Nghiên cứu quy trình chuyeenrrrr gen vào cây hoa loa kèn “lilium longiflorum” bằng vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

B

GIÁO D C VÀ ðÀO T O

TRƯ NG ð I H C NÔNG NGHI P HÀ N I
----------

----------

LƯƠNG H NG H NH

NGHIÊN C U XÂY D NG QUY TRÌNH CHUY N GEN
VÀO CÂY HOA LOA KÈN “Lilium longiflorum”
B NG VI KHU N Agrobacterium tumefaciens

LU N VĂN TH C SĨ NÔNG NGHI P

Chuyên ngành: TR NG TR T
Mã s : 60.62.01

Ngư i hư ng d n khoa h c: PGS.TS. NGUY N TH LÝ ANH

HÀ N I - 2009


L I CAM ðOAN

Tơi xin cam đoan r ng s li u và k t qu nghiên c u trong lu n văn này
là hoàn toàn trung th c và chưa ñư c s d ng ñ b o v m t h c v nào. M i
s giúp ñ cho vi c hồn thành lu n văn này đ u đã đư c c m ơn. Các thơng
tin, tài li u trong lu n văn này ñã ñư c ghi rõ ngu n g c.

Tác gi

Lương H ng H nh

Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………i


L I C M ƠN
Sau m t quá trình th c hi n ñ tài t t nghi p t i Vi n Sinh h c Nông
nghi p, Trư ng ð i h c Nông Nghi p Hà N i, ñư c s giúp ñ t n tình c a
các th y cô giáo, các cán b c a Vi n cùng v i s n l c và c g ng c a b n
thân, đ n nay tơi ñã hoàn thành xong ñ tài t t nghi p c a mình.
- Trư c tiên tơi xin g i l i c m ơn chân thành và sâu s c t i PGS.TS
Nguy n Th Lý Anh - Vi n trư ng Vi n Sinh h c Nông nghi p, Trư ng ð i
h c Nông Nghi p Hà N i, ngư i ñã tr c ti p hư ng d n và giúp đ tơi r t
nhi u trong su t th i gian tôi th c hi n ñ tài t t nghi p, cũng như th i gian
tơi hồn thành b n lu n văn này.
- Tôi xin chân thành c m ơn các th y cô giáo trong b môn CNSH Th c v t SHPT và CN Vi sinh đã đóng góp nhi u ý ki n giúp tơi th c hi n đ tài.
- Tôi xin chân thành c m ơn Ks. Nguy n Th Thanh Phương, Ks. H Th
Thu Thanh và toàn th các cán b c a Vi n Sinh h c Nông nghi p – Trư ng ð i
h c Nơng nghi p Hà N i đã ln giúp đ tơi khi tơi th c hi n đ tài t i Vi n.
Nhân đây tơi xin trân tr ng c m ơn ban ch nhi m khoa Nông h c, Vi n
ðào t o Sau ñ i h c cùng t t c các th y cơ giáo, gia đình và b n bè đã giúp
tơi hồn thành đ tài này.
Hà N i, tháng 09 năm 2009
Tác gi

Lương H ng H nh

Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………ii


M CL C
L i cam ñoan

i

L i c m ơn

ii

M cl c

iii

Danh m c các ch vi t t t và ký hi u

v

Danh m c b ng

vi

Danh m c hình

vii

1.

M ð U

1

1.1

ð tv nđ

1

1.2

M c đích và u c u

2

1.3

Ý nghĩa khoa h c và ý nghĩa th c ti n

2

2.

T NG QUAN TÀI LI U

3

2.1

Gi i thi u chung v hoa loa kèn

3

2.2

Chuy n gen

6

2.3

Cơ s khoa h c c a phương pháp chuy n gen vào th c v t nh vi

th c v t

khu n A. tumefaciens

10

2.4

Phương pháp PCR

18

2.5

M t s thành t u và xu hư ng phát tri n c a cây tr ng bi n ñ i gen

19

3.

N I DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U

31

3.1

ð i tư ng, v t li u, ñ a ñi m và th i gian nghiên c u

31

3.2

N i dung và phương pháp nghiên c u

32

4.

K T QU VÀ TH O LU N

41

4.1

Thí nghi m 1: Nghiên c u nh hư ng c a ngu n m u c y ñ n
kh năng chuy n gen c a vi khu n Agrobacterium tumefasciens.

4.2

41

Thí nghi m 2: Nghiên c u nh hư ng c a th i gian ti n ni c y
đ n kh năng chuy n gen c a vi khu n A.tumefaciens

Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………iii

45


4.3

Thí nghi m 3: Nghiên c u nh hư ng c a phương pháp lây
nhi m m u ñ n kh

năng chuy n gen c a vi khu n
50

Agrobacterium tumefasciens.
4.4

Thí nghi m 4: Nghiên c u nh hư ng c a th i gian đ ng ni
c y đ n kh

năng chuy n gen c a vi khu n Agrobacterium
55

tumefasciens
4.5

Thí nghi m 5: ðánh giá tác ñ ng t h p c a các công th c t i ưu
t i kh

năng chuy n gen c a vi khu n Agrobacterium

tumefasciens.

60

4.6

Ki m tra s có m t c a gen chuy n vào b ng phương pháp PCR

62

4.7

So sánh và th o lu n k t qu ñ tài v i các k t qu nghiên c u
chuy n gen

cây hoa loa kèn đã đư c cơng b

Vi t Nam

63

5.

K T LU N VÀ ð NGH

66

5.1

K t lu n

67

5.2

ð ngh

67

TÀI LI U THAM KH O

69

PH L C

74

Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………iv


DANH M C CÁC CH

VI T T T VÀ KÝ HI U

CT

Công th c

2,4 D

2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

BA

6-Benzyllamino purine

AS

Acetosyringone

TNC

Ti n nuôi c y

ðNC

ð ng nuôi c y

MS

Murashige & Skoog, 1962

PPT

DL - Phosphinotricine

Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………v


DANH M C B NG
STT
4.1.

Tên b ng

Trang

ðánh giá nh hư ng c a ngu n m u ñ n kh năng chuy n gen c a
vi khu n A.tumefaciens qua bi u hi n c a gen Gus (sau 3 tu n).

4.2.

ðánh giá nh hư ng c a ngu n m u c y ñ n kh năng chuy n gen
c a vi khu n A.tumefaciens qua bi u hi n c a gen Bar (sau 8 tu n )

4.3.

41
44

ðánh giá nh hư ng c a th i gian ti n ni c y đ n kh năng
chuy n gen c a vi khu n A.tumefaciens qua bi u hi n gen Gus

(sau 3 tu n)

4.4.

nh hư ng c a th i gian ti n ni c y đ n kh năng chuy n gen
c a vi khu n A.tumefaciens qua bi u hi n c a gen Bar (sau 8 tu n)

4.5.

46
48

ðánh giá nh hư ng c a phương pháp lây nhi m m u ñ n kh năng
chuy n gen c a vi khu n A.tumefaciens qua bi u hi n c a gen Gus (sau 3
tu n).

4.6.

51

ðánh giá nh hư ng c a phương pháp lây nhi m m u t i kh năng
chuy n gen c a vi khu n A.tumefaciens qua bi u hi n c a gen Bar (sau 8
tu n)

4.7.

ðánh giá nh hư ng c a th i gian ðNC ñ n kh năng chuy n gen
c a vi khu n A.tumefaciens qua bi u hi n gen Gus (sau 3 tu n).

4.8.

54
56

ðánh giá nh hư ng c a th i gian ðNC ñ n kh năng chuy n gen
c a vi khu n A.tumefaciens qua bi u hi n c a gen Bar (sau 8
tu n).

4.9.

58

ðánh giá tác ñ ng c a t h p các công th c t i ưu t i kh năng chuy n
gen c a vi khu n A.tumefaciens qua s bi u hi n c a gen Gus (sau 3 tu n) 60

Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………vi


DANH M C HÌNH
STT

Tên hình

Trang

2.2.

Chuy n gen cây tr ng

7

2.3.

M t s kh i u do vi khu n Agrobacterium tumefaciens t o ra trên
thân cây hoa h ng (A) và trên thân cây nho (B).

9

2.4.

C u trúc Ti- Plasmid

12

2.5.

Mô hình chuy n gen nh Agrobacterium

13

3.1.

Callus loa kèn in vitro

31

3.2.

Lilium longiflorum thunb

31

3.3.

Sơ ñ c u trúc plasmid ITB2c

31

4.1.

nh hư ng c a ngu n m u ñ n kh năng chuy n gen c a vi
khu n A.tumefaciens.

4.2.

42

nh hư ng c a ngu n m u ñ n kh năng chuy n gen c a vi
khu n A.tumefaciens

4.3: S bi u hi n c a gen Gus
4.4.

45
CT4

47

nh hư ng c a th i gian ti n ni c y đ n kh năng chuy n gen
c a vi khu n A.tumefaciens

49

4.5.

ðC trong MT ch n l c có 2.5mg/l PPT

50

4.6.

M u s ng trong MT ch n l c có 2.5mg/l PPT

50

4.7.

nh hư ng c a phương pháp lây nhi m m u ñ n kh năng
chuy n gen c a vi khu n A.tumefaciens

4.8.

nh hư ng c a PP lây nhi m m u t i kh năng chuy n gen c a
vi khu n A.tumefaciens

4.9.

54

nh hư ng c a th i gian đ ng ni c y đ n kh năng chuy n gen

c a vi khu n Agrobacterium tumefasciens

4.10.

53

58

nh hư ng c a th i gian ñ ng ni c y đ n kh năng chuy n gen
c a vi khu n A.tumefaciens

Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………vii

59


4.11.

ðánh giá tác ñ ng c a t h p các công th c t i ưu t i kh năng
chuy n gen c a vi khu n A.tumefaciens qua s bi u hi n c a
gen Bar (sau 8 tu n)

4.10.

61

ðánh giá tác ñ ng c a t h p các công th c t i ưu t i kh năng
chuy n gen c a vi khu n A.tumefaciens qua s bi u hi n c a gen
Bar (sau 8 tu n)

62

4.12.

K t qu ñi n di s n ph m PCR c a các dòng loa kèn chuy n gen

63

4.13.

Sơ đ

th

hi n quy trình chuy n gen cho hoa loa kèn

L.longiflorum nh vi khu n A.tumefacens

Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………viii

66


1. M

1.1

ð U

ð tv nđ

Nói đ n v đ p c a thiên nhiên khơng th khơng nói đ n các loài hoa.

M i loài hoa n ch a m t v ñ p, m t s c quy n rũ và giá tr kinh t riêng.
V i màu tr ng pha thêm chút xanh, mùi hương thơm d u, hoa loa kèn tr ng
(Lilium longiflorum) ñã r t ñư c ưa chu ng và có giá tr kinh t cao trên th
trư ng hoa th gi i và Vi t Nam.
Tuy nhiên, cây hoa loa kèn tr ng có th i gian sinh trư ng khá dài nên
ngư i tr ng ph i chi phí cao cho phịng tr c d i và sâu b nh, ñ c bi t là vào
mùa Xuân m ư t, gây ra nh ng khó khăn cho ngư i s n xu t hoa loa kèn
mi n B c nư c ta. Vi c ch n t o ra các gi ng cây hoa b ng t t c nh ng
phương pháp ch n t o gi ng hi u qu luôn là mong mu n c a các nhà ch n
t o gi ng v i m c tiêu không ng ng nâng cao giá tr thu nh p trên m t đơn v
di n tích canh tác cho ngư i nơng dân. Do đó, vi c t o ra các gi ng cây hoa
loa kèn m i ch ng ch u ñi u ki n b t l i c a th i ti t, ch ng ch u sâu b nh,
kháng thu c tr c ... là nhu c u c a th c ti n s n xu t và mong mu n c a các
nhà ch n t o gi ng.
Ngày nay v i s phát tri n c a cơng ngh gen đã cho phép các nhà ch n
t o gi ng ñưa ñư c nh ng tính tr ng mong mu n vào cây tr ng ch trong th i
gian ng n (ch sau m t th h ), t o ñư c nhi u gi ng m i có nhi u đ c tính
m i. V i phương pháp này, ngư i ta có th ñưa ñư c nh ng gen quy ñ nh
nh ng tính tr ng m i, k c nh ng tính tr ng c a nh ng lồi có quan h r t
xa, cũng có th t vi sinh v t, ñ ng v t… ñi u mà các phương pháp truy n
th ng khơng th th c hi n đư c. Trong các k thu t chuy n gen, thì phương
pháp chuy n gen thông qua Agrobacterium tumefaciens t ra có nhi u ưu
đi m hơn các phương pháp khác và ñư c s d ng ph bi n nh t. Chính vì v y
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………1


chúng tơi th c hi n đ tài:“Nghiên c u xây d ng quy trình chuy n gen vào cây
hoa loa kèn (Lilium longiflorum) b ng vi khu n Agrobacterium

tumefaciens”.
1.2

M c đích và u c u

1.2.1 M c đích
Xác đ nh đư c các thơng s kĩ thu t cho các bư c trong quy trình
chuy n gen m c tiêu nh vi khu n Agrobacterium tumefaciens, làm cơ s cho
vi c t o cây chuy n gen mang các ñ c tính mong mu n.
1.2.2 Yêu c u
1. Xác ñ nh ñư c v t li u lây nhi m phù h p.
2. Xác ñ nh ñư c phương pháp lây nhi m vi khu n phù h p.
3. Xác ñ nh ñư c th i gian ti n ni c y phù h p.
4. Xác đ nh đư c th i gian đ ng ni c y phù h p.
5. Xác đ nh đư c s

có m t c a gen chuy n n p trong m u ñã

chuy n gen.
1.3

Ý nghĩa khoa h c và ý nghĩa th c ti n

1.3.1 Ý nghĩa khoa h c
K t qu nghiên c u c a ñ tài cho th y kh năng có th chuy n đư c
gen vào cây hoa loa kèn, m t lo i cây thu c nhóm m t lá m m b ng vi khu n
Agrobacterium tumefaciens. ð ng th i, các thông s kĩ thu t ñã xác ñ nh
ñư c s làm cơ s cho vi c ti p t c chuy n các gen mong mu n khác vào cây
hoa loa kèn nói riêng và các cây hoa lily nói chung.
1.3.2 Ý nghĩa th c ti n

K t qu nghiên c u c a ñ tài làm ti n ñ và thúc ñ y vi c ng d ng
m t phương pháp m i là t o gi ng cây tr ng chuy n gen mang đ c tính mong
mu n trong công tác ch n t o gi ng cây tr ng nói chung và cây hoa loa kèn
nói riêng

Vi t Nam.

Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………2


2. T NG QUAN TÀI LI U
2.1

Gi i thi u chung v hoa loa kèn

2.1.1 Ngu n g c, phân lo i
a) Ngu n g c
Lily là tên g i chung c a t t c các loài Lilium, h Liliaceae đư c tìm
th y

các nư c thu c khu v c ðông Á như: Nh t B n, Trung Qu c, các vùng

d c theo dãy núi Himalaya... Ngày nay, lily ñư c tr ng ph bi n kh p nơi trên
th gi i, ch ng h n: M , Hà Lan, Nh t B n, Ý, Thái Lan, Trung Qu c, Vi t
Nam... Trong đó Trung Qu c ñư c xem là nư c tr ng cây hoa lily đ u tiên.
Trong s n xu t có th phân chia Lilium thành ba nhóm chính sau: Asiatic lily,
Oriental lily, Longiflorum lily.
Hi n nay

Vi t Nam trong s n xu t ch y u tr ng hoa loa kèn Lilium

longiflorum Thunb (hay còn g i là Hu Tây) [21], là gi ng ñư c nh p n i vào
Vi t Nam t r t lâu do ngư i Pháp du nh p vào, g n đây có m t s gi ng
nh p n i ñang ñư c tr ng th nghi m

Sapa, ðà L t, H i Phòng và m t s

nơi khác.
b) Phân lo i khoa h c
Gi i: Th c v t
Ngành: Th c v t có hoa
Nhóm: M t lá m m (Monocotyledones)
L p: Hành (Lilidae)
B : Hành (Liliales)
H : Hu tây (Liliaceae)

Hình 2.1. Lilium longiflorum Thunb

Chi: Lilium
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………3


Loài: L. Longiflorum
Danh pháp khoa h c Lilium longiflorum Thunb.
(Dương ð c Ti n, Võ Văn Chi, 1978)
2.1.2 ð c ñi m sinh v t h c
Cây hoa loa kèn tr ng sinh trư ng phát tri n t t trên đ t giàu ch t h u cơ,
trung tính (pH 6,5-7,0), thốt nư c t t, nhi t đ thích h p cho s ra r là 1617oC, cho s ra hoa và sinh trư ng c a n hoa là 21-23oC, là cây ưa sáng. Hoa
loa kèn tr ng là cây thân th o lâu năm, thân cao t 50-200cm, thân d ng hành
có v y, ph n dư i m t ñ t g m thân v y, r và ph n trên m t ñ t g m lá, thân.

Tr ng tháng 10-11. Ra hoa tháng 4 năm sau. Tr ng b ng c , m i c thư ng
ch m c m t cây [8]:
* Thân v y là ph n phình to c a các v y c t o thành, trên ñĩa thân v y
có vài ch c v y h p l i, phía ngồi khơng có màng bao b c nên g i là thân
v y tr n. Màu s c, kích thư c c a thân v y tùy thu c vào loài, gi ng khác
nhau. ðây là ph n thương ph m có th dùng đ nhân gi ng.
* R hoa loa kèn tr ng g m hai ph n r thân và r g c. R thân do ph n
thân m c dư i m t ñ t sinh ra, có nhi m v nâng đ thân, hút nư c và dinh
dư ng, r g c sinh trư ng kh e, là cơ quan ch y u hút nư c và dinh dư ng
c a loa kèn.
* Lá hoa loa kèn tr ng m c chéo nhau, hình dài, hình tr ng… khơng có
cu ng ho c cu ng r t ng n, m c xung quanh thân. M t s ít gi ng

nách có

lá m m, có th dùng ñ nhân gi ng.
* Hoa loa kèn tr ng m c ñơn l ho c c m g m nhi u hoa thư ng có 16 hoa. Hoa to m c riêng r thành chùm ho c thành c m trên ñ nh ng n thân,
hoa thư ng có 6 cánh và 6 nh , n u mu n hoa tươi lâu thì khi c m hoa ta nên
c t 6 bao ph n c a hoa s ñ ñư c hoa tươi lâu hơn và ngăn ch n s già hố.
Trư ng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………4


M i c ch có m t cành hoa, m m thân c a nó b r ng đi, ho c sau khi ng t
ng n không th m c ra thân m i, cũng khơng th hình thành cành hoa khác.
Hoa có hình d ng như hình loa kèn…( Flower favourite), màu tr ng, hương
thơm d ch u [8].
2.1.3 Giá tr s d ng và giá tr kinh t
Hoa loa kèn to, có đ b n cao, hoa có màu tr ng tinh khi t tư ng
trưng cho m t v ñ p quý phái. Hoa ñư c s d ng trong nh ng ngày h i
l n, ngày l t t, trang trí trong h i trư ng, cơng viên, trong văn phịng.

Khơng nh ng th , hoa cịn đư c c m trong phịng khách c a m i gia đình
t o nên m t c m giác tho mái và m cúng. Ngoài ra hoa loa kèn cịn đư c
s d ng làm q t ng nhân các d p l . V i Hà N i, hoa loa kèn ñư c coi là
m t th hoa sang tr ng, quy n quý, trong sáng, nh nhàng, ñ c trưng c a
Hà N i khi tháng tư v [37].
Châu Âu, Lilium longiflorum ñư c g i là Easter lily _ hoa Ph c Sinh
vì hoa n vào mùa Ph c Sinh [37]. Hoa loa kèn tư ng trưng cho ni m hân
hoan vui m ng trư c v ñ p và ni m hy v ng vào cu c s ng, cũng như ñ t
ñư c s ưa chu ng và phát tri n m nh

kh p nơi trên th gi i.

Bên c nh giá tr v tinh th n, hoa loa kèn cịn có giá tr kinh t đáng k .
Năm 2002, di n tích tr ng hoa loa kèn ti p t c tăng lên v i t ng di n tích là
4523ha, đ ng th hai trong t ng di n tích hoa c t tr ng b ng c , ch x p sau di n
tích tr ng hoa tulip. Bên c nh Hà Lan còn m t s nơi tr ng nhi u hoa loa kèn
như: Nh t, M , Nam Hemisphere, e.g. Australia, Chile và Nam Phi. T i M ,
60% ngu n c ñư c nh p kh u t Hà Lan v i hơn 1 t c hoa, 8% nh p kh u t
nư c Anh, 6% nh p kh u t các nư c khác, 25% hàng n i ñ a (do M t s n
xu t) [8]. Năm 2003, Hàn Qu c xu t kh u hoa loa kèn c t cành sang th trư ng
Nh t B n thu v hơn 10 tri u USD, và nh p kh u 4 tri u USD c loa kèn gi ng
t Hà Lan [8].
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………5


Vi t Nam, cây hoa loa kèn ñang tr thành m t trong nh ng xu hư ng
chuy n d ch cơ c u cây tr ng c a r t nhi u h nơng dân. Hoa chính v thu
ho ch giá t 700 - 1000 ñ ng/cành, vào nh ng ngày l t t giá hoa có th lên
t i 15000 – 20000đ/cành. Theo tính tốn c a m t h nông dân

Mê Linh

Vĩnh Phúc tr ng 1 sào hoa loa kèn trái v , n ñúng d p T t, thu ñư c g n 20
tri u ñ ng, lãi kho ng 10 tri u ñ ng [34].
Tuy nhiên, tr ng hoa loa kèn g p khơng ít khó khăn v gi ng, sâu b nh
và đi u ki n t nhiên không thu n l i. Ch ng lo i, ch t lư ng, kích thư c hoa
khơng đ ng đ u, ít phong phú nên giá tr xu t kh u hoa cịn nh . Vì v y, vi c
liên t c ch n t o ra các gi ng cây hoa loa kèn m i nâng cao hi u qu kinh t
là m t trong nh ng nhi m v c n thi t ñ i v i các nhà ch n t o gi ng Vi t
Nam trong xu th h i nh p.
2.2

Chuy n gen

th c v t

2.2.1 Khái ni m chuy n gen
Chuy n gen là k thu t ñưa m t hay nhi u gen l ñã ñư c thi t k
d ng DNA tái t h p vào t bào ch c a cây tr ng nói riêng và c a các sinh
v t nói chung (vi sinh v t, ñ ng v t,...) làm cho gen l có th t n t i

d ng

plasmid tái t h p ho c g n vào b gen t bào ch . Trong t bào ch , các gen
này ho t ñ ng t ng h p nên các protein ñ c trưng d n t i vi c xu t hi n các
đ c tính m i c a cơ th chuy n gen [18].
Chuy n gen

th c v t ñã phát tri n cùng v i s phát tri n c a các k

thu t nuôi c y mô và t bào th c v t. Nó cho phép nghiên c u c u trúc và
ñi u khi n ho t ñ ng c a gen, m ra tri n v ng chuy n các gen có ý nghĩa
kinh t vào cây tr ng.
Các bư c chính đ t o m t th c v t chuy n gen g m có: Ch n l c và
phân l p gen; chuy n gen vào t bào th c v t; nuôi t bào th c v t mang gen
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………6


l thành cây hồn ch nh.

Hình 2.2. Chuy n gen cây tr ng
2.2.2 Chuy n gen nh vi khu n Agrobacterium
Có nhi u phương pháp chuy n gen vào th c v t nhưng có th phân lo i
thành hai nhóm phương pháp chính: phương pháp chuy n gen tr c ti p và
phương pháp chuy n gen gián ti p.

phương pháp chuy n gen tr c ti p, gen

ñư c chuy n tr c ti p vào t bào th c v t thông qua nh ng thi t b ho c thao
tác nh t đ nh mà khơng c n ph i nh các sinh v t trung gian. Phương pháp
chuy n gen gián ti p, gen ñư c chuy n vào t bào th c v t qua m t sinh v t
trung gian thư ng là vi sinh v t ho c virus [12], [13].
Vi khu n ñ t nhu m gram âm Agrobacterium tumefaciens là m t vi
khu n gây b nh, mà m t ph n bình thư ng trong vịng đ i c a nó là bi n n p
di truy n các t bào th c v t. ðư c nghiên c u t nh ng năm 1960 – 1970,
vi c phát hi n ra vi khu n này có kh năng chuy n gen vào th c v t vào ñ u
nh ng năm 1980 đã bi n lồi này tr thành m t trong nh ng công c quan
tr ng nh t c a Công ngh sinh h c th c v t v i nh ng ưu ñi m n i tr i: s
b n sao c a gen bi n n p ñư c chuy n vào t bào th c v t th p (kho ng 1-2
gen, trong khi s d ng súng b n gen là nhi u hơn), do v y, gi m t i thi u s

Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………7


khơng bi u hi n c a gen đư c chuy n, tăng kh năng chuy n gen b n v ng,
hi u qu chuy n gen cao; tránh ñư c s hình thành c a các cây chuy n gen
kh m; k thu t ñơn gi n, d th c hi n; khơng địi h i thi t b ñ t ti n [17].
Phương pháp này ñã kh c ph c ñư c nh ng h n ch ch y u c a các
phương pháp chuy n gen tr c ti p như: thư ng thu nh n ñư c cây tr ng có
nhi u b n sao c a m t gen d n t i s “nhi u gen” và không b n v ng c a gen
trong th c v t, t n s chuy n gen th p, k t qu có th thu đư c nh ng cây
mang th kh m nghĩa là ch mang gen

m t s v trí trên cây...

Chuy n gen b ng Agrobacterium đã th c hi n có k t qu trên nhi u
loài cây hai lá m m như: thu c lá, cà chua, khoai tây, ñ u tương, ngơ, bơng và
đ c bi t là trên cây m t lá m m thì đã làm cho phương pháp chuy n gen này
tr nên h p d n và c ng c đư c v trí c a nó ngay t đ u [19].
* ð c đi m chung c a vi khu n Agrobacterim tumefaciens
Agrobacterium là các vi khu n ñ t nhu m gram (-) gây ra các tri u
ch ng b nh

cây khi xâm nhi m qua v t thương, t o ra các u s n nh hư ng

ñ n s sinh trư ng bình thư ng c a cây b xâm nhi m [5], [7].
Trong chi Agrobacterium thì A.tumefaciens đư c s d ng nhi u nh t
cho vi c chuy n gen.
Phân lo i khoa h c:
Gi i: Bacteria
Ngành: Proteobacteria

L p: Alpha Proteobacteria
B : Rhizobiales
H : Rhizobiaceae
Chi: Agrobacterium
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………8


Lồi: A. tumefaciens
Danh pháp khoa h c: Agrobacterium tumefaciens.

Hình 2.3. M t s kh i u do vi khu n Agrobacterium tumefaciens t o ra
trên thân cây hoa h ng (A) và trên thân cây nho (B).
Quy trình chung đ chuy n gen nh vi khu n A. tumefaciens như sau:
Bư c 1: Thi t k vector mang gen.
Bư c 2: Nhân dòng vector nh vi khu n E.coli.
Bư c: Chuy n vector mang bi n n p t E.coli sang A.tumefaciens.
Bư c 4: Lây nhi m A.tumefaciens ch a gen bi n n p v i t bào, mô th c
v t đ ti n hành q trình chuy n gen sang mơ, t bào đích.
Bư c 5: Ch n l c các mơ, t bào đư c bi n n p thành công.
Bư c 6: Tái sinh mô, t bào bi n n p thành cây hoàn ch nh.
Sau đó, t nh ng cây chuy n gen thu ñư c c n ñánh giá s

n ñ nh di

truy n qua các th h , s d ng phương pháp lai h u tính đ thu đư c con cái
mang gen mong mu n. ð ng th i ñánh giá tác ñ ng c a cây chuy n gen ñ
ñưa ra s n xu t và cung c p cho th trư ng [18].
Vì v y v i m i lo i cây, m i lo i vector mang gen khác nhau s d ng
cho quá trình chuy n gen nh vi khu n Agrobacterium tumefaciens c n có
quy trình riêng v i các thơng s k thu t c th c n ñư c nghiên c u.

Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………9


2.3

Cơ s khoa h c c a phương pháp chuy n gen vào th c v t nh vi
khu n A. tumefaciens

2.3.1 Cơ s v kh năng tái sinh

th c v t

Trong k thu t chuy n gen vào th c v t thì nh ng đ i tư ng thư ng
ñư c s d ng ñ chuy n gen là: mô lá, mô thân, m u callus hay nh ng t bào
tách r i... nh ng v t li u này sau khi ñã ñư c bi n n p thành cơng các t bào đã
dung h p các gen ngo i lai, ta ph i tìm cách làm cho các t bào này tái sinh
ñư c thành m t cơ th hồn ch nh b ng cách đ t vào nó m t mơi trư ng tái
sinh thích h p. N u như s tái sinh thành cây hồn ch nh khơng thành cơng thì
t t c nh ng v t li u ñã ñư c bi n n p đó s tr lên vơ nghĩa. Chính vì v y, s
thành công c a k thu t chuy n gen ph thu c vào s tái sinh c a t bào.
Q trình phát sinh hình thái trong ni c y mô t bào th c v t th c
ch t là k t qu c a quá trình phân hoá và ph n phân hoá t bào. V cơ b n thì
q trình phân hố và ph n phân hố là q trình ho t hố, c ch các gen.
T i m t th i ñi m nào đó trong q trình phát tri n cá th có m t s gen đư c
ho t hố (mà v n trư c nay b

c ch ) ñ cho ta tính tr ng m i cịn m t s

gen khác thì l i b đình ch ho t đ ng. ði u này x y ra theo m t chương trình
đã đư c mã hố trong c u trúc c a phân t DNA c a m i t bào khi n quá

trình sinh trư ng phát tri n c a cơ th th c v t ln đư c hài hoà. M t khác,
khi t bào n m trong m t kh i mô c a cơ th thư ng b

c ch b i các t bào

xung quanh, khi tách riêng t ng t bào ho c gi m kích thư c c a kh i mơ s
t o ñi u ki n thu n l i cho s ho t hoá các gen c a t bào [18].
Do v y, vi c l a ch n và ñi u ch nh môi trư ng nuôi c y mô và t bào
th c v t đóng vai trị quan tr ng góp ph n quy t đ nh s thành cơng hay th t
b i c a thí nghi m bi n n p. Yêu c u cơ b n ñ i v i h th ng tái sinh:
* Các m u t bào, mơ dùng cho q trình chuy n gen c n ph i có kh năng
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………10


phân chia in vitro nhanh.
* Các mô, t bào này ph i có kh năng ti p nh n gen m i.
* Quy trình tái sinh cây ph i có hi u qu cao, khơng ho c ít ph thu c vào
ki u gen
* Cây tái sinh ph i có t l s ng cao (khi đưa ra ngồi đ t tr ng), t n s bi n
d th p và kh năng h u th cao đ có th s d ng làm ngu n nguyên li u ban
ñ u ñ ti p t c ti n hành chuy n gen trong ñi u ki n in vivo sau này.
N u s bi n n p x y ra mà khơng có s tái sinh kèm theo, ho c s tái
sinh di n ra mà không kèm theo s bi n n p thì thí nghi m bi n n p khơng
thành cơng. Vì v y, giai đo n bi n n p và giai ño n tái sinh cây đ u có ý
nghĩa quan tr ng trong thành cơng c a thí nghi m chuy n gen.
2.3.2 Cơ ch chuy n gen c a Agrobacterim tumefaciens.
A.tumefaciens có kh năng chèn gen c a mình vào th c v t và sau đó s
d ng b máy th c v t ñ bi u hi n các gen này dư i d ng h p ch t dinh dư ng
cho chúng. A.tumefaciens s t o ra các kh i u th c v t g n ñi m ti p n i gi a
r và thân, gây ra nh ng n t s n

đó các t bào kh i u

cây (b nh m n cây - crown gall disease), khi

th c v t có g n m t đo n DNA t vi khu n. Khi phân

tích kh i u cho th y trong kh i u có s hình thành m t s v t ch t m i như:
nopaline, octopine g i chung là opine. Các ch t này khơng h có trư c đó và
khơng h có

cây tr ng thơng thư ng.

Như v y vi khu n ñã truy n vào cây qua v t thương m t tác nhân gây
b nh cho cây và tác nhân này có b n ch t là v t ch t di truy n.
Qua nghiên c u ngư i ta k t lu n r ng tác nhân gây u này chính là Tiplasmid có trong vi khu n A.tumefaciens. Ti-plasmid này có đ c đi m chung
như sau:
Ti-plasmid là m t plasmid ñư c c u t o bao g m m t phân t DNA kép,
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………11


vịng trịn l n có kích thư c: 200kb, có kh năng tái b n ñ c l p v i s tái b n
c a DNA nhi m s c th c a vi khu n.

Hình 2.4. C u trúc Ti- Plasmid
(ngu n : )
Trên Ti-plasmid có đo n T-DNA ñư c gi i h n b ng b

ph i (right

border) và b trái (left border) có trình t nucleotid tương t nhau. T-DNA là

đo n nucleotid có kích thư c 25kb và mang hai lo i gen: lo i gen gây ung thư
(oncogenic gene), lo i này mã hoá cho m t enzym liên quan t i t ng h p các
auxin, cytokinin và hình thành kh i u; lo i th hai liên quan t i t ng h p
opine. ðo n này ñư c g i là T-DNA (Tumor DNA) vì đây là đo n s ñư c
chuy n vào t bào th c v t g n vào b NST và gây ra b nh u.
Trên Ti-plasmid cịn có vùng vir ch a các gen ch u trách nhi m ho t
ñ ng lây nhi m, chuy n n p và tiêu hoá opine.

Trư

Khi cây nhi m b nh, do T-DNA n p vào trong b gen c a cây ch b t
ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………12


ñ u ho t ñ ng và s n sinh ra auxin, cytokinin và opine, toàn b sinh trư ng
c a cây b r i lo n, các t bào phân chia vô t ch c và t o ra các kh i u.
Opine ñư c vi khu n s d ng như m t lo i th c ăn, nh gen chuy n hố
opine trên Ti-plasmid.

Hình 2.5. Mơ hình chuy n gen nh Agrobacterium
(1)_Agrobacterium nh n d ng và t n cơng t bào ch ;(2)_T h p tín hi u
VirA/VirG c a Agrobacterium c m nh n nh ng tín hi u th c v t đ c
trưng;(3)_S ho t hoá c a vùng gen vir; (4)_ T-DNA ñư c tách ra kh i Tiplasmid nh ph c h p protein VirD1/D2; (5)_S t o thành ph c h p VirD2DNA (ph c h p-T chưa thành th c), cùng v i m t vài protein Vir khác, ñi vào
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………13


nguyên sinh ch t t bào ch ; (6)_S k t h p c a VirE2 v i s i-T t o thành
ph c h p-T thành th c ñi xuyên qua nguyên sinh ch t t bào ch ; (7)_Ph c
h p-T thành th c ch ñ ng ñi vào nhân t bào ch ; (8)_T-DNA b h p d n t i
v trí h p nh t; (9)_T-DNA tách kh i các protein b o v ; (10)_T-DNA h p

nh t vào b gen ch .
Quá trình chuy n T-DNA t

vi khu n A.tumefaciens sang t bào

cây ch ñư c th c hi n b i ho t ñ ng c a các gen vir A, B, C, D, E, G,
F, trong đó vir C và vir E có tác d ng làm tăng t n s bi n n p [19]. Các
gen này có vai trị quan tr ng trong vi c nh n di n ra v t thương c a cây
thơng qua tín hi u hố h c acetosyringone (AS). Tín hi u hố h c ñư c
nh n bi t ñ u tiên b i vir A. Gen vir A s t ng h p nên m t lo i protein
n m trong màng t bào ñ ñáp ng s trao ñ i ch t c a v t thương trên
cây. Protein vir A t photphoryl hố đ ng th i làm cho protein vir G đư c
photphoryl hố và kích ho t sao mã c a các gen vir B, C, E, F, G.
Ti p đó các protein đư c mã hố b i vir D, vir E th c hi n ch c năng
gi i phóng s i T-DNA. Protein D2 c t T-DNA t i v trí 5’ c a b ph i và 3’
c a b trái và gi i phóng s i T-DNA. Protein E2 b o v T-DNA kh i s phân
gi i c a enzym nuclease trong cây. ð ng th i th c hi n ch c năng này có các
protein vir C1, vir C 2 có tác d ng tăng cư ng vi c gi i phóng T-DNA.
S chuy n ph c h p T-DNA do operon vir B ñ m nhi m. Vir B có
ch c năng t o kênh xuyên qua màng t bào giúp chuy n s i ñơn T-DNA vào
nhân t bào. ð ng th i protein vir B4, vir B11 có ho t tính ATPase cung c p
năng lư ng cho v n chuy n T-DNA.
Như v y, th c ch t đã có m t h th ng chuy n gen c a vi khu n ñ t vào
cây tr ng t n t i trong t nhiên.
* Thi t k vector chuy n gen.
Trư

Các nghiên c u v Agrobacterium và kh năng t nhiên c a chúng trong
ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………14

vi c bi n ñ i v t ch t sinh h c c a các t bào th c v t b nhi m ñã giúp các
nhà khoa h c thi t k ñư c nh ng phân t giúp chuy n gen mong mu n vào
t bào th c v t: T-DNA ñư c gi i h n hai ñ u b i vùng biên (T-DNA
borders), ph n cịn l i trong vùng biên s khơng có ch c năng gì trong quá
trình chuy n gen. Nh v y, có th lo i b kh năng gây h i c a T-DNA b ng
cách thay các gen t o kh i u (oncogenes) n m trong hai ñ u vùng biên b ng
các gen mong mu n. Khi các oncogene b lo i b , t bào ho c mô th c v t
chuy n gen s phát tri n bình thư ng và trong h u h t các trư ng h p, cho
cây h u th . Quá trình t ng h p opine s d ng các nguyên li u c a cây làm
nh hư ng ñ n năng su t cu i cùng nên trong quá trình thi t k cũng lo i b
các gen t ng h p opine. Ti-plasmid có kích thư c l n (200-800kb) nên nh ng
đo n DNA khơng c n thi t cũng ph i ñư c c t b ñ chèn vào ño n DNA
m c tiêu. Ngồi ra, Ti-plasmid khơng t tái b n trong E.coli nên c n ñư c b
sung thêm g c tái b n c a E.coli. Cu i cùng, c n b sung các gen ch th ñ
ch n l c cây và vi khu n.
Như v y, c u trúc c a m t vector chuy n gen bao g m:
* Có g c tái b n (ORI) có ngu n g c t vi khu n.
* Vùng kh i ñ ng (promoter) có ngu n g c t th c v t.
* Vùng k t thúc (terminator).
* Vùng g n gen chuy n vào (MCS).
* Vùng ch a gen ch n l c (ñ tách các t bào chuy n gen).
* Vùng ch a các gen báo cáo ñ bi t đư c các gen chuy n vào có thành
công không (Gus, GFP - gen phát huỳnh quang).
Ngư i ta ñã t o ra các d ng vector m i ñ chuy n gen là nh ng vector
liên h p (cointegrate vector) và vector nh th (binary vector) [4].
H th ng vector liên h p (cointegrate vector) là k t qu c a s liên h p
hai lo i plasmid: Ti-plasmid ñã lo i tr vùng gen gây kh i u và gen t o các
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………15

h p ch t opine nhưng v n gi l i vùng vir và vùng b trái, b ph i. Thay vào
nh ng gen b c t b là ño n tương ñ ng v i m t ño n trên plasmid th hai
(plasmid trung gian) ñ ph c v cho vi c liên h p hai lo i plasmid. Plasmid
trung gian là m t plasmid tách dòng t vi khu n E.coli và có th tái sinh đư c
Agrobacterium. Plasmid này có ch a vùng g n gen c n chuy n n p, các gen
ch th ph c v vi c ch n l c và có m t ño n tương ñ ng. Khi cho tương tác
hai lo i plasmid này v i nhau chúng s liên h p qua s trao ñ i chéo gi a hai
đo n tương đ ng và hình thành nên vector liên h p. Vector liên h p này n m
trong vi khu n A. tumefaciens và ho t ñ ng theo cơ ch chuy n gen thông
thư ng c a vi khu n ñ t. Do t n s ñưa plasmid trung gian t E.coli sang
Agrobacterium r t th p (10-7-10-5) nên vector này ít đư c s d ng.
H th ng vector nh th khác v i vector liên h p là chúng có hai vector
(plasmid) cùng có m t và ho t ñ ng trong Agrobacterium. M t plasmid tách
dịng t E.coli trong đó có thi t k vùng b trái và b ph i, n m gi a chúng là
các gen ch th và vùng g n gen c n chuy n. Plasmid th hai là Ti-plasmid c i
ti n: toàn b vùng T-DNA và vùng b trái và b ph i b c t b ch gi l i
vùng vir, plasmid này ñư c g i là plasmid h tr . H th ng vector này cũng
ho t ñ ng theo cơ ch chuy n gen c a vi khu n ñ t Agrobacterium m t cách
r t h u hi u [18].
2.3.3 ð c ñi m ưu vi t c a phương pháp bi n n p gen

th c v t so v i

các phương pháp ch n t o gi ng truy n th ng
T xưa ñ n nay con ngư i ñã can thi p vào các đ c tính di truy n c a
th c v t b ng ch n gi ng kinh ñi n. Theo phương pháp truy n th ng này, nhà
t o gi ng tìm cách t h p l i các gen gi a hai cá th th c v t nh m t o ra con
lai mang nh ng tính tr ng mong mu n. Phương pháp này ñư c th c hi n
b ng cách chuy n h t ph n t cây này sang nhu hoa c a cây khác.

Tuy nhiên phép lai chéo này b h n ch b i nó ch có th th c hi n
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………16