAg có trọng lƣợng phân tử 21 kDa, gồm 183 - 185 acid amine.
Đây là kháng nguyên cấu trúc của phần nucleocapside. Protein này không đƣợc bài tiết
ra khỏi tế bào gan vì khơng có đoạn peptide tín hiệu.
 Gen P
Chiếm 80 % chiều dài bộ gen, chồng lấp lên một phần gen C và gen X, bao trùm
toàn bộ gen S. Toàn thể gen P mã hố cho một polypeptide có trọng lƣợng phân tử
80 - 90 kDa vừa có hoạt tính DNA polymerase phụ thuộc RNA lại vừa có hoạt tính
DNA polymerase phụ thuộc DNA.
Men DNA polymerase đƣợc dùng để tổng hợp một DNA mới từ RNA tiền
genome mà sợi RNA tiền genome này lại đƣợc tạo ra từ khuôn mẫu là DNA của HBV
dƣới tác dụng của men RNA polymerase của tế bào gan. Gồm 4 vùng:
Vùng đầu tận cùng N: mã hoá cho primase là đoạn mồi cần thiết cho sự tổng
hợp mạch DNA âm.
Vùng kế tiếp: là vùng đệm nằm gối lên các vùng pre - S1 và pre - S2 vai trị
chƣa hiểu rõ, có lẽ giúp biểu hiện các protein bề mặt trung bình và lớn.
Vùng kế tiếp: mã hố DNA polymerase phụ thuộc RNA hoặc DNA có vai trị
là men phiên mã ngƣợc. Vùng này có một trình tự mã hoá các acid amine tƣơng đối ổn


8

định YMDD (tyrosine – methyonine – apartate - aspartate) có lẽ đây là vị trí xúc tác
của men phiên mã ngƣợc.
Vùng đầu C: là Rnase H có vai trị phân cắt RNA trong các thể lai RNA-DNA
làm thối biến khn trong lúc tổng hợp mạch DNA âm.
 Gen X
Có chiều dài 450 base mã hoá cho đoạn polypeptide khoảng 145 - 154 acid amine
tạo nên HBxAg.

Vai trò của HBxAg chƣa rõ, chƣa đƣợc chứng minh bằng thành phần cấu trúc của
virion.
Gần đây, HBx đƣợc chứng minh góp phần làm ung thƣ di căn.
2.4. Quá trình sao chép và nhân lên của HBV [ 18 ]
Chu kỳ sống của HBV đƣợc chia thành nhiều bƣớc
1. Gắn virus vào màng tế bào ký chủ.
2. Sự xâm nhập của virus vào tế bào.
3. Sự phóng thích bộ gen của virus.
4. Sự biểu hiện các sản phẩm gen virus.
5. Sự sao chép bộ gen virus.
6. Lắp ráp các hạt virion.
7. Phóng thích virus.

Hình 2.4. Lƣợc đồ vòng đời HBV
(www.infekt.ch)


9

Virion vào cơ thể, xâm nhập vào tế bào, gắn lên thụ thể trên bề mặt tế bào, có sự
dung hợp giữa màng tế bào và vỏ virus. Sau đó, virus sẽ phóng thích bộ gen vào trong
nhân.
Trong nhân, bộ gen sợi đơi khơng khép kín của HBV biến đổi thành DNA sợi đơi
vịng khép kín đồng hố trị (cccDNA.). cccDNA của virus sẽ liên kết với histone nhân
của tế bào chủ hình thành nhiễm sắc thể nhỏ ngoại thể và đƣợc sử dụng làm khuôn để
phiên mã tổng hợp các RNA.
Các RNA dịch mã cho ra protein polymerase và protein lõi HBcAg. Hai protein
này lắp ráp chung với mRNA hình thành phức hợp sao chép. Vùng primase của
polymerase đƣợc dùng nhƣ những đoạn mồi đối với enzyme transcriptase sẽ phiên mã
tiền genome RNA hình thành DNA sợi âm.

Hình 2. 5. Quá trình sao chép và nhân lên của HBV


10

Khi DNA âm đƣợc tổng hợp, tiền genome mRNA sẽ bị giáng hoá dƣới tác dụng
của Rnase H, trừ một đoạn nhỏ khoảng 20 cặp base ở đầu 5’. Đoạn RNA này sẽ hoạt
động nhƣ một primer để tổng hợp DNA sợi dƣơng từ DNA sợi âm mới đƣợc tổng hợp,
hình thành DNA sợi kép hồn chỉnh.
DNA sợi kép sẽ nhận vỏ bọc chứa HBsAg bằng cách đâm chồi từ màng bào
tƣơng và sẽ trở thành những hạt virus gây nhiễm. Các hạt virion hồn chỉnh này đƣợc
giải phóng vào máu tuần hoàn và tiếp tục gây nhiễm các tế bào chủ tiếp theo.
2.5. Các phƣơng pháp xét nghiệm để phát hiện HBV [ 1 ]
Hiện nay, việc chẩn đoán HBV thƣờng dựa vào các dấu ấn miễn dịch
(finger -print) nhƣ tìm kháng nguyên HBs, HBe và kháng thể anti - HBs, anti - HBe,
anti - HBc, tìm DNA hoặc hạt tử Dane trong huyết thanh hoặc trong tế bào gan bị
nhiễm, xác định và định lƣợng kháng nguyên của HBV đặc biệt là HBsAg.
2.5.1. Phƣơng pháp chẩn đoán huyết học
Phƣơng pháp này dựa vào sự biến động các thành phần của máu. Khi bị nhiễm
virus, bạch cầu đa nhân giảm, lympho bào tăng ở thời kỳ trƣớc vàng da và bình thƣờng
khi vàng da.
2.5.2. Phƣơng pháp chẩn đốn dựa trên chức năng gan
Khi tế bào gan bị tổn thƣơng sẽ xuất hiện các hội chứng ứ mật làm tăng bilirubin
máu, hội chứng viêm mô làm mất sự thăng bằng protein huyết tƣơng hoặc sự thay đổi
thuộc tính của transaminase ở hội chứng huỷ hoại tế bào gan.
2.5.3. Phƣơng pháp chẩn đoán huyết thanh học và hoá miễn dịch
Phƣơng pháp trực tiếp phát hiện các hạt Dane hoặc kháng nguyên của HBV trong
huyết thanh hoặc tế bào gan bằng kính hiển vi điện tử.
Phƣơng pháp gián tiếp phát hiện HBV thông qua các dấu ấn miễn dịch của virus

viêm gan có trong huyết thanh bằng cách cho chúng tạo phức với kháng nguyên hoặc
kháng thể tƣơng ứng, việc đánh giá có thể thực hiện bằng mắt thƣờng hoặc bằng máy.


11

Bảng 2.1. Các dấu ấn HBV chính trong viêm gan B cấp và mạn [ 1 ]

Dấu ấn

Cấp tính

Mạn tính

HBsAg

Dƣơng tính, rồi biến mất

Dƣơng tính, tồn tại

IgM anti – HBc

Dƣơng tính, cao

Thấp hoặc âm tính

HBeAg / anti – Hbe

HBeAg dƣơng, chuyển huyết

HBeAg hoặc anti – HBe

thanh thành anti – HBe

HBV DNA

Dƣơng tính, rồi biến mất

Cao hoặc thấp, tồn tại

Anti - HBs

Xuất hiện khi hồi phục

Âm

Bảng 2.2. Ý nghĩa các dấu ấn huyết thanh học của HBV ở bệnh nhân viêm gan [ 3 ]

HBsAg HBeAg Anti-HBe Anti-HBc Anti-HBs
+

+

-

-

-

+

+

-

+

-

-

-

+

+

-

-

-

+

+

+

-

-

-

+

+

-

-

-

-

+

-

+

-

Nhận định
Thời kỳ ủ bệnh hoặc khởi
đầu giai đoạn cấp tính
Giai đoạn cấp tính hoặc
mạn tính

Giai đoạn cuối hoặc mạn
tính
Giai đoạn hồi phục sau
cấp tính
Hồi phục từ nhiễm trùng
Nhiễm HBsAg khơng bị
nhiễm trùng
Hồi phục sớm của nhiễm
trùng mạn tính


12

2.6. Các kiểu lây truyền HBV [ 1 ]
Có 4 kiểu lây truyền HBV chủ yếu sau
 Lây nhiễm qua đƣờng máu và các dịch sinh lý cơ thể
 Lây nhiễm HBV qua tiếp xúc tình dục
 Lây nhiễm giữa các trẻ nhỏ qua tiếp xúc
 Lây nhiễm qua chu sinh
2.7. Kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B (HBsAg) [ 3 ]
2.7.1. Bản chất của HBsAg
 HBsAg là phần gắn liền với HBV.
 Phần lớn là những hạt hình cầu đƣờng kính 22 nm hoặc những hạt hình ống
chiều dài thay đổi, đƣờng kính 22 nm hoặc một số hạt đƣờng kính 42 nm. Tất cả các
hạt này đều là HBsAg.
 Phần lớn HBsAg có tỷ trọng 1,2 g/ cm3 trong chlorua cesium.
 HBsAg đƣợc cấu tạo bởi protein và lipid.
 HBsAg tinh khiết có trọng lƣợng phân tử cao 3.106 Da, song các quyết định
kháng nguyên của HBsAg đƣợc biểu thị bằng các chuỗi polypeptid có kích thƣớc nhỏ
hơn nhiều, ví dụ nhƣ 22.000, 27.000 và 49.000 Da, nồng độ từ 10 – 1.000 µg/ml.

2.7.2. Tầm quan trọng của HBsAg
Việc phát hiện HBsAg trong huyết thanh của một ngƣời, chứng tỏ ngƣời đó có
HBV và có khả năng truyền bệnh cho ngƣời khác.
Việc xét nghiệm HBsAg cho những ngƣời cho máu để đề phòng truyền máu
hoặc các sản phẩm của máu HBsAg (+) đã làm giảm đƣợc sự truyền máu có liên quan
đến viêm gan B.
HBsAg là chỉ điểm của một nhiễm trùng HBV ngay cả khi trạng thái của bệnh
khơng rõ ràng. HBsAg có thể là một dấu hiệu duy nhất của một nhiễm trùng viêm gan
B cấp tính trong một vài ngày đến vài tuần, trƣớc khi xuất hiện các triệu chứng lâm
sàng hoặc các chỉ điểm khác của sự nhiễm trùng (kháng thể kháng kháng nguyên lõi
của viêm gan B (anti-HBc) xuất hiện).


13

HBsAg đƣợc tìm thấy trong tất cả các thành phần của máu và các sản phẩm điều
chế từ huyết thanh có HBsAg (+). Ngồi ra, HBsAg cịn có trong các dịch tiết khác
nhau của cơ thể: nƣớc tiểu, nƣớc mắt, sữa, nƣớc bọt…
HBsAg là kháng nguyên rất bền vững
2.7.3. Các phân typ của HBsAg
Kháng nguyên HBsAg có một quyết định kháng nguyên đặc hiệu nhóm a và hai
cặp quyết định kháng nguyên: d và y; w và r. Cả ba quyết định kháng nguyên trên đều
có mặt trong ba dạng thể virus. Với ba quyết định kháng nguyên trên sinh ra bốn dòng
di truyền thứ là: adw, ayw, adr và ayr. Phân biệt bốn dịng trên có ích trong giám sát
dịch tể học nhƣng bốn dòng đều gây bệnh lý nhƣ nhau.
Bảng 2.3. Phân typ của HBsAg
Quyết định kháng nguyên nhóm

Alen quyết định kháng ngun

a

d-y
w-r

Phân typ chính của HBsAg:adw, ayw, adr, ayr
Quyết định kháng nguyên phân typ phụ:x, n, t, g,
Re, j, k và tên gọi a1(w1), a21(w2),a3(w4)
2.7.4. Tinh khiết HBsAg [ 3 ] [ 11 ]
Có thể tách chiết và tinh khiết HBsAg bằng nhiều kỹ thuật khác nhau gồm
 Siêu ly tâm
 Sắc ký cột.
 Tập trung đẳng điện.
 Kết tủa bằng ammonium sulfate hoặc polyethylen glycol.
 Và các phƣơng pháp phối hợp các quá trình trên.
Các thành phần hay liên kết với HBsAg là albumin, lipoprotein, 2-macroglobulin.
Việc tinh khiết HBsAg từ bất kỳ nguồn nào cũng là một q trình thử thách hồn
tồn khác với q trình tinh khiết các protein khác, bởi vì sản phẩm mong muốn không


14

chỉ là một polypeptide 24 kD đơn thuần mà là một phức hợp của polypeptide lắp ráp
với lipide của tế bào chủ vào hạt hình cầu 22 nm, mỗi hạt chứa khoảng 100
polypeptide.
Vì lƣợng kháng ngun có trong ngun liệu ban đầu (huyết thanh, dung dịch ly
giải nấm men…) chỉ khoảng 1% lƣợng protein tồn phần. Vì vậy việc phân tích trực
tiếp có thể đƣợc tiến hành với các thử nghiệm dựa vào kỹ thuật hoặc miễn dịch men
(ELISA) hoặc là miễn dịch đồng vị phóng xạ (RIA). Sắc ký lỏng cao áp (HPLC) và
điện di trên SDS - PAGE đƣợc dùng để kiểm sốt q trình tinh khiết ở các giai đoạn

sau khi kháng nguyên đã là thành phần cơ bản.
Những kết quả làm biến tính và chạy điện di trên gel polyacrylamid của phịng thí
nghiệm, một số tác giả mơ tả có tới 11 băng trên HBs hình cầu đã đƣợc tinh chế. Một
số khác cho rằng có 2 băng.
Tóm lại, có 2 băng protein chủ yếu với MW = 22 - 26 (kD) và MW = 25 - 30
(kD). Theo Peterson (1977), protein lớn là dạng N - glycosyl hoá của protein loại nhỏ
chƣa đƣợc glycosyl hoá. Những protein này là P24, PG 27.
Rất nhiều tác giả cho rằng P24 và sản phẩm GP27 của nó là HBsAg hoặc protein
HBs. Tuy nhiên, quan điểm này không thống nhất với định nghĩa gốc về HBsAg nhƣ
là một thực thể của tất cả các thành phần KN có trên bề mặt của virus.
Nghiên cứu một cách kỹ lƣỡng hơn tất cả các protein của virion viêm gan B cho
thấy ngồi P24 và GP27 cịn có ít nhất 4 băng nữa cũng có trên bề mặt của virion:
GP33, GP36, P39, GP42.
2.7.5 Định lƣợng HBsAg [ 3 ]
Kỹ thuật miễn dịch đồng vị phóng xạ (RIA) đã đƣợc sử dụng trƣớc đây để định
lƣợng HBsAg trong huyết thanh. Bộ thuốc thử RIA bán trên thị trƣờng có thể xác định
đƣợc 2 ng/ml HBsAg thuộc phân typ ad và 6 ng/ml HBsAg thuộc phân typ ay.
Phần lớn các bộ thuốc thử HBsAg do Mỹ điều chế có thể xác định đƣợc hàm
lƣợng HBsAg thuộc phân týp ad thấp hơn so với phân typ ay.