luận án tiến sĩ nghiên cứu xây dựng và phát triển phương pháp phân tích một số chất kích thích tăng trưởng (auxin, gibberellin, cytokinin) trong rau xanh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

LÊ VĂN NHÂN

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÀ PHÁT TRIỂN
PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MỘT SỐ CHẤT KÍCH
THÍCH TĂNG TRƢỞNG (AUXIN, GIBBERELLIN,
CYTOKININ) TRONG RAU XANH

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hà Nội, 2021


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
----------------------------LÊ VĂN NHÂN

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÀ PHÁT TRIỂN
PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MỘT SỐ CHẤT KÍCH THÍCH
TĂNG TRƢỞNG (AUXIN, GIBBERELLIN, CYTOKININ)
TRONG RAU XANH
Chun ngành: Hóa phân tích
Mã số: 9.44.01.18

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
1. PGS. TS. Nguyễn Quang Trung
2. TS. Vũ Đức Nam


Hà Nội, 2021


i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề

tài Luận án “Nghiên cứu xây dựng và phát triển số

phương pháp phân tích một chất kích thích tăng trưởng (auxin, gibberellin,
cytokinin) trong rau xanh” là do tôi thực hiện với sự hƣớng dẫn của PGS. TS
Nguyễn Quang Trung và TS. Vũ Đức Nam. Các kết quả nghiên cứu trong luận án là
trung thực, không trùng lặp và sao chép với bất kỳ công trình khoa học nào khác.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2021

Nghiên cứu sinh

Lê Văn Nhân

ii
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện đề tài luận án, nghiên cứu
sinh đã nhận đƣợc sự hỗ trợ và giúp đỡ từ nhiều cá nhân và tập thể; nghiên cứu sinh
rất trân trọng và biết ơn sự hỗ trợ và giúp đỡ này.
Trƣớc hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành và sâu sắc đến thầy giáo
PGS. TS. Nguyễn Quang Trung, ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn, động viên khích lệ,
dành nhiều thời gian trao đổi và định hƣớng cho tôi trong q trình nghiên cứu và
thực hiện luận án.
Tơi xin chân thành cảm ơn thầy giáo TS. Vũ Đức Nam, ngƣời luôn quan
tâm, nhắc nhở, hƣớng dẫn và động viên tôi sớm hồn thành luận án.
Tơi xin chân thành cảm ơn Trung tâm Nghiên cứu và Chuyển giao Công
nghệ đã tạo điều kiện về mặt thời gian, cơ sở vật chất, trang thiết bị phục vụ cho
việc nghiên cứu và thực hiện luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn Học viện Khoa học và Cơng nghệ đã mời các
giảng viên có nhiều kinh nghiệm và kiến thức chuyên sâu giảng dạy cho các nghiên
cứu sinh cũng nhƣ bố trí thời gian học tập linh hoạt và phổ biến các thông tin kịp
thời tới nghiên cứu sinh.
Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị em bạn bè, đồng nghiệp đã động viên,
khích lệ, cổ vũ và giúp đỡ tơi trong q trình thực hiện và hồn thành luận án.
Con xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới cha mẹ, vợ, con, các anh chị em
và ngƣời thân đã luôn động viên, khích lệ và cổ vũ con hồn thành chƣơng trình
đào tạo nghiên cứu sinh.
Xin chân thành cảm ơn!
Nghiên cứu sinh

Lê Văn Nhân

iii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN......................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN........................................................................................................... ii
MỤC LỤC...............................................................................................................iii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT...........................................vii
DANH MỤC BẢNG................................................................................................ ix
DANH MỤC HÌNH................................................................................................... x
MỞ ĐẦU...................................................................................................................1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN.....................................................................................3
1.1. Khái niệm chất kích thích sinh trƣởng thực vật.............................................3
1.2. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật.......3
1.2.1. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm auxin.....................3
1.2.2. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm gibberellin.............6
1.2.3. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm cytokinin...............7
1.3. Vai trị chức năng của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật.....................9
1.3.1. Vai trị chức năng của các chất thuộc nhóm auxin...................................9
1.3.2. Vai trị chức năng của các chất thuộc nhóm gibberellin.........................10
1.3.3. Vai trị chức năng của các chất thuộc nhóm cytokinin...........................11
1.4. Các nghiên cứu về tác dụng của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật. . .11
1.4.1. Các nghiên cứu về tác dụng của các chất thuộc nhóm auxin.................11
1.4.2. Các nghiên cứu về tác dụng của các chất thuộc nhóm gibberellin........14
1.4.3. Các nghiên cứu về tác dụng của các chất thuộc nhóm cytokinin...........15
1.5. Các nghiên cứu về dƣ lƣợng của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật .. 17

1.6. Các phƣơng pháp phân tích các chất kích thích sinh trƣởng thực vật..........18
1.6.1. Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu................................................................... 18
1.6.1.1. Thu thập mẫu................................................................................. 19
1.6.1.2. Chiết tách....................................................................................... 19

1.6.1.3. Làm sạch và tinh chế mẫu.............................................................. 19
1.6.2. Phƣơng pháp phân tích......................................................................... 20
1.6.2.1. Phương pháp phân tích các hợp chất auxin................................... 21
1.6.2.2. Phương pháp phân tích các hợp chất gibberellin...........................22
1.6.2.3. Phương pháp phân tích các hợp chất cytokinin.............................23
CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................25
2.1. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất thí nghiệm...................................................... 25


iv
2.1.1. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm.............................................................. 25
2.1.2. Hóa chất thí nghiệm.............................................................................. 25
2.1.2.1. Hóa chất......................................................................................... 25
2.1.2.2. Chuẩn bị dung dịch chuẩn............................................................. 26
2.2. Đối tƣợng nghiên cứu.................................................................................. 26
2.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu........................................................................... 26
2.2.2. Đối tƣợng phân tích.............................................................................. 27
2.2.3. Thu thập mẫu........................................................................................ 27
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu............................................................................. 28
2.3.1. Phƣơng pháp khảo sát các điều kiện tối ƣu của quy trình phân tích.....28
2.3.1.1. Phương pháp khảo sát điều kiện khối phổ..................................... 28
2.3.1.2. Phương pháp khảo sát điều kiện sắc ký lỏng.................................28
2.3.2. Phƣơng pháp khảo sát điều kiện xử lý mẫu.......................................... 30
2.3.3. Phƣơng pháp xây dựng và xác nhận giá trị sử dụng của quy trình phân
tích.................................................................................................................. 32
2.3.4. Phƣơng pháp đánh giá dƣ lƣợng các chất kích thích sinh trƣởng thực vật
trong các mẫu rau thu thập tại Hà Nội............................................................. 35

2.3.5. Phƣơng pháp đánh giá ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng thực
vật đến sự phát triển của một số loại rau và mức độ tích lũy của chúng..........36

2.3.5.1. Bố trí thí nghiệm............................................................................ 36
2.3.5.2. Phương pháp đánh giá sự ảnh hưởng của chất kích thích sinh
trưởng thực vật đến sự phát triển của các loại rau..................................... 38
2.3.5.3. Phương pháp đánh giá sự tích lũy của chất kích thích sinh trưởng
thực vật trong các loại rau.......................................................................... 38
2.3.6. Phƣơng pháp xử lý số liệu.................................................................... 39
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN................................. 40
3.1. Khảo sát các điều kiện tối ƣu của quy trình phân tích các chất kích thích sinh
trƣởng thực vật trong rau.................................................................................... 40
3.1.1. Khảo sát điều kiện phân tích khối phổ.................................................. 40
3.1.1.1. Khảo sát mức năng lượng phân mảnh của các ion........................40
3.1.1.2. Khảo sát các hướng phân mảnh của các chất KTST......................45
3.1.1.3. Khảo sát các thơng số của nguồn ion hóa...................................... 56
3.1.2. Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng.............................................................. 57
3.1.2.1.Khảo sát cột phân tích và dung mơi pha động................................ 57
3.1.2.2. Khảo sát chế độ gradient của pha động......................................... 66


v
3.2. Tối ƣu hóa điều kiện xử lý mẫu................................................................... 69
3.3. Xây dựng và xác nhận giá trị sử dụng của quy trình phân tích.....................74
3.3.1. Xây dựng quy trình phân tích đồng thời các chất kích thích sinh trƣởng
thực vật trong các mẫu rau.............................................................................. 74
3.3.2. Xác nhận giá trị sử dụng của quy trình phân tích.................................. 77
3.3.2.1. Đánh giá độ ổn định của chu kỳ đông/rã đông mẫu.......................77
3.3.2.2. Đường chuẩn, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng.............79
3.3.2.3. Ảnh hưởng của nền mẫu................................................................ 81
3.3.2.4. Hiệu suất thu hồi và độ chính xác của phương pháp phân tích......83
3.3.2.5. So sánh với một số phịng thí nghiệm............................................. 86
3.4. Kết quả đánh giá hiện trạng dƣ lƣợng các chất kích thích sinh trƣởng thực

vật trong các mẫu rau thu thập tại Hà Nội........................................................... 89
3.4.1. Số lƣợng mẫu rau phát hiện chứa các chất kích thích sinh trƣởng thực
vật................................................................................................................... 89
3.4.2. Số lƣợng chất kích thích sinh trƣởng thực vật phát hiện đƣợc trong các
mẫu rau cải xanh............................................................................................. 90
3.4.3. Hàm lƣợng các chất kích thích sinh trƣởng thực vật phát hiện đƣợc
trong các mẫu rau cải xanh.............................................................................. 91
3.4.4. Sự tồn dƣ nhiều hợp chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong mẫu rau
cải xanh ở các khu vực nghiên cứu................................................................. 93
3.5. Đánh giá ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng thực vật đến sự phát
triển của một số loại rau và mức độ tích lũy của chúng....................................... 97
3.5.1. Ảnh hƣởng của GA3 đến sự phát triển của một số loại rau xanh..........97
3.5.1.1. Ảnh hưởng của GA3 đến sự phát triển của rau cải xanh................97
3.5.1.2. Ảnh hưởng của GA3 đến sự phát triển của rau mồng tơi.............100
3.5.1.3. Ảnh hưởng của GA3 đến sự phát triển của rau xà lách................102
3.5.2. Sự tích lũy của GA3 trong một số loại rau...........................................105
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...............................................................................110
ĐIỂM MỚI CỦA LUẬN ÁN................................................................................111
DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ......................................................112
TÀI LIỆU THAM KHẢO.....................................................................................114
PHỤ LỤC..............................................................................................................128
PHỤ LỤC 1. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG CÁC CHẤT KÍCH
THÍCH SINH TRƢỞNG THỰC VẬT TRONG RAU..........................................128
PHỤ LỤC 2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT CHẾ ĐỘ GRADIENT..............................133


vi
PHỤ LỤC 3. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỐI CHỨNG Ở CÁC PTN.....................139
PHỤ LỤC 4. ĐƢỜNG CHUẨN CỦA GA3 TRÊN CÁC NỀN MẪU RAU THÍ
NGHIỆM............................................................................................................... 144

PHỤ LỤC 5. MỘT SỐ HÌNH ẢNH TRONG NGHIÊN CỨU..............................145


vii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu
2,4,5-T

2,4,5-Trichloro

2,4-D

2,4-Dichloroph

4-CI-IAA

4-Chloroindole

AIA

β-Indolyaxetic

APCI

Atmospheric P

BA

N6-Benzylade

Ctv

Et al.

DHZR

Dihydrozeatin

EI

Electron Ioniza

ELISA

Enzym Link Im

ESI

Electrospray Io

FLD

Flourescence D

GA1

Gibberellin A1

GA3

Gibberellin A3

GA4

Gibberellin A4

GA7

Gibberellin A7

GAs

Gibberellin

GC

Gas Chromato

HPLC

High Performa

IAA

Indole-3-acetic

IBA

Indole-3-butyr

ICA

Indole-3-carbo

iP

N6-Isopenteny

IPA

Indole-3-propi

iPR

Isopentenylade

IT MS

Ion Trap Mass

K

Kinetin

KTST

Plant growth s

LFMCE

Leaf-Ferrocene
Electrode
Multiple React

MRM


viii
MS

Mass Spectrom

NanoESI

Nano-Electros

PAA

Phenylacetic a

PGR

Plant Growth R

QQQ MS

Triple Quadrup

RIA

Radioimmunoa

SIM

Selected Ion M

SRM

Selected React

TDZ

Diphenylurea,

TOF-MS

Time-of-Flight

tZ

Trans-zeatin

tZR

Trans-zeatin R

UPLC

Ultra Performa

Z

Zeatin

α-NAA

α-naphthalenea

(Chú thích: Tên hóa chất trong luận án đƣợc viết theo tên tiếng Anh)


ix
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm auxin.......................5
Bảng 1.2. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm gibberellin...............7
Bảng 1.3. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm cytokinin.................9
Bảng 1.4. Một số nghiên cứu về tác dụng của auxin đối với các loại cây trồng......13
Bảng 1.5. Một số nghiên cứu về tác dụng của gibberellin đối với các loại cây trồng
14
Bảng 1.6. Một số nghiên cứu về tác dụng của cytokinin đối với các loại cây trồng 16
Bảng 3.1. Các điều kiện tối ƣu hóa của khối phổ trong phân tích các chất KTST .. 42

Bảng 3.2. Các thơng số của nguồn ion đƣợc tối ƣu hóa.......................................... 56
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát gradient của pha động.................................................. 67
Bảng 3.4. Điều kiện gradient tối ƣu sử dụng phân tích các chất KTST trong rau
xanh......................................................................................................................... 68
Bảng 3.5. Diện tích píc của các chất KTST và độ ổn định của chu kỳ đông/ rã đông
78
Bảng 3.6. Đƣờng chuẩn, giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp

phân tích.................................................................................................................. 81
Bảng 3.7. Độ lặp lại và độ thu hồi của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật.....84
Bảng 3.8. Kết quả so sánh với một số phịng thí nghiệm đối với mẫu 10 ng.mL -1.. 86
Bảng 3.9. Kết quả so sánh với một số phịng thí nghiệm đối với mẫu 100 ng.mL -1 87

Bảng 3.10. Kết quả so sánh với một số phịng thí nghiệm đối với mẫu 1000 ng.mL-1
88
Bảng 3.11. Số lƣợng các chất KTST phát hiện đƣợc trong các mẫu rau cải xanh .. 90
Bảng 3.12. Hàm lƣợng của các KTST phát hiện đƣợc trong các mẫu rau cải xanh 92


x
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của các chất thuộc nhóm auxin......................................3
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của các chất thuộc nhóm gibberellin..............................6
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của các chất thuộc nhóm cytokinin................................8
Hình 2.1. Quy trình tách chiết và phân tích các hoocmon thực vật trong mẫu cây
thuộc Họ Cải theo nghiên cứu của Xiangqing và cộng sự....................................... 30
Hình 2.2. Các khu vực nghiên cứu và thu thập mẫu rau.......................................... 35
Hình 2.3. Thuốc kích thích sinh trƣởng thực vật Gibber4TB.................................. 37
Hình 2.4. Mơ hình thí nghiệm đánh giá sự tích lũy của chất kích thích sinh trƣởng
thực vật trong một số loại rau xanh......................................................................... 37
Hình 3.1. Kết quả khảo sát năng lƣợng phân mảnh ion của các chất KTST............41
Hình 3.2. Phân mảnh ion đặc trƣng của các chất KTST ở điều kiện tối ƣu hóa......44
Hình 3.3. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất IAA.....................46
Hình 3.4. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất IBA.....................47
Hình 3.5. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất ICA.....................47
Hình 3.6. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất IPA......................48
Hình 3.7. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất GA3.....................49
Hình 3.8. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất GA4.....................49

Hình 3.9. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất GA7.....................50
Hình 3.10. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất BA.....................51
Hình 3.11. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất DHZR...............52
Hình 3.12. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất iP.......................52
Hình 3.13. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất iPR....................53
Hình 3.14. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất K.......................54
Hình 3.15. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất tZ...................... 54
Hình 3.16. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất tZR....................55
Hình 3.17. Sắc ký đồ của các chất KTST đƣợc phân tách bởi cột Hypersil sử dụng
pha động ACN (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng 0,1
mL.phút-1................................................................................................................. 58


xi
Hình 3.18. Sắc ký đồ của các chất KTST đƣợc phân tách bởi cột Hypersil sử dụng
pha động MeOH (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dịng 0,1
mL.phút-1................................................................................................................. 59
Hình 3.19. Sắc ký đồ của các chất KTST đƣợc phân tách bởi cột Purospher sử dụng
pha động ACN (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dịng 0,1
mL.phút-1................................................................................................................. 60
Hình 3.20. Sắc ký đồ của các chất KTST đƣợc phân tách bởi cột Purospher sử dụng
pha động ACN (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dịng 0,3
mL.phút-1................................................................................................................. 61
Hình 3.21. Sắc ký đồ của các chất KTST đƣợc phân tách bởi cột Purospher sử dụng
pha động MeOH (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dịng 0,1
mL.phút-1................................................................................................................. 62
Hình 3.22. Sắc ký đồ của các chất KTST đƣợc phân tách bởi cột Purospher sử dụng
pha động MeOH (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dịng 0,3
mL.phút-1................................................................................................................. 63
Hình 3.23. Sắc ký đồ của các chất KTST đƣợc phân tách bởi cột Purospher sử dụng

pha động MeOH (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dịng 0,5
mL.phút-1................................................................................................................. 64
Hình 3.24. Sắc ký đồ của các chất KTST đƣợc phân tách bởi cột Purospher sử dụng
pha động MeOH (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng 1
mL.phút-1................................................................................................................. 65
Hình 3.25. Quy trình tách chiết và phân tích các KTST trong các mẫu rau xanh
đƣợc phát triển và tối ƣu hóa.................................................................................. 70
Hình 3.26. Hiệu suất của q trình chiết mẫu theo quy trình Xiangqing và cộng sự
sử dụng các dung mơi 1-propanol và 2-propanol..................................................... 72
Hình 3.27. Hiệu suất của quá trình chiết mẫu theo quy trình mới xây dựng và phát
triển sử dụng các dung môi 1-propanol và 2-propanol............................................ 73
Hình 3.28. Sơ đồ quy trình chiết và phân tích các chất KTST trong các mẫu rau....74
Hình 3.29. Sắc ký đồ của các chất KTST ở điều kiện gradient tối ƣu.....................76
Hình 3.30. Đƣờng chuẩn của các chất KTST trên nền mẫu rau cải xanh................79
Hình 3.31. Ảnh hƣởng của nền mẫu đến tín hiệu của các chất KTST.....................82
Hình 3.32. Tỷ lệ phát hiện các chất KTST trong rau cải xanh................................. 90


xii
Hình 3.33. Tỷ lệ phát hiện các chất KTST trong rau cải xanh ở các huyện nghiên
cứu........................................................................................................................... 90
Hình 3.34. Sự phân bố hàm lƣợng của các chất KTST trong các mẫu rau cải xanh ở
các khu vực nghiên cứu........................................................................................... 94
Hình 3.35. Ảnh hƣởng của GA3 đến sự phát triển của rau cải xanh........................98
Hình 3.36. Ảnh hƣởng của GA3 đến sự phát triển của rau mồng tơi.....................101
Hình 3.37. Ảnh hƣởng của GA3 đến sự phát triển của rau xà lách........................104
Hình 3.38. Sự tích lũy của GA3 trong các loại rau................................................108


1

MỞ ĐẦU
Nhu cầu sử dụng lƣơng thực, thực phẩm và rau xanh ở Việt Nam ngày càng
gia tăng. Do đó, trong sản xuất nơng nghiệp, ngƣời ta ln tìm kiếm, nghiên cứu
các giải pháp để nâng cao hiệu quả sản xuất cây trồng. Sử dụng chất điều hòa sinh
trƣởng thực vật đƣợc xem là một trong những giải pháp tốt trong nơng nghiệp để
thúc đẩy nhanh q trình tăng trƣởng của cây.
Chất điều hòa sinh trƣởng thực vật là những chất có khả năng điều tiết sự
sinh trƣởng và phát triển của thực vật từ khi nảy mầm đến khi lão hóa và chết.
Trong tự nhiên, các chất điều hịa sinh trƣởng thực vật còn đƣợc gọi là các
hoocmon sinh trƣởng thực vật, là những chất đƣợc sinh ra trong cây. Bằng con
đƣờng hóa học nhân tạo, nhiều hợp chất khác nhau, có hoạt tính tƣơng tự với các
chất điều hòa sinh trƣởng thực vật tự nhiên đƣợc tổng hợp nhân tạo và dùng để điều
chỉnh quá trình sinh trƣởng, phát triển của cây nhằm tăng năng suất và phẩm chất
của cây trồng. Có hai nhóm chất điều hịa sinh trƣởng thực vật gồm: nhóm chất kích
thích sinh trƣởng thực vật (auxin, gibberellin và cytokinin...), có vai trị thúc đẩy sự
sinh trƣởng và phát triển của thực vật và nhóm chất ức chế sinh trƣởng thực vật
(absicic, ethylen và các hợp chất phenol...), có chức năng kìm hãm sự sinh trƣởng
và phát triển của thực vật để chuyển sang thời kỳ ra hoa, kết quả, hoặc chín.
Trên thị trƣờng, nhiều loại hóa chất điều hịa sinh trƣởng thực vật đƣợc
bn bán và sử dụng ở các dạng khác nhau nhƣ: dạng bột, dạng lỏng hoặc dạng
phối trộn cùng với các loại phân bón khác... Trong đó, nhiều hóa chất đƣợc sản xuất
ở Việt Nam, một số loại khác đƣợc nhập khẩu từ các nƣớc trên thế giới và có cả
những loại khơng nhãn mác, khơng có nguồn gốc xuất xứ. Nếu không đƣợc quản lý
chặt chẽ và sử dụng đúng cách thì những chất này có thể tiềm ẩn những nguy cơ dẫn
tới ô nhiễm môi trƣờng, ảnh hƣởng xấu đến sức khỏe ngƣời sản xuất và tiêu dùng.
Các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật đã đƣợc các nhà khoa học trên thế
giới quan tâm, nghiên cứu và ứng dụng từ nhiều năm nay. Việc sử dụng các chất
điều hịa sinh trƣởng thực vật trong sản xuất nơng nghiệp cũng diễn ra khá phổ biến
ở Việt Nam, tuy nhiên, rất ít cơng trình cơng bố nghiên cứu về phƣơng pháp phân
tích và đánh giá dƣ lƣợng của các chất này trong các sản phẩm nông nghiệp, đặc

biệt là rau xanh. Mặt khác, có nhiều loại thuốc điều hịa sinh trƣởng thực vật không


2
có nhãn mác và nguồn gốc xuất xứ vẫn đƣợc nông dân truyền tai nhau sử dụng do
hiệu quả nhanh chóng và vƣợt trội của chúng mang lại cho cây trồng. Đây là một
trong những nguyên nhân tiềm ẩn có thể gây nên tình trạng ngộ độc thực phẩm và ô
nhiễm môi trƣờng liên quan đến dƣ lƣợng của các hóa chất sử dụng trong sản xuất
nơng nghiệp.
Xuất phát từ thực tế trên, nghiên cứu sinh đề xuất thực hiện đề tài “Nghiên
cứu xây dựng và phát triển phương pháp phân tích một số chất kích thích tăng
trưởng (auxin, gibberellin, cytokinin) trong rau xanh”. Nghiên cứu này thành
công sẽ là tiền đề cho việc phát triển và ứng dụng phƣơng pháp phân tích đánh giá
dƣ lƣợng và thực trạng sử dụng các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong các
loại rau xanh, các sản phẩm nông nghiệp và trái cây.... sản xuất ở nƣớc ta cũng nhƣ
nhập khẩu từ các nƣớc trên thế giới. Đây cũng chính là cơ sở giúp các cơ quan chức
năng, các nhà quản lý ban hành các chế tài và có phƣơng thức giám sát việc sử
dụng các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong sản xuất nông nghiệp một cách
hiệu quả, đảm bảo sự phát triển sản xuất, an toàn cho ngƣời tiêu dùng và môi
trƣờng sinh thái.
Mục tiêu nghiên cứu của luận án:



Nghiên cứu xây dựng và phát triển phƣơng pháp phân tích đồng thời
các hợp chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong rau xanh bằng phƣơng
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối với detector khối phổ bẫy ion.



Áp dụng phƣơng pháp xây dựng đƣợc để phân tích, đánh giá hiện
trạng sử dụng, mức độ tồn dƣ và khả năng tích lũy của một số chất kích thích
sinh trƣởng thực vật sử dụng trong rau tại một số quận/ huyện của Hà Nội.
Nội dung nghiên cứu của luận án:
2) Khảo sát các điều kiện tối ƣu của phƣơng pháp phân tích các chất kích
thích sinh trƣởng thực vật trong rau, gồm: các điều kiện vận hành trên thiết bị
sắc ký lỏng khối phổ và các điều kiện của phƣơng pháp xử lý mẫu.
3) Xây dựng phƣơng pháp phân tích và đánh giá các thơng số của phƣơng
pháp.
4) Đánh giá hiện trạng dƣ lƣợng các chất kích thích sinh trƣởng thực vật
trong các mẫu rau xanh thu thập tại Hà Nội.


5)

Đánh giá ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng thực vật đến sự sinh

trƣởng và phát triển của một số loại rau và mức độ tích lũy của chúng trong rau
xanh.


3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Khái niệm chất kích thích sinh trƣởng thực vật
Chất kích thích sinh truởng thực vật (KTST) là nhóm các hợp chất hữu cơ
nhƣ: auxin, gibberellin, cytokinin, brassinosteroid, jasmonate, salicyclic acid và
strigolactone...; có tác dụng kích thích quá trình sinh trƣởng và phát triển của cây
[1]. Những chất này tác động lên sự sinh trƣởng của cây trồng theo cơ chế: (1) Kích
thích tăng trƣởng thể tích tế bào ở lá, thân, quả [2-4]; (2) Kích thích hình thành tế
bào mới, làm tăng cƣờng sự nảy chồi, đâm rễ, ra hoa [5-7]; (3) Bổ sung và tăng

cƣờng hoạt động của các men trong quá trình sinh tổng hợp của cây bằng cách cung
cấp thêm các chất vi lƣợng nhƣ Fe, Mn, Cu, Bo, Zn… [1].
1.2. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật
1.2.1. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm auxin

α-NAA
(C12H10O2)

2,4-D
(C8H6Cl2O3)

2,4,5-T
(C8H5Cl3O3)

Dicama
(C8H6Cl2O3)

IAA
(C10H9NO2)

IBA
(C12H13NO2)

ICA

4-CI-IAA

PAA

(C9H6NO2)

(C10H8ClNO2)

(C8H8O2)

Picloram
(C6H3Cl3N2O2)

IPA
(C11H11NO2)

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của các chất thuộc nhóm auxin

β-IAA


4
Auxin là một hoocmon thực vật có nguồn gốc từ axít amin tryptophan, đƣợc
xác định và phân lập về mặt hóa học vào những năm 1930. Auxin có trong tất cả các
bộ phận của cây với các nồng độ khác nhau, trong đó, nồng độ auxin ở mỗi vị trí là
thông tin quan trọng của sự phát triển, đƣợc điều chỉnh chặt chẽ thơng qua cả q
trình trao đổi chất và vận chuyển trong cây. Auxin hoạt động kết hợp hoặc đối lập
với các hoocmon thực vật khác. Ví dụ, tỷ lệ nhất định của auxin với cytokinin trong
các mô thực vật có ảnh hƣởng đến sự hình thành rễ của các cành giâm [8].
Cấu trúc hóa học của các hợp chất auxin đƣợc trình bày ở Hình 1.1. Ở cấp độ
phân tử, tất cả các auxin đều là hợp chất có một vịng thơm và một nhóm axít
cacboxylic. Trong đó, indole-3-acetic acid (IAA) là một dẫn xuất của indole-3-acetic
acid, là monocacboxylic acid, hợp chất chứa acetic acid đƣợc liên kết với nguyên tử
cacbon C3 của indole. IAA đƣợc xem là hợp chất quan trọng nhất của nhóm auxin,
có vai trò tạo ra phần lớn các hiệu ứng auxin trong thực vật. Là một auxin tự nhiên

nên trạng thái cân bằng của IAA trong cây có thể đƣợc kiểm sốt theo nhiều cách từ
tổng hợp cho đến sự phân hủy các phân tử của nó tùy theo điều kiện mơi trƣờng [9].
Có 5 hợp chất auxin trong tự nhiên gồm: IAA, 4-chloroindole-3-acetic acid
(4-CI-IAA), indole-3-butyric acid (IBA), indole-3-propionic acid (IPA) và
phenylacetic acid (PAA) [10, 11]. Bên cạnh đó, nhiều hợp chất tổng hợp có tính chất
tƣơng tự auxin nhƣ: Indole-3-carboxylic acid (ICA); α-naphthaleneacetic acid (αNAA); 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D); 2,4,5-Trichlorophenoxyacetic acid
(2,4,5-T); 4-Amino-3,5,6-trichloropicolinic acid (tordon or picloram); 2-Methoxy3,6-dichlorobenzoic acid (dicamba), β-Indolyaxetic acid (AIA)... [10]. Những auxin
tổng hợp nhân tạo này cũng có khả năng kích thích sự phát triển của thực vật và đã
đƣợc ứng dụng nhiều trong nông nghiệp và thƣơng mại.
Các đặc điểm, tính chất hóa lý nhƣ khối lƣợng mol phân tử, mật độ, diện
tích bề mặt, màu sắc, trạng thái, nhiệt độ nóng chảy và độ tan của một số hợp chất
auxin đƣợc trình bày ở Bảng 1.1.


5
Bảng 1.1. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm auxin (Nguồn:
PubChem)
Hợp chất
IAA

203,241 1,252 53,1 Tinh thể màu trắng hơi
vàng

IPA

125 Trong nƣớc:
250
o
mg.L-1 ở
20 C;

trong benzene: >
-1
1000 g.L ; Trong
acetone,
etanol,
diethyl: 30-100 g.L-1;
trong
chloroform:
0,01-1 g.L-1

ICA
4-CI-IAA
PAA
2,4-D

α-NAA

Dicamba

Picloram

2,4,5-T

mg.L-1 ở 25oC; tan
trong dung môi hữu
cơ: methanol, aceton,
chloroform,
dichloromethane
241,45

-

76,2

Màu trắng

-1

218,5 Trong nƣớc: 430 mg.L
o
(ở 25 C); tan trong
các dung môi hữu cơ:
aceton, acetonitrile,
benzene,
etanol,
isopropanol
154-158 Trong nƣớc: 238
-1
o
mg.kg (ở 30 C)


6
1.2.2. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm gibberellin
Gibberellin (GAs) là nhóm hoocmon thực vật đƣợc phát hiện sau auxin, đƣợc
tổng hợp trong các mô non của chồi, có thể có trong rễ, hạt đang phát triển và lá cây

[12]. Gibberellin chính là các diterpenoid acid đƣợc tổng hợp từ terpenoid trong thể
hạt và sau đó đƣợc biến đổi thành dạng hoạt hóa sinh học trong lƣới nội chất và
cytosol [13]. Các gibberellin đều dẫn xuất từ bộ khung ent-gibberellan và đƣợc tổng

hợp thông qua ent-kauren.
Các gibberellin đƣợc đặt tên theo thứ tự phát hiện của chúng là GA 1, GA2,
GA3.... GAn. Trong đó, GA3 là gibberellin đầu tiên đƣợc mô tả cấu trúc và là chất có

tác dụng sinh học lớn nhất. Hiện nay, có 126 gibberellin đƣợc xác định từ thực vật,
nấm và vi khuẩn với công thức phân tử không chứa nitơ [14]. Gibberellin là các
deterpene acid, với sự xuất hiện của cacbon 19 (C-19) hoặc cacbon 20 (C-20). Các
gibberellin C-19, bị mất đi C-20, tại vị trí đó sở hữu một cầu lacton 5 thành viên liên
kết với cacbon 4 và cacbon 10. Gibberellin C-19 đƣợc xem là dạng gibberellin có
hoạt tính sinh học [15].
Các gibberellin có hoạt tính sinh học gồm: GA 1, GA3, GA4, GA7 với các đặc
điểm chung là: nhóm hydroxyl gắn ở vị trí C-3β, một nhóm cacboxyl ở vị trí C-6, và
một lacton ở vị trí giữa C-4 và C-10. Nhóm 3β-hydroxyl có thể đƣợc trao đổi cho
các nhóm chức khác ở vị trí C-2 và/ hoặc C-3. GA 5 và GA6 là các gibberellin có
hoạt tính sinh học khơng chứa nhóm hydroxyl ở vị trí C-3β [16]. Cơng thức cấu tạo
của một số gibberellin đƣợc trình bày ở Hình 1.2.

GA1
(C19H24O6)

GA3
(C19H22O6)

GA4
(C19H24O5)

GA7
(C19H22O5)

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của các chất thuộc nhóm gibberellin

Gibberellin tan tốt trong dung mơi hữu cơ nhƣng tan kém trong nƣớc. Các
đặc điểm hóa lý của một số gibberellin đƣợc trình bày trong Bảng 1.2.


7
Bảng 1.2. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm gibberellin
Hợp chất KLPT
(g.mol-1)

GA1
GA3

GA4
GA7
(Nguồn: PubChem)
1.2.3. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm cytokinin
Cytokinin là hoocmon thực vật đƣợc phát hiện sau auxin và gibberellin, có
khả năng thúc đẩy sự phân chia tế bào trong thân và rễ cây. Cytokinin tham gia vào
quá trình phát triển và biệt hóa tế bào, truyền tín hiệu tại chỗ và tới các vị trí khác
nhau trong cơ thể với cơ chế vận chuyển tƣơng tự nhƣ purin và nucleosit; đồng thời
cytokinin ảnh hƣởng đến tính ƣu thế đỉnh, sự phát triển chồi nách và sự già đi của
lá [17].
Cytokinin hoạt động phối hợp với auxin trong điều hòa sự sinh trƣởng và
phát triển của thực vật. Cytokinin là các hợp chất hữu cơ với thành phần cơ bản gồm
các nguyên tố C, N và H. Một số hợp chất thuộc nhóm cytokinin nhƣ: kinetin
(K), zeatin (Z), 6-benzylaminopurine, diphenylurea, thidiazuron (TDZ), trans-zeatin
(tZ), N6-Benzyladenine (BA), N6-Isopentenyladenine (iP),
Isopentenyladenosine (iPR), Dihydrozeatin riboside (DHZR), Trans-zeatin riboside
(tZR)…. [18].
Cytokinin là các dẫn xuất của adenine với chuỗi bên ở vị trí N6. Cấu trúc và

hình dạng của chuỗi bên gắn với vị trí N6 có thể ảnh hƣởng rõ rệt đến hoạt tính sinh
học của cytokinin. Tùy thuộc vào cấu trúc của nhóm thế N6, các cytokinin đƣợc


8
phân loại thành các cytokinin isoprenoid hoặc thơm. Cấu trúc hóa học của adenine
và một số chất thuộc nhóm cytokinin đƣợc trình bày ở Hình 1.3.

Adenin
(C5H5N5)

Z
(C10H13N5O)

iPR
(C15H21N5O4)

BA
(C12H11N5)

tZ
(C10H13N5O)

K
(C10H9N5O)

Diphenylurea
(C13H12N2O)

iP

(C10H13N5)

Thidiazuron
(C9H8N4OS)

DHZR
(C15H23N5O5)

tZR
(C15H21N5O5)

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của các chất thuộc nhóm cytokinin
Các hợp chất hữu cơ thuộc nhóm cytokinin thƣờng có màu trắng hoặc khơng
màu và tan kém trong nƣớc. Đặc điểm, tính chất hóa lý của một số hợp chất
cytokinin đƣợc trình bày trong Bảng 1.3.


9
Bảng 1.3. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm cytokinin
Hợp chất

K

Z
tZ
BA
Diphenylurea 212,252
Thidiazuron
iP
iPR

DHZR
tZR
(Nguồn: PubChem)
1.3. Vai trị chức năng của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật
1.3.1. Vai trị chức năng của các chất thuộc nhóm auxin
Auxin đóng vai trị quan trọng trong việc điều phối nhiều quá trình sinh lý
cần thiết trong chu kỳ sống của thực vật nhƣ: sự sinh trƣởng, phát triển, sự ra hoa,
hình thành củ, quả, hạt của thực vật.... Auxin có thể ảnh hƣởng đến dòng của tế bào
chất, sự di chuyển của chất lỏng trong tế bào và hoạt tính của các enzym khác nhau
[19].