Xác định tác nhân gây bệnh đục thân trên ấu trùng tôm càng xanh (macrobrachium rosenbergii) và vị trí nhiễm của mầm bệnh

Đại Học Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
--------------------

NGUYỄN DOÃN DUẨN

XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỤC THÂN TRÊN ẤU
TRÙNG TƠM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii)
VÀ VỊ TRÍ NHIỄM CỦA MẦM BỆNH
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 12 năm 2008


CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học : TS. LÝ THỊ THANH LOAN

Cán bộ chấm nhận xét 1 :

Cán bộ chấm nhận xét 2 :

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN
THẠC SĨ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày . . . . . tháng . . . . năm . . . . .

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
PHÒNG ĐÀO TẠO SĐH

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
ĐỘC LẬP – TỰ DO – HẠNH PHÚC

Tp. HCM, ngày

tháng

năm 2008

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: Nguyễn Doãn Duẩn

Phái:

Nam

Ngày, tháng, năm sinh: 18/08/1981

Nơi sinh: Hà Tĩnh

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

MSHV: 03106667

I- TÊN ĐỀ TÀI: XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỤC THÂN TRÊN ẤU
TRÙNG TƠM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii) VÀ VỊ TRÍ NHIỄM
CỦA MẦM BỆNH

II- NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
– Xác định tác nhân gây bệnh đục thân trên ấu trùng TCX.
– Xác định vị trí có sự hiện diện của mầm bệnh trên ấu trùng TCX bị bệnh đục thân.
III- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ :

21/01/2008

IV- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ : 15/10/2008
V- CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : TS. LÝ THỊ THANH LOAN
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

CN BỘ MÔN
QL CHUYÊN NGÀNH

TS. LÝ THỊ THANH LOAN

Nội dung và đề cương luận văn thạc sĩ đã được Hội đồng chun ngành thơng qua.
Ngày
TRƯỞNG PHỊNG ĐT – SĐH

tháng

năm

TRƯỞNG KHOA QL NGÀNH


LỜI CẢM ƠN

Trân trọng cảm ơn các thầy cô trường Đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí

Minh đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập tại
trường.
Chân thành cảm ơn TS. Lý Thị Thanh Loan đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và
tạo mọi điều kiện giúp tơi hồn thành luận văn.
Xin cảm ơn anh Đoàn Văn Cường và các anh chị trong Trung tâm Quốc gia
quan trắc cảnh báo môi trường và phòng ngừa dịch bệnh thủy sản Nam Bộ, Viện
nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tơi trong q
trình thực hiện luận văn.
Cảm ơn các anh chị và các bạn học viên cao học ngành Công nghệ sinh học,
trường Đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ và truyền đạt cho tôi
những kinh nghiệm và kiến thức trong thời gian học tập.


i

TĨM TẮT

Nghề ni TCX đang phải đối mặt với những thiệt hại kinh tế do bệnh đục thân
gây ra trên các giai đoạn ấu trùng. Ấu trùng bị bệnh có hiện tượng cơ bị trắng đục
như sữa, tỉ lệ chết có thể đến 100%. Tác nhân gây bệnh được xác định là do
Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) và Extra small virus (XSV). Các
phương pháp mô bệnh học, RT-PCR và kỹ thuật lai tại chỗ (In situ hybridization)
được sử dụng trong nghiên cứu. Thí nghiệm cảm nhiễm được thực hiện bằng
phương pháp ngâm, ấu trùng thí nghiệm cũng xuất hiện các dấu hiệu bị đục thân, tỉ
lệ tử vong sau 22 ngày là 63%. Kết quả kiểm tra bằng phương pháp RT-PCR đã
phát hiện đồng thời cả MrNV và XSV trên ấu trùng bị đục thân. Nghiên cứu bằng
kỹ thuật lai tại chỗ ghi nhận vị trí nhiễm của MrNV và XSV trên mô cơ, chân bơi và
cơ quan gan tụy. Kết quả nghiên cứu của đề tài đã xác định MrNV và XSV là tác
nhân gây bệnh đục thân trên ấu trùng TCX.

ii

ABSTRACT

Giant

freshwater

prawn

(Macrobrachium

rosenbergii) culture is facing

important economic losses attributed to white tail disease which affects larvae and
post-larvae. The clinical sign of this disease is an opaque whitish appearance of the
muscles. The mortality may reach 100% in some hatcheries. The causative agents
have been identified as Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) and extra
small virus (XSV) by previous studies. Histopathology, RT-PCR and in situ
hybridization were used for studying. The experimental pathogenicity of MrNV và
XSV to healthy post-larvae of M. rosenbergii was carried out by immersion
challange, the viral inoculum caused 63% mortality at 22 days post-infection,
opaque whitish muscle was observed in experimental post-larvae. RT-PCR assay
ravealed the presence of both viruses in opaque whitish post-larvae. The nonradioactive DNA probes were used to successfully detect MrNV and XSV infection
in the muscle tissues, pleopods and hepatopancreas by in situ hybridization. The
results of study confirm the causative agents of this disease are MrNV and XSV.


iii

MỤC LỤC
TÓM TẮT ................................................................................................................... i
ABSTRACT ............................................................................................................... ii
MỤC LỤC................................................................................................................. iii
DANH MỤC CÁC BẢNG..........................................................................................v
DANH MỤC CÁC HÌNH......................................................................................... vi
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ...................................................................................... vii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................ viii
MỞ ĐẦU.....................................................................................................................1
Phần 1.
TỔNG QUAN...........................................................................................3
1.1. Tổng quan về tôm càng xanh .......................................................................3
1.1.1. Phân loại và hình thái............................................................................3
1.1.2. Vịng đời của tơm càng xanh ................................................................4
1.1.3. Sự phân bố ............................................................................................4
1.1.4. Đặc điểm phát triển của ấu trùng ..........................................................4
1.2. Một số bệnh trên tôm càng xanh ..................................................................5
1.2.1. Các bệnh do virus..................................................................................5
1.2.2. Các bệnh do vi khuẩn............................................................................5
1.2.3. Bệnh do Ricketsia .................................................................................7
1.2.4. Bệnh do nấm .........................................................................................7
1.2.5. Bệnh do động vật nguyên sinh..............................................................7
1.2.6. Một số bệnh chưa xác định rõ tác nhân gây bệnh.................................8
1.3. Bệnh đục thân trên tôm càng xanh ...............................................................8
1.3.1. Lịch sử phát hiện bệnh ..........................................................................8
1.3.2. Dấu hiệu của bệnh đục thân ..................................................................9
1.3.3. Tác nhân gây bệnh ................................................................................9
1.4. Các phương pháp nghiên cứu bệnh đục thân trên tôm càng xanh .............10
1.4.1. Phương pháp nghiên cứu mô bệnh học...............................................11

1.4.2. Phương pháp RT-PCR ........................................................................13
1.4.3. Phương pháp lai Dot-blot....................................................................15
1.4.4. Phương pháp ELISA ...........................................................................16
1.4.5. Phương pháp lai tại chỗ ......................................................................17
1.5. Các nghiên cứu trong nước và ngoài nước.................................................21
1.5.1. Các nghiên cứu trong nước .................................................................21
1.5.2. Các nghiên cứu ngoài nước.................................................................21
Phần 2.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................24
2.1. Vật liệu .......................................................................................................24
2.1.1. Mẫu tôm ..............................................................................................24
2.1.2. Thang DNA.........................................................................................24
2.1.3. Mồi ......................................................................................................25
2.1.4. Bộ kit tổng hợp và đánh dấu mẫu dò ..................................................25
2.1.5. Bộ kit tách chiết và tinh sạch DNA từ gel agarose .............................26


iv

2.2. Phương pháp...............................................................................................26
2.2.1. Thu và bảo quản mẫu..........................................................................27
2.2.2. Tách chiết RNA tổng số......................................................................28
2.2.3. Phương pháp tách chiết dịch virus MrNV và XSV ............................29
2.2.4. Bố trí thí nghiệm cảm nhiễm ..............................................................30
2.2.5. Phương pháp mô bệnh học..................................................................32
2.2.6. Phương pháp RT-PCR và điện di trên gel agarose .............................34
2.2.7. Phương pháp tổng hợp và đánh dấu mẫu dò.......................................36
2.2.8. Phương pháp tinh sạch mẫu dò từ gel agarose....................................38
2.2.9. Phương pháp lai tại chỗ ......................................................................39
Phần 3.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................................43
3.1. Kết quả kiểm tra MrNV với kỹ thuật RT-PCR ..........................................43
3.2. Kết quả khảo sát mô bệnh học ...................................................................46
3.3. Kết quả thí nghiệm cảm nhiễm ..................................................................49
3.4. Kết quả phát hiện mầm bệnh với kỹ thuật lai tại chỗ.................................54
3.4.1. Kết quả tổng hợp và đánh dấu mẫu dò cho MrNV và XSV ...............54
3.4.2. Kết quả phát hiện MrNV và XSV bằng phương pháp lai tại chỗ .......56
Phần 4.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................62
4.1. KẾT LUẬN ................................................................................................62
4.2. ĐỀ NGHỊ....................................................................................................62
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................63
Phần tiếng Việt ......................................................................................................63
Phần tiếng Anh ......................................................................................................64


v

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Các cặp mồi được sử dụng để phát hiện MrNV bằng RT-PCR.............25
Bảng 3.1: Kết quả kiểm tra MrNV và XSV trên 36 mẫu TCX bằng RT-PCR ......45
Bảng 3.2: So sánh kết quả khảo sát bằng phương pháp mô bệnh học trên ấu trùng
TCX bị đục thân với các tác giả khác .....................................................................48
Bảng 3.3: Bảng theo dõi kết quả thí nghiệm cảm nhiễm. ..........................................52
Bảng 3.4: Kết quả kiểm tra MrNV và XSV bằng kỹ thuật RT-PCR trên ấu trùng
TCX trong thí nghiệm cảm nhiễm.................................................................................54
Bảng 3.5: So sánh kết quả xác định vị trí lây nhiễm của MrNV trên ấu trùng TCX
với các tác giả khác .................................................................................................59
Bảng 3.6: So sánh kết quả lai tại chỗ giữa MrNV và XSV....................................61

vi

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Cấu tạo ngồi của M. rosenbergii .........................................................3
Hình 1.2: Tơm càng xanh có dấu hiệu bị bệnh đục thân........................................9
Hình 1.3: Ảnh chụp bằng kính hiển vi điện tử của MrNV và XSV ......................10
Hình 1.4: Đặc điểm mơ học của TCX bị nhiễm bệnh đục thân. ............................13
Hình 1.5: Phát hiện MrNV bằng kỹ thuật lai Dot-blot...........................................16
Hình 1.6: Kết quả lai tại chỗ trên mô của TCX bị nhiễm MrNV...........................20
Hình 2.1: Thang DNA 100 trên gel agarose 2% ....................................................24
Hình 3.1: Kết quả kiểm tra MrNV và XSV bằng RT-PCR....................................43
Hình 3.2: Các thay đổi về mơ bệnh học trên mơ cơ của ấu trùng TCX bị đục
thân ..........................................................................................................................46
Hình 3.3: Đặc điểm mô bệnh học cơ quan gan tụy của ấu trùng TCX ..................47
Hình 3.4: Ấu trùng TCX bị bệnh đục thân trong thí nghiệm cảm nhiễm...............50
Hình 3.5: Tỉ lệ PL chết trong thí nghiệm cảm nhiễm MrNV và XSV ...................51
Hình 3.6: Kết quả RT-PCR MrNV và XSV trên PL cảm nhiễm ...........................53
Hình 3.7: Kết quả đánh dấu mẫu dị cho MrNV và XSV ......................................55
Hình 3.8: Phản ứng oxi hóa-khử tạo kết tủa màu xanh dương trong phương
pháp lai tại chỗ ........................................................................................................56
Hình 3.9: Kết quả lai tại chỗ với mẫu dị đặc hiệu cho MrNV trong gan tụy........57
Hình 3.10: Lai tại chỗ với mẫu dò đặc hiệu cho MrNV trên mơ cơ và chân bơi...58
Hình 3.11: Kết quả lai tại chỗ với mẫu dò đặc hiệu cho XSV ...............................60


vii

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1: Sơ đồ các phương pháp nghiên cứu ......................................................27

Sơ đồ 2.2: Sơ đồ phương pháp tách chiết dịch virus MrNV và XSV ....................30
Sơ đồ 2.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm cảm nhiễm MrNV và XSV trên PL ................31
Sơ đồ 2.4: Quy trình xử lý mẫu mơ bệnh học ........................................................33
Sơ đồ 2.5: Quy trình nhuộm mẫu mô bệnh học......................................................34


viii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
AG:

An Giang

bp:

Base pair

cDNA:

Complementary deoxyribonucleic acid

DEPC:

Diethyl Prycacbonat

DIG:

Digoxigenin

DNA:

Deoxyribonucleic Acid

ĐBSCL:

Đồng bằng sông Cửu Long

ĐT:

Đồng Tháp

ELISA:

Enzyme linked immunosorbent assay

g:

Gravity

H & E:

Hematoxylin và eosin

KHV:

Kính hiển vi

MrNV:

Macrobrachium rosenbergii nodavirus

PCR:

Polymerase Chain Reaction

PL:

Postlarvae

RNA:

Ribonucleic Acid

RT-PCR:

Reverse – transcriptase polymerase chain reaction

S - ELISA:

Sandwich-Enzyme linked immunosorbent assay

STT:

Số thứ tự

TCX:

Tôm càng xanh

Tm:

Melting Temperature

XSV:

Extra small virus


1

MỞ ĐẦU
Tôm càng xanh (TCX) được xem là một trong những lồi có giá trị kinh tế cao
trong các đối tượng nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam, đặc biệt là ở vùng Đồng bằng
Sông Cửu Long. Từ năm 2000, sản lượng TCX hàng năm đều tăng và đạt 10000 tấn
trong năm 2002 (Bộ Thủy sản, 2003).
Tuy nhiên, những năm gần đây nghề nuôi TCX ở nước ta và một số nước trên
thế giới bị thiệt hại lớn, nguyên nhân gây ra là do bệnh đục thân. Từ khi được phát
hiện đến nay, bệnh đục thân đã xuất hiện ở Đài Loan (Tung và cộng sự, 1999),
Trung Quốc (Qian và cộng sự, 2003), Ấn Độ (Sahul và cộng sự, 2004), Thái Lan
(Yoganandhan và cộng sự, 2006) và ở Việt Nam (AGDAFF-NACA, 2007). Tác
nhân gây bệnh được xác định là do Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV)
và Extra small virus (XSV) (Qian và cộng sự, 2003).
Bệnh đục thân gây ảnh đến giai đoạn ấu trùng và tôm giống. Dấu hiệu nhiễm
của bệnh là xuất hiện những vùng cơ bị trắng đục ở phần đầu ngực, bụng và đuôi;
khả năng bơi và bắt mồi giảm sút. Tỉ lệ chết có thể đến 100% (Qian và cộng sự,
2003). Song đây không phải là những dấu hiệu đặc trưng cho bệnh đục thân
(Romestand và Bonami, 2003; Widada và cộng sự, 2004). Vì vậy, khi có những dấu
hiệu nhiễm của bệnh đục thân, tôm cần phải được kiểm tra bằng các phương pháp
có độ chính xác cao như kỹ thuật RT-PCR, lai tại chỗ, lai Dot-blot,….
Từ thực tế đó, cần phải có những nghiên cứu về tác nhân gây bệnh, cơ chế phát

sinh của bệnh đục thân trên TCX nuôi ở Việt Nam. Những nghiên cứu này sẽ là cơ
sở cho các phương pháp chẩn đoán bệnh nhanh chóng, chính xác. Từ đó áp dụng
các biện pháp phịng và trị bệnh có hiệu quả để hạn chế đến mức thấp nhất những
thiệt hại về kinh tế do bệnh đục thân gây ra. Vì vậy chúng tơi thực hiện đề tài:
“XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỤC THÂN TRÊN ẤU TRÙNG TƠM
CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii) VÀ VỊ TRÍ NHIỄM CỦA MẦM
BỆNH”


2

Mục tiêu nghiên cứu
− Xác định tác nhân gây bệnh đục thân trên ấu trùng TCX do virus gây ra.
− Xác định vị trí có sự hiện diện của mầm bệnh trên ấu trùng TCX bị bệnh đục
thân.
Nội dung nghiên cứu
− Phát hiện mầm bệnh trên ấu trùng TCX bị bệnh đục thân bằng kỹ thuật RTPCR.
− Xác định tác nhân gây bệnh đục thân trên ấu trùng TCX.
− Xác định vị trí nhiễm của tác nhân gây bệnh bằng kỹ thuật lai tại chỗ (In situ
hybridization).
Phạm vi nghiên cứu
Đề tài nghiên cứu trên đối tượng ấu trùng TCX bị bệnh đục thân.


3

Phần 1. TỔNG QUAN
1.1.
1.1.1.

Tổng quan về tôm càng xanh
Phân loại và hình thái

Theo hệ thống phân loại của Holthuis (1950), tơm càng xanh được xác định với
vị trí phân loại như sau (dẫn theo Nguyễn Việt Thắng, 1993) [7]:
Ngành chân khớp

:

Arthropoda

Lớp giáp xác

:

Crustacea

Lớp phụ giáp xác bậc cao

:

Malacostraca

Bộ mười chân

:

Decapoda

Bộ phụ chân bơi

:

Natantia

Phân bộ

:

Caridea

Họ

:

Palaemonidae

Giống

:

Macrobrachium

Lồi

:

M. rosenbergii De Man 1879

Hình 1.1: Cấu tạo ngồi của M. rosenbergii (Lương Đình Trung, 1999).

Tơm càng xanh có cơ thể thon dài, đối xứng hai bên. Cơ thể gồm có 2 phần là
phần đầu ngực phía trước và phần bụng phía sau. Phần đầu ngực lớn, có dạng hơi


4

giống hình trụ, gồm phần đầu với 5 đốt gần nhau, mang 5 đôi phụ bộ và phần ngực
với 8 đốt liền nhau mang 8 đôi phụ bộ. Phần đầu ngực được bao dưới tấm vỏ dày
gọi là giáp đầu ngực. Phần bụng gồm có 6 đốt có thể cử động và 1 đốt đuôi. Mỗi đốt
mang một đôi phụ bộ gọi là chân bơi. Mỗi đốt bụng có tấm vỏ bao. Tấm vỏ phía
trước xếp chồng lên tấm vỏ phía sau. Các đốt bụng hơi trịn trên mặt lưng và dẹp hai
bên. Cơ thể có dạng hơi cong như hình dấu phẩy, to ở phần đầu và thon nhỏ về phía
sau [4].
1.1.2.

Vịng đời của tơm càng xanh

Vịng đời của tơm càng xanh có 4 giai đoạn: trứng, ấu trùng, hậu ấu trùng và
tôm trưởng thành [4]. Khi tôm đã trưởng thành, chúng thường sống ở vùng nước
ngọt như: sông, rạch, ao hồ,…. Cũng chính nơi này sẽ xảy ra quá trình thành thục,
phát dục và giao vĩ đẻ trứng. Nhưng khi ơm trứng chúng có xu thế bơi ra vùng nước
lợ từ 6-18 ‰, ở đó ấu trùng được nở ra và sống trôi nổi theo kiểu phù du. Sau 11 lần
lột xác với 12 giai đoạn biến thái, ấu trùng (Nauplii) biến thành hậu ấu trùng (Post
larvae) lúc này tôm con di cư về vùng nước ngọt, sống và lớn lên ở đây [4], [7].
1.1.3.

Sự phân bố

Trong tự nhiên tôm càng xanh phân bố rộng ở các vùng nhiệt đới và á nhiệt đới
tập trung ở khu vực Ấn Độ Dương và Tây Nam Thái Bình Dương, chủ yếu ở khu

vực từ Châu Úc đến New Guinea, Trung Quốc và Ấn Độ. Tôm phân bố ở hầu hết
các thủy vực nước ngọt trong nội địa như sông, hồ, ruộng, đầm hay cả các thủy vực
nước lợ khu vực cửa sông [4].
Ở Việt Nam, tôm càng xanh phân bố tự nhiên chủ yếu các tỉnh Nam Bộ, đặc biệt
là vùng ĐBSCL. Ở các thủy vực độ mặn 18 ‰ hay đơi khi cả 25 ‰ vẫn có thể thấy
tơm xuất hiện. Tùy từng thủy vực với các đặc điểm môi trường khác nhau và tùy
mùa vụ khác nhau mà tơm càng xanh xuất hiện với kích cỡ, giai đoạn thành thục và
mức độ phong phú khác nhau [4].
1.1.4.

Đặc điểm phát triển của ấu trùng

Ấu trùng mới nở ra sống phù du và cần nước lợ (6-16 ‰) để sống và phát triển.


5

Ấu trùng sẽ chết sau 3-4 ngày nếu không được sống trong nước lợ. Ấu trùng bơi lội
chủ động, bụng ngửa và đi ở phía trước. Ấu trùng có tính hướng quang mạnh,
chúng bơi lội gần sát mặt nước thành từng đám. Thức ăn của ấu trùng bao gồm các
loại động vật phù du, giun nhỏ, ấu trùng các động vật thủy sinh. Ấu trùng trải qua
11 lần lột xác và biến thái để trở thành hậu ấu trùng [4].
1.2.
1.2.1.

Một số bệnh trên tôm càng xanh
Các bệnh do virus

1.2.1.1. MHPV (Macrobrachium hepatopancreatic parvo-like virus)
Loại virus này được ghi nhận nhận gây bệnh trên tôm càng xanh nhưng không

gây thiệt hại nghiêm trọng. Kết quả nghiên cứu bằng phương pháp mô học trên tơm
bị nhiễm MHPV cho thấy có sự xuất hiện các thể vùi đặc trưng ở trong nhân của
các tế bào biểu mô cơ quan gan tụy. Những dấu hiệu này rất giống với các đặc điểm
của bệnh do HPV (hepatopancreatic parvovirus) gây ra trên tôm thẻ chân trắng. Tuy
nhiên có thể phân biệt hai bệnh này bằng phương pháp lai tại chỗ [27].
1.2.1.2. MMV ( Macrobrachium muscle virus)
Loại virus này lần đầu tiên được phát hiện ở Đài Loan [51]. MMV chỉ gây
nhiễm trên cơ, các mô cơ bị nhiễm virus trở nên trắng đục, sau đó dẫn đến hoại tử.
Các thể vùi ưa kiềm cũng có thể xuất hiện trong tế bào chất của các tế bào cơ. Bệnh
thường bùng phát trong vòng 10 ngày sau khi chuyển PL sang ao ni, tỉ lệ chết có
thể trên 50% [27].
1.2.1.3. WSBV (White spot syndrome baculovirus)
Nhiều nghiên cứu đã ghi nhận sự lây nhiễm và gây bệnh của WSBV trên tôm
càng xanh. Kết quả nghiên cứu bằng phương pháp lai tại chỗ xác định vị trí có sự
hiện diện của WSBV bao gồm: dạ dày, mang và cơ quan gan tụy [27].
1.2.2.

Các bệnh do vi khuẩn

1.2.2.1. Bệnh đốm nâu (Brown spot)
Bệnh này còn được gọi là bệnh đốm đen (Black spot) hay bệnh trên vỏ (Shell


6

disease) [27]. Bệnh đốm nâu xuất hiện ở tất cả các giai đoạn phát triển của tôm càng
xanh, nhất là khi tôm phải sống trong môi trường nước bị nhiễm bẩn và thiếu dinh
dưỡng [13], [27]. Bệnh đốm nâu gây thiệt kinh tế lớn, năng suất có thể giảm đến
30%. [5], [13].
Tôm bị bệnh đốm nâu thường xuất hiện những đốm có màu nâu, sau đó chuyển

dần sang màu đen. Các vết này bị viêm tấy dẫn đến lở loét và xuất hiện bất kì chỗ
nào trên cơ thể và phần phụ [5], [13]. Các tổn thương này là cửa ngõ xâm nhiễm
của các mầm bệnh cơ hội khác [27]. Những tơm bị bệnh nặng thường kém ăn, gầy
yếu, ít hoạt động; râu, chân, đuôi bị ăn cụt và chết rải rác [5], [13].
Tác nhân gây bệnh có thể do các nhóm vi khuẩn như Aeromonas và
Pseudomonas [5], [13], [27]. Ngoài ra, các yếu tố ngoại cảnh gây sốc cho tôm, môi
trường nước bị nhiễm bẩn, mật độ nuôi dày, quản lý và chăm sóc kém cũng tạo điều
kiện cho bệnh phát triển nhanh, tỉ lệ tôm chết cao hơn [13], [27].
1.2.2.2. Bệnh hoại tử do vi khuẩn
Bệnh thường xảy ra ở giai đoạn ấu trùng, đặc biệt ở giai đoạn IV-V thì bệnh
càng nghiêm trọng. Dấu hiệu của bệnh là xuất hiện các đốm nâu và hoại tử trên các
phụ bộ. Các điểm hoại tử phát triển rất nhanh, nếu khơng được xử lý kịp thời thì tỉ
lệ chết rất cao. Ấu trùng bị bệnh có dạ dày rỗng, màu xanh nhạt, yếu dần và chìm
xuống đáy bể [4], [27].
Tác nhân gây bệnh là các nhóm vi khuẩn Pseudomonas và vi khuẩn dạng sợi
Leucothrix. Ngoài ra, các yếu tố như nhiệt độ thay đổi đột ngột, mật độ ấu trùng
cao, sự chăm sóc quản lý khơng tốt sẽ làm giảm sức đề kháng của tôm và làm cho
bệnh trở nên trầm trọng hơn [4], [27].
1.2.2.3. Bệnh phát sáng
Tác nhân gây bệnh là vi khuẩn phát sáng Vibrio harveyi. Biểu hiện cấp tính của
bệnh là sự phát sáng của những ấu trùng nhiễm bệnh hoặc đã chết và có thể quan sát
dễ dàng lúc ban đêm [4], [27].


7

Ấu trùng nhiễm bệnh cũng bị vi sinh vật bám, đục cơ và bơi lội chậm chạp [4].
Bệnh phát sáng gây thiệt hại lớn cho nghề ương nuôi ấu trùng tơm càng xanh, tỉ lệ
tử vong có thể đến 100% [4], [27].
1.2.3.

Bệnh do Ricketsia

Bệnh do Ricketsia gây thiệt hại lớn đến sản lượng PL, tỉ lệ tử vong có thể tới
95%. Giai đoạn ấu trùng rất mẫn cảm với bệnh này, đặc biệt là giai đoạn ấu trùng
IV-V. Dấu hiệu cơ bản của bệnh là sự thối hóa cơ quan gan tụy của ấu trùng bị
bệnh [27].
Bệnh do Ricketsia gây ra xuất hiện khá phổ biến trên các loài giáp xác, tuy
nhiên việc nghiên cứu bằng phương pháp mô bệnh học gặp nhiều khó khăn vì
chúng có kích thước nhỏ và thiếu các phương pháp nhuộm tiêu bản phù hợp [27].
1.2.4.

Bệnh do nấm

Tơm càng xanh thường bị nhiễm các lồi nấm như Lagenidium, Fusarium
solani, Saprolegnia sp., Dabaryomyces hansenii và Metschnikowia bicuspidata
[27]. Khi tơm bị nhiễm nấm, cơ có màu vàng hoặc xám, sức đề kháng giảm, dễ bị
nhiễm các mầm bệnh cơ hội khác. Sự phát triển và gây bệnh của nấm là do sự tồn
dư nhiều chất hữu cơ, cơng tác vệ sinh và chăm sóc kém [27].
1.2.5.

Bệnh do động vật nguyên sinh

Các động vật nguyên sinh thường được tìm thấy trên tơm càng xanh như:
Zoothamnium,

Epistylis,

Vorticella,

Opercularia,

Vaginicola,

Cothurnia,

Lagenophrys, Acineta, Podophria, Tokophrya và Ephelota [27]. Chúng thường sống
ngoại sinh trên thân, các phần phụ và mang của tôm. Tất cả các giai đoạn phát triển
của tơm đều có thể mắc bệnh [1]. Ấu trùng bị nhiễm động vật nguyên sinh có màu
hơi mờ đục. Nếu nhiễm nhẹ bệnh có thể hết sau khi lột xác, nếu bị nhiễm nặng sẽ
ảnh hưởng đến q trình lột xác tăng trưởng, ấu trùng khơng bơi lội được, chìm dần
xuống đáy và chết [4], [1]. Tác hại của bệnh không chỉ làm tôm chậm lớn, mà còn
tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn xâm nhập và gây bệnh [13].


8

1.2.6.

Một số bệnh chưa xác định rõ tác nhân gây bệnh

1.2.6.1. Bệnh giữa chu kì ấu trùng (Larval Mid Cycle Disease- MCD)
MCD là một bệnh gây thiệt hại lớn cho nghề ương giống tôm càng xanh [27].
Nguyên nhân gây bệnh vẫn chưa được xác định [4], [27], có lẽ là do nhiễm khuẩn tự
nhiên nhất là vi khuẩn Enterobacter aerogenes [4]. MCD cũng có thể là một loại
bệnh phát sinh bởi nhiều nguyên nhân khác nhau [27].
Bệnh bùng phát vào các giai đoạn giữa chu kì phát triển của ấu trùng, thường là
giai đoạn IV-XI [4], hay giai đoạn VI-VII [27]. Dấu hiệu của bệnh thường là ấu
trùng bỏ ăn và những cá thể bị bệnh sẽ bị các con khỏe hơn ăn thịt. Ấu trùng nhiễm
bệnh thường có màu xám lơ, bơi lội yếu ớt và thường bơi theo hình xoắn ốc [4].

1.2.6.2. Bệnh lột xác dính vỏ
Bệnh lột xác dính vỏ (Exuvia entrapment diease-EED) chủ yếu xảy ra ở giai
đoạn ấu trùng, đặc biệt là sự lột xác biến thái sang giai đoạn PL [27]. Dấu hiệu của
bệnh là ấu trùng không thể rút các phụ bộ, mắt hoặc chủy ra khỏi vỏ lột. Số khác đã
thoát ra được các vỏ lột thì bị dị tật các phụ bộ và chết [4], tỉ lệ chết có thể tới 80%
[27].
Nguyên nhân gây bệnh vẫn chưa được xác định [27]. Có thể là do chất lượng
nước kém hoặc dinh dưỡng khơng tốt, nhất là thiếu lecithin [4]. Có giả thuyết cho
rằng bệnh do nhiều nguyên nhân khác nhau gây ra [27].
1.3.
1.3.1.

Bệnh đục thân trên tôm càng xanh
Lịch sử phát hiện bệnh

Bệnh đục thân trên tơm càng xanh cịn được gọi là bệnh đục cơ (Whitish muscle
disease) hay bệnh đuôi trắng (White tail disease) [32]. Bệnh này lần đầu tiên được
phát hiện vào năm 1994 trong các trại ương giống ở đảo Guadeloupe [15]. Sau đó
bệnh xuất hiện ở Đài Loan [51], Trung Quốc [31], Ấn Độ [36] và Thái Lan [59].
Bệnh gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng cho các trại ương giống và các trại nuôi
tôm càng xanh [42], [36]. Khi có dấu hiệu của bệnh đục thân, ấu trùng bị chết
nhiều, tỉ lệ tử vong 95% [14], có thể tới 100% [31], [42], [36].


9

1.3.2.

Dấu hiệu của bệnh đục thân

Trong các bể ương, ấu trùng bị nhiễm bệnh có dấu hiệu lờ đờ, biếng ăn và có
màu trắng đục ở phần đi, sau đó lan dần về phía đầu, cuối cùng là tồn bộ cơ của
phần đầu ngực và phần đi đều có màu trắng đục như sữa [14], [36].

Hình 1.2: Tơm càng xanh có dấu hiệu bị bệnh đục thân (Hsieh và cộng sự, 2006a)
Ấu trùng bị nhiễm bệnh có màu trắng đục khác hẳn so với ấu trùng bình thường.
Các mơ bị nhiễm bệnh là cơ ở phần đuôi và đầu ngực, mô liên kết giữa các vi quản
của cơ quan gan tụy [15], [14], [23]. Điều đáng lưu ý là ấu trùng bị bệnh có thể chỉ
biểu hiện một số trong tất cả các dấu hiệu trên, thậm chí tác nhân gây bệnh vẫn hiện
diện ngay cả khi ấu trùng không có các biểu hiện của bệnh [14].
Mặc dù dấu hiệu chính để chẩn đốn bệnh đục thân là cơ có màu trắng đục,
nhưng đây không phải là các dấu hiệu đặc trưng của bệnh. Vì vậy cần sử dụng
những phương pháp chẩn đốn bệnh đục thân chính xác và có độ tin cậy cao hơn
[36], [58].
1.3.3.

Tác nhân gây bệnh

Tác nhân gây bệnh lần đầu tiên được xác định là Macrobrachium rosenbergii
nodavirus (MrNV) [15]. Sau đó Qian và cộng sự (2003) cơng bố thêm một loại
virus có tên là Extra small virus (XSV). XSV được phát hiện cùng với MrNV trên


10

tôm bị bệnh đục thân thu từ Trung Quốc [31].
MrNV là một virus có dạng hình cầu đa diện 20 mặt, khơng có màng bao, đường
kính khoảng 26-27 nm. Bộ gen của MrNV bao gồm 2 sợi đơn RNA có kích thước
lần lượt là 2,9kb và 1,3kb [18]. Vỏ capsid của MrNV là một chuỗi polypeptide có
khối lượng 43 kDa [18]. Với những đặc điểm này, MrNV được xếp vào họ

Nodaviridae [34], [18].
XSV cũng là một virus có dạng đa diện 20 mặt, khơng có màng bao, kích thước
khoảng 15-16 nm; vật chất di truyền là một sợi đơn RNA, kích thước khoảng 0,80,9 kb [31]. Kết quả giải trình tự cho thấy RNA này gồm có 796 nucleotide và một
đoạn poly(A) khoảng 15-20 nucleotide ở đầu 3’ [43]. Vỏ capsid của XSV gồm 2 sợi
polypeptide có khối lượng lần lượt là 16 và 17 kDa [18].

Hình 1.3: Ảnh chụp bằng kính hiển vi điện tử của MrNV (trái) và XSV (phải)
(Bonami và cộng sự, 2005)
Vai trò và mối quan hệ giữa MrNV và XSV vẫn chưa được sáng tỏ. Vì kích
thước nhỏ và khơng có gen mã hóa enzyme cần thiết cho sự tái bản nên có giả thiết
cho rằng XSV là một satellite virus và MrNV đóng vai trò như là một virus trợ giúp
(helper virus) [31], [43]. Tuy nhiên, một số nghiên cứu chỉ phát hiện XSV mà
khơng có MrNV trên mẫu TCX bị bệnh đục thân [36], [44].
1.4.

Các phương pháp nghiên cứu bệnh đục thân trên tôm càng xanh

Nhiều phương pháp nghiên cứu bệnh đục thân trên tôm càng xanh đã được sử
dụng như: phương pháp mô bệnh học [15], [23]; kỹ thuật RT-PCR [18], [31, [36],
[40], [42], [50], [53], [59]; kỹ thuật lai Northern blot [31]; lai Dot-blot [42]; kỹ


11

thuật S-ELISA [34]; phương pháp lai tại chỗ [23], [42], [54].
1.4.1.

Phương pháp nghiên cứu mô bệnh học

1.4.1.1. Nguyên tắc

Mô học nói chung được tạo nên bởi các tế bào và chất nền, giữa chúng có mối
quan hệ tác động qua lai lẫn nhau. Tế bào và các phân tử của chất nền có kích thước
rất nhỏ nên phải được khảo sát ở mức độ vi thể và siêu vi thể [8]. Phương pháp
khảo sát vi thể phổ biến nhất là thực hiện và khảo sát tiêu bản mô học dưới kính
hiển vi (KHV) quang học. Vì vậy, các cấu trúc và các cơ quan cần được cắt mỏng
và làm sạch. Hầu hết các mô đều được cắt mỏng và gắn vào phiến kính trước khi
quan sát bằng KHV quang học [8]. Kỹ thuật này gồm một số giai đoạn chính như
sau:
Cố định
Khâu cố định giúp mẫu bền vững, bảo quản được lâu ngày. Để cho mẫu không
bị tiêu hủy bởi các enzyme có sẵn bên trong các tế bào hay bởi các vi khuẩn và bảo
vệ các cấu trúc nguyên vẹn ở mức độ phân tử, cần xử lý các mẫu với dung dịch cố
định [8].
Chất cố định thường dùng là formaldehyde 4%-10%; cơ chế tác động của
formaldehyde chưa được hiểu rõ đầy đủ, người ta thấy rằng nó có tác động với các
gốc amin (NH2) của protein [8].
Vùi
Trước khi cắt mỏng, mẫu được vùi vào một chất liệu cứng vừa phải để có thể
cho lát cắt mơ thật mỏng. Chất liệu dùng vùi mẫu là sáp paraffin và nhựa resin. Sáp
paraffin được dùng phổ biến trong khảo sát với KHV quang học [8].
Quy trình vùi mẫu với paraffin có hai khâu chính là khử nước và làm sạch. Đầu
tiên, nước được rút ra bằng cách ngâm mẫu trong một loạt các dung dịch hỗn hợp
ethanol và nước (với nồng độ tăng dần từ 70%-100% ethanol). Ethanol sau đó được
thay thế bằng một dung mơi có tính hịa tan chất liệu dùng vùi mẫu. Đối với chất


12

vùi mẫu là paraffin, dung môi thường dùng là xylene. Khi đã ngấm đầy xylene, mẫu
được vùi vào paraffin lỏng ở nhiệt độ 58-60oC. Nhiệt độ này làm cho xylene bốc

hơi và khoảng trống còn lại được lấp đầy bởi paraffin. Mẫu ngấm paraffin trở nên
cứng sau khi được lấy ra khỏi tủ ấm [8]. Sau khi vùi, khối mô được gắn vào máy cắt
mỏng (microtome) với độ cắt mỏng 1-10 µm. Lát mơ cắt mỏng được để nổi trên
mặt nước và chuyển sang phiến kính trước khi nhuộm [8], [26].
Nhuộm
Khâu nhuộm cho phép khảo sát mô dưới KHV quang học. Hầu hết các mô đều
không màu và việc khảo sát mô không màu dưới KHV quang học là không hiệu
quả. Vì vậy, nhuộm mẫu giúp làm rõ và phân biệt các thành phần cấu trúc của mơ
[8].
Có nhiều loại thuốc nhuộm, hầu hết ở dạng hợp chất có tính acid và tính bazơ,
có xu hướng kết gắn bền vững (ở dạng muối). Cấu trúc ăn thuốc nhuộm tính bazơ
được gọi là có tính ưa bazơ (basophilic); cấu trúc ăn thuốc nhuộm có tính acid thì
được gọi là có tính ưa acid (acidophilic) [8].
Trong số tất cả các loại thuốc nhuộm, hợp chất hematoxylin và eosin (H & E)
được dùng phổ biến. Hematoxylin có tính bazơ, nó nhuộm được các cấu trúc có tính
ưa bazơ như nhân tế bào cho màu xanh dương. Eosin là thuốc nhuộm có tính acid,
nhuộm bào tương và các sợi collagen, cho màu hồng [8].
Toàn bộ quy trình thực hiện tiêu bản mơ học từ khâu cố định đến lúc quan sát
tiêu bản dưới KHV quang học có thể tiến hành trong vịng 12 giờ đến 2,5 ngày tùy
theo kích cỡ mẫu, chất cố định và chất vùi mẫu [8].
1.4.1.2. Các nghiên cứu về bệnh đục thân trên tôm càng xanh bằng phương
pháp mô bệnh học
Một số tác giả đã sử dụng phương pháp mô bệnh học để nghiên cứu bệnh đục
thân trên TCX như Arcier và cộng sự (1999); Tung và cộng sự (1999); Hsieh và
cộng sự (2006) (Hình 1.4). Kết quả cơng bố đều cho thấy có sự hoại tử cơ, xuất hiện
các thể vùi ưa kiềm trong cơ quan gan tụy và trên cơ.


13

Kết quả trên Hình 1.4 cho thấy virus MrNV gây ra những điểm bị thối hóa và
hoại tử trên cơ ở phần bụng (a). Những khoảng trống chứa đầy dịch được tạo ra do
sự phù thủng trên cơ ở phần bụng (b). Các thể vùi ưa kiềm bên trong tế bào chất, có
màu tối, hình ơ-val hoặc hình dạng khác xuất hiện trên cơ ở phần ngưc bụng (c).
Các thể vùi ưa kiềm xuất hiện trong các tế bào của mô liên kết, và các thể thực bào
trong cơ quan gan tụy (d) [23].

Hình 1.4: Đặc điểm mơ học của TCX bị nhiễm bệnh đục thân
(Hsieh và cộng sự. 2006a)
1.4.2.

Phương pháp RT-PCR

1.4.2.1. Nguyên tắc
Vật chất di truyền của MrNV và XSV đều là RNA [18], [31] và do enzyme Taq
polymerase không hoạt động trên RNA [2], [6] nên không thể sử dụng trực tiếp kỹ
thuật PCR để nghiên cứu bệnh đục thân trên tơm càng xanh. Do đó người ta phải sử
dụng phối hợp kỹ thuật PCR với enzyme phiên mã ngược là reverse transcriptase,
gọi là kỹ thuật RT-PCR. Kỹ thuật RT-PCR được ứng dụng trong việc khuyếch đại
các cDNA, là sản phẩm của sự phiên mã ngược trước đó từ mRNA hoặc RNA của
virus có vật chất di truyền là RNA [11].
Kỹ thuật RT-PCR gồm 2 giai đoạn: giai đoạn phiên mã ngược và giai đoạn
khuyếch đại cDNA [11].