Phân lập và xác định khả năng khử đạm của vi khuẩn pseudomonas stutzeri trong nước thải ao nuôi cá tra

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG
KHOA NÔNG NGHIỆP – TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
________________

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG KHỬ ĐẠM CỦA
VI KHUẨN Pseudomonas stutzeri TRONG NƯỚC THẢI
AO NUÔI CÁ TRA

Chủ nhiệm đề tài: Ths. Trịnh Hoài Vũ

Long Xuyên, tháng 5 năm 2012
i


TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG
KHOA NÔNG NGHIỆP – TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
________________

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG KHỬ ĐẠM CỦA
VI KHUẨN Pseudomonas stutzeri TRONG NƯỚC THẢI
AO NUÔI CÁ TRA

BAN GIÁM HIỆU

KHOA

NN-TNTN

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI

Long Xuyên, tháng 5 năm 2012
ii


LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian thực hiện đề tài mặc dù gặp nhiều khó khăn nhưng được
sự động viên, giúp đỡ của Ban giám hiệu, quý đồng nghiệp khoa NN-TNTN đã giúp tơi
có động lực để vượt qua khó khăn trong q trình thí nghiệm. Tơi xin trân trọng gởi
lời cám ơn đến:
- Trường Đại học An Giang đã cấp kinh phí cho tơi thực hiện đề tài nghiên cứu
này.
- Ban chủ nhiệm Khoa Nông nghiệp-TNTN, trường Đại học An Giang đã tạo
mọi điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài.
- Các đồng nghiệp Bộ môn Công nghệ sinh học đã hết lịng hỗ trợ, đóng góp
nhiều ý kiến q báu giúp đỡ tơi trong q trình hoàn thành đề tài.
Xin chân thành cảm ơn!
Long Xuyên, ngày 22 tháng 05 năm 2012

iii


TĨM LƯỢC
Từ nước trong các ao ni cá tra ở 3 huyện Chợ Mới, Phú Tân và Châu Phú
đã phân lập được 21 dịng vi khuẩn và có 11/21 dịng được nhận diện chính xác là vi
khuẩn Pseudomonas stutzeri bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu fps158 và

rps743. Kết quả giải trình tự cho thấy 2 dịng CM8 và PT5 có mức độ đồng hình với vi
khuẩn Pseudomonas stutzeri chuẩn là 99%. Các dòng CP1, CM8, PT3 và PT5 có khả
năng phát triển tốt trên mơi trường Minimal có bổ sung NH4+ và NO3- ở nồng độ là
500 mM và trên mơi trường có bổ sung 100 mM NO2-. Ba dòng vi khuẩn CP1, CM8
và PT5 khi được sử dụng thí nghiệm trên nước thải ao ni cá tra đều có khả năng oxy
hóa NH4+, NO3- và NO2-, làm giảm đáng kể lượng các chất này với hiệu suất cao và
khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng khơng xử lý. Kết quả này cho thấy có khả năng
sử dụng chúng trong việc xử lý nước thải chứa đạm từ các ao cá tra và có thể có triển
vọng trong việc xử lý các loại nước thải ô nhiễm đạm khác.
Từ khóa: Pseudomonas stutzeri, vi khuẩn khử đạm, nước thải ao nuôi cá tra, nitrat,
kỹ thuật PCR.

iv


MỤC LỤC
LỜI CẢM TẠ
TĨM LƯỢC
MỤC LỤC
DANH SÁCH BẢNG
DANH SÁCH HÌNH
GIỚI THIỆU
CHƯƠNG 1 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
1.1. Chu trình Nitrogen
1.2. Vi sinh vật của chu trình Nitrogen
1.2.1. Cố định đạm
1.2.2. Sự đồng hóa Nitrogen
1.2.3. Sự khống hóa đạm (Ammonium hóa)
1.2.4. Sự nitrat hóa
1.2.5. Sự khử nitrat

1.3. Vi khuẩn Pseudomonas stutzeri
1.3.1. Vị trí của Pseudomonas stutzeri trong hệ thống phân loại
sinh vật
1.3.2. Các gen tham gia vào quá trình khử nitrat của
Pseudomonas stutzeri
1.3.3. Một số nghiên cứu về khả năng khử nitrat của
Pseudomonas stutzeri
1.4. Các dạng đạm chính trong mơi trường nước
1.4.1. Ammonium (NH4+)
1.4.2. Nitrat (NO3-)
1.4.3. Nitrit (NO2-)
1.4.4. Nhu cầu oxy hóa học - COD (Chemical Oxygen Demand)
CHƯƠNG 2 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Phương tiện nghiên cứu
2.1.1. Thiết bị
2.2.2. Hóa chất
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Thời gian và địa điểm thực hiện thí nghiệm
2.2.2. Thu mẫu
2.2.3. Phân lập vi khuẩn
2.2.4. Nhận diện (identification) vi khuẩn Pseudomonas stutzeri
2.2.5. Đánh giá khả năng khử của các dòng vi khuẩn
Pseudomonas stutzeri
2.2.6. Giải trình tự các dịng vi khuẩn có khả năng khử nitrate tốt
2.2.7. Thử nghiệm xử lý khả năng khử đạm của loài vi khuẩn
Pseudomonas stutzeri này trong điều kiện ngoài thực tế
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn khử đạm trong nước thải ao ni cá tra
3.2. Nhận diện các dịng vi khuẩn phân lập được bằng kỹ thuật PCR

Trang
iii
iv
v
vii
viii
1
3
3
3
3
4
4
4
5
6
6
8
8
9
9
10
10
10
12
12
12
12
13
13

13
13
14
16
17
17
18
18
20

v


3.3. Kết quả giải trình tự một số dịng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri
phân lập
3.4. Khả năng khử nitrate, nitrite và oxid hóa ammonium của các dịng
Pseudomonas stutzeri
3.5. Thí nghiệm khả năng khử nitrate, nitrite của các dòng
Pseudomonas stutzeri trong nước thải ao nuôi cá tra
3.5.1. pH
3.5.2. Ammonium (NH4+)
3.5.3. Nitrat (NO3-)
3.5.4. Nitrit (NO2-)
3.5.5. Nhu cầu oxy hóa học - COD (Chemical Oxygen Demand)
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. Kết luận
2. Đề nghị
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ CHƯƠNG 1
PHỤ CHƯƠNG 2

22
25
25
26
26
27
29
30
31
31
31
32
35
36

vi


DANH SÁCH BẢNG
Bảng
Bảng 1. Chu kỳ phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen khử đạm trên vùng
16S rRNA của Pseudomonas stutzeri
Bảng 2. Trình tự primer dùng nhận diện vi khuẩn khử đạm Pseudomonas
stutzeri (dựa trên vùng 16S rRNA)
Bảng 3. Đặc điểm của các dòng vi khuẩn phân lập được tại tại các ao ni
cá tra
Bảng 4. Kết quả giải trình tự dịng CM8
Bảng 5. Kết quả giải trình tự dịng PT5
Bảng 6. Khả năng phát triển trên môi trường Minimal có bổ sung NH4+,

NO3- và NO2-của các dịng Pseudomonas stutzeri phân lập
Bảng 7. Các dịng được sử dụng trong thí nghiệm xử lý đạm nước ao nuôi
cá tra
Bảng 8. Ảnh hưởng của vi khuẩn khử đạm lên pH trong nước ao nuôi cá tra
Bảng 9. Ảnh hưởng của vi khuẩn khử đạm lên hàm lượng ammonium
(mg/L) trong nước ao nuôi cá tra
Bảng 10. Ảnh hưởng của vi khuẩn khử đạm lên hàm lượng nitrat (mg/L)
trong nước ao nuôi cá tra
Bảng 11. Ảnh hưởng của vi khuẩn khử đạm lên hàm lượng nitrit trong
nước ao nuôi cá tra
Bảng 12. Ảnh hưởng của vi khuẩn khử đạm lên COD (mgO2/L) trong nước
ao nuôi cá tra

Trang
16
16
18
22
23
25
26
26
27
28
29
30

vii

DANH SÁCH HÌNH
Hình
Hình 1. Chu trình nitrogen (Nguồn: Tortora et al., 2004)
Hình 2: Một số dạng khuẩn lạc của vi khuẩn Pseudomonas stutzeri
(Lalucat et al., 2006)
Hình 3. Tổ chức của các gen tham gia vào quá trình khử nitrate của vi
khuẩn Pseudomonas stutzeri (Lalucat et al., 2006)
Hình 4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khử đạm của các dịng vi khuẩn
Pseudomonas stutzeri
Hình 5. Dịng vi khuẩn CP1 chụp bằng kính hiển vi điện tử qt ở độ
phóng đại 10.000 lần
Hình 6. Dịng vi khuẩn CM8 chụp dưới kính hiển vi điện tử qt ở độ
phóng đại 11.000 lần
Hình 7. Dịng vi khuẩn PT5 chụp dưới kính hiển vi điện tử qt ở độ phóng
đại 7.000 lần
Hình 8. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi tổng 16f27 và 16r1488
của 25 dịng vi khuẩn phân lập được
Hình 9. Kết quả điện di sản phẩm PCR bằng cặp mồi fps158 và rps743
Hình 10. Tương đồng của dịng CM8 với vi khuẩn Pseudomonas stutzeri
Hình 11. So sánh trình tự của dịng CM8 với vi khuẩn Pseudomonas
stutzeri
Hình 12. Tương đồng của dịng PT5 với vi khuẩn Pseudomonas stutzeri
dịng P4
Hình 13. So sánh trình tự của dịng PT5 với vi khuẩn Pseudomonas stutzeri
dịng P4
Hình 14. Diễn biến pH của các nghiệm thức trong quá trình xử lý
Hình 15. Sự thay đổi nồng độ NH4+ ở các nghiệm thức trong q trình thí
nghiệm
Hình 16. Sự thay đổi nồng độ NO3- ở các nghiệm thức trong q trình thí
nghiệm

Hình 17. Sự thay đổi nồng độ NO2- ở các nghiệm thức trong q trình thí
nghiệm
Hình 18. Sự thay đổi của COD ở các nghiệm thức trong q trình thí
nghiệm

Trang
3
7
8
17
19
20
20
21
22
23
23
24
24
26
27
28
29
30

viii


PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG KHỬ ĐẠM CỦA VI
KHUẨN Pseudomonas stutzeri TRONG NƯỚC THẢI

AO NI CÁ TRA

Trịnh Hồi Vũ1
ABSTRACT
Twenty-one denitrifying bacterial isolates were isolated from the sediment and wastewater of catfish
ponds in An Giang province. Among them, 11/21 isolates were determined as Pseudomonas stutzeri by
using PCR technique with specific fps158 and rps743 primers. The result of DNA sequence showed that
two isolates (CM8, PT5) had the identity with standard Pseudomonas stutzeri were 99%. Most of them
could grow on Minimal medium complemented with various concentration of NH4+, NO3- và NO2-.
Especially, many isolates such as CP1, CM8, PT3 and PT5 could develop well in 500 mM NH4+, NO3and 100 mM NO2- concentration.
Key words: Pseudomonas stutzeri, denitrifying bacteria, catfish pond’s wastewater, PCR technique
1. GIỚI THIỆU

Có nhiều nghiên cứu về vấn đề xử lý các hợp chất chứa đạm trong nước thải, trong số
đó biện pháp xử lý bằng vi sinh vật được chú ý đặc biệt do hiệu quả xử lý cao và ít tốn chi phí.
Trong xử lý nước thải, sự loại thải hợp chất đạm có thể được thực hiện bởi sự kết hợp của q
trình nitrat hóa và q trình khử nitrat (khử nitrat thành N2O hoặc N2). Điều này đòi hỏi hoạt
động phối hợp hoặc nối tiếp của các nhóm vi sinh vật khác nhau, đặc biệt là vi khuẩn nitrat hóa
và vi khuẩn khử nitrat (Lee et al., 2002). Một số dòng vi khuẩn tham gia trong chu trình nitơ
như Pseudomonas stutzeri có khả năng khử đạm (denitrifying bacteria) dưới dạng thức ăn thừa
hoặc phân giúp giảm lượng nitrat, ammonium gây ô nhiễm nguồn nước, cải thiện chất lượng
nước ao ni, góp phần thực hiện ni thủy sản bền vững.
1.1. Vi khuẩn Pseudomonas stutzeri
Loài vi khuẩn Pseudomonas stutzeri được phân lập và xác định lần đầu tiên bởi Burri và
Stutzer vào 1895 với tên gọi là Bacillus denitrificans II, sau đó được van Niel và Allen xác định
tên chính thức của nó là Pseudomonas stutzeri (van Niel và Allen, 1952). Đây là lồi vi khuẩn
Gram âm, hình que, kích thước khoảng 1,4-2,8 x 0,7-0,8, di chuyển bằng 1 chiên mao ở đầu.
Các dòng khuẩn lạc được phân lập đến nay đều là dính chặt, có màu nâu tối và có đặc điểm bên
ngồi nhăn nheo, đặc điểm này thường bị mất đi sau vài lần được cấy truyền trong mơi trường
thí nghiệm (Garrity, 2005). Các khuẩn lạc cuối cùng có thể trở nên trơn láng, đặc và mất màu.

Trong số các đặc điểm để nhận diện P. stutzeri là khả năng khử nitrat mạnh, sự xuất hiện các
khuẩn lạc và việc sử dụng tinh bột làm nguồn carbon và năng lượng duy nhất. Có thể sinh
trưởng ở nhiệt độ từ 4-45oC (Lalucat et al., 2006). Nhiệt độ tối thích khoảng 35oC (van Niel và
Allen, 1952). pH tối thích khoảng 7 nhưng có thể sinh trưởng ở pH 9 (van Niel và Allen, 1952).
Hàm lượng G-C của DNA từ 60,6-66,3 (Garrity, 2005). Dịng mẫu của lồi là: AB 201, ATCC
17588, CCUG 11256, DSM 5190 được đăng ký trên GenBank.
2. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Phương tiện nghiên cứu
Môi trường Minimal (Sikorski et al., 2002) gồm: sodium succinate (8,1 g/l); KH2PO4
(340 mg/l); K2HPO4 (435 mg/l); vi lượng (1 ml/l); stock gồm 10 mM NaNO3, 10 mM NH4Cl,
100 mM artificial seawater (SW) (gồm NaHCO3 [0,11 g/l], MgSO4. 7H2O [10,5 g/l], NaCl [24
g/l] ); KOH 4M ( 50 ml/l); pH 6,8 được điều chỉnh bằng KOH 0,1M; agar (2 %).
Môi trường Luria Bertani (LB) (Bennasar et al., 1998): Bacto yeast extract (YE) (5 g/l);
Bacto tryptone (10 g/l); NaCl (10 g/l); cycloheximide (50 mg) dùng để nhân mật số vi khuẩn
chuẩn bị cho việc trích DNA.
2.2. Phuơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Thời gian và địa điểm thực hiện thí nghiệm
Thí nghiệm phân lập và xác định đặc tính của P. stutzeri đuợc thực hiện tại phịng thí
nghiệm bộ mơn Cơng nghệ Sinh học, khoa Nông nghiệp – TNTN, trường đại học An Giang; các
thí nghiệm nhận diện vi khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử được thực hiện tại phòng thí
nghiệm Sinh học phân tử, viện Nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học, trường đại học
1

Ths. GV Bộ môn CNSH, khoa Nông nghiệp - TNTN, Đại học An Giang; Email:


Cần Thơ; thí nghiệm áp dụng xử lý khử đạm được thực hiện trên nước thải của ao nuôi cá Tra 34 tháng tuổi từ tháng 2/ 2009 - 12/2009.
2.2.2. Thu mẫu và phân lập vi khuẩn
Mẫu bùn đáy ao và mẫu nước thải (được thu thập riêng biệt) của ao nuôi cá Tra 3-4

tháng tuổi tại các huyện Châu Phú (xã Khánh Hịa), huyện Phú Tân (xã Phú Bình) và huyện
Chợ Mới (xã Long Giang). Mỗi xã sẽ thu lấy 3 mẫu để phân lập vi khuẩn.
2.2.3. Nhận diện vi khuẩn P. stutzeri
Bảng 2. Trình tự primer dùng nhận diện vi khuẩn khử đạm P. stutzeri

Primer

Trình tự primer (5’ – 3’)

Kích
thước
1.456 bp

16F27
AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG
16R1488
CGG TTA CCT TGT TAG GAC TTC ACC
fps 158
GTG GGG GAC AAC GTT TC
625 bp
rps 743
CTA CGA TCG GTT TTA TGG
2.2.4. Đánh giá khả năng khử của các dòng vi khuẩn P. stutzeri
Đánh giá khả năng khử nitrat của các dòng vi khuẩn P. stutzeri vừa phân lập dựa trên sự
phát triển của các dịng vi khuẩn này trên mơi trường Minimal đặc có bổ sung NH4+, NO3- ở các
nồng độ tăng dần từ 10 đến 500 mM và NO2- ở các nồng độ 10, 100 mM.
2.2.5. Giải trình tự các dịng vi khuẩn có khả năng khử nitrat tốt
Sau khi xác định khả năng khử nitrat trên môi trường Minimal, chọn 2 dịng vi khuẩn có
khả năng khử mạnh đem giải trình tự, sau đó tìm trên GeneBank của NCBI với phần mềm
BLASTN để xác định chính xác dịng vi khuẩn P. stutzeri.

2.2.6. Thử nghiệm khả năng khử đạm của vi khuẩn P. stutzeri ở điều kiện thực tế
Sử dụng 3 dịng vi khuẩn có khả năng khử nitrat mạnh để bố trí thí nghiệm. Thí nghiệm
được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại với các nghiệm thức:
- Nghiệm thức 1: dòng vi khuẩn 1 (D1) ở tỉ lệ 1% (v/v).
- Nghiệm thức 2: dòng vi khuẩn 2 (D2) ở tỉ lệ 1% (v/v).
- Nghiệm thức 3: dòng vi khuẩn 3 (D3) ở tỉ lệ 1% (v/v).
- Nghiệm thức 4: đối chứng (ĐC) (không xử lý với vi khuẩn).
Các nghiệm thức với các dòng vi khuẩn được chọn được chủng hoàn toàn ngẫu nhiên
vào các thùng nhựa, mỗi thùng chứa 100 lít nước thải ra từ ao ni cá Tra 3-4 tháng tuổi, để
thống khí trong điều kiện tự nhiên, định kỳ 24, 48, 72, 96 giờ lấy mẫu (mỗi mẫu 1 lít nước
thải) để phân tích các chỉ tiêu: NH4+, NO2-, NO3- so sánh với TCVN 5942:1995.
Số liệu được thống kê bằng chương trình Minitab ver.14, dùng kiểm định LSD để so
sánh các trung bình nghiệm thức.
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn khử đạm trong nước thải ao ni cá tra
Tổng cộng có 9 mẫu (bùn và nước) thu được ở ao nuôi cá tra tại ba huyện Châu Phú,
Phú Tân và Chợ Mới. Sử dụng môi trường Minimal (pH = 6,8) chuyên dùng để phân lập và nuôi
cấy vi khuẩn khử đạm đã phân lập được tổng cộng 21 dịng vi khuẩn có khả năng là lồi P.
stutzeri để tiến hành các bước nhận diện tiếp theo.
Về hình dạng khuẩn lạc: 17/21 dịng vi khuẩn phân lập đều có hình trịn (80,95%) và
4/21 dịng có hình dạng khơng đều.
Về màu sắc khuẩn lạc: có 12/21 (57,14%) khuẩn lạc màu trắng đục, một số khuẩn lạc có
màu trắng sữa, vàng nhạt. Về đặc điểm màu sắc khuẩn lạc, trong q trình phân lập có có sự
biến đổi màu sắc của khuẩn lạc trong quá trình phân lập: thời kỳ đầu phân lập một số khuẩn lạc
có màu tối nhưng sau một vài lần cấy truyền, khuẩn lạc bị mất màu và có màu nhạt hơn hay
chuyển sang màu trắng đục. Điều này cũng phù hợp với mô tả của van Niel và Allen (1952),
Garrity et al. (2005) rằng khuẩn lạc có thể bị mất màu chỉ sau một vài lần cấy truyền.
Về đặc điểm hình dạng của tế bào vi khuẩn: 19/21 dịng vi khuẩn có que ngắn (chiếm
90,48%), đa số đều có khả năng chuyển động (20/21 dịng chiếm 95,24%). Điều này có thể do

đa số các dịng vi khuẩn phân lập được đều có chiên mao. Kết quả này phù hợp với mô tả của
van Niel và Allen (1952), Garrity et al. (2005) và Lalucat et al. (2006) rằng các vi khuẩn P.
stutzeri chuyển động được nhờ vào chiên mao gắn ở đầu. Sau khi phân lập, một số dòng được


chọn để chụp hình dưới kính hiển vi điện tử qt ở các độ phóng đại thích hợp. Các hình ảnh
thu nhận được cho thấy các dịng đều có hình que ngắn và có chiên mao ở đầu chứng tỏ giả thiết
ban đầu rằng các dòng này chuyển động bằng chiên mao là phù hợp (Hình 1).

Hình 1. Các dịng vi khuẩn CP1, CM8 và PT5 chụp dưới kính hiển vi điện tử

3.2. Nhận diện các dòng vi khuẩn phân lập được bằng kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR với các cặp mồi đặc trưng đã được Bennasar et al. (1998) sử dụng để
nhận diện chính xác lồi P. stutzeri trong số các dịng vi khuẩn phân lập được. Trong thí nghiệm
này, 2 cặp mồi gồm cặp mồi tổng 16f27 và 16r1488 để nhận diện các dòng vi khuẩn
Pseudomonas sp., sản phẩm PCR có kích thước khoảng 1500 bp; và cặp mồi đặc hiệu nhận diện
chính xác dịng vi khuẩn P. stutzeri, sản phẩm PCR của cặp mồi này có kích thước 625 bp. Sản
phẩm PCR sau đó được kiểm tra trên gel agarose 1% (w/v). Kết quả thu được của việc sử dụng
2 cặp mồi này như sau: có 15/21 dịng xuất hiện band ở vị trí 1500 bp chứng tỏ 15 dòng này là
vi khuẩn Pseudomonas sp.. Các dòng đó là: CP1, CP2, CP4, CP5, CP6, CM1, CM2, CM3,
CM5, CM6, CM7, CM8, PT1, PT3, PT5 (Hình 2).
1 2

3

4 5

6 7

8

9 10 11 12 13 14 15 16 17

18 19 20

21 22 23 24 25
1500 bp

Hình 2. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi tổng 16f27 và 16r1488 của 21 dòng vi khuẩn
(1) Thang chuẩn 100bp plus; (2) Đối chứng dương (P. stutzeri ZoBell14405); (3) CP1; (4) CP2; (5) CP3;
(6) CP4; (7) CP5; (8) CP6; (9) CM1; (10) CM2; (11) CM3; (12) CM4; (13) CM5; (14) CM6; (15) CM7;
(16) CM8; (17) PT1; (18) Thang chuẩn 100bp plus; (19) Đối chứng dương (P. stutzeri ZoBell14405);
(20) PT2; (21) PT3; (22) PT4; (23) PT5; (24) PT6; (25) PT7

Sử dụng cặp mồi fps158 và rps743 để nhận diện chính xác dịng vi khuẩn P.stutzeri từ
15 dòng đã được nhận diện là Pseudomonas sp.. Kết quả cho thấy có 11 dịng xuất hiện band ở
vị trí 625 bp (Hình 3) chứng tỏ 11 dịng này là lồi vi khuẩn P. stutzeri. Các dòng này bao gồm:
CP1, CP2, CP4, CP5, CP6, CM1, CM2, CM3, CM5, CM6, CM7, CM8, PT1, PT3, PT5.
1 2 3

4

5

6 7

8

9 10 11 12 13 14 15 16 17

625 bp
Hình 3. Kết quả điện di sản phẩm PCR 15 dòng vi khuẩn bằng cặp mồi fps158 và rps743
(1) Thang chuẩn 100bp; (2) Đối chứng dương P. stutzeri ZoBell14405; (3) CP1; (4) CP2; (5) CP4; (6)
CP5; (7) CP6; (8) CM1; (9) CM2; (10) CM3; (11) CM5; (12) CM6; (13) CM7; (14) CM8; (15) PT1; (16)
PT3; (17) PT5

Tại ĐBSCL, việc sử dụng cặp mồi đặc hiệu fps158 và rps743 để nhận diện loài vi
khuẩn khử đạm P. stutzeri cũng đã đạt được một số kết quả như: Phan Trường Khanh (2007)
trên đất tại ĐBSCL, Nguyễn Thành Nhân (2008) trên chất thải trại chăn nuôi heo tại Tiền
Giang, Huỳnh Thị Cẩm Tú (2009) trên nước thải ao nuôi tôm ở Bạc Liêu, Nguyễn Thị Thủy
Trinh (2009) nước thải ao nuôi cá ở Bến Tre, Nguyễn Thị Ngọc Hà (2009) trên nước thải ao
nuôi cá tra tại An Giang. Các kết quả trên cùng với kết quả phân lập và nhận diện trong thí


Hàm lượng NO3- (mg/l)

Hàm lượng NH4+ (mg/l)

nghiệm này cho thấy P. stutzeri phân bố rất rộng rãi trong môi trường đất và nước tại vùng
ĐBSCL.
3.3. Kết quả giải trình tự một số dòng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri phân lập
Hai dòng vi khuẩn CM8, PT5 (thu được tại huyện Chợ Mới và Phú Tân) được chọn để
giải trình tự đoạn gen có kích thước 625 bp (sản phẩm PCR với cặp mồi fps158 và rps743). Kết
quả nhận được được so sánh bằng chương trình BLAST (NCBI) với các trình tự đã có trước đây
về lồi vi khuẩn P. stutzeri lưu trữ trên GenBank (Hoa Kỳ). Kết quả so sánh cho thấy dịng
CM8 có tổng số nucleotide là 592 cho kết quả đồng hình 99% với vi khuẩn P. stutzeri. Trong
khi đó dịng PT5 có tổng số nucleotide là 598 và cũng cho kết quả đồng hình với vi khuẩn P.
stutzeri dịng P4 là 99%.
3.4. Khả năng khử nitrat, nitrit và oxid hóa ammonium của các dịng P. stutzeri
Các dịng vi khuẩn P. stutzeri đã được nhận diện chính xác bằng cặp mồi đặc hiệu

fps158 và rps743 tiếp tục được xác định khả năng khử đạm bằng phương pháp kiểm tra trên đĩa
petri chứa môi trường Minimal đặc bổ sung NH4+, NO3- ở các nồng độ 10 mM, 100 mM, 200
mM, 300 mM, 400 mM, 500 mM và NO2- ở các nồng độ 10 mM, 100mM. Kết quả cho thấy:
các dòng P. stutzeri phân lập được đều có khả năng phát triển. Trong đó các dịng CP1, CM8,
PT3 và PT5 có khả năng phát triển tốt ở nồng độ NH4+, NO3- thử nghiệm là 500 mM, ở nồng độ
NO2- thử nghiệm là 100 mM. Kết quả này cho thấy các dòng P. stutzeri phân lập được đều có
khả năng khử nitrat, nitrit và oxid hóa ammonium.
3.5. Đánh giá khả năng khử nitrat, nitrit của các dòng P. stutzeri trong nước thải ao nuôi
Sau khi xác định khả năng khử nitrat của các dịng vi khuẩn đã được nhận diện chính
xác là vi khuẩn P. stutzeri. Các dịng CP1, CM8 và PT5 có khả năng phát triển tốt trên các đĩa
petri được chọn để tiến hành xác định khả năng khử đạm của chúng trên nước thải ao ni cá.
3.5.1. pH
Kết quả thí nghiệm cho thấy diễn biến của nồng độ pH của nước trong thí nghiệm tương
đối ổn định. Trong tất cả các nghiệm thức pH cao nhất là 8,44 ở nghiệm thức sử dụng dòng vi
khuẩn CP1 vào thời điểm 72 giờ sau khi xử lý. Nhìn chung trong cả thí nghiệm pH nước thay
đổi từ 6,89-8,44 và vẫn nằm trong giới hạn cho phép của TCVN 5942-95 - Chất lượng nước Tiêu chuẩn chất lượng nước mặt (mức B – Dùng cho mục đích giao thơng thuỷ, tưới tiêu, bơi
lội, nuôi thuỷ sản, trồng trọt...) pH = 5,5 – 9.
3.5.2. Ammonium (NH4+)
Hàm lượng NH4+ lúc bắt đầu thí nghiệm trong 10,513 mg/l. Bắt đầu sau 24 giờ đã có sự
khác biệt giữa các nghiệm thức sử dụng vi khuẩn P. stutzeri so với đối chứng không xử lý. Sau
48, 72 và 96 giờ tiếp theo sự khác biệt đó vẫn được suy trì và trong suốt q trình thí nghiệm 96
giờ khơng có sự khác biệt giữa các nghiệm thức được xử lý với vi khuẩn P. stutzeri với nhau.
Hình 4 cho thấy hàm lượng NH4+ giảm dần theo thời gian trong đó ba dịng vi khuẩn đều có khả
năng oxy hóa ammonium và làm giảm đáng kể lượng NH4+ với hiệu suất cao. Dòng CM8 sau
khi kết thúc 96 giờ thí nghiệm, hàm lượng NH4+ cịn lại 1,39 mg/l, hiệu suất oxy hóa là 86,77%;
dịng CP1 là 81,16%; và dòng PT5 là 77,35%. Kết quả này tương tự như thí nghiệm của Su et al
(2001), thực hiện với vi khuẩn P. stutzeri dịng NS-2 khi ni cấy trong mơi trường BM/NO3.
Theo TCVN 5942-95 giá trị cho phép của hàm lượng ammonium ở cột B là 1 mg/L, kết quả thí
nghiệm cho thấy hàm lượng ammonium sau khi xử lý đạt mức tương đương 1 mg/L, gần đạt
yêu cầu về chuẩn đầu ra của nước thải công nghiệp khi xả vào các nguồn tiếp nhận là các nguồn

nước không dùng cho mục đích cấp nước sinh hoạt.

Hình 4. Sự thay đổi nồng độ NH4+ ở các
nghiệm thức trong quá trình thí nghiệm

Hình 5. Sự thay đổi nồng độ NO3- ở các
nghiệm thức trong q trình thí nghiệm


3.5.3. Nitrat (NO3-)
Hàm lượng NO3- lúc bắt đầu thí nghiệm trong 2,91 mg/l. Sau 96 giờ thí nghiệm có sự
khác biệt giữa các nghiệm thức sử dụng vi khuẩn P. stutzeri so với đối chứng không xử lý và
trong suốt q trình thí nghiệm 96 giờ khơng có sự khác biệt giữa các nghiệm thức được xử lý
với vi khuẩn P. stutzeri với nhau. Hình 5 cho thấy hàm lượng NO3- giảm dần theo thời gian
trong đó ba dịng vi khuẩn đều có khả năng oxy hóa NO3- và làm giảm đáng kể lượng NO3- với
hiệu suất cao. Dòng PT5 sau khi kết thúc 96 giờ thí nghiệm, hàm lượng NO3- cịn lại 1,77 mg/l,
hiệu suất oxy hóa là 39,18%; dòng CP1 là 2,26 mg/l (hiệu suất 22,34%), và dòng CM8 là 2,29
mg/l thấp nhất (hiệu suất 21,31%) nhưng khác biệt khơng ý nghĩa so với 2 nghiệm thức cịn lại.
Theo TCVN 5942-1995 quy định giới hạn các thông số và nồng độ cho phép của các
chất ô nhiễm trong nước mặt thì nồng độ NO3- < 15 mg/L (mức B). Như vậy, nồng độ NO3- đo
được trong các nghiệm thức còn ở mức rất thấp nên chưa ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát
triển của thủy sinh vật trong nước. Tuy nhiên, nồng độ nitrat không giảm nhiều sau 4 ngày thí
nghiệm có lẽ do sự chuyển hóa ammonium và nitrit sang nitrat kém vì trong các nguồn nước bị
ô nhiễm, NO3- là sản phẩm cuối cùng của q trình oxy hóa NH4+ (Lê Văn Cát et al., 2006).
3.5.4. Nitrit (NO2-)
Hàm lượng NO2- lúc bắt đầu thí nghiệm trong 1,43 mg/l. Bắt đầu sau 24 giờ đã có sự
khác biệt giữa các nghiệm thức sử dụng vi khuẩn P. stutzeri so với đối chứng không xử lý. Sau
48, 72 và 96 giờ tiếp theo sự khác biệt đó vẫn được suy trì và sau 96 giờ có sự khác biệt giữa
các nghiệm thức được xử lý với vi khuẩn P. stutzeri với nhau, trong đó hai dịng CP1 và CM8
đạt hiệu suất xử lý cao và khác biệt có ý nghĩa với dịng vi khuẩn PT5. Dịng CM8 sau khi kết

thúc 96 giờ thí nghiệm, hàm lượng NO2- cịn lại 0,02 mg/l, hiệu suất oxy hóa là 98,60%; dịng
CP1 là 97,90% so với dịng PT5 là 90,21%. Hình 6 cho thấy hàm lượng NO2- giảm dần theo
thời gian trong đó ba dịng vi khuẩn đều có khả năng oxy hóa nitrit và làm giảm đáng kể lượng
NO2- với hiệu suất cao.

Hàm lượng NO2- (mg/l)

Theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5942 –
1995 (mức B), chất lượng nước mặt quy
định nồng độ NO2- phải ở mức dưới 0,05
mg/L. Kết quả thí nghiệm cho thấy hai
dịng CP1, CM8 có khả năng xử lý tốt và
hàm lượng nitrit trong nước sau khi xử lý
đạt dưới mức tiêu chuẩn cho phép theo
TCVN 5942-1995.
Hình 6. Sự thay đổi nồng độ NO2- ở các
nghiệm thức trong q trình thí nghiệm
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

1. Kết luận
- Phân lập được 21 dịng vi khuẩn có khả năng phát triển trên mơi trường Minimal.
Trong đó, có 11/21 dịng được nhận diện chính xác là vi khuẩn P. stutzeri với cặp mồi đặc hiệu
fps158 và rps743. Kết quả giải trình tự cho thấy 2 dịng CM8 và PT5 có mức độ tương đồng với
vi khuẩn P. stutzeri là 99%.
- Đa số các dòng P. stutzeri phân lập được đều có khả năng phát triển trên mơi trường
Minimal có bổ sung NH4+, NO3- và NO2-. Trong đó, các dịng CP1, CM8, PT3, PT5 có khả năng
phát triển tốt ở nồng độ NH4+, NO3- lên đến 500 mM và trên mơi trường có bổ sung NO2- lên
đến 100 mM.
- Ba dòng vi khuẩn CP1, CM8, PT5 khi được sử dụng thí nghiệm trên nước thải ao ni
cá tra đều có khả năng oxy hóa NH4+, NO3- và NO2-, làm giảm đáng kể lượng các chất này với

hiệu suất cao và khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng khơng xử lý. Kết quả này đã cho thấy có
khả năng sử dụng vi khuẩn P. stutzeri trong việc khử đạm từ nước thải ao nuôi cá tra cũng như
mở ra hướng ứng dụng để xử lý các loại nước ô nhiễm nitrat khác.
2. Đề nghị


- Khảo sát khả năng khử đạm của các dòng vi khuẩn có khả năng phát triển trên mơi
trường có bổ sung NH4+, NO3- và NO2- cao trên nước thải ao nuôi cá tra ở mức độ lớn hơn và
các loại nước thải ô nhiễm đạm khác.
- Tiếp tục phân lập và nhận diện các dòng vi khuẩn P. stutzeri có khả năng khử đạm
hiệu quả hơn, phát triển thành chế phẩm sinh học xử lý môi trường nuôi thủy sản bị nhiễm
ammonia, nitrat nhằm đạt kết quả tốt nhất.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Bộ Khoa học Công nghệ và Môi trường. 2002. TCVN 5942 – 1995 - Chất lượng nước – Tiêu chuẩn chất
lượng nước mặt. Kèm theo quyết định số 35/2002/QĐ-BKHCN&MT ngày 25/6/2002.
Bennasar, A., C. Guasp, M. Tesar, and J. Lalucat. 1998. Genetic relationships among Pseudomonas
stutzeri strains based on molecular typing methods, J. App. Microbiol. 85: 643- 656.
Bennasar, A., C. Guasp and J. Lalucat. 1998. Molecular methods for the detection and identification of
Pseudomonas stutzeri in pure culture and environmental samples, Microb. Ecol. 35: 22- 33.
Garrity, G. M., J. A. Bell and T. Lilburn. 2005. Order IX. Pseudomonadales, Family I.
Pseudomonadaceae, Genus I. Pseudomonas. In Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, 2nd
Edition, Volume 2 The Proteobacteria, Part B The Gammaproteobacteria. Springer, New York. pp.
323-378.
Lee H. W., S. Y. Lee, J. W. Lee, J .B. Park, E. S. Choi, and Y. K. Park. 2002. Molecular characterization
of microbial community in nitrate-removing activated sludge, FEMS Microb. Ecol. 41: 85-94.
Phan Trường Khanh. 2007. Phân lập vi khuẩn Pseudomonas stutzeri trong đất đồng bằng sông Cửu Long
và ứng dụng xử lý ammonia trong nước ở điều kiện phòng thí nghiệm. Luận văn thạc sĩ Khoa học
mơi trường, trường Đại học Cần Thơ.
Sikorski, J., N. Teschner, and W. Wackernagel. 2002. Highly different levels of natural transformation
are associated with genomic subgroups within a local population of Pseudomonas stutzeri from soil,

Appl. Environ. Microbiol. 68 (2): 865- 873.
Su, J. J., J. Lin, B. Y. Liu, and J. B. Yang. 2001. Isolation of an aerobic denitrifying bacterial strain NS-2
from the activated sludge of piggery wastewater treatment systems in Taiwan possessing
denitrification under 92% oxygen atmosphere. J. Appl. Microbiol. 91: 853-860.
van Niel, C. B., and M. B. Allen. 1952. A note on of Pseudomonas stutzeri. Bacteriol. 64: 413- 422.


GIỚI THIỆU
Nền nông nghiệp ở đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) đã có nhiều khởi sắc
trong những năm gần đây. Nhiều tiến bộ kỹ thuật về trồng trọt, chăn nuôi, nuôi trồng
thủy sản đã được áp dụng rộng rãi và mang lại nhiều lợi ích kinh tế quan trọng và tạo
điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của các ngành. Tuy nhiên, khu vực này ngày càng
đối mặt với nhiều rủi ro về mặt môi trường và phát triển bền vững như: dư thừa thức ăn
trong nuôi trồng thủy sản, chất thải từ các hệ thống chăn nuôi gia súc, gia cầm làm ô
nhiễm nguồn nước, mất cân bằng sinh thái, bùng nổ sinh vật cạnh tranh hay bộc phát
dịch bệnh,…
Năm 2006, tổng số trang trại nuôi trồng thủy sản ở ĐBSCL là 25.147 (Tổng cục
Thống kê, 2008). Với số lượng như trên, vấn đề ô nhiễm môi trường chỉ là vấn đề thời
gian nếu khơng có biện pháp xử lý thích hợp. Trong chất thải từ các hệ thống nuôi trồng
thủy sản chứa một lượng đạm dưới dạng nitrate và ammonium đáng kể từ phân, nước
tiểu gia súc và chất thải từ phân cá và thức ăn dư thừa. Các chất này đi vào môi trường
đều là các chất gây ô nhiễm nghiêm trọng và một số chất như NO2-, NO3- có thể gây ra
ung thư (Nguyễn Đức Lượng, 2003).
Hiện nay vấn đề xử lý các hợp chất chứa đạm từ nước thải đã được nghiên cứu
nhiều, trong số đó biện pháp xử lý bằng vi sinh vật được chú ý đặc biệt do hiệu quả xử
lý cao và ít tốn chi phí. Trong xử lý nước thải, sự loại thải hợp chất đạm có thể được
thực hiện bởi sự kết hợp của q trình nitrate hóa (oxi hóa ammonium thành nitrate) và
q trình khử nitrate (khử nitrate thành N2O hoặc N2). Điều này đòi hỏi hoạt động phối
hợp hoặc nối tiếp của các nhóm vi sinh vật khác nhau, đặc biệt là vi khuẩn nitrate hóa
và vi khuẩn khử nitrate (Lee et al., 2002). Một số dòng vi khuẩn tham gia trong chu

trình nitơ như Pseudomonas stutzeri có khả năng khử đạm (denitrifying bacteria) dưới
dạng thức ăn thừa hoặc phân giúp giảm lượng nitrate, ammonium gây ô nhiễm nguồn
nước, cải thiện chất lượng nước ao ni, góp phần thực hiện nuôi thủy sản bền vững.
Với các lý do trên, đề tài “Phân lập và xác định khả năng khử đạm của vi khuẩn
Pseudomonas stutzeri trong nước thải ao ni cá tra” được thực hiện nhằm mục đích
phân lập được lồi Pseudomonas stutzeri có khả năng khử đạm tốt phục vụ cho việc xử
lý nước thải từ các trại ni trồng thủy sản nhằm góp phần hạn chế ô nhiễm môi trường.
1. Mục tiêu của đề tài:
Phân lập được lồi Pseudomonas stutzeri có khả năng khử đạm tốt phục vụ cho
việc xử lý đạm dạng nitrate trong nước thải từ các ao ni cá Tra góp phần hạn chế sự ô
nhiễm nitrate trong môi trường nước.
2. Nội dung nghiên cứu của đề tài:
- Phân lập loài vi khuẩn Pseudomonas stutzeri có khả năng khử (loại bỏ) đạm dạng
NO3- thành N2 trong nước thải ao nuôi cá tra tại tỉnh An Giang.
+ Lấy mẫu tại các ao nuôi cá tra trong tỉnh An Giang.
+ Phân lập vi khuẩn Pseudomonas stutzeri trong phịng thí nghiệm.
+ Dùng phương pháp PCR kết hợp giải trình tự để nhận diện chính xác lồi vi
khuẩn Pseudomonas stutzeri.

1


+ Thử nghiệm khả năng khử đạm của Pseudomonas stutzeri trong điều kiện
phịng thí nghiệm.
- Thử nghiệm xử lý khả năng khử đạm của loài vi khuẩn Pseudomonas stutzeri này
trong điều kiện ngồi thực tế ở quy mơ nhỏ.

2

CHƯƠNG 1
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
1.1. Chu trình Nitrogen
Nitrogen là một chất cần thiết cho sự sống, là thành phần của protein và
nucleic acid trong các tế bào động vật, thực vật và vi sinh vật. Khí nitrogen là khí chiếm
lượng nhiều nhất trong khơng khí (79%) và là yếu tố dinh dưỡng giới hạn trong môi
trường nước và trong các loại đất nông nghiệp, tạo nên sự thiếu hụt protein cho hàng
triệu người ở các quốc gia đang phát triển. Tuy vậy, khí nitrogen lại khơng thể được sử
dụng bởi hầu hết các sinh vật nếu trước hết nó khơng được chuyển thành ammonia.
Điều này do N2 là một phân tử rất bền vững có thể chịu được các thay đổi chỉ dưới các
điều kiện cực kỳ khắc nghiệt (chẳng hạn như tia lửa điện, nhiệt độ và áp suất cao).

Hình 1. Chu trình nitrogen (Nguồn: Tortora et al., 2004)
1.2. Vi sinh vật của chu trình Nitrogen
Các vi sinh vật tác động như một nhân tố chủ yếu của chu trình nitrogen trong
mơi trường. Chu trình nitrogen được trình bày ở Hình 1. Có 5 bước tác động (tham gia)
của vi sinh vật vào chu trình nitrogen: Cố định đạm, đồng hóa đạm, khống hóa đạm, sự
nitrat hóa và sự khử nitrat.
1.2.1. Cố định đạm
Sự biến đổi hóa học của nitrogen đòi hỏi nhiều năng lượng và rất đắt tiền. Liên
quan đến sự biến đổi sinh học của nitrogen, chỉ có một vài lồi vi khuẩn và vi khuẩn
lam là có khả năng thực hiện việc cố định đạm, kết quả cuối cùng là tạo thành ammonia.
Sự cố định đạm sinh học trên toàn cầu xấp xỉ 2 x 108 tấn nitrogen/ năm. Các nhà nông
3


học đã có những cố gắng đáng kể để khai thác quá trình cố định đạm sinh học nhằm đưa
sản lượng cây trồng lên mức tối đa (Bitton, 2005).
1.2.2. Sự đồng hóa Nitrogen
Các vi sinh vật tự dưỡng và dị dưỡng hấp thu và đồng hóa NH4+ và NO3- sau

khi biến đổi NH4. Sự đồng hóa là nguyên nhân của việc loại bỏ nitrogen từ các nhà máy
xử lý nước thải. Các tế bào thực vật và tảo hấp thu nitrogen tốt nhất ở dạng NH4+. Trong
đất, phân bón chứa NH4+ được ưa thích sử dụng hơn loại phân bón chứa NO3-.
Các tế bào chuyển NO3- hay NH4+ thành protein và tăng trưởng trừ khi
nitrogen bị giới hạn. Với mỗi 100 đơn vị carbon được đồng hóa, các tế bào cần khoảng
10 đơn vị nitrogen (tỉ lệ C/N = 10).
1.2.3. Sự khống hóa đạm (Ammonium hóa)
Sự ammonium hóa là sự chuyển dạng của các hợp chất hữu cơ chứa nitrogen
thành các dạng vơ cơ. Q trình này được điều khiển bởi nhiều loại vi sinh vật khác
nhau (vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm). Trong đất, vài loại hợp chất hữu cơ chứa nitrogen trở
nên kháng với sự phân hủy sinh học do cấu tạo phức tạp của chúng với các hợp chất
phenol, polyphenol hay cả hai.
Các protein được khống hóa thành NH4+theo các bước sau:
Proteins → Amino acids → Khử amin thành NH4+
1.2.4. Sự nitrat hóa
Sự nitrat hóa là sự chuyển đổi ammonium (NH4+) thành nitrat (NO3-) bằng
hoạt động của các vi sinh vật. Quá trình này được thực hiện bằng hai loại vi sinh vật,
trong hai giai đoạn: chuyển ammonium thành nitrit và chuyển nitrit thành nitrat.
Chuyển ammonium thành nitrit: Việc chuyển ammonium thành nitrit được
thực hiện bởi các vi khuẩn oxi hóa ammonium (AOB), các vi khuẩn này được xếp vào
nhóm phụ beta (Nitrosomonas, Nitrosospira, Nitrosolobus, và Nitrosovibrio) và gamma
proteobacteria (Nitrosococcus) (Purkhold et al., 2003). Nitrosomonas (như loài N.
europaea) là lồi vi khuẩn tự dưỡng oxi hóa ammonium thành nitrit thông qua
hydroxylamine (NH2OH). Trong hầu hết các môi trường nước thải, các AOB chiếm ưu
thế đều nằm trong genus Nitrosomonas.
Các phản ứng chuyển hóa ammonium thành nitrite:
NH3 + O2 + 2H+

Ammonia
monooxygenase

NH2OH + H2O

NH2OH + H2O → NO2 + 5 H

+

Phản ứng tổng quát là:
Hydroxylamine
oxidoreductase

NH3 + 3/2 O2

NO2− + H+ + H2O

Việc chuyển nitrit thành nitrat: Việc chuyển nitrit thành nitrat được thực
hiện bởi các vi khuẩn oxi hóa nitrit (NOB). Các lồi được xếp vào nhóm phụ alpha của
proteobacteria và các loài tự dưỡng bắt buộc ngoại trừ Nitrobacter, lồi có thể sinh
trưởng dị dưỡng với sự hiện diện của acetate, formate, hoặc pyruvate. Ví dụ,
4


Nitrobacter (chẳng hạn N. agilis, N. winogradski) chuyển đổi nitrit thành nitrat (Bitton,
2005):
NO2− + ½ O2

Nitrite
oxidoreductase

NO3−

Các vi khuẩn oxi hóa nitrit khác là Nitrospina, Nitrospira, và Nitrococcus.
Nitrobacter đã được nghiên cứu nhiều trong các nhà máy xử lý nước thải và các môi
trường khác, Nitrospira thường được phát hiện trong các nitrifying biofilm và các mẫu
bùn hoạt tính, bằng cách sử dụng lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) và đôi khi genus NOB
chiếm ưu thế được tìm thấy trong các mơi trường nước thải (Bitton, 2005).
Sự oxi hóa NH3 thành NO2− và sau đó thành NO3− là một q trình tạo năng
lượng. Các vi sinh vật sử dụng năng lượng được tạo ra để đồng hóa CO2. Nhu cầu
carbon của các vi khuẩn nitrat hóa được đáp ứng ở dạng CO2, bicarbonate hay
carbonate. Sự nitrat hóa được xảy ra với sự hiện diện của oxygen và môi trường kiềm để
trung hịa các ion H+ được tạo ra trong q trình oxi hóa. Theo U.S. EPA, nhu cầu
oxygen là 4,6 mg O2/mg ammonia được oxi hóa thành nitrat (Bitton, 2005). Dù chúng là
các thể hiếu khí bắt buộc, các vi khuẩn nitrat hóa có ái lực yếu với oxy hơn các vi khuẩn
dị dưỡng hiếu khí khác. pH tối thích cho sự sinh trưởng của Nitrobacter là 7,5-8,0
(Spieck và Bock, 2005). Kết quả tạo thành acid từ sự nitrat hóa có thể gây ra một số vấn
đề về sự suy giảm các chất đệm trong nước thải.
1.2.5. Sự khử nitrat
Theo Knowles (1982), sự khử nitrat được quan tâm nghiên cứu nhiều do một
số lý do chủ yếu sau: (i) Nó là cơ chế chủ yếu làm mất đi một lượng lớn phân bón chứa
nitrogen bón cho cây trồng, qua đó làm giảm hiệu quả sử dụng phân; (ii) Nó có khả
năng ứng dụng rất cao trong việc loại bỏ các chất chứa nitrogen từ các chất thải chứa
hàm lượng nitrogen cao như trong chất thải chăn nuôi; (iii) Sự khử nitrat là một q
trình rất quan trọng góp phần đưa khí nitrous oxide (N2O) vào khí quyển, làm phá hủy
tầng ozone; (iv) Sự khử nitrat là cơ chế giúp làm cho chu trình nitrogen trên trái đất
được cân bằng trở lại.
Hai cơ chế quan trọng của sự biến đổi sinh học nitrat là sự đồng hóa và dị hóa
nitrat (Bitton, 2005).
¾
Sự biến đổi bằng cách đồng hóa nitrat: Bằng cơ chế này, nitrat được
hấp thu và được chuyển đổi thành nitrit và sau đó thành ammonium bởi cây trồng và các

vi sinh vật (Knowles, 1982).
¾
Sự biến đổi bằng cách dị hóa nitrat (sự khử nitrat-denitrification):
Đây là sự hơ hấp hiếm khí trong đó NO3− hay NO2− là chất nhận điện tử cuối cùng.

NO3− hay NO2− được biến đổi thành nitrite oxide (NO), nitrous oxide (N2O) và cuối
cùng thành khí nitrogen (N2). Sự phóng thích N2 chiếm ưu thế ở đầu ra của sự khử
nitrat. Các vi sinh vật có liên quan đến sự khử nitrat là các vi sinh vật tự dưỡng hiếu khí
hay dị dưỡng có thể chuyển sang sinh trưởng hiếm khí khi nitrat được sử dụng như là
chất nhận điện tử. Trong số này các loài vi khuẩn như Pseudomonas aeruginosa và
Paracoccus denitrificans, Pseudomonas stutzeri có thể tạo ra các sản phẩm cuối cùng
khác nhau khi tham gia vào q trình khử nitrate: lồi Pseudomonas aeruginosa và
Paracoccus denitrificans tạo ra chủ yếu là nitrous oxide, Pseudomonas stutzeri chỉ tạo
ra sản phẩm cuối cùng là khí nitrogen (N2) (Carlson et al., 1983).
5


Sự khử nitrat có thể được thực hiện theo trình tự sau (Zumft, 1997):

NO3−

Nitrate
reductase

NO2−

Nitrite
reductase

NO

Nitric oxide
reductase

N 2O

Nitrous oxide
reductase

N2

Từng phản ứng riêng lẻ được thể hiện như sau (Heylen, 2006):

NO3− + 2e- + 2H+ → NO2− + H2O
NO2− + e- + 2H+ → NO + H2O
2NO + 2e- + 2H+ → N2O + H2O
N2O + 2e- + 2H+ → N2 + H2O
Các vi sinh vật khử nitrat được xếp vào vài nhóm sinh lý (organotrophs,
lithotrophs, and phototrophs) và nhóm phân loại (Bitton, 2005) và có thể sử dụng nhiều
nguồn năng lượng khác nhau (các chất hữu cơ hoặc vô cơ hay ánh sáng). Các vi sinh vật
có khả năng khử nitrat được xếp vào các giống (genera) sau: Pseudomonas, Bacillus,
Spirillum, Hyphomicrobium, Agrobacterium, Acinetobacter, Propionobacterium,
Rhizobium, Corynebacterium, Cytophaga, Thiobacillus, và Alcaligenes. Các giống phân
bố rộng rãi nhất có lẽ là Pseudomonas (P. fluorescens, P. aeruginosa, P. denitrificans)
và Alcaligenes, lồi thường được tìm thấy trong đất, nước và nước thải. Nitrous oxide
(N2O) có thể được tạo ra trong suốt quá trình khử nitrat trong nước thải, đưa đến sự loại
bỏ khơng hồn tồn nitrat. Loại khí này là chất gây ơ nhiễm khơng khí chính, sự tạo
thành chúng phải được ngăn ngừa hoặc làm giảm đến mức tối thiểu. Dưới các điều kiện
nào đó, dưới 8% nitrat được chuyển thành N2O; các điều kiện thích hợp cho sự tạo
thành chúng là COD/NO3 thấp, thời gian giữ chất rắn ngắn và pH thấp (Bitton, 2005).

Sự hô hấp nitrat cũng có thể được quan sát dưới các điều kiện hiếu khí và nó
được điều khiển bởi enzyme nitrat reductase nằm trong vùng periplasmic của vi khuẩn.
Vài loài vi khuẩn có khả năng hơ hấp nitrat hiếu khí được phân lập từ đất và bùn
(sediment) và từ mặt trên của lưới lọc kỵ khí (Carter et al., 1995).
1.3. Vi khuẩn Pseudomonas stutzeri
1.3.1. Vị trí của Pseudomonas stutzeri trong hệ thống phân loại sinh vật
Theo Garrity (2005) vị trí của vi khuẩn Pseudomonas stutzeri trong hệ thống
phân loại vi khuẩn của Bergey như sau:
Kingdom: Bacteria
Phylum: Proteobacteria
Class: Gamma Proteobacteria
Order: Pseudomonadales
Family: Pseudomonadaceae
Genus: Pseudomonas
Species: Pseudomonas stutzeri
Loài vi khuẩn Pseudomonas stutzeri được phân lập và xác định lần đầu tiên bởi
Burri và Stutzer vào 1895 với tên gọi là Bacillus denitrificans II, sau đó được van Niel
và Allen xác định tên chính thức của nó là Pseudomonas stutzeri (van Niel và Allen,

6


1952). Đây là lồi vi khuẩn Gram âm, hình que, kích thước khoảng 1,4-2,8 x 0,7-0,8, di
chuyển bằng 1 chiên mao ở đầu. Các dòng khuẩn lạc được phân lập đến nay đều là dính
chặt, có màu nâu tối và có đặc điểm bên ngồi nhăn nheo, đặc điểm này thường bị mất
đi sau vài lần được cấy truyền trong mơi trường thí nghiệm (Garrity, 2005). Các khuẩn
lạc cuối cùng có thể trở nên trơn láng, đặc (butyrous) và mất màu. Phản ứng dương tính
với gelatinase. Trong số các đặc điểm để nhận diện Pseudomonas stutzeri là khả năng
khử nitrat mạnh, sự xuất hiện các khuẩn lạc và việc sử dụng tinh bột làm nguồn carbon
và năng lượng duy nhất. Có thể sinh trưởng ở nhiệt độ từ 4-45oC (Lalucat et al., 2006).

Nhiệt độ tối thích khoảng 35oC (van Niel và Allen, 1952). pH tối thích khoảng 7 nhưng
có thể sinh trưởng ở pH 9 (van Niel và Allen, 1952). Hàm lượng G-C của DNA từ 60,666,3 (Garrity, 2005). Dòng mẫu của loài là: AB 201, ATCC 17588, CCUG 11256, DSM
5190 được đăng ký trên GenBank.
Được tìm thấy trong đất và nước, có thể được phân lập sau khi tăng sinh trên
mơi trường có nitrat dưới các điều kiện hiếm khí ở 30oC sử dụng các nguồn carbon khác
nhau. L (+) - tartrate cho thấy kết quả tuyệt vời khi tăng sinh (van Niel và Allen, 1952)
dù một nghịch lý là các dịng nhận được bằng cách này khơng thể sinh trưởng với tartrat
khi ni cấy thuần (Garrity, 2005).

Hình 2: Một số dạng khuẩn lạc của vi khuẩn Pseudomonas stutzeri
(Lalucat et al., 2006)

7


1.3.2. Các gen tham gia vào quá trình khử nitrat của Pseudomonas stutzeri
Khả năng khử nitrat của Pseudomonas stutzeri cơ bản dựa trên tồn bộ các gen
mã hóa cho các enzyme dị hóa nitrat (dissimilatory reductase) chứa bên trong. Chúng
bao gồm: gen nar (nitrate reductase), gen nir (nitrite reductase), gen nor (nitric oxide
reductase) và gen nos (nitrous oxide reductase) (Lalucat et al., 2006). Tổ chức của toàn
bộ các gen này trong vi khuẩn Pseudomonas stutzeri được trình bày trong Hình 2.

Hình 3. Tổ chức của các gen tham gia vào quá trình khử nitrate của vi khuẩn
Pseudomonas stutzeri (Lalucat et al., 2006)
Trong đó, các gen nar khơng liên kết với các gen khác như nir, nor hay nos
trong quá trình khử nitrat mà nằm tách biệt ra thành một nhóm trên một locus riêng. Các
gen nos liên kết với gen nor và nir hình thành một nhóm lớn khoảng 30 kb (Braun et al.,
1992) chứa trong đó 33 gen khác nhau (Zumft, 1997).
1.3.3. Một số nghiên cứu về khả năng khử nitrat của Pseudomonas stutzeri
¾ Trên thế giới:

Pseudomonas stutzeri là một loài vi khuẩn được phân bố rộng rãi nhất trong mơi
trường tự nhiên. Lồi này được quan tâm nhiều vì đặc điểm tính chất đa dạng của các
q trình chuyển hóa của chúng đối với nhiều loại hợp chất khó phân hủy trong tự nhiên
(Bennasar et al., 1998), chẳng hạn như phân hủy các hợp chất o-xylene (Baggi et al.,
1987), carbazol/dioxin (Shintani et al., 2003), oxy hóa hiếm khí hợp chất 2chloroethanol (Dijk et al., 2003),… Tuy nhiên, khả năng khử nitrat là một đặc tính bền
vững của Pseudomonas stutzeri, loài vi khuẩn này là một trong những loài vi khuẩn dị
dưỡng khử nitrat hiệu quả nhất và được xem như là một hệ thống chuẩn của quá trình
khử nitrat bằng vi khuẩn (Zumft, 1997).
Pseudomonas stutzeri đã được biết là một lồi vi khuẩn khử nitrat rất mạnh, có
khả năng sinh trưởng trên môi trường chứa nitrat, nitrit và nitrous oxide. Beijerinck và
Minkman cho rằng dòng vi khuẩn β mà Gayon và Dupetit (những nguời đầu tiên nghiên
cứu về quá trình khử nitrat) sử dụng cho việc nghiên cứu của họ là dòng Bacillus
stutzeri (hiện nay là Pseudomonas stutzeri) (Zumft, 1997).
Carlson et al. (1983) đã nghiên cứu khả năng khử nitrat của Pseudomonas
stutzeri, Pseudomonas aeruginosa và Paracoccus denitrificans. Kết quả cho thấy rằng
Pseudomonas stutzeri chỉ tạo ra sản phẩm là khí N2 trong khi Pseudomonas aeruginosa
tạo ra nhiều khí nitrous oxide (N2O) hơn là N2. Thêm vào đó một bất lợi là
Pseudomonas aeruginosa làm giảm luợng nitrat, nitrit và nitrous oxide chậm và khơng
có khả năng sinh trưởng hiếm khí, điều này hồn tồn có thể được thực hiện bởi
Pseudomonas stutzeri. Thí nghiệm này chứng tỏ Pseudomonas stutzeri là lồi vi khuẩn
có thể được tiếp tục nghiên cứu sâu hơn trong quá trình khử nitrat.

8


Su et al. (2001) đã phân lập được dòng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri NS-2 có
khả năng khử nitrat ở điều kiện oxy trong khơng khí bão hịa trong điều kiện xử lý chất
thải chăn nuôi heo bằng hệ thống bùn hoạt tính của hệ thống xử lý. Đây cũng là một đặc
điểm ưu việt của loài vi khuẩn Pseudomonas stutzeri khi nó có thể hoạt động cả trong

điều kiện hiếm khí lẫn hiếu khí, điều kiện mà các enzyme tham gia vào q trình khử
đạm của các lồi vi khuẩn khác có thể bị bất hoạt bởi nồng độ oxy khơng khí cao q
mức.
¾ Tại Việt Nam:
Phan Trường Khanh (2007) đã thực hiện đề tài “Phân lập vi khuẩn
Pseudomonas stutzeri trong đất đồng bằng sông Cửu Long và ứng dụng xử lý
ammonium trong nước ở điều kiên phịng thí nghiệm”. Tác giả đã phân lập được 20
dòng vi khuẩn từ 36 mẫu đất đã thu thập ở 6 tỉnh: Long An, Đồng Tháp, Cần Thơ, An
Giang, Sóc Trăng, Bạc Liêu. Tác giả đã nhận diện được một dòng Pseudomonas
stutzeri bằng cặp mồi đặc trưng 16S rDNA. Bước đầu khảo sát khả năng khử đạm trong
nước ao nuôi tôm bị nhiễm ammonia.
Nguyễn Trần Hải Bằng (2008), dùng cặp mồi đặc hiệu nosZ2F-nosZ2R và cd1nirF-cd1- nirR đã nhận diện được 6 dòng Pseudomonas stutzeri có chứa gen nosZ, và 8
dịng có chứa gen cd1- nir.
Tơ Thị Lài (2008), ở qui mơ phịng thí nghiệm cho thấy các dịng vi khuẩn
Pseudomonas stutzeri phân lập từ mơi trường ni cá tra đều có khả năng xử lý
ammonia hiệu quả.
1.4. Các dạng đạm chính trong môi trường nước
1.4.1. Ammonium (NH4+)
NH4+ trong nước rất cần thiết cho sự phát triển của các sinh vật làm thức ăn tự
nhiên, nhưng nếu hàm lượng NH4+ quá cao sẽ làm cho thực vật phù du phát triển quá
mức không có lợi cho cá . Trong các ao hồ ni thâm canh, amoni thường có mặt với
nồng độ khá cao, nó có độc tính đối với thủy sản. Theo Boyd (1990) hàm lượng NH4+
thích hợp cho ao ni thủy sản là 0,2 – 2 mg/L.
Ammoniac (NH3) là chất bài tiết dạng nitơ của hầu hết các loài thủy động vật,
một số loài bài tiết dạng urin nhưng dễ dàng chuyển hóa thành ammoniac và carbon
dioxit. Ammoniac cũng hình thành từ quá trình phân hủy chất hữu cơ chứa nitơ như
thức ăn tổng hợp (protein) hay phân hủy tảo chết. Ammoniac tồn tại trong nước ở thế
cân bằng với ion amoni, tại pH = 9,25 thì lượng amoni bằng lượng ammoniac, tại vùng
pH cao thì dạng tồn tại sẽ dịch chuyển về ammoniac và ngược lại. Trong hai dạng tồn
tại trên thì ammoniac là dạng gây độc đối với thủy động vật. Ammoniac và amoni là

dạng phân đạm ưa chuộng của thực vật, nó thúc đẩy sự phát triển mạnh của tảo trong
các ao hồ nuôi thủy sản (Lê Văn Cát et al., 2006).
NH3 là yếu tố quan trọng có ảnh lớn đến tỷ lệ sống, sinh trưởng đối với thủy sinh
vật. NH3 là khí độc đối với thủy sinh vật cịn ion NH4+ khơng độc và nồng độ gây độc đối
với cá là 0,6 - 2,0 ppm. Tác dụng độc hại của NH3 đối với cá là khi hàm lượng NH3 trong
nước cao, cá khó được bài tiết NH3 từ máu ra mơi trường ngồi. NH3 trong máu và các
mơ tăng làm pH máu tăng dẫn đến rối loạn những phản ứng xúc tác của enzyme và độ
bền vững của màng tế bào đưa đến cá chết vì khơng điều khiển được quá trình trao đổi
muối giữa cơ thể và mơi trường ngồi (Trương Quốc Phú et al., 2006).
Ammoniac được tạo thành trong nước do sự phân giải các chất hữu cơ có
trong nước. NH3 là loại khí độc đối với cá, khí được tạo thành sẽ phản ứng với nước
9


sinh ra ion NH4+ cho đến khi cân bằng được thiết lập. Nồng độ NH3 phụ thuộc vào 2
yếu tố nhiệt độ và pH. Khi nhiệt độ và pH của nước tăng thì hàm lượng NH3 sẽ gia
tăng và ngược lại. NH3 cao cũng làm tăng tiêu hao oxy của mô, làm tổn thương
mang và làm giảm khả năng vận chuyển của máu. Ở hàm lượng dưới mức gây chết
NH3 cũng có ảnh hưởng xấu đến thủy sinh vật như: nó gia tăng tính mẫn cảm của
động vật đối với những điều kiện không thuận lợi của môi trường như sự giao động
của nhiệt độ, thiếu oxy, ức chế sự sinh trưởng bình thường, giảm khả năng sinh sản,
giảm khả năng chống bệnh. Do đó, việc theo dõi hàm lượng NH3 trong ao nuôi thủy
sản là rất cần thiết để nâng cao năng suất nuôi (Boyd, 1990).
1.4.2. Nitrat (NO3-)
Nitrat trong thủy vực là sản phẩm của hóa trình nitrat hóa nhờ hoạt động của
một số vi khuẩn hóa tự dưỡng như: Nitrobacter, Nitrospina, Nitrosococcus.
NO2- + ½ O2
NO3- + 24 kcal.
Nitrat là hợp chất khá thông dụng trong môi trường nước tự nhiên cũng như
trong các ao, hầm nuôi trồng thủy sản. Nitrat là sản phẩm cuối cùng của sự phân hủy

các chất chứa nitơ. Nồng độ NO3- cao là môi trường dinh dưỡng tốt cho tảo, rong phát
triển gây ảnh hưởng đến chất lượng nước dùng trong sinh hoạt và thủy sản. Trẻ em uống
nước có nồng độ nitrat cao có thể ảnh hưởng đến máu (chứng methaemoglo binaemia).
Theo quy định của tổ chức y tế thế giới nồng độ NO3- trong nước uống khơng được vượt
q 10 mg/L (tính theo nitơ).
Nitrate là một trong những dạng đạm được thực vật hấp thu dễ nhất, không độc
đối với thủy sinh vật. Hàm lượng trong các thủy vực nước ngọt có thể lên tới hàng chục
ppm. Nồng độ thích hợp cho các ao nuôi cá là 0,1 - 10 mg/L. Hàm lượng nitrat cao
khơng gây độc cho cá nhưng có thể làm thực vật phù du nở hoa gây những biến đổi chất
lượng nước khơng có lợi cho tơm cá ni (Trương Quốc Phú et al, 2006).
1.4.3. Nitrit (NO2-)
Nitrit (NO2-) có trong nước do các nguồn ô nhiễm xâm nhập vào hoặc là hợp
chất trung gian của quá trình phân hủy sinh ra từ amoniac thành nitrat. Nó cũng là tác
nhân gây độc đối với động vật thủy sinh. Nitrit thâm nhập vào cơ thể cá qua mang. Tại
vùng pH rất thấp nitrit tồn tại trong phân tử axit nitrơ (HNO2) trung hịa vì nó là axit yếu
(Lê Văn Cát et al., 2006).
Trong các thủy vực Nitrit (NO2-) được tạo ra từ q trình oxy hóa ammonia
(NH3) và ammonium (NH4+) nhờ hoạt động của nhóm vi khuẩn hiếu khí. Khi hàm
lượng nitrit cao, nitrit sẽ kết hợp với hemoglobin tạo thành methemoglobin, lúc này Fe
của hemoglobin bị oxy hóa từ Fe2+ thành Fe3+, methemoglogin không kết hợp với oxy
gây hiện tượng thiếu máu. Máu có chứa methemoglobin thường có màu nâu nên nó
được gọi là “bệnh máu nâu” (Trương Quốc Phú et al., 2006).
Nitrit hấp thụ vào máu qua mang, mức độ hấp thụ nitrit phụ thuộc vào tỷ lệ nitrit
và chloride trong môi trường nước (Boyd, 1990) và khả năng chịu đựng nitrit có liên
quan đến hàm lượng chloride. Khi cá nheo sống trong mơi trường nước có tỉ lệ
nitrit:chloride 1:1 thì methemoglobin chiếm 85 % trong máu, trong khi mơi trường nước
có nitrit:chloride 1:3 thì hàm lượng methemoglobin chiếm 25 %.
1.4.4. Nhu cầu oxy hóa học - COD (Chemical Oxygen Demand)
Chỉ số này được dùng rộng rãi để biểu thị hóa hàm lượng chất hữu cơ trong
nước thải và mức độ ô nhiễm nước tự nhiên. COD là lượng oxy cần thiết cho q trình

oxy hóa hóa học các chất hữu cơ trong nước thành CO2 và H2O (thể hiện bằng gam
10


hoặc miligam oxy theo đơn vị thể tích). Như vậy, COD là lượng oxy cần để oxy hố
tồn bộ các chất hố học trong nước, trong khi đó BOD là lượng oxy cần thiết để oxy
hoá một phần các hợp chất hữu cơ dễ phân huỷ bởi vi sinh vật.

11