Thiết lập môi trƣờng dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy để sản xuất prodigiosin từ vi khuẩn s marcescens SH1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
..

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

THIẾT LẬP MƠI TRƯỜNG DINH DƯỠNG VÀ ĐIỀU KIỆN
NUÔI CẤY ĐỂ SẢN XUẤT PRODIGIOSIN TỪ VI KHUẨN
SERRATIA MARCESCENS SH1

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1051110139

:TRẦN LÂM TÚ QUYÊN
Lớp: 10DSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2014


Đồ án tốt nghiệp

LỞI CẢM ƠN
Em xin được trân trọng cảm ơn quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Thực
phẩm - Môi trường, trường Đại học Công nghệ TP.HCM đã nhiệt tình giúp đỡ,
truyền đạt những kiến thức nền tảng, những kinh nghiệm quý báu cho em trong
suốt quá trình học tập và làm đồ án tốt nghiệp.
Đặc biệt em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Hồi Hương, người
cơ đáng kính, đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn cho em về nội dung cũng như các kỹ
năng, phương pháp, cách thức tiến hành thí nghiệm để em có thể hồn thành đồ
án tốt nghiệp của mình.
Em xin chân thành cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành và thầy Nguyễn Trung Dũng
đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình em thực hiện đồ án tại
phịng thí nghiệm Khoa Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường
Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh.
Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trong hội đồng phản biện đã dành thời
gian đọc và nhận xét đồ án tốt nghiệp của em.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình đã ln ủng hộ, thương u và
dành cho con những điều tốt đẹp nhất trong suốt quá trình học tập cũng như trong
cuộc sống.
Xin chân thành cảm ơn!
TP. Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2014
Sinh viện thực hiện


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tơi, các số liệu và kết quả là
trung thực.
Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào, tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm về
nội dung đồ án của mình. Trường Đại học Công Nghệ TP. HCM không liên quan

đến những vi phạm tác quyền, bản quyền do tôi gây ra trong quá trình thực hiện.
TP.Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2014
Sinh viên thực hiện


Đồ án tốt nghiệp

Mở Đầu
1. Tính cấp thiết của đề tài
Các nguồn tài nguyên thiên nhiên, chẳng hạn như thực vật, vi sinh vật, động vật
có xương sống và khơng xương sống là những nguồn có giá trị của các hợp chất
hoạt tính sinh học. Một số lượng lớn các loại thuốc đã được phát triển trong ngành
y từ các sản phẩm tự nhiên (Amador và cộng sự. 2003). Kể từ khi phát hiện và
thành công trong việc điều trị của peniciline, các vi sinh vật đã được sử dụng như
một nguồn đặc biệt của các tác nhân hoạt tính sinh học có cấu trúc đa dạng. các ứng
dụng điều trị của các chất chuyển hóa của vi sinh vật cung cấp cơ hội cho việc phát
hiện ra kháng sinh (ví dụ peniciline, erythromycin…), ức chế miễn dịch trong cấy
ghép, các tác nhân giảm cholesterol (ví dụ : lovastain và mevastatin) và tác nhân
chống ung thư (ví dụ: doxorubicin, daunorubicin, bleomycin và pentostatin).
Từ khi nền khoa học hiện đại bắt đầu, các hợp chất thứ cấp tự nhiên được chiết
xuất từ trái cây, rau, hạt, rễ cũng như từ vi sinh vật đã được sử dụng trong việc làm
thuốc đông y, mỹ phẩm, thực phẩm ,... Nhưng sau đó, các hợp chất thứ cấp tự nhiên
đã được nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc hóa học cũng như cách tổng hợp bằng
phương pháp hóa học, bởi người ta cho rằng chúng bền hơn, có thể sản xuất trên
quy mơ lớn và chi phí sản xuất thấp. Tuy nhiên, các vấn đề ô nhiễm môi trường và
ảnh hưởng xấu đến sức khỏe gây ra bởi các hợp chất tổng hợp hóa học đã bắt đầu
được quan tâm.
So với các hợp chất thứ cấp từ thực vật và động vật thì các hợp chất từ vi sinh
vật ngày càng được quan tâm và phát triển, vì vi sinh vật cũng là một yếu tố tự
nhiên và an toàn để sử dụng, sản xuất được quanh năm trong các điều kiện địa lý

khác nhau và do sự tăng trưởng nhanh chóng của vi sinh vật nên sẽ làm giảm thời
gian sản xuất xuống còn chỉ một vài ngày. So với các nguồn khác từ thực vật hoặc
động vật thì hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật có thể dễ dàng được kiểm soát và dự
đoán sản lượng (Francis, 1987; Taylor, 1984). Trong những sắc tố từ vi sinh vật thì
hợp chất prodigiosin được biết đến với ý nghĩa quan trọng.

1


Đồ án tốt nghiệp

Một số loài Serratia, đặc biệt loài Serratia marcenscens có khả năng tổng hợp
sắc tố đỏ (red pigment) prodigiosin (2-methyl-3-amyl-6-methoxyprodigiosene)
(C20H25N3O = 323,44) (Williams và Qadri, 1980, Kobayashi và El-Barrad, 1996;
Press và cộng sự, 1997; Someya và cộng sự, 2000; Roberts và cộng sự, 2005).
Prodigiosin là sắc tố màu đỏ, và có hoạt tính kháng vi sinh vật đã được bắt đầu
nghiên cứu từ những năm 1960, nay thu hút được nhiều quan tâm do khả năng sử
dụng làm màu tự nhiên và ứng dụng trong lĩnh vực bảo vệ thực vật cũng như hoạt
chất kháng ức chế miễn dịch và chống khối u (D’Alessio và Rossi, 1996; Azuma và
cộng sự, 2000; Bennet và Bentley, 2000; Melvin và cộng sự, 2000, Tsuji và cộng
sự, 1990; Kataoka và cộng sự, 1992; Tsuji, 1992; Songia và cộng sự, 1997).
Dựa trên cơ sở lợi ích rất quan trọng của hợp chất prodigiosin được tách từ việc
nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcenscens, đề tài “THIẾT LẬP MÔI TRƢỜNG
DINH DƢỠNG VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐỂ SẢN XUẤT PRODIGIOSIN
TỪ VI KHUẨN S. MARCESCENS SH1” được tiến hành nhằm tìm ra được mơi
trường và điều kiện nuôi cấy để tổng hợp ra prodigiosin cao nhất.
2. Mục tiêu của nghiên cứu
Khảo sát các loại môi trường tổng hợp prodigiosin cao nhất.
Khảo sát các điều kiện nuôi cấy tổng hợp prodigiosin cao nhất.
3. Ý nghĩa khoa học

Tìm ra được mơi trường ni cấy tốt nhất để tổng hợp prodigiosin nhiều nhất.
Thiết lập được điều kiện nuôi cấy tối ưu nhất để tổng hợp prodigiosin nhiều
nhất.
4. Ý nhĩa thực tiễn
Prodigiosin là hợp chất thứ cấp vi sinh vật được nghiên cứu phát triển dược
phẩm nên được bán trên thị trường với giá rất cao. Thành công của đề tài sẽ góp
phần vào việc tìm được mơi trường tốt nhất và điều kiện nuôi cấy tối ưu để sản xuất
và ứng dụng hợp chất prodigiosin.

2


Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 1. TỒNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Tổng quan hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật

1.1.1. Hợp chất thứ cấp
Hợp chất thứ cấp là chất được tạo ra từ hợp chất sơ cấp, có trọng lượng phân tử
nhỏ, thường được gọi là chất có hoạt tính sinh học đóng vai trị điều hịa quan hệ
sinh thái của chủ thể với các tác động lên chủ thể của môi trường xung quanh.
Hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật là những hợp chất được vi sinh vật tạo ra từ q
trình chuyển hóa hợp chất sơ cấp
1.1.2. Triển vọng và tiềm năng sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật
Vi sinh vật đã được sử dụng trong một thời gian dài cho sản xuất các phân tử
sinh học như thuốc kháng sinh, enzyme, vitamine và các tác nhân chỉ thị. Có sự
quan tâm ngày càng tăng trong ngành công nghiệp thực phẩm trong việc sử dụng
các thành phần tự nhiên. Các thành phần, chẳng hạn như hợp chất thứ cấp, được

xem là tự nhiên khi xuất phát từ nguồn gốc sinh học như động vật, thực vật hoặc
vi sinh vật. Hợp chất thứ cấp của vi sinh vật được sử dụng trong ngành công nghiệp
chế biến cá, ví dụ như để tăng màu hồng của cá hồi ni. Hơn nữa, một số hợp chất
tự nhiên có tiềm năng thương mại để sử dụng như chất chống oxy hóa. Ngành
cơng nghiệp hiện nay đã sản xuất một số hợp chất từ vi sinh vật ứng dụng trong
thực phẩm, mỹ phẩm hoặc vật liệu dệt. Trong tự nhiên phong phú về hợp chất và
vi sinh vật sản xuất hợp chất (nấm, nấm men và vi khuẩn). Trong các sắc tố tự
nhiên thì vi sinh vật cung cấp một số lượng hợp chất rất lớn như:
carotenoid, melanin, flavin, quinone, prodigiosin và cụ thể hơn là monascin,
violacein hoặc indigo (Dufosse, 2009). Các loại hợp chất này có tiềm năng khai thác
cao, vì quá trình sản xuất đơn giản, sự đa dạng di truyền ở vi sinh vật, cũng như có
thể dễ dàng tối ưu hóa quy trình cơng nghệ (Juailova và cộng sự, 1997).
Bên cạnh đó, một số vi sinh vật có khả năng sản xuất hợp chất với hiệu suất
cao, bao gồm các chi Monascus (Hajjaj và cộng sự, 2000) và Serratia (Williams
và cộng sự, 1971a). Các chi vi sinh vật khác như: Rhodotorula, Bacillus,
Achrombacter, Yarrowia và Phaffia cũng có khả năng sản xuất số lượng lớn hợp

3


Đồ án tốt nghiệp

chất thứ cấp (Krishna, 2008), trong đó kháng sinh, nhóm hoạt chất có khả năng gây
chết hoặc kìm hãm vi sinh vật phát triển, được một số vi sinh vật (fungi,
actmomycetes, bacteria) tạo ra, là một trong những thành tựu quan trọng của việc
sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật. Mỗi kháng sinh có phổ tác động riêng của
mình. Bảng 1.1 tóm tắt về một số hợp chất thứ cấp được sản xuất bởi vi sinh vật.
Bảng 1.1. Danh sách một số hợp chất thứ cấp được sản xuất bởi vi sinh vật

Vi sinh vật

Hợp chất thứ

Ứng dụng

cấp

Kiểu tác động ức chế

Penicillium notatum,

Ức chế tụ cầu

Ức chế tạo polymer

Penicillium

khuẩn, nhiễm

vách tế bào vi khuẩn,

trùng kỵ khí,

ức chế hấp thu amino

giang mai, hen

acid và protein, ức chế

suyễn.

tạo enzyme

Ức chế vi khuẩn

Ức chế ghép nối một

Gram âm và ram

số amino acid vào

dương. Trị bệnh

protein, tác động lên

lao, bệnh viêm

hệ enzyme của vi

màng não, ho gà

khuẩn tham gia

chrysogenum

Penicillin

Streptomyces griceus

Streptomycin

chuyển pyruvate vào
chu trình Creb…
Steptomyces

Ức chế đối với

Ức chế đặc hiệu sinh

venezuelae

bệnh lỵ, sốt cao,

tổng hợp protein vi

sốt phát ban

khuẩn liên quan đến

Chloramphenicol

peptidyl transferase
trong tiểu đơn vị
Ribosome 50s, ngăn
không cho tạo liên kết
peptide

4

Đồ án tốt nghiệp

Streptomyces
aureomycin

Tetracilin

Ức chế phổ rộng

Ức chế tổng hợp

vi khuẩn Gram

protein

âm, Gram dương
Streptomyces
erythraeus

Erythromycin

Chữa bệnh do tụ

ức chế vi khuẩn Gram

cầu khuẩn

âm và Gram dương

streptococcal gây

ra

Streptomyces fradiae

Tác dụng vi
Neomycin

Hơi độc

khuẩnn Gram âm
và Gram dương

Streptomyces
kanamycetius

Kanamycin

Điều trị lao, ức

Tác động giống như

chế vi khuẩn

streptomycin và

Gram âm và

neomycin

Gram dương

Streptomyces
lavendulae

1.2.

Điều trị bệnh lao

Cycloserine

Cản trở tổng hợp vách
tế bào

Tổng quan prodigiosin

1.2.1. Khái niệm về prodigiosin
Prodigiosin là một tripyrrole được phát hiện lần đầu tiên trên khuẩn lạc đặc
trưng của vi khuẩn Serratia marcescens. Tên gọi “prodigiosin” có nguồn gốc
từ “prodigious” có nghĩa là một điều gì đó kỳ diệu. Prodigiosin được tìm thấy ở
dạng túi bên ngoài tế bào cũng như các tế bào liên kết, và dạng hạt ở bên trong tế
bào (Kobayashi và Ichikawa, 1991).

5


Đồ án tốt nghiệp

Prodigiosin là một chất chuyển hóa thứ cấp, được sản xuất bởi các vi khuẩn
như Serratia marcescens, Pseudomonas magneslorubra, Vibrio psychroerythrous,
Serratia rubidaea, Vibrio gazogenes, Alteromonas rubra, Rugamonas rubra và
các xạ

khuẩn Gram dương, chẳng hạn

Streptoverticillium rubrireticuli

và

Streptomyces longisporus (Khanafari và cộng sự, 2006). Hình 1.1 trình bày cấu trúc
hóa học của các hợp chất đại diện của prodigiosin.

Hình 1.1. Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003)
1.2.2. Cấu trúc và đặc điểm của prodigiosin
Mãi đến năm 1960, cơng thức hóa học chính xác của prodigiosin được tổng hợp
bởi Serrattia marcescens mới được biết đến (Rapoport và Holden, 1962). Do sự tiến
bộ nhanh chóng trong khoa học phân tích và quang phổ ở những năm tiếp theo,
mà cấu trúc của prodigiosin dần được nghiên cứu rõ ràng hơn (Hesse, 2000).

6


Đồ án tốt nghiệp

Prodigiosin với tên gọi (5[(3-methoxy-5-pyrrol-2-ylidene-pyrrol-2-ylidene)methyl]-2-methyl-3-pentyl-1H-pyrrole) có cơng thức phân tử C20H25N3O và
trọng lượng phân tử là 323,44 Da (Harris và cộng sự, 2004; Song và cộng
sự, 2006; Williamson và cộng sự, 2006).
Prodigiosin là một alkaloid có cấu trúc hóa học đặc biệt, với ba vịng pyrrole tạo
thành bộ khung pyrrolylpyrromethane, trong đó hai vịng đầu liên kết trực tiếp với
nhau, còn vòng thứ ba được gắn vào thông qua cầu nối methene (Qadri và Williams,
1972; Gerber, 1975). Cấu trúc của prodigiosin có bảy liên kết đơi và được miêu tả là
tạo sắc tố mạnh (Krishna, 2008).

Prodigiosin nhạy cảm với ánh sáng và không tan được trong nước. Prodigiosin
có thể tan tương đối trong alcohol và ether; bên cạnh đó, nó dễ tan trong
chloroform, methanol, acetonitrile và DMSO (Grimont và cộng sự, 1977; Khanafari
và cộng sự, 2006).
Bảng 1.2. Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973)

Loài

Danh pháp

Tên sắc tố

prodigiosin

Serratia marcescens

Prodigiosin

Serratia marcescens

Norprodigiosin

Nocardia
(Actinomadura)

Nonylprodigiosin

madurae

7

Trọng lƣơng
phân tử và
công thức

2-Methyl-3-amyl-6-

323,4 Da C20

methoxy prodigiosene

H25 N30

2-Methyl-3-amyl-6-

309,4 Da

hydroxy-prodigiosene

C10 H23N3O

2-Nonly-6-

363,5 Da

methoxyprodigiosene

C23H31 N3O

Đồ án tốt nghiệp

Nocardia
(Actinomadura)

2,10-Nonano-6-

265,5 Da

melhoxy-prodigiosene

C23H33 N3O

Methylcyclodc

2,10-Nonano-6-

391,5 Da

cyl-prodigiosin

Methoxy-prodigiosene

C25H33N3O

2-Undecyl-6-

393,6 Da

Rnethoxyprodigiosene

C25 H35 N3O

Cyclononylprodigiosin

Madurae
Nocardia
(Actinomadura)
pellctieri
Streptomyces
longisporusruber và
Nocardia

Undccylprodigiosin

(Actinomadura)
pelletieri
Streplonlyces
longisporusruber

2,4-(9-Ethylnonano)
Metacycloprodigiosin

-6methoxyprodigiosene

391,6 Da
C25H33N3O

1.2.3. Hoạt tính sinh học của prodigiosin
1.2.3.1. Hoạt tính kháng khuẩn

Prodigiosin có khả năng ức chế sự tăng trưởng của một số loài vi
khuẩn (Khanafari và cộng sự, 2006). Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin
là do khả năng thấm qua màng tế bào và khả năng ức chế các enzyme như
DNA gyrase, topoisomerase IV,… dẫn đến quá trình ức chế sự tăng trưởng của
tế bào vi khuẩn (Ramina và Samira, 2009).
Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện và nhận thấy rằng prodigiosin có thể kháng
một số vi khuẩn như: Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus,
Bacillus subtilis, Enterococcus avium, Streptococcus pyogenes, Echerichia coli,
Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Proteus mirabilis, Klebsiella
pneumoniae, Bacillus cereus,... Tuy nhiên, hoạt động kháng khuẩn của prodigiosin

8


Đồ án tốt nghiệp

đối với các vi khuẩn Gram dương lại cao hơn so với các vi khuẩn Gram
âm (Ramina và Samira, 2009; Chandni và cộng sự, 2012).
1.2.3.2. Hoạt tính chống tế bào ung thư
Prodigiosin có khả năng gây độc tế bào và có thể chống lại một loạt các dịng
tế bào ung thư ở người, nhưng vẫn duy trì các tế bào lành tính (Pandey và
cộng sự,2009; Pérez-Tomás và Viđas, 2010). Vì khả năng gây độc chọn lọc
này, prodigiosin hứa hẹn có nhiều triển vọng trong việc sản xuất thuốc chống ung
thư. Các hoạt động chống ung thư trong cơ thể của prodigiosin được chứng minh
lần đầu tiên bằng những tác dụng ức chế của cycloprodigiosin trên tế bào
Huh-7 hepatocarcinoma xenografted (Yamamoto và cộng sự, 1999). Một mơ hình
khối u ác tính trên chuột cũng cho thấy prodigiosin có khả năng ức chế sự di căn,
bằng cách nó đã giảm sự di căn trên tế bào ung thư phổi (Zhang và cộng sự,
2005), điều này đã cho thấy rằng prodigiosin ngăn quá trình phát triển của tế bào
ung thư thông qua nhiều cơ chế.

Các khả năng gây độc dẫn đến sự tự hủy của tế bào ác tính bởi prodigiosin
chủ yếu là do ảnh hưởng từ proapoptotic của chúng chống lại các tế bào ác tính.
Nhiều nghiên cứu đã dần làm sáng tỏ con đường prodigiosin gây sự tự hủy của
các tế bào (Chia-Che và cộng sự, 2011). Cơ chế kháng tế bào ung thư của
prodigiosin được mô tả cụ thể như sau:

9


Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.2. Cơ chế kháng tế bào ung thư của prodigiosin (Chia-Che và cộng sự,
2011)
Quá trình acid hóa pH trong tế bào (pHi) rõ ràng là một kích hoạt quan trọng
của q trình tự hủy trong tế bào (Lagadic-Gossmann và cộng sự, 2004). Acid hóa
nội bào là cần thiết cho cycloprodigiosin kích thích q trình tự hủy trong tế bào
HL-60 (Yamamoto và cộng sự, 2000), cũng tương tự như prodigiosin gây ra sự tự
hủy ở tế bào ung thư ruột (Castillo-Avila và cộng sự, 2005).
Các kết cấu của BCL-2 rất quan trọng trong việc tiến hành con đường tự hủy
của ty thể bằng cách điều hịa tính thấm của màng ty thể bên ngồi. Tăng tính thấm
của màng ty thể bên ngồi sẽ dẫn đến việc hình thành cytosolic của cytochrome c,
nhằm kích hoạt caspase-9 bắt đầu caspase để tạo ra quá trình tự hủy. Prodigiosin
được biết là tác nhân gây ra sự kích thích q trình tự hủy của protein BCL-2 BAX
trong tế bào MCF-7 (Soto-Cerrato và cộng sự, 2004). Tương tự như vậy, các nghiên
cứu cũng đã chứng minh trước đó undecylprodigiosin giảm sự ngăn chặn tự
hủy BCL-XL nhưng nâng kích thích tự hủy BIK, BIM, MCL-1S và NOXA (Ho và
cộng sự, 2007).
Survivin và XIAP là chất ức chế nội sinh của caspase. Survivin hoặc XIAP
cao sẽ tạo ra sự đề kháng, điều này rất phổ biến trong các tế bào ung thư (Schimmer
và cộng sự, 2006; Altieri, 2008). Một nghiên cứu trước đó của các tác giả thấy rằng

10


Đồ án tốt nghiệp

cả survivin và XIAP đều được giảm đi bởi sự có mặt của undecylprodigiosin trong
tế bào MCF-7 (Ho và cộng sự, 2007).
Ngừng chu kỳ tế bào: bên cạnh việc gây sự tự hủy của các tế bào ung thư,
prodigiosin cũng ngăn chặn sự phát triển ung thư bằng cách gây ra quá trình ngừng
chu kỳ tế bào ở nồng độ không gây độc cho tế bào. Để làm điều này,
undecylprodigiosin làm giảm sự phát triển của tế bào lympho T bằng cách ức chế
CDK4 và CDK2 (Songia và cộng sự, 1997). Tương tự như vậy, prodigiosin gây ra
ngừng tăng trưởng của các tế bào Jurkat tại quá trình chuyển đổi G1-S, bằng cách
giảm phosphoryl hóa Rb thơng qua sự ức chế hoạt động của kinase cyclin E-CDK2
và cyclin A-CDK2, cũng như bằng cách điều chỉnh p21CIP1/WAF1 và
p27KIP1 (Pérez-Tomás, và Montaner, 2003). Một nghiên cứu gần đây của SotoCerrato và cộng sự (Soto-Cerrato và cộng sự, 2007) đã cung cấp một cái nhìn sâu
sắc vào cách prodigiosin điều chỉnh p21CIP1/WAF1.
Chống sự xâm nhập và chống sự di căn: di căn là một nguyên nhân hàng đầu
dẫn đến sự tử vong do bệnh ung thư và làm tăng nhu cầu về thuốc chống
di căn. Những lợi ích chữa bệnh của prodigiosin đã được chứng minh trong một mơ
hình khối u ác tính ở chuột, bằng cách giảm sự di căn phổi (Zhang và cộng sự,
2005). Cơ chế hoạt động chống di căn của prodigiosin có thể là do tác dụng ức chế
của nó trên các tế bào di căn và xâm nhập, có thể thơng qua q trình
down-regulation của RhoA và matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) (Zhang và
cộng sự, 2005).
Tiềm năng gây độc tế bào của prodigiosin cũng đã nghiên cứu trong 60 dòng tế
bào tiêu chuẩn của các khối u ở người, có nguồn gốc từ phổi, ruột, thận,
buồng trứng, ung thư não, các khối u ác tính và bệnh bạch cầu. Ức chế tăng sinh tế
bào cũng như cảm ứng cho tế bào tự hủy đã được quan sát trong các dòng

tế bào (Chidambaram và Perumalsamy, 2009).

11


Đồ án tốt nghiệp

Ngồi ra, prodigiosin cũng được tìm thấy gây độc tế bào ung thư phổi và các tế
bào biểu mô kháng doxorubicin và biểu hiện tốt lên các protein đa kháng
thuốc (Lagostera và cộng sự, 2005).
1.2.3.3. Hoạt tính ức chế miễn dịch
Hoạt động ức chế miễn dịch của prodigiosin lần đầu tiên được mô tả
bởi Nakamura và cộng sự, họ đã cho thấy sự hiện diện của prodigiosin và
metacycloprodigiosin trong canh trường nuôi cấy vi khuẩn Serratia và quan sát sự
ức chế chọn lọc quá trình phát triên của các tế bào lympho T đa giá so với các tế
bào lympho B (Han và cộng sự, 2001). Sau đó, hoạt động ức chế miễn dịch đã được
chứng minh cho các chất tương tự prodigiosin khác như: undecylprodigiosin, cPrG,
MAMPDM, nonylprodigiosin,…
Bảng 1.3. Ảnh hưởng prodigiosin đến khả năng tồn tại của các tế bào miễn dịch
(Hwanmook và cộng sự, 2003)
Prodigiosin
(nM)
Đồi chứng

Thử nghiệm

Khả năng tồn tại (%)
Ngay thứ
nhất

Ngày thứ hai

Ngày thứ ba

0

93

79

77

3

96

86

79

10

89

82

79

30

89

70

81

100

82

70

70

300

68

14

18

1000

74

14

14

3000

61

9

8

10 000

32

4

4

30 000

4

4

4

12


Đồ án tốt nghiệp

1.3. Cơ chế sinh tổng hợp prodigiosin

1.3.1. Điều kiện tổng hợp prodigiosin
Helvia và cộng sự (2010), đã tối ưu hóa q trình sản xuất proodigiosin
bởi Serratia marcescens UCP 1549 bằng việc sử dụng 6% nước thải từ công nghiệp
chế biến sắn và bổ sung 2% mannitol ở 28oC và pH =7 trong 48 giờ. Kết quả cho
thấy Serratia marcescens sản xuất prodigiosin ở mức cao nhất là 49,5 g/l.
Antony và cộng sự (2011), đã thực hiện quá trình tối ưu hóa sản xuất
prodigiosin bởi Serratia marcescens SU-10 và đánh giá các hoạt tính sinh học của
prodigiosin. Kết quả cho thấy điều kiện tối ưu cho việc sản xuất prodigiosin trong
môi trường Nutrient broth là ở nhiệt độ 28oC, pH = 7 và trong thời gian 72 giờ. Và
quá trình chiết xuất prodigiosin được thực hiện bằng ethanol: hydrochloric
acid (9,5: 0,5) hoặc acetone: ethyl acetate (1:1). Ngoài ra, prodigiosin thu nhận
được có tác dụng ức chế tốt ở cả vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm.
Chandni và cộng sự (2012), đã nhận thấy rằng prodigiosin có khả năng kháng
khuẩn như Staphylococcus aureus, Bacillus cereus và kháng nấm bệnh như
Candida albicans,

Candida parapsilosis

và

Cryptococcus

sp., hơn nữa,

prodigiosin có khả năng chống oxy hóa ở nồng độ 22,05 μg/ml và có tiềm năng
nhuộm, cùng với việc không bị ảnh hưởng bởi acid, kiềm , chất tẩy rửa, mà có thể
ứng dụng rộng rãi trong ngành dệt và các ngành công nghiệp trị liệu.
Shahitha và Poornima (2012), đã tiến hành cải tiến quá trình sản xuất
prodigiosin trong Serratia marcescens. Họ nhận thấy rằng trong số các mơi
trường dầu khác nhau thì dầu đậu phộng sản xuất prodigiosin cao nhất (2,72

mg/ml) và có thể sử dụng để nhuộm bông tạo ra màu đẹp.
San và cộng sự (2012), đã sử dụng chất thải chế biến thủy sản như một nguồn
carbon và nitơ để sản xuất prodigiosin từ Serratia marcescens TKU011. Hơn nữa,
nghiên cứu của các tác giả này cũng cho thấy prodigiosin có khả năng diệt
côn trùng.
Nghiên cứu của Ananda và cộng sự (2013) đã sử dụng prodigiosin thu nhận từ
chủng Serratia marcescens CMST 07 để chống lại các vi khuẩn như Alteromonas

13


Đồ án tốt nghiệp

sp. và Gallionella sp., cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu là khoảng 6,75 μg/ml và
nồng độ diệt khuẩn tối thiểu là khoảng 12,5 μg/ml. Bên cạnh đó, Ananda và cộng sự
cũng đã sử dụng prodigiosin để nghiên cứu độc tính trên Artemia cho thấy
LD50 khoảng 50 μg/ml.
1.3.2. Cơ chế tổng hợp prodigiosin
Các gene sinh tổng hợp prodigiosin trong Serratia nằm trong một operon
lớn. Cấu tạo của các gene sinh tổng hợp prodigiosin (pig) trong Serratia sp.
ATCC 39.006 (Serratia 39.006) và trong chủng Serratia marcescens, ATCC
274 (Sma 274) đã được báo cáo (Cerdeno và cộng sự, 2001).
Prodigiosin được hình thành

qua hai giai đoạn:

2-methyl-3-amylpyrrole

(MAP) và 4-methoxy-2, 2'-bipyrrole-5-carboxyaldehyde (MBC), tạo nên dẫn
xuất tripyrrole, được gọi là 2-methyl-3-amyl-6-methoxyprodigiosene. Có rất ít

thơng tin về con đường sinh tổng hợp ở giai đoạn MAP hoặc MBC, ngoại trừ
việc mô tả về phân tử proline kết hợp nguyên vẹn thành một trong những nhóm
pyrrole của MBC. Q trình tổng hợp sắc tố này cần có khơng khí và phân tử oxy
(Williams và Qadri, 1980).

Hình 1.3. So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) tử Serratia ATCC
39.600, Sma 274 và các cụm sinh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) tử
Streptomyces coelicolor A3(2) (Cerdeno và cộng sự, 2001).
Prodigiosin là một chất rất dễ dàng để thực hiện thử nghiệm trong các
chất chuyển hóa của Serratia marcescens và có thể hữu ích đối với việc nghiên cứu

14


Đồ án tốt nghiệp

một hệ thống mơ hình các cơ chế biểu hiện của chất chuyển hóa thứ cấp trong vi
khuẩn. Tách các phân tử tái tổ hợp mã hóa cho quá trình tổng hợp prodigiosin sẽ là
một cách tiếp cận để xác định sản phẩm gene và sự hiểu biết về enzymology và di
truyền học của quá trình sinh tổng hợp prodigiosin. Việc tách trình tự của DNA mã
hóa một phần trong quá trình tổng hợp prodigiosin bằng cách sử dụng hệ thống
nhân bản vector ở Escherichia coli cosmid đã được báo cáo (Dauenhauer và cộng
sự, 1984).
Cụm gene tổng hợp sắc tố của Serratia spp. ATCC 39.006 được biểu hiện
trong Erwinia carotovora sub sp. carotovora (25 chủng trong số 36 chủng thử
nghiệm), mặc dù nó đã khơng được biểu hiện trong một số chủng vi khuẩn
khác thuộc Enterobacteriaceae, bao gồm cả Escherichia coli (Thomson và
cộng sự, 2000). Trong Serratia ATCC 39.006 tổng hợp prodigiosin được quy định
bởi nhiều yếu tố, bao gồm hệ thống quorum-sensing, thông qua các đồng đẳng
LuxIR, SmaI và SmaR (Thomson và cộng sự, 2000; Slater và cộng sự, 2003). Điều

thú vị là việc sản xuất prodigiosin tạo thành N-(3 oxohexanoyl)-L-homoserine
lacton (OHHL) tùy thuộc vào sự biểu hiện trong Erwinia carotovora sub sp.
carotovora, mặc dù sau này, việc sản xuất một phân tử tín hiệu khác đã được thực
hiện bởi Serratia 39.006 (Thomson và cộng sự, 2000).
Nhóm sắc tố Serratia được quy định bởi 14 gene chung cho cả Serratia
và Streptomyces coelicolor và được bố trí trong pigA đến pigN, trong đó có năm
gene tổng hợp MBC (màu đỏ) và bốn gene tổng hợp MAP (màu xanh), được mơ
tả ở hình 1.4. Bốn gene cịn lại khơng có vai trị tổng hợp, tuy nhiên, có một protein
cịn lại (PigL) tham gia vào q trình hậu dịch mã của một số protein trong phức
hợp. Thứ tự gene của hai loài Serratia khác nhau là khác nhau và 14 protein thể
hiện kích thước và trình tự amino acid khác nhau giữa các loài (Cerdeno và
cộng sự, 2001).
1.3.3. Yếu tố ảnh hưởng đến tổng hợp prodigiosin
Prodigiosin là một chất chuyển hóa thứ cấp điển hình chỉ xuất hiện sau giai
đoạn phát triển của vi khuẩn (Harris và cộng sự, 2004). Bản chất màu đỏ tươi

15


Đồ án tốt nghiệp

của prodigiosin giúp việc nghiên cứu hợp chất thứ cấp này dễ

dàng hơn

(Chidambaram và Perumalsamy, 2009). Nhiều yếu tố, chẳng hạn như: nhiệt độ, pH,
độ oxy hòa tan, ánh sáng, phosphate vô cơ và thành phần môi trường ảnh hưởng
đến quá trình sản xuất prodigiosin (Heinemann và cộng sự, 1970; Sole và cộng sự,
1994; Rjazantseva và cộng sự, 1995; Williamson và cộng sự, 2005).
Quá trình sản xuất prodigiosin trong Serratia marcescens rất nhạy cảm với

nhiệt độ và bị ức chế đáng kể ở nhiệt độ cao hơn 37°C (Giri và cộng sự, 2004).
Hơn nữa, môi trường thông thường được sử dụng để sinh tổng hợp prodigiosin bởi
các chủng Serratia marcescens là môi trường phức tạp và rất giàu dinh dưỡng
(Yamashita và cộng sự, 2001; Furstner, 2003; Giri và cộng sự, 2004). Một số chất
dinh dưỡng như thiamine và acid sắt (Wei và Chen, 2005) đặc biệt quan
trọng đối với sản xuất prodigiosin, trong khi phosphate (Witney và cộng sự,
1977), adenosine triphosphate và ribose (Lawanson và Sholeye, 1975) lại có
tác dụng ức chế sản lượng prodigiosin.

Hình 1.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp prodigiosin bởi
Serratia marcescens (Sundaramoorthy và cộng sự, 2009)
Giri và cộng sự (2004), đã so sánh sự phát triển của Serratia marcescens trên
các môi trường khác nhau như: môi trường hạt mè, nutrient broth và peptone
glycerol broth,... Các môi trường cũng được so sánh tốc độ tăng trưởng và khả
năng xuất prodigiosin ở các nhiệt độ khác nhau. Các thí nghiệm này cũng giúp quan

16


Đồ án tốt nghiệp

sát vai trò của các acid béo trong việc sản xuất prodigiosin và nhận thấy nhiều
thành phần trong hạt có thể kích thích tăng mật độ tế bào và sinh tổng hợp nhiều
prodigiosin hơn. Trên môi trường peanut broth thì prodigiosin có thể tổng hợp ở
nhiệt độ 37oC trong khi trên các môi trường như nutrient broth, peptone
glycerol broth có hoặc khơng có bổ sung đường cũng khơng thể làm được
điều này (Chidambaram và Perumalsamy, 2009).
Q trình sản xuất prodigiosin ở Serratia marcescens giảm bởi glucose và các
loại đường metabolizable khác do sự giảm pH trong canh trường ni cấy
Khanafari và cộng sự, 2006). Bên cạnh đó, có thể xét đến vai trị của nguồn carbon

trong q trình sản xuất sắc tố. Điểm đầu tiên là trong nutrient broth, về cơ bản là
mơi trường này khơng có nguồn carbon, việc bổ sung maltose hoặc glucose
làm tăng cường việc sản xuất sắc tố, trong trường hợp sử dụng mơi trường sesame
broth thì nguồn carbon ở dạng các acid béo. Maltose và glucose được thêm vào
nutrient broth làm tăng gấp đôi năng suất so với chỉ sử dụng môi trường nutrient
broth hoặc peptone glycerol broth. Điểm thứ hai là sự sản xuất sắc tố được tăng
cường trong môi trường peptone glycerol broth ở 30oC và trong nutrient broth ở
28oC, điều này có thể là do sự hiện diện của glycerol như là một nguồn carbon. Rõ
ràng trong thực tế nguồn carbon giúp hỗ trợ tăng trưởng tế bào và sản xuất
prodigiosin (Chidambaram và Perumalsamy, 2009).
Ngoài ra, một báo cáo đã chứng minh việc bổ sung silicagel vào môi trường
lỏng của Serratia marcescens cũng dẫn đến sự tăng trưởng tế bào, sản xuất
prodigiosin và serrawettin (Yamashita và cộng sự, 2001). Hơn nữa, prodigiosin
thường nằm trên màng tế bào, việc bổ sung các chất hoạt động bề mặt chẳng hạn
như SDS vào mơi trường ni cấy cũng có thể nâng cao hiệu quả sản xuất
prodigiosin (Feng và cộng sự, 1982; Wei và Chen, 2005).

17


Đồ án tốt nghiệp

Bảng 1.4. So sánh quá trình tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens trong các
môi trường và các nhiệt độ khác nhau ( Chidambaram và Perumalsamy, 2009).
STT

1

Môi trƣờng sử dụng

Nhiệt độ

Tác giả

280C

300C

370C

13,0

-

-

Môi trường dextrose bổ sung
casein

Pruss and
Matsummura,
1996

2

Ethanol và nguồn carbon

3,0

-

-

Mandarville,
2001

3

Canh dinh dưỡng

0,52

0,354

0,111

Giri and cs, 2004

4

Cang pepton glycerol

0,302

0,569

0,111

Giri and cs, 2004

5

Môi trường hạt mè

16,68

9,3

0,319

Giri and cs, 2004

6

Canh dinh dưỡng bổ sung 0,5%

1,836

0,79

0,104

Giri and cs, 2004

1,698

0,29

0,104

Giri and cs, 2004

9,43

8,56

1,63

Giri and cs, 2004

1,47

1,16

0,42

Giri and cs, 2004

maltose
7

Canh dinh dưỡng bổ sung 0,5%
glucose

8

Môi trường hạt mè bổ sung
0,5% maltose

9

Môi trường hạt mè bổ sung
0,5% glucose

10

Môi trường dầu mè

0,767

1,006

0,107

Giri and cs, 2004

11

Môi trường hạt đậu phộng

38,75

25,98

1,49

Giri and cs, 2004

12

Môi trường dầu đậu phộng

2,89

0,559

0,111

Giri and cs, 2004

13

Môi trường từ dừa

1,94

1,39

0,1736

Giri and cs, 2004

14

Môi trường dầu dừa

1,42

0,05

0,117

Giri and cs, 2004

Prodigiosin được phân lập từ Serratia marcescens. Hiển thị kháng khuẩn, chống
ung thư, gây độc tế bào, ức chế miễn dịch, và chống các hoạt động đào thải trong
quá trình cấy ghép . Prodigiosin gây ra ức chế trong tế bào ung thư máu và các tế
bào có nguồn gốc từ các loại ung thư khác của con người, bao gồm cả dạ dày và đại

18


Đồ án tốt nghiệp

tràng khơng có độc tính đáng kể trong các dịng tế bào ác tính. Vì vậy, prodigiosin
được sản xuất mang tính thương mại trên tồn thế giới, điều đó được thể hiện trong
bảng 1.5.
Bảng 1.5. Giá trị thương mại prodigiosin trên thế giới (Santa Cruz Biotechnology,
Merck Millipore, Biovision incorporated)

ST

GÍA THÀNH

T

SẢN PHẨM

ĐỘ
TINH

THƠNG SỐ KỸ THUẬT

ỨNG DỤNG

SẠCH
Hoạt động như
- Độ hòa tan : DMSO hoặc

95 $/ 250 𝜇g

Ethanol

= 2000000
1

VNĐ/ 250 𝜇g

≥ 95%

355 $/ 1 mg =

HPLC

7100000 VNĐ/

- Nhiệt độ lưu trữ: -200C
- Điều kiện vận chuyển : gói gel,
tránh khơng khí ánh sáng.
- Dạng thành phẩm: rắn màu đỏ

1mg

đậm

một mTORC1
và mRTOC2
ức chế chất
phát triển phức
tạp. Chỉ sử
dụng cho
nghiên cứu,
không sử dụng
cho người

- Trạng thái vật lý: rắn
- Có nguồn gốc từ: Serratia
marcescens
349 $/500 𝜇g
2

= 6980000

- Độ hòa tan: Hòa tan trong
>95%

VNĐ/ 500 𝜇g

ethanol, methanol, DMF hoặc
DMSO. Tan trong nước hạn chế

- Bảo quản: ở nhiệt độ -20°C
- Điểm nóng chảy: 151-152ºC

3

159 GBP/200 𝜇g

>95%

- Nguồn: marcescens Serratia

19

Hoạt động như
một kháng
sinh. Chỉ sử
dụng cho
nghiên cứu,
không sử dụng
cho điều trị ở
người.
Một ứng dụng


Đồ án tốt nghiệp

= 3975000

HPLC

VNĐ/ 200 𝜇g

- Xuất hiện: rắn, màu đỏ đậm

hợp chất tế

- Lưu trữ dài hạn: -20 ° C

bào thẩm thấu

- Độ hịa tan: Hịa tan trong

có hiển thị ức

ethanol, methanol, DMF hoặc

chế miễn dịch

DMSO. Tan trong nước hạn chế.

và chống khối

- Đóng gói khí trơ

u đặc tính
khơng phân
biệt tình trạng
p53 và kháng
đa thuốc.

1.3.4. Thu nhận, tinh sạch và định lượng prodigiosin
1.3.4.1. Thu nhận và tinh sạch
Các sắc tố không tan trong nước mà tan trong dầu thường được chiết xuất bằng
dung môi hữu cơ pha nước như: acetone, methanol, ethanol, hoặc các hỗn hợp của
các dung môi, để giúp các dung môi này hoạt động tốt hơn. Chiết xuất thường có
chứa một lượng nước đáng kể, do đó, có thể được loại bỏ bằng cách phân lớp nhờ
hexane, petroleum ether, diethyl ether, dichloromethane hoặc hỗn hợp các
dung môi. Sắc ký, quang phổ hấp thụ ở vùng khả kiến là cơ sở đầu tiên dùng để
xác định các chất màu. Quang phổ sẽ được thực hiện, lưu giữ và sau đó tiến hành so
sánh với các phổ chuẩn (Amaya. 2001).
Các tiêu chuẩn tối thiểu sau đây được đề xuất là nên thực hiện để xác định một
hợp chất chưa biết (Liaaen-Jensen, 1971; Pfander và cộng sự, 1994).
- Phổ khả kiến (𝜇max ).
- Sắc ký lớp mỏng (Rf).
- Sắc ký lỏng cao áp (thời gian lưu mẫu).
- Phương pháp phổ khối (khối lượng phân tử).

20


Đồ án tốt nghiệp

- NMR (chuyển hóa về mặt hóa học).
Các nhà khoa học đã thực hiện nhiều nghiên cứu về quá trình thu nhận và tinh
sạch prodigiosin như sau:
- Prodigiosin (2-metyl-3-pentyl-6 methoxyprodigiosene) được chiết xuất từ
môi trường nutrient broth nuôi cấy Serratia marcescens sau 72 giờ, với ethanol và
petroleum ether, tiếp theo loại bỏ dung môi trong một cốc nước sơi (hay trong một
bể cách thủy) và hịa tan phần còn lại vào 50% ethanol (Rosenzweig và Stotzky,
1980).

- Các sắc tố từ tế bào của Serratia marcescens phân lập từ đất được chiết
xuất bằng acetone, hịa với một ít ethyl acetate, và được sấy khô bằng natri sulfat.
Các chất chiết xuất được hòa tan và được thực hiện quét từ bước sóng 200 – 700
nm. Hỗn hợp dung mơi dichloromethane, chloroform và acetone với tỷ lệ 2,5: 2,5:
0,5 đã được sử dụng để tách một cách hiệu quả các tạp chất từ chiết xuất cùng với
các sắc tố bằng sắc ký lớp mỏng. Cột silicagel có kích thước từ 80 – 100 mesh đã
được sử dụng để phân tách các tạp chất không màu từ các sắc tố. Mẫu tinh khiết
cho thấy có độ hấp thụ cao duy nhất tại 535 nm trong quang phổ UV. Nó được tiếp
tục phân tích để xác định trọng lượng phân tử bằng việc sử dụng máy quang phổ
khối. Các sắc tố prodigiosin tinh khiết được đem phân tích quang phổ khối cho
thấy chúng có trọng lượng phân tử là 324 Da (Giri và cộng sự, 2004).
- Prodigiosin được chiết xuất bằng cách lắc môi trường nuôi cấy tế bào
Serratia marcescens 2170 với methanol có tính acid (1ml dung dịch HCl 1N: 24ml
methanol) và dịch trong suốt được làm cho bay hơi trong chân không. Sắc ký lỏng
cao áp của các chiết xuất được thực hiện trên silicagel với dung môi chloroform và
methanol. Các sắc tố thu được sẽ được rửa giải trong methanol và phân tích
bởi phương pháp phổ khối (ESI-MS). Sau đó, các sắc tố chưa tinh khiết đã thu
được sẽ tiếp tục được thực hiện phương pháp HPLC. Một cột đảo pha Nucleosil
C18 (250x4 mm, 10 vm) đã được sử dụng với một gradient tuyến tính 0% đến
100% trong 30 phút (A: 10mM amoni acetate, pH 7,0, B: 100% acetonitrile). Việc

21


Đồ án tốt nghiệp

rửa giải được theo dõi bằng cách sử dụng cả hai máy dò UV diode-array và ESI-MS
(Montaner và Perez-Tomas, 2001; Tomas và Montaner, 2003).
- Sau khi lên men Serratia marcescens phân lập từ đất, canh trường được lấy
từ những chất hấp thụ trong bioreactor (IAB) và sau đó, 1 lít ethanol 95% (v/v) đã

acid hóa (pH 3,0) được thêm vào IAB. Các sắc tố được chiết xuất bằng
cách sử dụng một vòng tròn giải hấp impller trong IAB, ở 200 vịng trong 5 giờ,
rồi đem cơ đặc và ly tâm. Sau đó, nó được thu bằng cách sử dụng nước và
chloroform để tách pha. Prodigiosin màu đỏ đi vào chiếm hết chỗ ở phía dưới của
pha chloroform và được cô đặc bằng cách cho bốc hơi. Prodigiosin được phân tách
bằng sắc ký cột silicagel (2,5 × 30 cm). Nó được rửa với một hỗn hợp hexane: ethyl
acetate (2: 1, v/v). Các sắc tố cô đặc đã được tách ra bởi việc sử dụng hỗn
hợp chloroform: methanol 95:5 (v/v) trong TLC. Sau đó, màu đỏ duy nhất của
prodigiosin (giá trị Rf là 0,43) đã được thu nhận và hòa tan trong acetone. Các sắc
tố chưa tinh khiết sẽ tiếp tục được thực hiên phương pháp TLC (với tỷ lệ
dung môi chloroform: methanol: diethyl ether là 6: 2: 2), và cuối cùng là tinh chế
bằng HPLC (với cột C18 (2,5×10 cm)). Sau đó, nó được tách rửa với hỗn hợp
methanol: nước (7:3, v/v) đã được điều chỉnh pH= 3,0 bằng 0,1N HCl với tốc độ
dòng chảy là 20 ml/ phút. Một lưới thép khơng gỉ lớn với kích thước lỗ 0,5 cm đã
được sử dụng như sự hỗ trợ cho chất hấp phụ bên trong. Nồng độ

của các

prodigiosin đỏ sản xuất ra được ước tính bằng cách đo độ hấp thụ ở 535 nm sử
dụng chùm quang phổ tia UV khả kiến trong methanol đã được acid hóa
(0,01N HCI 4ml + 96ml methanol) (Goldschmidt và Williams, 1968). Khối
lượng phân tử của chất màu tinh khiết được xác định bằng việc sử dụng quang phổ
khối. Các 1H- và 13C-NMR của các mẫu màu được ghi nhận sau khi hòa tan trong
CDCl3. Các dịch chuyển hóa đã được đối chiếu trong một TMS (trimetylsilyl)
tín hiệu. Phổ FT-IR của các sắc tố được ghi nhận (Song và cộng sự, 2006).
1.3.4.2. Định lượng
Mẫu tinh khiết của prodigiosin cho thấy nó có độ hấp thụ cao và duy nhất
tại bước sóng 535nm trong quang phổ UV (Giri và cộng sự, 2004). Chính vì vậy,

22