Nghiên cứu quá trình tự phân autolysis protein thịt đỏ cá ngừ

..

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
---------------------------------------

TRẦN TRUNG THANH BÌNH

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TỰ PHÂN
(AUTOLYSIS) PROTEIN THỊT ĐỎ CÁ NGỪ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT
CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Đà Nẵng – Năm 2018


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
---------------------------------------

TRẦN TRUNG THANH BÌNH

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TỰ PHÂN
(AUTOLYSIS) PROTEIN THỊT ĐỎ CÁ NGỪ

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số
: 60420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. BÙI XUÂN ĐÔNG

Đà Nẵng – Năm 2018


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên em xin được gửi lời cám ơn chân thành nhất đến TS. Bùi Xuân Đông,
người đã tận tình hướng dẫn cho em trong suốt thời gian vừa qua. Chính nhờ sự giúp
đỡ và chỉ dẫn của thầy đã giúp em có thể hồn thành đề tài này một cách tốt nhất và
qua thời gian làm việc cùng thầy đã giúp em học hỏi thêm được những kiến thức cũng
như kinh nghiệm quý báu trong nghiên cứu khoa học.
Em cũng xin gửi lời cám ơn đến thầy cơ cán bộ phịng thí nghiệm là ThS. Võ
Cơng Tuấn và ThS. Phạm Thị Kim Thảo đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho em
trong khoảng thời gian thí nghiệm tại phịng thí nghiệm của bộ mơn Cơng nghệ Sinh
học. Bên cạnh đó em cũng xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến các thầy cô trong bộ mơn
Cơng nghệ Sinh học, khoa Hóa, trường Đại học Bách khoa-Đại học Đà Nẵng đã dạy
dỗ, truyền đạt cho em những kiến thức bổ ích và giúp đỡ em trong suốt quãng thời
gian học tập tại trường.
Cuối cùng em xin gửi lời cám ơn chân thành đến những người thân và bạn bè đã
động viên và giúp đỡ em trong suốt khoảng thời gian học tập tại trường.
Công việc nghiên cứu không tránh khỏi những bỡ ngỡ và sai sót, em kính mong
nhận được sự góp ý của q thầy cơ phản biện để đề tài em được hồn thiện hơn.
Đà Nẵng, ngày 01 tháng 10 năm 2018
Học viên thực hiện

Trần Trung Thanh Bình

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai cơng
bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.
Người cam đoan

Trần Trung Thanh Bình


NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TỰ PHÂN (AUTOLYSIS) PROTEIN
THỊT ĐỎ CÁ NGỪ

Học viên: Trần Trung Thanh Bình.
Mã số: 107160267

Chun ngành: Cơng nghệ Sinh học

Khóa: 32 - Trường Đại học Bách khoa - ĐHĐN

Tóm tắt – Cá ngừ (Thunuss spp.) và họ cá ngừ là nguồn thực phẩm đóng vai trị
rất quan trọng đối với nền kinh tế Việt Nam. Cá ngừ thường được sử dụng tươi, chế
biến phi-lê/thăn thịt hoặc chế biến đồ hộp. Quá trình chế biến đồ hộp chỉ sử dụng một
phần ba khối lượng cá nguyên liệu. Do đó, ngành cơng nghiệp đồ hộp loại bỏ tới 70%
phụ phẩm so với nguyên liệu ban đầu, cơ thịt đỏ là một trong nguồn phế liệu rắn đó.
Dịch đạm thủy phân (FPH) được chế biến từ phụ phẩm cá ngừ, có thể được ứng dụng
như một loại gia vị trong công nghiệp chế biến thực phẩm nhằm tạo các hiệu ứng chức
năng. Mục tiêu của nghiên cứu này là nghiên cứu quá trình tự phân cơ thịt đỏ cá ngừ
để thu dịch đạm thủy phân. Đã xác định được điều kiện tối ưu cho quá trình tự phân
protein cơ thịt đỏ cá ngừ là thời gian phản ứng là 6,0, tỷ lệ phối trộn nước : nguyên
liệu là 2:1, nhiệt độ t=450C và pH của phản ứng là pH=5,0.

Từ khóa – tự phân; phế phẩm cá ngừ; cơ thịt đỏ cá ngừ; cathepsin; calpain;
collagenase; dịch đạm thủy phân;
STUDY OF AUTOLYSIS OF THE TUNA’S RED MUSCLE PROTEIN
Abstract – Tuna (Thunnus spp.) and tuna-like species are significant sources of
food and thus play a very important role in the economy of Vietmam. Tuna generally
is processed as raw fish flesh and marketed as loins/steaks or as a canned food. In the
tuna canning process, only about one-third of the whole fish is used. Thus, the canning
industry generates as much as 70% solid wastes from original fish materials, red
muscle is solid waste too. Fish protein hydrolysate (FPH), which is obtained through
hydrolysis of tuna waste, can be used as an ingredient in food industries to provide
functional effects. The purpose of this research is to autolysis of tuna’s red muscle to
obtain protein hydrolyzate. The optimal parameters for autolysis reaction were
reaction time of 6 h, ratio of water to red meat of 2:1, reaction temperature of 45°C
and pH of reaction – pH=5,0.
Key words – autolysis; tuna waste; tuna’s red muscle; cathepsin; calpain;
collagenase; protein hydrolysate;


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1
1.1. Tính cấp thiết của đề tài ....................................................................................... 1
1.2. Mục đích nghiên cứu ............................................................................................ 2
1.3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ........................................................................2
1.3.1. Đối tượng nghiên cứu: ..................................................................................2
1.3.2. Phạm vi nghiên cứu ...................................................................................... 3
1.4. Phương pháp nghiên cứu...................................................................................... 3
1.4.1. Phương pháp vật lý ....................................................................................... 3
1.4.2. Phương pháp hóa lý ...................................................................................... 3
1.4.3. Phương pháp hóa sinh ...................................................................................3
1.4.4. Phương pháp vi sinh ..................................................................................... 3

1.4.5. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................3
1.5.

ngh a khoa học và thực ti n của đề tài nghiên cứu ..........................................3

1.5.1.

ngh a khoa học của đề tài ..........................................................................3

1.5.2.

ngh a thực ti n của đề tài ..........................................................................4

1.6. Bố cục của luận văn ............................................................................................. 4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................5
1.1. Giới thiệu về dịch thủy phân protein....................................................................5
1.2. Giới thiệu về nguồn nguyên liệu thịt đỏ cá ngừ ...................................................6
1.2.1. Thành phần của thịt đỏ cá ngừ ......................................................................6
1.3. Tổng quan về enzyme nội tại ...............................................................................7
1.3.1. Các loại enzyme nội tại thủy phân ở hải sản ................................................7
1.3.2. Các phương pháp thủy phân protein thủy sản ............................................12
1.3.3. Ứng dụng của dịch thủy phân protein cá, thủy hải sản............................... 14
1.4. Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tự phân ................................................15
1.4.1. Nhiệt độ.......................................................................................................15
1.4.2. pH................................................................................................................15
1.4.3. ượng muối ................................................................................................ 15
1.4.4. Diện tích tiếp xúc ........................................................................................ 15
1.4.5. Bản thân nguyên liệu ..................................................................................16

1.5. Lịch sử vấn đề nghiên cứu .................................................................................16
1.5.1. Nghiên cứu trong nước ...............................................................................16
1.5.2. Nghiên cứu nước ngồi ...............................................................................19
1.5.3. Mơ hình nghiên cứu tổng quan và thực nghiệm .........................................22
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 23
2.1. Đối tượng nghiên cứu......................................................................................... 23
2.2. Dụng cụ và máy móc thiết bị .............................................................................23
2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 24
2.3.1. Phương pháp vật lý ..................................................................................... 24
2.3.2. Phương pháp hóa lý .................................................................................... 24
2.3.3. Phương pháp hóa sinh .................................................................................24
2.3.4. Phương pháp vi sinh ................................................................................... 26
2.3.5. Phương pháp cảm quan ...............................................................................27
2.4. Khảo sát thực nghiệm......................................................................................... 27
2.4.1. Xác định thành phần khối lượng các cơ quan của cá ngử ồ ....................... 27
2.4.2. Xác định thành phần hóa học của hỗn hợp thịt đỏ cá ngừ được thu gom từ
nhà máy.......................................................................................................................... 27
2.4.3. Nghiên cứu quá trình bất hoạt vi sinh vật trong mẫu nguyên liệu bằng
phương pháp vật lí và hóa học....................................................................................... 28
2.4.4. Khảo sát mức độ hoạt động của các hệ enzyme calpain, cathepsin và
collagenase trong nguyên liệu hỗn hợp thịt đỏ cá ngừ ..................................................28
2.4.5. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng tự thủy phân thịt đỏ cá ngừ
dưới tác dụng của enzyme cathepsin. ............................................................................30
2.5. Phương pháp xử lý số liệu ..................................................................................32
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................................. 33
3.1. ết quả xác định thành phần khối lượng các cơ quan của một số loại cá ngừ ở
khu vực Đà Nẵng ...........................................................................................................33
3.2. Kết quả xác định thành phần hóa học của hỗn hợp thịt đỏ cá ngừ thu gom từ
nhà máy chế biến thủy sản............................................................................................. 33
3.3. Kết quả nghiên cứu bất hoạt vi sinh vật trong mẫu ngun liệu bằng phương

pháp vật lí và hóa học ....................................................................................................34


3.4. Kết quả khảo sát mức độ thủy phân protein trong nguyên liệu dưới tác dụng của
các hệ enzyme calpain, cathepsin và collagenase ......................................................... 35
3.5.

ết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng tự thủy phân (autolysis)

thịt đỏ cá ngừ dưới tác dụng của enzyme cathepsin ...................................................... 39
3.5.1. nh hưởng của tỷ lệ phối trộn nguyên liệu nước ......................................39
3.5.2. nh hưởng của pH môi trường ...................................................................40
3.5.3. nh hưởng của thời gian phản ứng ............................................................ 41
3. . ết quả thí nghiệm kiếm chứng sản xuất thử dịch đạm .....................................42
3.7. Đề xuất quy trình cơng nghệ thu hồi dịch đạm từ thịt đỏ cá ngừ trên cở sở kích
hoạt hệ enzyme nội tại ...................................................................................................43
3.7.1. Nguyên vật liệu ........................................................................................... 43
3.7.2. Sơ đồ quy trình cơng nghệ ..........................................................................43
3.7.3. Thuyết minh quy trình cơng nghệ ............................................................... 44
3.8. Đánh giá chất lượng dịch đạm thu hồi từ thịt đỏ cá ngừ theo quy trình cơng
nghệ đề xuất ................................................................................................................... 45
3.8.1. Các chỉ tiêu lý-hóa của dịch thủy phân thịt đỏ cá ngừ................................ 45
3.8.2. Các chỉ vi sinh của dịch thủy phân thịt đỏ cá ngừ. .....................................48
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................. 49
4.1. Kết luận ..............................................................................................................49
4.2. Kiến nghị ............................................................................................................49
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 50
PHỤ LỤC 1
PHỤ LỤC 2
QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI LUẬN VĂN (bản sao)

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

FHP

Fish protein hydrolysate – Dịch đạm thủy phân từ cá

ATP

Adenosine triphotphate – dạng năng lượng sinh học

w/w

Weigh/Weigh – khối lượng/khối lượng

SD

Độ lệch chuẩn

Mb

Myoglobin

Hb

Hemoglobin

KLPT
HPLC

hối lượng phân tử
High performance lipuid chromatography - Sắc ký lỏng cao áp

kDa

Đơn vị khối lượng phân tử

pH

Power of Hydrogen - Độ hoạt động của các ion H +

µM

Micro mol

mM

Mili mol

ACE

Angiotensin-I-converting enzyme

STPP

Sodium Tripolyphosphate

DHA

Docosahexaenoic acid

EPA

Eicosapentaenoic acid

XLD agar
TSA

Thạch Xylose Lysine Desoxycholate
Tryptone casein soy agar


DANH MỤC CÁC BẢNG

Số hiệu

Tên bảng

bảng

Trang

1.1.

Hàm lượng các chất và năng lượng trong 1

1.2.

Hàm lượng một số acid amin có trong thịt đỏ cá ngừ.

7

1.3.

Hàm lượng các chất khống có trong thịt đỏ cá ngừ

7

2.1.

g thịt đỏ cá ngừ

Tỷ lệ bổ sung chất bảo quản vào mẫu nguyên liệu và phân bố
thời gian lấy mẫu phân tích vi sinh vật

7

28

3.1.

Thành phần khối lượng các cơ quan của một số loại cá ngừ

33

3.2.

Tính cảm quan của các mẫu dịch đạm ở các mức pH khác nhau

41

3.3.

Kết quả phân tích thành phần hóa học dịch thủy phân

46

3.4.

Kết quả phân tích thành phần acid amin của dịch thủy phân

46

3.5.

Kết quả phân tích chỉ tiêu vi sinh vật trong dịch thủy phân thịt
đỏ cá ngừ

48


DANH MỤC CÁC HÌNH
Số hiệu
hình

Tên hình

Trang

1.1.

Thịt đỏ cá ngừ

6

1.2.

Mơ hình cấu tạo của enzyme cathepsin

9

1.3.

Mơ hình cấu tạo của enzyme calpain

10

1.4.

Mơ hình cấu tạo của enzyme collagenase

12

1.5.

Mơ hình nghiên cứu tổng quát và thực nghiệm

22

2.1.

Mẫu thịt đỏ cá ngừ.

23

2.2.

Thành phần khối lượng các cơ quan của cá ngừ

27

2.3.

Sơ đồ khảo sát mức độ hoạt động của các hệ enzyme nội tại

29

2.4.

Sơ đồ khảo sát tỷ lệ phối trộn nguyên liệu nước

30

2.5.

Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường lên quá trình tự
phân

31

2.6.

Sơ đồ khảo sát thời gian phản ứng thích hợp cho q trình tự
phân

31

3.1.

Thành phần hóa học cơ bản của hỗn hợp nguyên liệu thịt đỏ cá
ngừ

34

3.2.

nh hưởng của các tác nhân vật lí và hóa học lên số lượng vi
sinh vật trong mẫu nguyên liệu

35

3.3.

Độ tích tụ nitơ acid amin trong dịch đạm thu được sau quá trình
tự thủy phân dưới tác dụng của các hệ enzyme cathepsin,
calpain và collagenase

36

3.4.

Mức độ thủy phân protein trong dịch đạm thu được sau quá
trình tự thủy phân dưới tác dụng của các hệ enzyme cathepsin,
calpain và collagenase

36

3.5.

nh hưởng của pH môi trường lên hoạt độ hệ enzyme protease
trong thịt đỏ cá ngừ

38

3.6.

Sự phụ thuộc của độ tích tụ nitơ acid amin của dịch đạm thủy
phân vào tỷ lệ phối trộn nguyên liệu nước

39

3.7.

Sự thay đổi độ tích tụ nitơ acid amin của dịch đạm thủy phân ở
các mức pH môi trường phản ứng khác nhau

40

3.8.

Sự phụ thuộc của độ tích tụ nitơ acid amin trong dịch đạm thủy
phân vào thời gian phản ứng

42


Số hiệu

Tên hình

Trang

Mẫu dịch sản phẩm đạm thủy phân (a –mẫu chưa ly tâm b-mẫu
sau ly tâm)

43

hình
3.9.
3.10.
3.11.
3.12

Quy trình cơng nghệ thu nhận dịch đạm từ thịt đỏ cá ngừ bằng
phản ứng tự thủy phân protein
Sắc kí đồ HP C thu được khi phân tích thành phần acid amin
của dịch đạm thủy phân thịt đỏ cá ngừ
Kết quả phân tích hàm lượng histamine trong dịch thủy phân
thịt đỏ cá ngừ

44
47
47


1
MỞ ĐẦU

1.1. Tính cấp thiết của đề tài
Việt Nam là quốc gia có thế mạnh về xuất khẩu thủy sản, sản lượng thủy sản năm
2 12 đạt ,13 tỷ USD, trong năm 2 13 – khảng 5,9 triệu tấn, … trong đó cá ngừ là
một trong những mặt hàng chủ lực. Hiện nay, cả nước có hơn 1

doanh nghiệp chế

biến cá ngừ với sản lượng nguyên liệu ước tính khoảng 91.35 tấn (số liệu tính tới
tháng 6 của năm 2 15). Theo ước tính của Hiệp hội chế biến cá ngừ (Vinatuna) sản
lượng chế biến và tiêu thụ cá ngừ hàng năm có thể đạt 2
khẩu đạt trên 4

.

tấn, với kim ngạch xuất

triệu USD/năm, là một trong những mặt hàng hải sản xuất khẩu

chính của Việt Nam chỉ sau cá Tra và tôm [4]. Các sản phẩm xuất khẩu chủ lực là cá
ngừ đơng lạnh (sashima), cá ngừ đóng hộp dầm dầu, cá ngừ xơng khói, xúc xích cá
ngừ,...

Các phụ phẩm từ quy trình chế biến cá ngừ (đầu cá, xương cá, da cá, ruột cá, thịt
đỏ, ...) đã được xác định là nguồn protein quan trọng để sản xuất các mặt hàng có giá
trị gia tăng. Nguồn phụ phẩm thịt đỏ cá ngừ bị loại bỏ chiếm 7-12% trọng lượng cá
ngừ nguyên con, hiện nay chưa được quan tâm nghiên cứu để chế biến [3]. Trong khi
đó, trong nước chưa có cơng trình nào nghiên cứu một cách bài bản và có hệ thống
giải quyết vấn đề này tận thu được lượng protein giá trị từ thịt đỏ trong sản xuất cá ngừ
để tạo ra các sản phẩm thực phẩm giá trị gia tăng.
Trong nhiều năm qua, các k thuật đã được phát triển trong việc khai thác và thu
hồi những sản phẩm có giá trị sinh học cao [21] như phân bón, thức ăn gia súc, thức ăn
thủy sản. Ngoài ra, dịch thủy phân protein được ứng dụng trong nhiều ngành công
nghiệp [21]. Gần đây, dịch thủy phân protein từ các nguyên liệu thủy sản đã trở nên
phổ biến trong ngành công nghiệp thực phẩm do hàm lượng protein cao [34]. Việc
thủy phân protein làm giảm kích thước các peptide, dịch thủy phân là nguồn acid amin
tự do, được sử dụng trực tiếp cho sinh tổng hợp protein [26]. Trong phương pháp hóa
học, một số hóa chất được áp dụng để thủy phân phụ thủy sản, ví dụ HCl 1M, sodium
sulfite, NaOH và KOH [26]. Tuy nhiên, việc sử dụng acid mạnh hoặc base mạnh để
thủy phân protein là nguyên nhân tạo ra các sản phẩm phụ có tác hại với mơi trường.
Vì vậy, thực hiện thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ theo phương pháp enzyme có nhiều
thuận lợi trong việc kiểm sốt các q trình thủy phân và do đó giảm thiểu các phản


2
ứng không mong muốn, giảm ô nhi m môi trường, tuy nhiên việc dùng enzyme
thương mại hiện nay còn khá đắt đỏ dẫn tới chi phí sản xuất cao. Bên cạnh đó, q
trình này thủy phân protein có thể thực hiện bằng cách tạo điều kiện thuận lợi cho hoạt
động của protease/proteinase nội tại có trong thịt đỏ cá ngừ [10]. Bởi vì, người ta đã
chứng minh, trong thịt đỏ cá ngừ, cathepsin – là một proteinase hoạt động trong môi
trường acid, hoạt độ mạnh nhất đạt được ở pH=2, -5,0. Cathepsin là một enzyme nội
bào, có vai trị quan trọng trong quá trình tự phân hủy thịt và thủy hải sản, quá trình tự
thủy phân di n ra rất mạnh mẽ ở điều kiện thích hợp[14].

Từ những luận giải khoa học trên đây, mục tiêu của luận văn được đưa ra là
nghiên cứu khả năng thủy phân thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme protease nội tại để thu
dịch đạm và tinh chế. Từ đó, tìm giải pháp k thuật để chế biến thịt đỏ cá ngừ để tạo ra
sản phẩm có giá trị kinh tế, có thể góp phần làm giảm hao tổn nguyên liệu cá ngừ sau
thu hoạch.

1.2. Mục đích nghiên cứu
Đề tài được tiến hành nhằm các mục đích sau đây
- Xác định được khối lượng và thành phần hóa học thịt đỏ cá ngừ.
- Nghiên cứu quá trình bất hoạt vi sinh vật trong mẫu nguyên liệu bằng phương
pháp vật lí và hóa học.
- Khảo sát mức độ thủy phân protein trong nguyên liệu dưới tác dụng của các hệ
enzyme calpain, cathepsin và collagenase.
- Đề xuất quy trình cơng nghệ thu hồi dịch đạm từ thịt đỏ cá ngừ trên cơ sở kích
hoạt hệ enzyme protease nội tại
- Đánh giá chất lượng dịch đạm từ cơ thịt đỏ cá ngừ để định hướng sử dụng.

1.3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
1.3.1. Đối tượng nghiên cứu:
- Cá ngừ ồ, cá ngừ sọc dưa và cá ngừ mắt to được thu mua từ Cảng Cá Thọ
Quang, TP. Đà Nẵng được dùng để xác định khối lượng thịt đỏ.
- Hỗn hợp thịt đỏ cá ngừ được lấy mẫu từ nhà máy đồ hộp Hạ ong, Đà Nẵng.
Nguyên liệu được xay nhỏ bằng máy xay (Luxta, Việt Nam) và lựa chọn bằng sàng
phân loại có đường kính lỗ sàng 3,0 - 3,5 mm. Sau đó, nguyên liệu được chia nhỏ
thành từng khối (100 gram/khối) và lưu trữ ở -20°C ± 2°C phục vụ nghiên cứu.


3

1.3.2. Phạm vi nghiên cứu

- Sử dụng thịt đỏ cá ngừ thu mua ở thành phố Đà Nẵng làm cơ chất để nghiên
cứu phản ứng tự thủy phân dưới xúc tác của enzyme protease nội tại.
- Nghiên cứu sẽ được thực hiện ở quy mô PTN.

1.4. Phương pháp nghiên cứu
1.4.1. Phương pháp vật lý
Xác định nhiệt độ bảo quản, rã đông nguyên liệu thịt đỏ cá ngừ. Xác định nhiệt
độ tiến hành phản ứng tự thủy phân và nhiệt độ bất hoạt enzyme và vi sinh vật sau
phản ứng.

1.4.2. Phương pháp hóa lý
Xác định độ pH hỗn hợp nguyên liệu trước phản ứng, pH của hỗn hợp phản ứng
và pH của dịch đạm thu được sau phản ứng tự thủy phân protein.

1.4.3. Phương pháp hóa sinh
- Xác định hàm lượng protein.
- Xác định hàm lượng lipid.
- Xác định hàm lượng nước.
- Xác định hàm lượng tro.
- Xác định hàm lượng ni-tơ amin .
- Xác định thành phần và hàm lượng acid amin của dịch đạm thủy phân.

1.4.4. Phương pháp vi sinh
- Xác định mối nguy lây nhi m vi sinh vật có hại trong dịch đạm thủy phân.

1.4.5. Phương pháp xử lý số liệu
- Kết quả thí nghiệm và độ lệch chuẩn (SD) được xử lý và tính tốn bằng chương
trình Microsoft Excel 2010.

1.5.

ngh a hoa học và th c ti n của đề tài nghiên cứu

1.5.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài
- àm cơ sở khoa học cho việc định hướng khai thác và sử dụng hiệu quả nguồn
thịt đỏ cá ngừ để sản xuất các sản phẩm giá trị gia tăng như dịch đạm, bột đạm dinh
dưỡng tại địa bàn Quảng Nam - Đà Nẵng.
- Xác định điều kiện thích hợp để thu nhận được dịch thủy phân protein từ thịt đỏ


4
cá ngừ đạt yêu cầu về chất lượng.

1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
- Tận dụng nguồn nguyên liệu thịt đỏ cá ngừ từ các nhà máy, công ty chế biến
thủy sản trên địa bàn thành phố Đà Nẵng để sản xuất các sản phẩm giá trị gia tăng,
nhằm tăng doanh thu cho các doanh nghiệp chế biến cá ngừ.
- Quy trình thu hồi dịch thủy phân protein từ thịt đỏ cá ngừ d áp dụng trong thực
ti n để chuyển giao cho các công ty hoạt động trong l nh vực chế biến cá ngừ có nhu
cầu

1.6. Bố cục của luận văn
Luận văn gồm những chương mục sau:
Mở đầu
Chương 1 Tổng quan
Chương 2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Chương 3

ết quả và thảo luận

Kết luận và kiến nghị
Tài liệu tham khảo
Phụ lục


5

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về dịch thủy phân protein
Protein là chất dinh dưỡng thiết yếu cho con người ở mọi lứa tuổi, protein cần
được cung cấp cho cơ thể hàng ngày. Cá và các loại hải sản là một trong những loại
thực phẩm quan trọng của con người, là nguồn cung cấp protein nguồn gốc động vật
quý giá. Nhiều quốc gia trên thế giới đã phát triển ngành công nghiệp sản xuất protein
(dịch thủy phân và bột protein dinh dưỡng) từ thủy sản từ những năm

của thế kỉ XX

để bổ sung protein vào các sản phẩm thực phẩm nghèo protein.
Ngồi những vai trị thiết yếu trong quá trình cung cấp thực phẩm, thì dịch thủy
phân protein từ thủy hải sản còn là một nguồn cung cấp các chất chống oxi hóa có thể
sử dụng trong bảo quản thực phẩm.
Trong mấy năm gần đây, dịch thuỷ phân protein từ nhiều nguồn động vật và thực
vật đã tìm thấy sở hữu hoạt động chống oxi hố, trong đó có các nguồn từ sản phẩm
thủy sản và phế phẩm từ cá. Một số peptide chống oxi hoá bao gồm 3 đến 16 acid
amin đã được xác định từ dịch thủy phân protein này. Hơn nữa, một vài acid amin,
như tyrosine, methionine, histidine, lysine, và tryptophan, thường được xem là chất
chống oxi hoá. Ở nghiên cứu gần đây, sản phẩm thuỷ phân khác nhau được tạo ra bởi
protease khác và hoạt động chống oxi hóa của chúng được đánh giá rất cao [26].
Dịch thủy phân protein, đặc biệt từ cá đến nay đã có những cơng trình nghiên cứu
chứng minh có tác dụng đối với khả năng chống tăng huyết áp, và là nguồn hợp chất

kháng sự tăng sinh, có khả năng chống lại sự tăng sinh bất bình thường của các dòng
tế bào sinh dưỡng trong cơ thể [26; 37].
Dịch thủy phân protein thường được sản xuất từ nguyên liệu thủy hải sản bằng
cách chiết tách protein trong acid, trong kiềm (phương pháp hóa học), hoặc sử dụng
enzyme nội tại của nguyên liệu (quá trình tự thủy phân), hoặc sử dụng các chế phẩm
enzyme protease thương mại, ví dụ, Flavourzyme, Corolase, Alcalase, Protamex,
Umamizyme, Kojizyme, Orientase, có nguồn gốc khác nhau [26]. Ưu thế của k thuật
thủy phân protein bằng enzyme là điều kiện phản ứng “mềm”, ngh a là enzyme xúc tác
thủy phân protein trong điều kiện êm dịu, ít khắc nghiệt hơn so với phương pháp hóa
học, giữ được các acid amin tồn vẹn và khơng sinh các sản phẩm thứ cấp. Nhờ những


6
điều kiện thuận lợi của phản ứng thủy phân protein bằng enzyme protease, nên sản
phẩm dịch thủy phân chứa thành phần acid amin tương tự như trong nguyên liệu ban
đầu.

1.2. Giới thiệu về nguồn nguyên liệu thịt đỏ cá ngừ
Cá ngừ là một loại thủy sản có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao. Trong cá ngừ có
hai loại thịt là thịt trắng và thịt đỏ. Phần thịt đỏ có vị trí nằm sát và dọc theo xương
sống, có màu đỏ hoặc sậm.

Hình 1.1. Thịt đỏ cá ngừ (Herpandi, 2011)
Trong công nghệ chế biến cá, phần thịt đỏ thường là phế phẩm được vứt bỏ do có
mùi tanh và hương vị ít thơm ngon như phần thịt trắng, phần thịt này thường chiếm
đến 12% tổng trọng lượng của thịt cá [20].
Hiện tại, lượng thịt này thường được sử dụng để sản xuất thức ăn chăn nuôi với
giá thành khá rẻ.

1.2.1. Thành phần của thịt đỏ cá ngừ

Trong thịt đỏ cá ngừ có chứa một lượng lớn protein, acid amin tự do,
carbohydrate và một số chất khống. Bên cạnh đó, màu sắc của thịt đỏ là do các hợp
chất mang màu mà chủ yếu là myoglobin (Mb) và hemoglobin (Hb), hàm lượng của
chúng trong thịt đỏ cá ngừ cao hơn gấp 5 lần so với thịt trắng [20]. Thịt đỏ d bị biến
đổi màu sắc do sự oxi hóa nguyên tử sắt trong nhóm hem của protein khi tiếp xúc với
khơng khí để hình thành dạng metMb (Mb-Fe3+) có màu nâu [18].
Trong thịt đỏ cá ngừ có một lượng lớn protein, nước và chất béo. Hàm lượng các
chất có trong thịt đỏ cá ngừ được thể hiện ở bảng 1.1.


7
Bảng 1.1. Hàm lượng các chất và năng lượng trong 100g thịt đỏ cá ngừ [33].
Thành phần
Hàm lượng
Calorie (kcal/100g)
120
Độ ẩm (g/100g)
69.37
Protein (g/100g)
18.28
Chất béo (g/100g)
4.631
Carbohydrate (g/100g)
0.75
Trong thịt đỏ cá ngừ có một lượng lớn các acid amin thiết yếu cho cơ thể như
acid glutamic, leucine, isoleucine. Ngoài ra trong thịt đỏ có chứa một lượng nhỏ
histidine, trong điều kiện thích hợp chúng sẽ chuyển hóa thành histamine – là một chất
gây nên hiện tượng dị ứng cho cơ thể người sử dụng.
Hàm lượng một số acid amin có trong thịt đỏ cá ngừ được trình bày trong bảng
1.2 sau:

Bảng 1.2. Hàm lượng một số acid amin có trong thịt đỏ cá ngừ. [33]
Thành phần
Hàm lượng (g/100g khô)
Acid glutamic
13.35
Leucine
8.57
Isoleucine
5
Valine
4.24
Lysine
4.17
Histidine
2.38
Tryptophan
0.45
Hàm lượng một số chất khống có trong thịt đỏ cá ngừ được thể hiện trong bảng
1.3. sau:
Bảng 1.3. Hàm lượng các chất khoáng có trong thịt đỏ cá ngừ [33].
Thành phần
Tro (g/100g khơ)
Kali (mg/100g khô)
Canxi (mg/100g khô)
Natri (mg/100g khô)
Sắt (mg/100g khô)

Hàm lượng
1.224
238.4

134.4
53.74
11.05

1.3. Tổng quan về enzyme nội tại
1.3.1. Các loại enzyme nội tại thủy phân ở hải sản
1.3.1.1. Enzyme Cathepsin [13]:
Hệ enzyme protease quan trọng nhất là cathepsin (là enzyme thủy phân nằm
trong lysosome), trong cá chúng hoạt động rất thấp, chủ yếu có trong thịt và nội tạng
cá, nhưng ngược lại hoạt động mạnh ở các lồi tơm, cua và nhuy n thể. Chúng được


8
giải phóng vào trong cơ thể của động vật sau khi chết.
Lysosome chứa ít nhất 13 loại cathepsin bao gồm cathepsin A, B, C, D, H và L.
Trong số này enzyme cathepsin quan trọng nhất là cathepsin D tham gia vào quá trình
thủy phân protein nội tại của tế bào tạo thành peptide.
Hoạt tính của cathepsin trong cơ sau khi chết tăng đáng kể, vì những enzyme này
thường hoạt động mạnh ở pH acid. Khi cá chết quá trình phân hủy glycogen tạo ra acid
latic trong điều kiện yếm khí xảy ra bằng con đường phosphoryl với sự tham gia của
ATP làm cho pH của cơ thịt giảm, hạn chế được phần nào sự phát triển của vi sinh vật.
Khi pH hạ thấp còn tạo điều kiện cho enzyme capthepsin hoạt động thúc đẩy quá trình
tự phân của cơ thịt. Các enzyme cathepsin có thể hoạt động đồng bộ hoặc đơn lẻ để
thủy phân cá sau khi chết.
Cathepsin D là một protease lysosomal aspartic của họ pepsin. Trọng lượng phân
tử cơ bản (ước tính trong cơ xương của cá trích (Clupea harengus) là 38-39 kDa) thay
đổi trong các loài và các mô. Một số báo cáo chỉ ra rằng cá chép (Cyprinus carpio) là
41 kDa và ở cá hồi (Oncorhynchus keta) là 50 kDa [13]. Không giống như họ
lysosome Protease cysteine, cathepsin D thể hiện một giới hạn hoạt động mạnh và có
thể bị ức chế bởi pepstatin. Vùng xúc tác của nó bao gồm Asp33 và Asp231 và có tới 4048% tương đồng với các protease aspartic khác như pepsin, renin, và chymosin [13].

Các acid amin kỵ nước là vùng hoạt động ưa thích của cathepsin D. Sau khi giết mổ
pH và nhiệt độ đóng một vai trị quan trọng trong hoạt động thủy phân của Cathepsin
D. Enzyme thường hoạt động trong khoảng pH acid (3.0-5.0). Những điều kiện cuối
cùng sau khi giết mổ có trong cơ khi bị lão hóa bình thường của thịt từ các mơ động
vật có vú có thể khơng tương tự như các mơ trong cá với hoạt tính cathepsin D chủ yếu
với các thành phần là thịt cơ. Trong cơ bắp động vật sau giết mổ, cathepsin D hoạt
động thủy phân mạnh cá tổ chức mô cở ở pH acid (5,0) và ở nhiệt độ tối ưu là 45°C.
Enzyme cathepsin giảm dần hoạt động khi nhiệt độ hạ thấp hơn và gần như bất hoạt ở
nhiệt độ dưới 5°C [23]. Cathepsin D đã được phát hiện sau khi giết mổ trong tổ chức
cơ của cá chép, cá hồi cầu vồng, cá chình, và cá cơm [23]. Một số nghiên cứu chỉ ra
rằng việc các cơ thể cá sau khi chết đạt được pH khoảng xấp xỉ từ 6,3-6,6 và có thể
khơng đạt được độ pH thấp cho Cathepsin D hoạt động. Do đó, cathepsin D ít có khả
năng tham gia vào các tự phân hủy các tổ chức cơ cá. Các kết quả được báo cáo bởi


9
Godiksen và cộng sự (2 9) đã chứng minh rằng khả năng Cathepsin D gây ra sự thay
đổi cấu trúc của cơ bắp ở pH thấp sau khi chết, có thể là do sự hiện diện của các
cathepsin khác quan trọng và đó là tiền đề cho sự kích hoạt của cathepsin D [23].

Hình 1.2. Mơ hình cấu tạo của enzyme cathepsin
Sau đó peptide tiếp tục bị phân hủy dưới tác dụng của cathepsin A, B và C.
Enzyme cathepsin có vai trị chính trong q trình tự chín của cá ở pH thấp và
nồng độ muối thấp. Đều này giải thích lí do tại sao khi cá chết thịt cá co cứng sau đó
mềm nhũn, ngun chính là do khi cá chết do oxi khơng cịn cung cấp cho cơ thể làm
cho các cơ thịt hơ hấp yếm khí sinh ra acid lactic từ đó pH giảm, tạo điều kiện cho
cathepsin hoạt động phân giải protein cơ thể làm cho thịt cá trở nên mềm lại, nhưng
enzyme cathepsin bị ức chế hoạt động ở nồng độ muối 5%.

1.3.1.2. Enzyme Calpain[13]

Hệ enzyme protease calpain bao gồm µ-calpain, m-calpain và chất ức chế nội
sinh calpastatin. Cảm hai loại calpain đều tương tự nhau về tính chất hóa sinh, ngoại
trừ nhu cầu canxi của mỗi loại là khác nhau. Việc kích hoạt µ-calpain trong ống
nghiệm chỉ cần một lượng nồng độ canxi nhỏ tính bằng micro-mol (µM), ngược lại
việc kích hoạt m-calpain lại đòi hỏi một nồng độ canxi cao được đo bằng millimol
(mM) [39].
Hai dạng của calpains là dị phân tử gồm một tiểu đơn vị nhỏ (28kDa) và một tiểu
đơn vị lớn (80 kDa). Tiểu đơn vị nhỏ của cả hai dạng calpains bao gồm hai miền (V và
VI) kéo dài từ đầu N và đâu cuối C. Trên miền V của tiểu đơn vị nhỏ giàu glycine và
cũng được xác định là vị trí liên kết của phospholipid . Trên miền VI của tiểu đơn vị
28 kDa chứa năm địa điểm liên kết Ca2+. Tiểu đơn vị lớn của cả dạng calpain có bốn
vùng chính (Domain I-IV). Vùng II được xác định là nơi protease xúc tác được tạo


10
thành từ các tên vùng phụ (IIa và IIb) có chứa cysteine và histidine. Vùng III liên kết
với Ca2+ và phospholipid. Vùng IV giống như vùng VI chứa 5 vị trí liên kết canxi. Bốn
vị trí liên kết đầu tiên trong miền IV của tiểu đơn vị 8 kDa cũng chứa các vị trí liên
kết Ca2+. Tuy nhiên, phân tử vị trí thứ năm ở cuối carboxyl ở các vùng IV và VI
không thể liên kết Ca2+ nhưng liên kết được với nhau và hình thành một dị phân tử
gồm hai tiểu đơn vị của calpain [39].

Hình 1.3. Mơ hình cấu tạo của enzyme calpain
Vai trò của calpain trong quá trình tự thủy phân của thịt cơ giống như các loại
protease khác, calpain có khả năng phân cắt các protein cả trong ống nghiệm lẫn trong
cơ thể sống. Calpain ưu tiên quá trình tự phân đối với các acid amin kỵ nước đặc biệt
như leucine, isoleucine, valine. Sự hoạt động của calpains trong q trình thủy phân
proteins có giới hạn trong quá trình trao đổi protein ở điều kiện sinh lý và trong cơ thể
sau khi chết. Trong cơ thể , calpains giải phóng ra sẽ phân giải các sợi cơ từ các tổ
chức mô cơ. Như vậy, calpains hoạt động trong cơ sau chết dẫn đến sự suy yếu và làm

mất ổn định cấu trúc tổ chức cơ bằng cách tạo ra một số thay đổi cấu trúc. Chính điều
đó làm giảm độ phức tạp các chuỗi polypeptides tạo điều kiện để các protease khác
tiếp tục thủy phân [39].


11

1.3.1.3. Enzyme Collagenase
Collagen là loại protein cấu trúc trong cơ thể động vật. Nó được phân bố trong
các bộ phận như da, cơ, gân, sụn, dây chằng xương và răng…
Enzyme collagenase giúp làm mềm tế bào mô liên kết, và nó thể hiện chức năng
nhiều khi sinh vật chết đi cịn bình thường chủ yếu là tham gia phân giải các collagen,
tế bào, lão hóa cho cơ thể.
Collagenase là enzyme có khả năng thủy phân liên kết peptit dạng poly- như
prolin đặc trưng trong vùng xoắn của collagen ở trạng thái tự nhiên của cơ chất khơng
biến tính. Trong khi đó, các protein khác có thủy phân hạn chế collagen tự nhiên
nhưng chỉ tại phần cuối của chuỗi xoắn có ở ngồi vùng xoắn đặc trưng của collagen,
khơng có khả năng tấn công các liên kết trong vùng xoắn của collagen [16].
Đặc điểm cấu tạo của collagenase và một số tính chất cơ bản, các collagenase là
các protein có khối lượng phân tử lớn và có cấu trúc phân tử không giống nhau. Những
năm về sau, phương pháp xác định kích thước phân tử của enzyme chủ yếu là phương
pháp điện di trên gel polyarcylamide khi có mặt SDS hoặc phương pháp lọc gel được
tiến hành với enzyme ở trạng thái tinh khiết. Phân tử collagenase có thể được tạo nên
bởi các dưới – đơn vị. Collagenase A với

PT 1

kDa được phát hiện bao gồm 4

dưới – đơn vị không có hoạt tính enzyme với trọng lượng mỗi phần là 25 kDa, Vibrio

B- 30 bao gồm 2 dưới – đơn vị có KLPT khơng giống nhau 24 kDa và 28 kDa [16].
Đa số các enzyme đã được cơng bố có pH hoạt động trong khoảng trung tính
hoặc hơi kiềm (pH 7-8). Tuy thế, khả năng hoạt động của chúng cũng khơng vượt q
mức pH trung tính. Collagenase từ B.alvei DC – 1 được phát hiện là hoạt động trong
vùng pH acid yếu cho tới trung tính (4,5 -7). Đây là enzyme đầu tiên trong số các
collagenase đã biết có khả năng hoạt đông trong vùng acid yếu. Nhiệt độ hoạt động
thích hợp cùa các collagenase thường là dưới 40 – 42,40C. Các enzyme này hầu như bị
giảm hoạt tính khi tăng nhiệt độ lên trên 450C. Đặc biệt trong trường hợp của
collagenase từ Vibrio B -30, enzyme này bị mất tới 94% hoạt tính khi tăng nhiệt độ tới
450C [16].
Tính đặc hiệu của enzyme, hầu hết các collagenase có tính đặc hiệu cao đối với
collagen. Đa phần các enzyme bắt buộc khơng kèm hoạt tính với các casein hoặc
hemoglobin, trừ trường hợp enzyme từ Pseudomonas sp, hai hoạt tính collagenase và


12
caseinase ln đi kèm.

Hình 1.4. Mơ hình cấu tạo của enzyme collagenase
Collagenase từ vi khuẩn có khả năng phân cắt tích cực hơn so với các enzyme
của mơ. Clostridiopeptidase A có thể tác dụng tại 2

điểm trên một chuỗi xoắn α

trong khi colagenase của nịng nọc cóc chỉ có khả năng phân cắt chuỗi xoắn tại một
điểm duy nhất.
Các enzyme này gây ra các “vết nứt” hoặc bẻ gãy các myotome khi bảo quản cá
bằng đá trong một thời gian dài hoặc khi bảo quản chỉ trong thời gian ngắn nhưng ở
nhiệt độ cao.

1.3.2. Các phương pháp thủy phân protein thủy sản
Sự thủy phân protein là sự phân cắt đại phân tử protein thành những chuỗi
peptide có kích thước khác nhau và những đơn phân. Sự thủy phân có thể thực hiện
bằng phương pháp hóa học (sử dụng acid hoặc base) và phương pháp sinh học (sử
dụng enzyme)

1.3.2.1. Phương pháp hóa học
Sử dụng acid hoặc base để thủy phân các liên kết peptide của protein. Mặc dù
phương pháp này tạo ra sản phẩm có thành phần hóa học và tính chất có thể bị thay đổi
nhưng vẫn được ưa chuộng trong ngành cơng nghiệp vì đơn giản và ít tốn kém. Tuy
nhiên việc chất lượng dinh dưỡng và chức năng kém trong sản xuất bằng phương pháp
hóa học làm cho sản phẩm ít được sử dụng trong các thành phần của thực phẩm và hạn
chế do phải sử dụng chất tăng cường hương liệu [26].


13
Trong quá trình thủy phân cá, người ta thường sử dụng acid hơn base. Pasupuleti
và Braun (2008) đã báo cáo rằng việc sử dụng acid trong quá trình thủy phân thường
phá vỡ các protein thành các acid amin riêng lẻ và các chuỗi ngắn peptide, nhưng một
số các acid amin cần thiết như cystine, cysteine, methionine và trypstophan cũng bị
phá hủy [37]. Ovissipour và cộng sự (2

9) đã sử dụng HCl và H2SO4 để thủy phân

protein của cá quá trình được tiến hành ở nhiệt độ và áp suất cao, sau đó trung hịa
acid về pH 6,0 đến 7,0 và sản phẩm tạo thành là bột nhão hoặc sau đó tiếp tục sấy khô
[42]. Theo Kristinsson và Rasco (2000), thủy phân hoàn toan protein của các cần dùng
HCl 6M ở 118oC trong 18 giờ [29]. Tuy nhiên, sau đó phải trung hòa sản phẩm nên tạo
ra một lượng muối lớn không mong muốn trong sản phẩm, làm cho sản phẩm khơng
phù hợp với mục đích làm thực phẩm [26].

Sự thủy phân protein bằng base là một quá trình chuyển tiếp và đơn giản. Trong
quá trình này, calci, natri, kali được bổ sung hòa tan vào protein đang được gia nhiệt,
phản ứng được tiến hành ở nhiệt mong muốn (8 đến 130oF) trong một vài giờ đến khi
đạt được mức độ thủy phân mong muốn, sau đó sản phẩm được làm bay hơi, tiệt trùng
và sấy khô. Một số acid amin như serine và threonine bị phá hủy trong quá trình này
nhưng tryptophan vẫn còn [37]. Kết quả từ các quá trình thủy phân bằng phương pháp
hóa học ảnh hưởng đến giá trị dinh dưỡng của protein, và trong quá trình thủy phân có
thể hình thành nên những chất khơng mong muốn trong thực phẩm [28].

1.3.2.2. Phương pháp sinh học:
Sử dụng enzyme để thủy phân protein là một hướng phát triển bền vững cho
tương lai bởi kết quả tạo ra những sản phẩm có chức năng và giá trị dinh dưỡng cao.
Việc sử dụng enzyme mang lại những lợi ích đáng kể so với sử dụng phương pháp hóa
học khi cần một lượng enzyme nhỏ nhưng xử lý được nguồn nguyên liệu lớn và có thể
d dàng vơ hiệu hóa hoạt động của enzyme làm ngưng quá trình thủy phân bằng các
tác nhân đơn giản như pH và nhiệt độ [37]. Sự có sẵn của các loại enzyme khác nhau
đưa đến những sự lựa chọn tốt cho sản phẩm mong muốn cuối cùng. Hơn nữa, việc
thủy phân bằng enzyme không phá hủy các acid amin và không tạo ra các sản phẩm
không mong muốn. Từ quan điểm kỹ thuật và kinh tế, enzyme từ vi khuẩn như
alcalase hoạt dộng ở pH kiềm đã được báo cáo là có hiệu quả nhất trong sự thủy phân
protein ở cá. Các chế phẩm enzyme khác cho thấy tiềm năng thủy phân protein của cá