Khảo sát ảnh hưởng nồng độ BA và NAA lên sự tạo và nhân nhanh chồi của lan giả hạc dendrobium anosmum bằng phương pháp nuôi cấy mô

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG
KHOA NÔNG NGHIỆP & TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN

PHẠM VĨNH SƠN

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG NỒNG ĐỘ BA VÀ NAA
LÊN SỰ TẠO VÀ NHÂN NHANH CHỒI CỦA
LAN GIẢ HẠC (Dendrobium anosmum )
BẰNG PHƯƠNG PHÁP
NUÔI CẤY MÔ

An Giang, năm 2012


TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG
KHOA NÔNG NGHIỆP & TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN

PHẠM VĨNH SƠN

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG NỒNG ĐỘ BA VÀ NAA
LÊN SỰ TẠO VÀ NHÂN NHANH CHỒI CỦA
LAN GIẢ HẠC (Dendrobium anosmum )
BẰNG PHƯƠNG PHÁP
NUÔI CẤY MÔ

Giáo viên hướng dẫn:

Ths. Nguyễn Thị Mỹ Duyên

An Giang, năm 2012


Đề tài: KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG NỒNG ĐỘ BA VÀ NAA
LÊN SỰ TẠO VÀ NHÂN NHANH CHỒI CỦA
LAN GIẢ HẠT (Dendrobium anosmum )
BẰNG PHƯƠNG PHÁP
NUÔI CẤY MÔ

Do sinh viên: PHẠM VĨNH SƠN, MSSV: DSH084210 thực hiện và đệ nạp.
Kính trình Hội đồng nghiệm thu đề tài nghiên cứu khoa học sinh viên xét duyệt.

An Giang, ngày 25 tháng 05 năm 2012
XÁC NHẬN CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

ThS. Nguyễn Thị Mỹ Duyên
XÁC NHẬN CỦA KHOA

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI

Phạm Vĩnh Sơn
XÁC NHẬN CỦA BAN GIÁM HIỆU


Tóm lược
Ngày nay, cùng với sự phát triển vượt bậc của xã hội thì nhu cầu về hoa kiểng của
con người cũng ngày càng cao. Trong đó, lan Giả hạc (Dendrobium anosmum) là
đối tượng được quan tâm đặc biệt và đang dần trở thành mặt hàng chiến lược của

nhiều quốc gia, trong đó có Việt Nam. Chính vì vậy, việc áp dụng công nghệ nuôi
cấy mô - tế bào thực vật đối với Dendrobium anosmum là cần thiết. Trên cơ sở thực
tế đó, đề tài “Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA lên sự tạo và nhân
chồi của lan Giả hạc (Dendrobium anosmum) bằng phương pháp nuôi cấy mô”
được thực hiện nhằm đáp ứng nhu cầu về nguồn cây giống lớn cho thị trường.
Kết quả nghiên cứu cho thấy:
− Để tiến hành tạo chồi từ đoạn thân có mang chồi ngủ nên chọn các đoạn
thân trẻ (gần đỉnh chồi) sẽ cho khả năng tái sinh chồi cao hơn những đoạn
thân già (ở xa đỉnh chồi).
− Trong cả 2 trường hợp cắt đoạn thân và để nguyên không cắt thì mơi trường
MS + 0,5 mg/l NAA + 2 mg/l BA hoặc 3 mg/l BA đều cho hiệu quả nhân
chồi lan Giả hạc tốt.
− Môi trường MS + 0,5 mg/l NAA + 3 mg/l BA cho hiệu quả nhân chồi tốt
nhất sau 12 tuần nuôi cấy, đạt 8,76 chồi với mẫu cấy là chồi nguyên và
12,50 chồi với mẫu cấy là cắt đoạn.

i


Lời cảm tạ

Trước hết con xin khắc ghi công ơn cha mẹ đã hết lòng chăm lo vật chất, tạo mọi
điều kiện thuận lợi cho con học tập và hoàn thành đề tài này.
Tôi xin chân thành cảm ơn:
Cô Nguyễn Thị Mỹ Duyên đã tận tình hướng dẫn, động viên tơi trong suốt q trình
thực hiện và giúp tơi giải quyết những khó khăn để hồn thành đề tài này.
Các cán bộ phịng thí nghiệm đã tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tơi hồn thành đề
tài. Cơ Hiền và cơ Giang ln đóng góp ý kiến khi tơi gặp khó khăn.
Chị Lê Thị Thiên Khoa và anh Nguyễn Minh Mẫn đã ln bên tơi, giúp tơi giải quyết
khó khăn trong suốt q trình thực hiện đề tài.

Bạn Nguyễn Hồi Thanh, Nguyễn Thị Lan Vi, Nguyễn Thị Hồng Hoa và các em sinh
viên khố 10SH đã ln giúp đỡ,động viên tơi trong suốt q trình thực hiện đề tài
này.
Các bạn sinh viên ngành Cơng Nghệ Sinh Học khóa 2008 – 2012 luôn quan tâm và
động viên tôi trong thời gian tơi tiến hành thí nghiệm.
Một lần nữa tơi xin chân thành cảm ơn mọi người. Chúc mọi người thật nhiều sức
khỏe và thành công trong cuộc sống.
An giang, tháng 05 năm 2012
Sinh viên thực hiện
Phạm Vĩnh Sơn

ii


Mục lục
Nội dung

Trang

Tóm lược .................................................................................................................. i
Lời cảm tạ ............................................................................................................... ii
Mục lục .................................................................................................................. iii
Danh sách bảng ........................................................................................................v
Danh sách hình....................................................................................................... vi
Danh mục các từ viết tắt ....................................................................................... vii
Chương 1 Mở đầu ..................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề .........................................................................................................1
1.2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................1
1.3. Nội dung nghiên cứu.........................................................................................2
Chương 2 Lược khảo tài liệu ................................................................................3

2.1. Giới thiệu lan Giả hạc (Dendrobium anosmum) ...............................................3
2.1.1. Nguồn gốc và phân loại .................................................................................3
2.1.2. Đặc điểm thực vật ..........................................................................................3
2.1.2.1. Cơ quan dinh dưỡng ...................................................................................3
2.1.2.2. Cơ quan sinh sản ........................................................................................4
2.1.3. Trồng trọt và chăm sóc ..................................................................................4
2.2. Ni cấy mơ - tế bào thực vật ...........................................................................5
2.2.1. Cở sở của nuôi cấy mô - tế bào thực vật ........................................................6
2.2.1.1. Tính tồn năng của tế bào thức vật ............................................................6
2.2.1.2. Khả năng biệt hoá và phản biệt hố của tế bào .........................................6
2.3. Ứng dụng của ni cấy mô - tế bào thực vật ....................................................6
2.4. Ưu điểm của nuôi cấy mô - tế bào thực vật ......................................................7
2.5. Môi trường và điều kiện nuôi cấy .....................................................................7
2.5.1. Môi trường ni cấy ......................................................................................7
2.5.2. Điều kiện ni cấy .......................................................................................11
2.6. Tình hình nghiên cứu và nhân giống Giả hạc trong và ngoài nước ................12
2.6.1. Tình hình nghiên cứu ngồi nước ................................................................12
2.6.1.1. Nhân giống vơ tính ngồi tự nhiên ...........................................................12

iii


2.6.1.2. Các nghiên cứu nhân giống Dendrobium in vitro ....................................12
2.6.2. Các cơng trình nghiên cứu trong nước.........................................................13
Chương 3 Phương tiện và phương pháp nghiên cứu ........................................15
3.1. Phương tiện .....................................................................................................15
3.1.1. Vật liệu .........................................................................................................15
3.1.2. Điều kiện thí nghiệm....................................................................................15
3.1.3. Địa điểm và thời gian thí nghiêm ................................................................15
3.2. Phương pháp ...................................................................................................15

3.2.1. Khử trùng Mẫu cấy ......................................................................................15
3.2.2. Thí nghiệm 1 ................................................................................................16
3.2.3. Thí nghiệm 2 ................................................................................................17
3.2.3.1. Thí nghiệm 2a ...........................................................................................17
3.2.3.2. Thí nghiệm 2b ...........................................................................................19
Chương 4 Kết quả thảo luận ...............................................................................20
4.1. Thí nghiệm 1 ...................................................................................................20
4.2. Thí nghiệm 2 ...................................................................................................22
4.2.1. Thí nghiệm 2a ..............................................................................................22
4.2.2. Thí nghiệm 2b ..............................................................................................29
Chương 5 Kết luận và kiến nghị .........................................................................37
5.1. Kết luận ...........................................................................................................37
5.2. Kiến nghị.........................................................................................................37
Tài liệu tham khảo .................................................................................................38
Phụ chương A ........................................................................................................40
Phụ chương B ........................................................................................................42

iv


Danh sách bảng
Bảng 1: Kí hiệu các nghiệm thức và mơi trường ni cấy ................................... .....17
Bảng 2: Kí hiệu các nghiệm thức và môi trường nuôi cấy ................................... .....18
Bảng 3: Kí hiệu các nghiệm thức và mơi trường ni cấy.................................... .…19
Bảng 4: Ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA đến khả năng tạo chồi lan Giả hạc
(Dendrobium anosmum) vào thời điểm 10 TSKC……...................................……....21
Bảng 5: Ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA đến khả năng tạo chồi lan Giả hạc
(Dendrobium anosmum) vào thời điểm 10 TSKC………………………...................22
Bảng 6: Ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA đến sự nhân nhanh chồi lan Giả hạc
(Dendrobium anosmum) vào thời điểm 4 TSKC…………………….........................23

Bảng 7: Ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA đến sự nhân nhanh lan Giả hạc
(Dendrobium anosmum) vào thời điểm 6 TSKC.........................................................24
Bảng 8: Ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA đến sự nhân nhanh chồi lan Giả hạc
(Dendrobium anosmum) không cắt vào thời điểm 8 TSKC........................................25
Bảng 9: Ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA đến sự nhân nhanh chồi lan Giả hạc
(Dendrobium anosmum) không cắt vào thời điểm 10 TSKC......................................26
Bảng 10: Ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA đến khả năng tạo chồi lan Giả hạc
(Dendrobium anosmum) vào thời điểm 12 TSKC.......................................................27
Bảng 11: Ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA đến sự nhân nhanh chồi lan Giả hạc
(Dendrobium anosmum) cắt đoạn vào thời điểm 4 TSKC..........................................29
Bảng 12: Ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA đến sự nhân nhanh chồi lan Giả hạc
(Dendrobium anosmum) cắt đoạn vào thời điểm 6 TSKC..........................................30
Bảng 13: Ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA đến sự nhân nhanh chồi lan Giả hạc
(Dendrobium anosmum) cắt đoạn vào thời điểm 8 TSKC..........................................31
Bảng 14: Ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA đến sự nhân nhanh chồi lan Giả hạc
(Dendrobium anosmum) cắt đoạn vào thời điểm 10 TSKC........................................32
Bảng 15: Ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA đến sự nhân nhanh chồi lan Giả hạc
(Dendrobium anosmum) cắt đoạn vào thời điểm 12 TSKC........................................33

v


Danh sách hình
Hình 1: Lan Giả hạc (Dendrobium anosmum)........................................................….3
Hình 2: Đoạn thân trẻ và đoạn thân già .....................................................................16
Hình 3: Mẫu bắt đấu xuất hiện chồi sau 6 tuần nuôi cấy ...........................................21
Hình 4: Mẫu bắt đấu xuất hiện chồi sau 10 tuần ni cấy .........................................22
Hình 5: Mẫu bắt đấu xuất hiện chồi sau 12 tuần ni cấy .........................................22
Hình 6: Mẫu sau 12 tuần ni cấy .............................................................................28
Hình 7: Mẫu sau 12 tuần ni cấy………………… .................................................35

Hình 8: Số chồi sau 12 tuần ni cấy ........................................................................35

vi


Danh mục các từ viết tắt
ABA: Abscissic acid
APA: Phenyl acetic acid
BA: 6 – benzyladenine
BAP: 6 – benzylamino purine
CĐHST: Chất điều hoà sinh trưởng
GA: Gibberellin
IAA: Indolacetic acid
IBA: Indol butyric acid
Kinetin: 6 – furfurylamino purine
NAA: acid α − naphtalenacetic
NSC: Ngày sau cấy
NXHC: Ngày xuất hiện chồi
PLB: Protocorm – like body
TDZ: Thidiazuron (N – phenyl – N1 – 1,2,3 – thiadizol – 5 – ylurea)
2,4 – D: acid 2,4 – diclorophenoxyacetic

vii


Chương 1
Mở đầu
1.1. Đặt vấn đề
Hoa lan được mệnh danh là một lồi hoa cao q nhất trong các lồi hoa, với số
lượng trên 25.000 lồi (Dương Cơng Kiên, 2006). Hoa lan được rất nhiều người yêu

thích bởi màu sắc, hình dáng đẹp, hương thơm nồng nàng. Đặc biệt là cấu trúc
quyến rũ của môi lan cùng những điểm xuyến ngộ nghĩnh trên lá tạo nên một nét
đẹp sang trọng và trang nhã.
Hơn thế nữa, Hoa lan đã dần dần chiếm vị trí cao trong các bàn tiệc, hội nghị, đám
cưới. Vì vậy, nó đã nhanh chóng trở thành sản phẩm trồng trọt mang lại hiệu quả
kinh tế cao, là mặt hàng chiến lược của một số quốc gia như Thái Lan, Đài Loan,
Nhật Bản, Hà Lan, Mỹ…
Trong đó, lan Dendrobium anosmum cịn có tên giả hạc hay phi điệp, đây là lồi lan
rừng q hiếm chỉ có ở một số nước như Việt Nam, Lào, Thái Lan, Philippines,
Borneo, New Guinea, Indonesia, Malaya và Sri Lanka. Đặc điểm của loài này là
siêng hoa, hoa to, đẹp lại có hương thơm nồng nàng nên rất được ưa chuộng cả
trong và ngoài nước.
Chính vì giá trị kinh tế cao của lan Giả hạc dẫn đến sự khai thác quá mức làm cho
số lượng ngày càng giảm dần và trở nên khan hiếm. Như vậy, việc bảo tồn, lai tạo
và nhân giống loài lan này là rất cần thiết. Trong khi việc nhân giống hữu tính và
tách chiết thơng thương khơng đáp ứng được nhu cầu do tốn nhiều thời gian và cây
con không đồng nhất.
Giải quyết vấn đề trên, phương pháp nuôi cấy chồi lan Giả hạc được sử dụng nhằm
tạo ra số lượng lớn cây giống con đồng nhất về mặt di truyền trong thời gian ngắn.
Do đó, đề tài “Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA lên sự tạo và nhân
chồi của lan Giả hạc (Dendrobium anosmum) bằng phương pháp nuôi cấy mô”
được thực hiện nhằm tạo và nhân nhanh số lượng chồi phục vụ nghiên cứu sau này
cũng như đáp ứng nhu cầu về nguồn cây giống lớn cho thị trường.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
- Bước đầu đưa ra qui trình nhân giống lan Dendrobium anosmum bằng phương
pháp nuôi cấy đoạn thân giúp cho việc nhân nhanh và bảo tồn loài lan quý hiếm này
của nước ta.

1

- Nghiên cứu sự ảnh hưởng các chất điều hòa sinh trưởng (BA và NAA) lên mẫu
cấy.
1.3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu mơi trường thích hợp (có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BA và
NAA) cho việc tạo và nhân nhanh chồi lan Dendrobium anosmum.
- So sánh khả năng nhân nhanh chồi khi cắt thành từng đoạn thân và để nguyên
không cắt.

2


Chương 2
Lược khảo tài liệu
2.1.

Giới

thiệu

lan

Giả

Hạc

(Dendrobium

anosmum)
2.1.1. Nguồn gốc và phân loại

Giới :

Thực vật

(Plantae)

Ngành : Ngọc lan

(Magnoliophyta)

Lớp :

Hành

(Liliopsida)

Bộ :

Lan

(Orchidales)

Chi :

Lan Giả hạc

(Dendrobium anosmum)

Vào năm 1845, lần đầu tiên Lindley khám phá ra
lan Giả hạc và đặt tên cho nó là Dendrobium

Hình 1: Lan Giả hạc
(Dendrobium anosmum)

anosmum. Ngồi ra, lan Giả hạc cịn có tên là
Dendrobium superbum và người Hawaii gọi là Dendrobium honohono có nghĩa là
lá mọc đối cách. Người Việt gọi là Dã hạc, Lưỡng điểm hạc, Phi diệp…Lan thường
mọc trên các cành cây ở độ cao khoảng 1000-3000 m tại các rừng cây thuộc Đô
Lương, Vinh, Đà Lạt, Bảo Lộc, Sông Bé, Đắc Lắc, Lộc Ninh…(Bùi Bảo Lộc,
2008).
Theo kinh nghiệm của các nhà vườn lan Giả hạc là giống dễ trồng, nhiều hoa và có
hương thơm ngào ngạt. Quê hương của lan Giả hạc là các nước Đông Nam Á như
Philippin, Malaya, Lào, Việt Nam. Ở Việt Nam, lan Giả hạc có nhiều trên dãy
Trường Sơn từ Bắc ra Nam (Nguyễn Thiện Tịch hội HLCC-TPHCM được trích bởi
Trần Văn Bảo, 1999).
Các loài Giả hạc lai xuất hiện rất sớm, làm phong phú về hình dáng và màu sắc cho
lan Giả hạc rừng. Nhiều giống lai được sử dụng trong ngành cơng nghiệp hoa cắt
cành có thể tạo được hoa quanh năm với giá thành thấp (Cung Hoàng Phi Phượng,
2007).
2.1.2. Đặc điểm thực vật
2.1.2.1. Cơ quan dinh dưỡng
Cây đa thân, thân dài từ 1,2-1,4 m bng rũ xuống, có giả hành và thân được bao
bọc bởi các bẹ lá xếp dọc chiều dài thân. Lá mọc đối cách dài 8-12 cm, rộng từ 4-7
cm, có dạng hình elip màu xanh đơn thuần hoặc tạp sắc. Cây có hệ rễ khí sinh nhỏ

3


nhưng số lượng rất nhiều chủ yếu bám vào giá thể hay thân cây để hút nước và các
dưỡng chất. Đặc biệt, rễ có một lớp hút ẩm dày bao quanh gồm những tế bào chết

chứa đầy khơng khí nên rễ ánh lên màu xanh bạc. (Nguyễn Công Nghiệp, 2004; Bùi
Bảo Lộc, 2006).
2.1.2.2. Cơ quan sinh sản
Hoa to có khi đạt từ 10-12 cm mọc từ 1-3 hoa ở các đốt thân đã rụng lá, thường nở
rộ vào mùa xuân. Dendrobium anosmum có hai màu sắc chính là tím hồng và trắng.
Tuy nhiên, Giả hạc còn khá nhiều màu sắc biến dạng khác như hồng nhạt, hồng
thẫm hoặc cánh trắng lưỡi tím. Tuy nhiên, rất dễ nhằm lẫn với Dendrobium parishii
thân ngắn chỉ chừng 30-40 cm vá hoa có màu tím thẫm hơn. Hoa có hương thơm
ngào ngạt và lâu tàn (3-4 tuần). Phát hoa mang rất nhiều hoa, cây khoẻ mạnh có thể
đạt 50-70 hoa (Bùi Bảo Lộc, 2008). Hoa sau khi thụ tinh sẽ tạo quả. Quả thuộc dạng
quả nang, chứa vơ số hạt. Theo Cung Hồng Phi Phượng (2007), hạt lan muốn nảy
mầm phải cộng sinh với nấm Rhizoctoniae.
Sau khi hoa tàn, những đốt gần trên ngọn hoặc ở gần dưới gốc thường nảy sinh ra
cây con (keiki). Vài tháng sau, khi các cây con mọc rễ dài từ 3-4 cm có thể tách ra
trồng riêng. Năm đầu, cây cịn nhỏ và ngắn 30-40 cm và khơng ra hoa, nhưng sẽ ra
hoa vào năm tiếp theo. Khi đó, dưới gốc cây sẽ có 3-4 mầm non, những mầm này
mọc mạnh và lớn hơn rất nhiều có thể đạt 120-140 cm nếu chăm sóc đúng cách (Bùi
Bảo Lộc, 2008).
Ngồi ra, có thể nhân giống Giả hạc theo phương pháp truyền thống: cắt thân cây
già thành từng đoạn dài 15-20 cm, đặt lên khai có rong rêu hoặc mùn cưa ẩm ướt,
vài tháng sau cây con sẽ mọc lên từ các đốt thân (đốt thân đã ra hoa sẽ không mọc
cây con). Khi cây con cao 4-5 cm hay rễ dài 3-4 cm có thể đem trồng vào giá thể
(Bùi Bảo Lộc, 2008).
2.1.3. Trồng trọt và chăm sóc
- Giả hạc tuy dễ trồng nhưng khơng thích hợp với chất trồng bằng than và thích hợp
với cách trồng trong chậu đất nung, tốt nhất là trồng vào khúc gỗ, cho nó bám lên
cây sống trong vườn, ngồi ra có thể trồng trên chậu đất nung loại lớn, khoét một lỗ
to ở bên hông và gần đáy chậu, đặt cây lan vào đó sao cho cây lan ở bên ngồi chậu
và các giả hành thòng xuống, bên trong chậu dùng các khúc gỗ nhỏ và có thể bỏ
thêm xơ dừa, treo chậu lên bình thường. Có thể trồng Giả hạc với nhiều vật liệu như

4


mảnh cây dương xỉ, cành cây, mảnh gỗ hay chậu với vỏ thông, vỏ dừa v.v… nhưng
tốt nhất là trồng trong chậu gỗ và treo lên bởi cây cần sự thơng thống gió (Bùi Bảo
Lộc, 2008).
- Nhiệt độ: Nhóm lan Dendrobium cần nhiều ánh sáng khoảng từ 4000-4500 luz,
nghĩa là trồng ở ngoài nắng với lưới che. Đặc biệt, Dendrobium anosmum là loài
lan chịu nhiệt khá tốt. Giả hạc phát triển tốt ở những nơi có nhiệt độ ban ngày
khơng quá 350C và ban đêm không dưới 15,60C (Dương Công Kiên, 2006).
- Ẩm độ: Điều kiện ẩm độ khơng khí thích hợp là 60 – 70%, đây là ẩm độ của
những ngày thấp nhất trong mùa khô ở Việt Nam.
- Ánh sáng: Giả hạc là loài lan ưa ánh sáng vì vậy khơng nên đặt cây ở nơi q râm
cây sẽ không phát triển. Cây lan Giả hạc dễ bị cháy lá khi gặp ánh sáng mặt trời
trực tiếp nên trồng cây dưới lưới đen che 70% ánh sáng. Ở Việt Nam, nếu trồng với
12 giờ chiếu sáng trong ngày, trong đó khoảng 1 – 2 giờ cây nhận được ánh sáng
trực tiếp, cây sẽ phát triển tốt (Lê Thúy Anh và Hồng Q Châu, khơng ngày
tháng).
- Nước: Yếu tố quan trọng đối với giả hạc giúp cây phát triển tốt, tránh bị khô héo
do mất nước hay ánh sáng quá mạnh. Ẩm độ phù hợp nhất trong khoảng 60 – 70%.
Vào mùa khô chú ý nên tưới nước hàng ngày cho cây, thời điểm tưới tốt nhất vào
buổi sáng 8 giờ và chiều 4 giờ để tránh ẩm độ lắng đọng vào ban đêm, giúp cây
tránh được bệnh thối rữa (Dương Cơng Kiên, 2006).
- Phân bón: Bón phân định kì 1 lần/tuần và đều đặn trong suốt cả năm. Cần điều
chỉnh hàm lương NPK phù hợp với độ tuổi cây giúp cây phát triển tốt. Ngồi ra, có
thể bổ sung thêm phân hữu cơ có pha thuốc diệt nấm giúp cây phịng bệnh (Lê
Thúy Anh và Hồng Q Châu, khơng ngày tháng).
- Sự thơng thống: Là điều kiện tối quan trọng đối với giả hạc. Vì đây là yếu tố liên
quan đến bệnh thối rữa thường gặp. Sự thông gió càng lớn cây càng ít bị bệnh vì

giúp cây mau khơ sau khi tưới. Nhưng nếu sự thơng gió quá lớn thì dễ làm cây bị
mất nước và chùn lá (Cung Hồng Phi Phượng, 2007).
2.2. Ni cấy mơ - tế bào thực vật
Nuôi cấy mô - tế bào thực vật hay nhân giống in vitro là thuật ngữ mô tả các
phương thức duy trì sự sống của bộ phận thực vật trong ống nghiệm với môi trường
xác định ở điều kiện vô trùng. Phương pháp này được nghiên cứu đầu tiên bởi

5


Haberlandt (1898-1902), Kotte và Robbins (1924), Schmucker (1929) (Vũ Văn Vụ
và ctv, 2007).
2.2.1. Cơ sở của nuôi cấy mô - tế bào thực vật
Nuôi cấy mô - tế bào thực vật được tiến hành thành công dựa trên cơ sở tính tồn
năng và khả năng biệt hố của tế bào thực vật.
2.2.1.1. Tính tồn năng của tế bào thực vật
Theo Haberlandt (1902), tính tồn năng có ở mọi tế bào, mỗi tế bào đều mang tồn
bộ lượng thơng tin di truyền của cơ thể và có khả năng phát triển thành một cơ thể
hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi. Điều này được chứng minh qua nghiên cứu
nuôi cấy đỉnh sinh trưởng ở rễ cây hoà thảo trong 12 ngày của Kotte và Robbins
(Vũ Văn Vụ và ctv, 2007).
2.2.1.2. Khả năng biệt hoá và phản biệt hoá của tế bào
Biệt hóa là sự biến đổi của tế bào từ trạng thái tế bào phôi cho đến khi thể hiện một
chức năng nào đó. Các tế bào khi ni cấy đều đã biệt hố về cầu trúc và chức
năng. Ngồi ra, những tế bào này cũng có thể trở lại trạng thái của tế bào phơi khi
điều kiện thích hợp, q trình này gọi là phản biệt hố.
Tất cả tế bào trong cùng một cơ thể đều có khả năng biệt hoá và phản biệt hoá.
Theo Galson (1986) và Murasshige (1974), khả năng hình thành cơ quan hay cơ thể
của tế bào thực vật giảm theo chiều từ ngọn xuống gốc. Điều này giúp việc chọn lựa
mẫu cấy đạt hiệu quả hơn. Đã có nhiều kết luận cho rằng những tế bào càng gần

hoặc không xa với trạng thái phôi bao nhiêu thì khả năng ni cấy càng dễ thành
cơng bấy nhiêu (Vũ Văn Vụ, 2007).
2.3. Ứng dụng của nuôi cấy mô - tế bào thực vật
Nuôi cấy mô - tế bào thực vật là cơng cụ hữu ích nhất hiện nay, đóng góp to lớn
trong cơng tác nhân giống, chọn tạo giống cây trồng qua các kĩ thuật sau:
− Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
− Nuôi cấy mô sẹo và phôi
− Nuôi cấy tế bào đơn và protoplast
− Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn
(Cung Hoàng Phi Phượng, 2007)

6


2.4. Ưu điểm của nuôi cấy mô - tế bào thực vật
− Hệ số nhân cao, tạo ra các cá thể đồng nhất về mặt di truyền và giữ được
tính trạng của bố mẹ, có sức sống cao.
− Phục hồi giống cây quí, giúp bảo tồn sự đa dạng nguồn gen thực vật.
− Cây giống sản xuất có giá thành rẻ.
− Tạo cây sạch bệnh.
− Rút ngắn thời gian trưởng thành của cây so với cây trồng từ hạt.
(Cung Hoàng Phi Phượng, 2007)
2.5. Môi trường và điều kiện nuôi cấy
2.5.1. Mơi trường ni cấy
Mơi trường ni cấy giữ vai trị quan trọng trong sự thành công của nuôi cấy mô –
tế bào thực vật. Sự lựa chọn môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào loại thực vật, loại tế
bào, mô hay cơ quan được ni cấy và mục đích ni cấy. Mơi trường ni cấy cịn
thay đổi tùy theo giai đoạn sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy.
Các loại môi trường nuôi cấy sử dụng phổ biến hiện nay như W-43 (White, 1943),
ST (Skoog & Tsui, 1949), VW (Vacin & Went, 1951), N-51 (Nitsch, 1953), LS

(Linsmaier & Skoog, 1953), MiS (Miller & Skoog, 1953), MS (Murashige &
Skoog, 1962), B5 (Gamborg, 1963), W-63 (White, 1963), K (Knop’s, 1964), KC
(Knudson C, 1964), O (Ohyama & Nitsch, 1972), CH (Cheng, 1978), L (Lyrene,
1979), WP (Mc Cown & Lloyd, 1981), OD-95 (Oradee, 1995), … Trong số đó, MS
là mơi trường được sử dụng nhiều nhất vì MS là mơi trường giàu dinh dưỡng và
phù hợp với nhiều đối tượng thực vật (Dương Công Kiên, 2006).
Về cơ bản, các loại môi trường nuôi cấy chỉ khác nhau về nồng độ các chất và bao
gồm các thành phần chính sau:
− Thành phần vơ cơ (các loại muối khoáng đa lượng và vi lượng).
− Thành phần hữu cơ (vitamin, amino acid, myo – inositol)
− Carbohydrat
− Chất điều hoà sinh trưởng
− Các thành phần hữu cơ phức hợp (nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết
khoai tây, bột chuối khô, các loại nước ép trái cây, …)
− Các thành phần khác (agar, …)
(Vũ Văn Vụ và ctv, 2007)

7


* Thành phần vơ cơ
Nhu cầu khống của tế bào thực vật đã tách rời không khác nhiều so với cây trồng
trong điều kiện tự nhiên (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thuỷ Tiên, 2002).
Khoáng đa lượng, bao gồm các nguyên tố N, S, P, K, Mg và Ca được sử dụng ở
nồng độ trên 30 mg/l.
Khoáng vi lượng là yếu tố không thể thiếu đối với sự phát triển của mô và tế bào.
Tuy nhiên, yêu cầu của thực vật về khoáng vi lượng rất phức tạp.
Sắt được cung cấp dưới dạng muối FeSO4.7H2O, Fe(SO4)3 nhưng dễ bị kết tủa và
khó hấp thu, để mơ cây hấp thu dễ dàng nên thêm vào môi trường Na2EDTA để tạo
ra phức NaFeEDTA.

* Thành phần hữu cơ
Thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng phát triển
của chúng. Trong môi trường nuôi cấy, người ta thường cung cấp các vitamin như
thiamine (B1), acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6).
Myo – inositol là một loại đường rượu liên quan đến quá trình tổng hợp
phospholipid, pectin của thành tế bào và các hệ thống màng tế bào, tham gia vào
dinh dưỡng khống, vận chuyển đường và trao đổi carbonhydrat, ngồi ra cịn tham
gia vào tích trữ, vận chuyển giải phóng auxin (Vũ Văn Vụ và ctv, 2005).
* Carbohydrat
Theo Dương Công Kiên (2002), nguồn carbon giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp
nên các chất hữu cơ, phân chia tăng sinh khối khơng phải do q trình quang hợp
cung cấp mà chính là nguồn carbon bổ sung vào môi trường dưới dạng đường.
Đường thường sử dụng trong nuôi cấy là sucrose.
Sucrose là loại đường thông thường nhất được vận chuyển trong thực vật. Khi nuôi
cấy mô – tế bào thực vật, sucrose sẽ được chuyển hoá để cung cấp năng lượng và
bộ khung carbon cho các quá trình biến dưỡng của tế bào (Dương Tấn Nhựt, 2007).
Nồng độ đường sucrose thường dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật từ 20-30 g/l
(Bùi Bá Bổng,1995). Ngoài ra, nồng độ đường cao làm mơ cấy khó hút được nước,
hàm lượng đường q thấp gây ra hiện tượng thuỷ tinh thể (Vũ Văn Vụ và ctv,
2005).
* Chất điều hoà sinh trưởng thực vật

8


Các chất điều hoà sinh trưởng trong cơ thể thực vật được gọi là phytohormones (các
hormone thực vật). Chúng là các chất hữu cơ có bản chất khác nhau do tế bào thực
vật tiết ra với một lượng rất nhỏ ở các cơ quan, bộ phận nhất định của cây và từ đấy
chúng được vận chuyển đến tất cả các cơ quan, bộ phận khác để điều tiết các hoạt
động sinh lý, các quá trình sinh trưởng, phát triển của cây và đảm bảo mối quan hệ

hài hoà giữa các cơ quan, bộ phận trong cơ thể.
Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật là thành phần không thể thiếu trong mơi
trường ni cấy, nó giúp điều chỉnh các q trình sinh trưởng, phát triển và các hoạt
động sinh lý của thực vật. Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật bao gồm chất điều
hoà sinh trưởng nội sinh và chất điều hoà sinh trưởng tổng hợp nhân tạo.
Dựa vào chất điều hoà sinh trưởng nội sinh mà người ta tạo ra chất điều hoà sinh
trưởng tổng hợp bằng con đường hố học, chúng có cơng thức hố học và hoạt tính
tương tự với chất điều hồ sinh trưởng tự nhiên (Vũ Văn Vụ và ctv, 2005).
™ Auxin:
Auxin là hormone sinh trưởng được phát hiện do Went và Thimann vào năm 1937.
Chúng bao gồm auxin tự nhiên (Indol acetic acid (IAA), Phenyl acetic acid
(APA),…) và auxin tổng hợp (Indol butyric acid (IBA), acid α – naphtalenacetic
(NAA), acid 2,4 – diclorophenoxyacetic (2,4D), …).
Trong tự nhiên, auxin có tác dụng giúp vươn dài thân, lóng, ngọn và ra rễ. Trong
ni cấy mơ, auxin giúp thúc đẩy sự sinh trưởng và giãn nở tế bào, tăng cường các
quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất, kích thích hình thành rễ và tham gia cảm
ứng phát sinh phơi vơ tính (Vũ Văn Vụ và ctv, 2005).
Các auxin thường dùng trong nuôi cấy mô là NAA, IBA và IAA ở nồng độ 0,1–0,5
mg/l. NAA và IBA thường dùng để kích thích sự ra rễ và dùng kết hợp với
cytokinin trong nhân chồi (Bùi Bá Bổng, 1995).
Các dung dịch auxin được chuẩn bị bằng cách cân 10 mg auxin cho vào cốc, thêm
vào vài giọt NaOH hoặc KOH 1N (không quá 3 ml) cho đến khi auxin tan hồn
tồn, sau đó, bổ sung thêm nước cất đến 100 ml. Ngồi ra, auxin cịn hồ tan trong
cồn 95% hoặc cồn đã pha loãng 70% nhưng cồn là một chất độc đối với mô thực
vật nên không được dùng để pha dung dịch auxin, bảo quản lỏng ở 0–80C và có thể
hấp thanh trùng.
™ Cytokonin:

9

Năm 1963, Letham và Miller tách chiết được cytokinin đầu tiên ở hạt ngô và đặt tên
là zeatin. Về sau, cytokinin được phát hiện ở hầu hết các mô và cơ quan thực vật.
Cytokinin gồm có cytokinin tự nhiên (Adenin (Ad), Zeatin, Dihydrozeatin, …) và
cytokinin tổng hợp (6 – furfurylamino purine (Kinetin) , 6 – benzyladenine (BA)
hoặc 6 – benzylamino purine (BAP), Chrophenylurea, N – phenyl – N1 – 1,2,3 –
thiadizol – 5 – ylurea (Thidiazuron - TDZ).
Cytokinin có tác dụng quan trọng trong nuôi cấy mô do ảnh hưởng rõ rệt của nó lên
sự phát sinh chồi và nhân chồi, giữ tuổi thọ cho mô cấy cũng như sự kích thích phân
chia tế bào và định hướng phân hố tế bào. Có biểu hiện ức chế sự tạo rễ và sự sinh
trưởng của mơ sẹo. Ngồi ra, chúng cịn dùng kết hợp với auxin trong trường hợp
tạo chồi (Đặng Phương Trâm, 2005).
Tỉ lệ giữa auxin và cytokinin quyết định kết quả phát sinh hình thái đối với mơ ni
cấy in vitro cũng như đối với cây nguyên vẹn. Nếu tỉ lệ auxin/cytokinin cao thì kích
thích hình thành rễ, ngược lại auxin/cytokinin thấp dẫn đến sự xuất hiện và phát
triển chồi. Tỉ lệ cân đối giữa auxin và cytokinin cho phép tạo cây hoàn chỉnh (rễ,
thân, lá). Tỉ lệ này thay đổi tuỳ theo đối tượng nuôi cấy và loại mô được nuôi cấy
(Vũ Văn Vụ, 2005).
Những chất được sử dụng rất phổ biến trong nuôi cấy mô – tế bào thực vật là BA
hay BAP thường dùng ở nồng độ từ 0,5–10 mg/l. Kinetin chỉ hoạt động khi có sự
hiện diện của auxin. Zeatin là cytokinin tự nhiên có vai trị tương tự như kinetin,
nhưng hoạt tính cao hơn khoảng 10 lần (Bùi Trang Việt, 2000).
Cytokinin thường được pha bằng HCl 1N (không quá 3 ml). Riêng TDZ lại tan
trong hỗn hợp NaOH 1N + cồn 70o và dễ bị tủa lại trong thời gian bảo quản nên
thường phải sử dụng ngay. Các cytokinin có thể bảo quản lỏng ở 0 – 8oC, và có thể
hấp thanh trùng (Vũ Văn Vụ, 2005).
* Các chất bổ sung khác
™ Nước dừa
Nước dừa có thành phần bao gồm muối khống, acid amin, vitamin, các yếu tố
khống, kích thích tố (Nguyễn Cơng Nghiệp, 2004; Vũ Văn Vụ và ctv, 2007).

Ngoài các yếu tố khống, chất điều hồ sinh trưởng chủ yếu là cytokinin cịn có mặt
của Myo – inositol.
™ Than hoạt tính

10


Than hoạt tính là một chất oxy hố tốt và có giá thành rẻ nên thường được bổ sung
vào mơi trường ni cấy để khử độc và kích thích sự tăng trưởng đối với một số đối
tượng thực vật như phong lan, hành,… Tuy nhiên, lạm dụng than hoạt tính có thể
làm giảm hiệu quả của các chất điều hồ sinh trưởng, làm thay đổi môi trường ánh
sáng, do môi trường trở nên sẫm hơn khi có than hoạt tính (Dương Công Kiên,
2006).
* Agar
Agar là thành phần quyết định độ cứng của môi trường, không gây độc hay tác dụng
với các thành phần có trong mơi trường vì agar có nguồn gốc từ thực vật (rong
biển). Lượng agar thường dùng ở 6 – 10 g/l. Khi nồng độ agar quá cao, môi trường
trở nên quá cứng sẽ ảnh hưởng đến sự khuếch tán của các chất dinh dưỡng gây khó
khăn cho sự hấp thụ nước và dinh dưỡng của mô cấy. Agar tan ra ở nhiệt độ từ 80oC
và đông đặc lại ở nhiệt độ phòng (25 – 30oC) (Vũ Văn Vụ và ctv, 2007).
* pH của môi trường
Giá trị pH của mơi trường thích hợp cho sinh trưởng và phát triển ở nhiều loài thực
vật, thay đổi từ 5,0 – 6,0 (Vũ Văn Vụ, 2007). pH dưới 5,5 làm agar khó chuyển
sang trạng thái gel, cịn pH lớn hơn 6,0 làm agar có thể rất cứng, từ đó gây ảnh
hưởng đến tính thẩm thấu của mơi trường. Khi pH thấp tạo mơi trường acid sẽ hoạt
hố các enzyme hydrolase gây ức chế sinh trưởng đồng thời kích thích sự hố già
của các tế bào trong ni cấy.
Arditti (1967) khi khảo sát ảnh hưởng của pH lên sự tăng trưởng của một số phôi
lan đã nhận thấy ở phần lớn các giống lan nghiên cứu thì pH = 5,0 – 6,0 là phù hợp.
Môi trường trước và sau khi hấp khử trùng có pH thay đổi một ít, nếu pH ban đầu

trong khoảng 5,0 – 7,0 thì sau khi hấp khử trùng sẽ giảm 0,3 – 0,5 đơn vị (Bùi Bá
Bổng, 1995). pH được điều chỉnh bằng NaOH 1N và HCl 1N (Vũ Văn Vụ và ctv,
2007).
2.5.2. Điều kiện nuôi cấy
* Ánh sáng
Quang hợp không phải là hoạt động cần thiết của mơ cấy vì năng lượng được cung
cấp dưới dạng đường có trong mơi trường ni cấy (Dương Cơng Kiên, 2002). Tuy
nhiên, nhiều nghiên cứu cho thấy ánh sáng hấp thụ đóng vai trị quan trọng trong

11


việc tạo hình của cây. Ni cấy được tiến hành tốt nhất trong điều kiện ánh sáng
khoảng 1000 lux.
Ngoài ra, thời gian chiếu sáng cũng gây ảnh hưởng đến mô cấy, phần lớn các phịng
thí nghiệm ni cấy mơ thường có thời gian chiếu sáng từ 16 – 18 giờ/ngày.
* Nhiệt độ
Nhiệt độ tối ưu cho nhiều loại cây trồng khoảng 20 – 250C. Theo Dương Công Kiên
(2002), cần phải giữ mức nhiệt độ này, vì nhiệt độ bên trong và bên ngoài keo trên
lệch nhau khoảng 2 – 40C. Nhiệt độ của phịng ni cấy thường được giữ ổn định
bằng máy điều hoà nhiệt độ trong suốt thời gian ni cấy. Thơng thường, người ta
điều chỉnh nhiệt độ phịng ni cấy thấp hơn 20C so với nhiệt độ phịng mong muốn
cho mơ cấy.
2.6. Tình hình nghiên cứu nhân giống lan Giả Hạc trong và ngồi nước
2.6.1. Tình hình nghiên cứu ngồi nước
2.6.1.1. Nhân giống vơ tính ngồi tự nhiên
Phương pháp tạo keiki (cây con) là hình thức nhân giống ngồi phổ biến ngồi tự
nhiên vì hạt lan khó nảy mầm ngồi tự nhiên. Hiện tượng hình thành keiki ngồi tự
nhiên ở Dendrobium anosmum được mô tả bởi Lindley (1845). Ngoài ra,
Dendrobium anosmum cũng được xử lý để sinh ra nhiều chồi trong điều kiện tự

nhiên bằng các chất morphactin như: n – butyl ester 9 – hydroxylfluorene – (9) –
carboxylic acid (Dương Công Kiên, 2006). Phương pháp nhân giống này tuy tạo
được cây con đồng nhất nhưng thời gian nhân giống rất dài và hệ số nhân rất thấp,
hơn nữa cây con tạo thành có sức sống khơng cao (Dương Công Kiên, 2006).
2.6.1.2. Các nghiên cứu nhân giống lan Dendrobium in vitro
a. Gieo hạt in vitro
Gieo hạt in vitro có thể làm cho các hạt chưa chín hồn tồn cũng có thể nảy mầm.
Phương pháp này được nghiên cứu bởi Knudson C (1922). Khi quả lan đã gần chín
được khử trùng trong thuốc tẩy hoặc lau cồn, sau đó tách vỏ quả, lấy hạt gieo vào
môi trường nuôi cấy trong điều kiện vô trùng. Sau khi hạt nảy mầm được 1-2 tháng
thì chuyển cây con sang mơi trường mới. Rễ thường hình thành khi cây con được 23 lá. Quá trình nhân giống từ hạt cho đến khi cây có thể ra hoa mất khoảng 4 năm
tuỳ giống, và các cây con tạo thành từ hạt không đồng nhất về di truyền (Dương
Công Kiên, 2006).

12


Gandewijaja (1980), đã sử dụng chồi đỉnh dài từ 1-1,5 mm của cây Dendrobium
phalaenosis gieo hạt in vitro sẽ tạo cụm chồi tối ưu ở mơi trường có bổ sung 1,5
mg/l BA và 0,5 mg/l TDZ và rễ tối ưu khi bổ sung 1 mg/l NAA (Dương Công Kiên,
2006).
b. Nhân giống in vitro
Việc nhân giống vơ tính các lồi phong lan trong ống nghiệm được tiến hành đầu
tiên bởi Gavina Rotor khi ông đang là nghiên cứu sinh ở Đại học Cornell (Rotor,
1949) (Hồng Ngọc Trâm, 2005). Ông đã sử dụng các mắt ngủ trên phát hoa.
Phương pháp của Rotor lúc đầu gần như đã bị bác bỏ nhưng khoảng 10 năm sau
nhiều nhà nghiên cứu khác đã dựa vào đó để đưa ra những qui trình mới như
Sagawa và Niimoto (1960), Sagawa (1961); Tse và ctv (1973), Intuwal và ctv
(1972), Resingger và ctv (1976), Arditti và ctv (1977), Tanaka và Sakanishi (1977),
Valmayor (1977), Johnson và ctv (1982) (Hồng Ngọc Trâm, 2005).

Nayka và ctv (1997), đã nghiên cứu sự nhân nhanh chồi khi kết hợp auxin và
cytokinin trên 2 đối tượng Dendrobium aphyllum và Dendrobium moschatum. Kết
quả cho thấy tần số tái sinh chồi đạt tối ưu ở 9,91 mg/l BA (Nayka và ctv, 1997).
2.6.2. Các cơng trình nghiên cứu trong nước
Trong nhiều năm qua, hoạt động nghiên cứu nhân giống hoa lan ở nước ta cũng đã
diễn ra mạnh mẽ ở nhiều Viện, Sở, Trung tâm, trường Đại học, …
Ở Viện Sinh học Nhiệt đới, Vũ Ngọc Phượng và ctv đã thực hiện nghiên cứu về
“Nhân giống vơ tính phong lan in vitro ở điều kiện ánh sáng tự nhiên” nhằm so
sánh việc sử dụng ánh sáng tự nhiên và đèn chiếu sáng để nuôi cấy phong lan
(Dương Tấn Nhựt, 2007).
Trong một nghiên cứu về “Nhân giống lan Dendrobium anosmum, Dendrobium
mini bằng phương pháp nuôi cấy mô. Thử nghiệm ra cây lan Dendrobium mini trên
nhiều loại giá thể” tại trường Đại học An Giang do Nguyễn Thị Mỹ Duyên thực
hiện (2009), đã sử dụng phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật để nhân giống 2
loài lan trên từ hạt. Kết quả cho thấy đối với lan Dendrobium anosmum thì mơi
trường MS có bổ sung 2mg/l BA nhân chồi tốt nhất ở thời gian 90 NSKC (đạt 3,17
chồi, chồi cao 20,6 mm, chồi xanh tốt). Đồng thời khi sử dụng BA ở nồng độ cao
10mg/l vào môi trường cho kết quả không tốt (xuất hiện 1,5 chồi, chồi dị dạng và
yếu ớt) (Nguyễn Thị Mỹ Duyên, 2009).

13


Trong một nghiên cứu “Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đường, vitamin và điều
kiện thống khí lên sự tăng trưởng của cụm chồi Dendrobiu burana fancy nuôi cấy
in vitro” cho thấy cụm chồi tăng trưởng mạnh trên môi trường đường cao và thống
khí vừa phải (Dương Cơng Kiên, 2006).
Trong nghiên cứu khác về nhân nhanh và tái sinh chồi từ protocom-like body (PLB)
của giống lan Dendrobium sonia cho thấy số protocom cao nhất là 77,7% ở nồng độ
1 mg/l NAA và 1 mg/l BA. Còn sự nhân nhanh chồi cao nhất 6,5 chồi ở nồng độ 23 mg/l BA (Dương Công Kiên, 2006).

14


Chương 3
Phương tiện và phương pháp nghiên cứu
3.1. Phương tiện
3.1.1. Điều kiện thí nghiệm
Tủ cấy vơ trùng, nồi hấp thanh trùng, tủ sấy, cân phân tích, máy đo pH, tủ lạnh,
dụng cụ pha mơi trường và cấy,…
Phịng được giữ ở nhiệt độ 26 ± 20C bởi máy điều hoà nhiệt độ và được chiếu sáng
bằng đèn huỳnh quang.
3.1.2. Vật liệu
Cây lan Giả hạc (cây mẹ) được mua từ các nhà trồng lan ở thành phố Long Xuyên
tỉnh An Giang. Sau đó, chăm sóc tại vườn lan thuộc bộ mơn Cơng nghệ Sinh học,
khoa Nông Nghiệp - Tài Nguyên Thiên Nhiên, trường Đại học An Giang.
3.1.3. Địa điểm và thời gian thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí tại phịng ni cấy mô thuộc bộ môn Công nghệ Sinh học,
khoa Nông Nghiệp & Tài Nguyên Thiên Nhiên, Trường Đại học An Giang.
Thời gian thí nghiệm: từ 1/2011 đến 12/2011.
3.2. Phương pháp
3.2.1. Khử trùng mẫu cấy
* Mục tiêu: Khảo sát điều kiện khử mẫu bằng thủy ngân clorua (HgCl2) đối với lan
Giả hạc để có nguồn mẫu in vitro tối ưu.
* Vật liệu: Đoạn thân có mang mầm ngủ lan Giả hạc
* Mơi trường nuôi cấy: Sử dụng môi trường MS (Musrashige và Skoog) có bổ sung
đường 30 g/l, agar 8 g/l, than hoạt tính 1 g/l. pH = 5,7 - 5,8 (điều chỉnh bằng NaOH
1N và HCl 1N), BA 1 mg/l, NAA 0,5 mg/l. Sau 2 tuần sẽ thu được mẫu cấy vơ
trùng.
* Cách tiến hành:

Thao tác ngồi tủ cấy
- Chọn cây lan Giả hạc tốt, không sâu bệnh, cắt tỉa thành từng đoạn ngắn có mang
mầm ngủ.
- Sau đó rửa dưới vòi nước chảy 10-15 phút.
- Tiếp theo, lau bằng cồn 70% và lắc với xà phòng 5-10 phút.

15