Nghiên cứu thu nhận dịch đạm thủy phân từ thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme protease vi sinh vật

..

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
---------------------------------------

TRẦN VĂN KHIÊM

TRẦN VĂN KHIÊM

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGHIÊN CỨU THU NHẬN DỊCH ĐẠM THỦY PHÂN
TỪ THỊT ĐỎ CÁ NGỪ BẰNG ENZYME PROTEASE
VI SINH VẬT

LUẬN VĂN THẠC SĨ
CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHỐ K32
Đà Nẵng – Năm 2018


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
---------------------------------------

TRẦN VĂN KHIÊM

NGHIÊN CỨU THU NHẬN DỊCH ĐẠM THỦY PHÂN TỪ
THỊT ĐỎ CÁ NGỪ BẰNG ENZYME PROTEASE

VI SINH VẬT

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số
: 60420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. Nguyễn Hoàng Minh

Đà Nẵng – Năm 2018


i

LỜI CẢM ƠN
Luận văn này khơng thể hồn thành nếu thiếu sự hướng dẫn, giúp đỡ, động viên
và hỗ trợ nhiệt tình của nhiều thầy, cơ và bạn bè.
Trước tiên, tơi xin bày tỏ sự kính trọng và lịng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn
Hoàng Minh, giảng viên BM Cơng nghệ sinh học, Khoa Hóa, Trường ĐH Bách Khoa
Đà Nẵng đã tận tình hướng dẫn, động viên, giúp đỡ tơi trong q trình nghiên cứu và
viết luận văn này. Những nhận xét và đánh giá của Cô, đặc biệt là những gợi ý về
hướng giải quyết vấn đề trong suốt quá trình nghiên cứu, thực sự là những bài học vô
cùng quý giá đối với tôi, không chỉ trong quá trình viết luận văn mà cả trong hoạt
động nghiên cứu chuyên môn sau này.
Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến TS. Lê Lý Thùy Trâm, Trưởng BM
Cơng nghệ sinh học, Khoa Hóa, Trường ĐH Bách Khoa Đà Nẵng, Cô đã luôn động
viên, hỗ trợ, giúp đỡ những lúc tơi cảm thấy khó khăn nhất, tuyệt vọng nhất và giúp tôi
vượt qua mọi trở ngại để đi trọn vẹn con đường cao học này.

Tôi cũng xin gửi cảm ơn sâu sắc đến PGS. TS Đặng Minh Nhật, Phó trưởng
Khoa Hóa, Trường ĐH Bách Khoa Đà Nẵng, Thầy đã giúp đỡ tôi từ những bước đầu
định hướng về đề tài nghiên cứu của mình và đặc biệt đã tạo điều kiện hết sức để tơi
có thể tiếp tục thực hiện đề tài luận văn và hoàn thành chương trình cao học.
Tơi xin cảm ơn Ban Giám hiệu và tập thể giảng viên Khoa Hóa, Trường ĐH
Bách Khoa Đà Nẵng đã dạy bảo, chia sẻ, động viên và tạo mọi điều kiện để tơi có thể
hồn thành luận văn này.
Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình tôi, đồng nghiệp và bạn bè đã giúp đỡ
tôi cả về tinh thần lẫn vật chất trong suốt quá trình học cao học cũng như làm luận
văn.
Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn!
Học viên

Trần Văn Khiêm


ii

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan luận văn thạc sĩ “Nghiên cứu thu nhận dịch đạm thủy phân
từ thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme protease vi sinh vật” là công trình nghiên cứu của
riêng tơi. Các số liệu và tài liệu trong luận văn là trung thực và chưa được cơng bố
trong bất kỳ cơng trình nghiên cứu nào. Tất cả những tham khảo và kế thừa đều được
trích dẫn và tham chiếu đầy đủ.
Học viên

Trần Văn Khiêm


iii

NGHIÊN CỨU THU NHẬN DỊCH ĐẠM THỦY PHÂN TỪ THỊT ĐỎ CÁ
NGỪ BẰNG ENZYME PROTEASE VI SINH VẬT
Học viên: Trần Văn Khiêm
Chun ngành: Cơng nghệ
sinh học
Mã số: 60420201

Khóa: K32 Trƣờng Đại học Bách khoa - ĐHĐN

Tóm tắt - Hiện nay có một mối quan tâm tăng cao hƣớng đến việc sản xuất lƣợng lớn enzyme
protease từ vi sinh vật để thủy phân thịt đỏ cá ngừ - nguồn phế phẩm đƣợc tạo ra hằng năm
trong ngành chế biến thủy sản thành các axit amin giá trị. Hƣớng đến mục tiêu này, gen
nprC10 mã hóa protease trung tính NPRC10 từ vi khuẩn Bacillus subtilis C10 đã đƣợc biểu
hiện trong vi khuẩn Escherichia coli M15 sử dụng hệ vector biểu hiện pQE30. Trong nghiên
cứu này, các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình ni cấy nhƣ nguồn nitơ, nồng độ IPTG, thời
gian cảm ứng đã đƣợc khảo sát. Kết quả cho thấy hoạt tính protease cao nhất (6,694 U/mL)
thu đƣợc khi E.coli M15 mang plasmid tái tổ hợp đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng LB cải tiến
tại 370C với thời gian nuôi cấy sau khi cảm ứng bằng 1mM IPTG ở giá trị OD600 đạt 2-3 là
19h. Protease sau khi tủa bằng ammonium sulphate 70% độ bão hịa có hoạt tính 31,725
U/mL, gấp 4,6 lần so với trƣớc khi tủa. Quan trọng hơn cả, hiệu suất thu hồi nitơ đạt 86% khi
sử dụng protease NPRC10 để thủy phân thịt đỏ cá ngừ với các thông số tối ƣu (5 giờ thủy
phân thịt đỏ cá ngừ, tỷ lệ enzyme/cơ chất = 1,6/100 (v/w) và nhiệt độ phản ứng là 500C).
Từ khóa - protease; Bacillus subtilis; E.coli M15; ammonium sulfate; thịt đỏ cá ngừ; hiệu
suất thu hồi nitơ.

STUDY OF THE PRODUCTION OF PROTEIN HYDROLYSATE FROM
TUNA RED USING MICROBIAL PROTEASE
Abstract - There is an increasing interest toward production of large amount of microbial
protease to degrade protein-rich byproducts such as tuna red meat from fish processing

industry into valuable amino acids. For this aim, the coding region of nprC10 gene
corresponding to mature neutral protease (NPRC10) from Bacillus subtilis C10 was
heterologously expressed in Escherichia coli M15 by using pQE30 expression system. In this
study, various factors related to cultivation such as nitrogen source, IPTG concentration,
induction time were investigated. The result indicated that the highest activity of protease
NPRC10 (6,694 U/mL) was obtained after induction by 1 mM IPTG at OD600 of 2-3 for 19h
at 370C with pepton as nitrogen source. The precipitation by ammonium sulfate (70%
saturation) offered protease activity of 31,725 U/mL, 4,6 times higher than activity of
protease in culture filtrate. More importantly, nitrogen recovery in soluble fraction was
approximately 86% when using the purified protease NPRC10 to hydrolyse tuna red meat
under optimized conditions (hydrolysis time: 5 hours; ratio of enzyme/tuna red meat:1,6/100
(v/w); hydrolysis temperature: 500C).
Key - protease; Bacillus subtilis; E.coli M15; ammonium sulfate; tuna red meat; nitrogen
recovery.


iv

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................... i
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................ii
NGHIÊN CỨU THU NHẬN DỊCH ĐẠM THỦY PHÂN TỪ THỊT ĐỎ CÁ NGỪ
BẰNG ENZYME PROTEASE VI SINH VẬT ............................................................ iii
MỤC LỤC ...................................................................................................................... iv
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ................................................vii
DANH MỤC CÁC BẢNG .......................................................................................... viii
DANH MỤC CÁC HÌNH .............................................................................................. ix
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1
1. Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu .......................................................................................... 2

3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ...................................................................... 2
4. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................... 2
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ............................................................ 2
6. Cấu trúc của luận văn.......................................................................................... 3
Chƣơng 1. TỔNG QUAN .............................................................................................. 1
1.1. Tổng quan về protease .............................................................................................. 1
1.1.1. Giới thiệu chung ........................................................................................... 1
1.1.2. Phân loại enzyme protease............................................................................ 1
1.1.3. Nguồn thu nhận protease .............................................................................. 3
1.1.4. Thu nhận enzyme .......................................................................................... 4
1.1.5. Thủy phân protein bằng enzyme protease .................................................... 6
1.1.6. Ứng dụng của protease ................................................................................. 8
1.2. Tổng quan về cá ngừ .............................................................................................. 11
1.2.1. Giới thiệu về cá ngừ .................................................................................... 11
1.2.2. Thành phần hóa học của cá ngừ..................................................................12
1.3. Tổng quan về công nghệ DNA tái tổ hợp ............................................................... 14
1.3.1. Công nghệ DNA tái tổ hợp ......................................................................... 14
1.3.2. Hệ thống biểu hiện E. coli .......................................................................... 15
1.4. Tổng quan về tình hình nghiên cứu protease tái tổ hợp ......................................... 17
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ............................................................. 17
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc ............................................................... 18
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 21
2.1. Vật liệu nghiên cứu................................................................................................. 21
2.1.1. Chủng vi sinh vật ........................................................................................ 21


v
2.1.2. Nguyên liệu và hóa chất ............................................................................. 21
2.1.3. Thiết bị sử dụng .......................................................................................... 22
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................................ 22

2.2.1. Phƣơng pháp bảo quản giống ..................................................................... 22
2.2.2. Các phƣơng pháp nuôi cấy E.coli M15 ...................................................... 22
2.2.3. Phƣơng pháp xây dựng đƣờng cong tăng trƣởng của E.coli M15 ............. 23
2.2.4. Phƣơng pháp định tính protease ................................................................. 23
2.2.5. Khảo sát sự biểu hiện của vi khuẩn E. coli M15 tái tổ hợp ........................ 23
2.2.6. Đánh giá hoạt độ enzyme protease thu đƣợc từ q trình ni cấy E.coli
M15 ................................................................................................................................ 24
2.2.7. Phƣơng pháp kết tủa enzyme protease ....................................................... 25
2.2.8. Xác định các thông số phản ứng enzyme để thủy phân thịt đỏ cá ngừ
bằng enzyme protease tái tổ hợp ................................................................................... 25
2.2.9. Xử lý thống kê ............................................................................................ 27
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 28
3.1. Khảo sát khả năng sinh trƣởng và sinh enzyme protease của chủng vi khuẩn
E.coli M15 ..................................................................................................................... 28
3.1.1. Đƣờng cong sinh trƣởng của vi khuẩn E.coli M15 .................................... 28
3.1.2. Xác định khả năng sinh enzyme protease của vi khuẩn E.coli M15 .......... 29
3.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của các điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp
enzyme protease NprC10 của vi khuẩn E.coli M15 tái tổ hợp ...................................... 30
3.2.1. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh tổng hợp enzyme protease
NprC10 của E. coli M15 tái tổ hợp ............................................................................... 30
3.2.2. Ảnh hƣởng của thời gian lên khả năng sinh tổng hợp enzyme protease
NprC10 của E. coli M15 sau khi cảm ứng .................................................................... 31
3.2.3. Ảnh hƣởng của nồng độ chất cảm ứng lên khả năng sinh tổng hợp
enzyme protease NprC10 của E. coli M15 .................................................................... 32
3.3. Kết quả nghiên cứu quá trình kết tủa protease E.coli M15 .................................... 34
3.4. Xác định các thông số của phản ứng ảnh hƣởng đến hiệu quả thủy phân thịt đỏ
cá ngừ bằng enzyme protease tái tổ hợp ........................................................................ 36
3.4.1. Kết quả ảnh hƣởng của tỷ lệ enzyme/cơ chất đến hiệu quả thủy phân
bằng enzyme protease NPRC10 .................................................................................... 36
3.4.2. Xác định ảnh hƣởng của thời gian đến hiệu quả thủy phân bằng enzyme

protease NPRC10 .......................................................................................................... 37
3.4.3. Xác định nhiệt độ phản ứng enzyme phù hợp ............................................ 38
3.4.4. Kết luận khảo sát đơn biến ......................................................................... 39


vi
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


vii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

OD
U

: Optical density – mật độ quang.
: Unit – Đơn vị hoạt độ protease.

UV-Vis
v/w

: Ultraviolet–visible spectroscopy – quang phổ tử ngoại khả kiến.
: volume/weigh – thể tích/khối lƣợng.

MTTUCB : Mơi trƣờng tối ƣu cơ bản
LB
: Luria Bertani

B. subtilis : Bacillus subtilis
E.coli
TCA

: Escherichia coli
: Trichloroacetic acid


viii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Số hiệu

Tên bảng

Trang

Bảng 1.1.

Một số tính chất của Protease (P) vi sinh vật

2

Bảng 1.2.

Thành phần hóa học của một số cá ngừ đại dƣơng

12

Bảng 1.3.

Hàm lƣợng các chất và năng lƣợng trong 100 g thịt đỏ cá ngừ

13

Bảng 1.4.

Hàm lƣợng một số acid amin có trong thịt đỏ cá ngừ

13

Bảng 1.5.

Hàm lƣợng các chất khống có trong thịt đỏ cá ngừ

13

Bảng 3.1.

Các phƣơng pháp phá mẫu

34

Bảng 3.2.

Thông số phản ứng thủy phân thịt đỏ cá ngừ

39

ix

DANH MỤC CÁC HÌNH
Số hiệu

Tên hình

Trang

Hình 1.1. Phản ứng thủy phân liên kết peptit

1

Hình 1.2. Một số loại cá ngừ

11

Hình 1.3. Vector pQE

16

Hình 2.1. Thành phần cơ bản của thịt đỏ cá ngừ

21

Hình 3.1. Đƣờng cong sinh trƣởng của E.coli M15

28

Hình 3.2. Hình ảnh vịng trịn thủy phân casein

30

Hình 3.3. Ảnh hƣởng của mơi trƣờng lên hoạt độ protease

31

Hình 3.4. Ảnh hƣởng của thời gian cảm ứng lên hoạt độ protease

31

Hình 3.5. Ảnh hƣởng của nồng độ cảm ứng lên hoạt độ protease

33

Hình 3.6. Ảnh hƣởng của các tác nhân tủa đến hoạt độ enzyme protease

35

Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nồng độ enzyme đến hàm lƣợng nitơ tổng số
trong dịch đạm và hiệu suất thu hồi nitơ từ thịt đỏ cá ngừ

36

Hình 3.8. Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hiệu suất thu hồi nitơ

37

Hình 3.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ thủy phân đến hiệu suất thu hồi nitơ
(%) khi thủy phân thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme protease

NPRC10

38


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Cá ngừ (tuna) là nguồn lợi hải sản có giá trị dinh dƣỡng, giá trị sinh học và giá
trị kinh tế cao. Theo Báo cáo xuất khẩu thủy sản Việt nam Quý II, năm 2011, Việt
Nam xuất khẩu gần 31 nghìn tấn cá ngừ, trị giá 148 triệu USD, tăng gần 16% về khối
lƣợng và 36,5% về giá trị so với cùng kỳ năm ngối. Hiện nay, có 87 doanh nghiệp
tham gia xuất khẩu cá ngừ sang 73 thị trƣờng thế giới. Trong công nghiệp chế biến cá
ngừ, thành phần khối lƣợng của thịt cá ngừ chiếm khoảng 60%, phần còn lại là phế
phẩm nhƣ đầu, xƣơng, vây, thịt vụn… Phần thịt thu nhận đƣợc sau quá trình chế biến
bao gồm phần thịt trắng đƣợc dùng để chế biến thành các mặt hàng nhƣ fillet, đồ hộp
và xơng khói, cịn phần thịt đỏ đƣợc loại bỏ do có chứa thành phần gây dị ứng. Tùy
theo loài, khối lƣợng phần thịt đỏ bị loại bỏ có thể lên tới 6,4% [13]. Ƣớc tính lƣợng
thịt đỏ cá ngừ này ở Việt Nam khoảng 1.000 tấn/năm. Quan trọng hơn nữa, phần thịt
đỏ này có chứa hàm lƣợng protein tƣơng đối cao (14%). Nếu lƣợng thịt đỏ này không
đƣợc xử lý hết trƣớc khi thải ra môi trƣờng ngồi thì sẽ gây ảnh hƣởng nghiêm trọng
tới mơi trƣờng [41]. Do đó, để giải quyết vấn đề nêu trên, hiện nay rất nhiều nhà
nghiên cứu đang quan tâm đến giải pháp sử dụng enzyme protease để biến đổi nguồn
protein trong thịt đỏ cá ngừ thành các axit amin. Đây là giải pháp không chỉ giải quyết
vấn đề ô nhiễm mơi trƣờng nêu trên, mà cịn góp phần tạo ra sản phẩm dinh dƣỡng giá
trị cao.
Enzyme Protease là enzyme xúc tác quá trình thủy phân liên kết peptit (-CONH-)n trong phân tử protein, polypeptide đến sản phẩm cuối cùng là các axit amin.
Protease có nhiều ứng dụng quan trọng trong nhiều ngành công nghiệp thực phẩm,
dƣợc, nông nghiệp…Trong công nghiệp thịt, protease từ lâu đã đƣợc dùng làm mềm

thịt nhờ sự thủy phân một phần protein trong thịt, kết quả làm cho thịt có độ mềm
thích hợp và có vị tốt hơn… Hiện nay, có nhiều nghiên cứu sử dụng enzyme protease
để thủy phân các nguồn nguyên liệu giàu protein tạo ra axit amin hƣớng đến muc tiêu
sản xuất dịch đạm thủy phân. So với phƣơng pháp sử dụng axit hay bazơ cho mục đích
này, phƣơng pháp enzyme có nhiều ƣu điểm vƣợt trội hơn. Bởi lẽ, quá trình thuỷ phân
bằng axit sẽ làm mất đi hoàn toàn các acid amin chứa lƣu huỳnh, và quá trình thủy
phân bằng bazơ thƣờng tạo ra các sản phẩm kém giá trị do q trình raxemic hố
(chuyển axit amin dạng L sang axit amin dạng D làm giảm giá trị sinh học của acid
amin). Ƣu điểm của việc thuỷ phân protein bởi enzyme protease là bảo tồn đƣợc
vitamin của ngun liệu, khơng tạo ra các sản phẩm phụ, không làm sẫm màu dịch
thuỷ phân [12].


2
Hiện nay, trên thế giới và tại Việt Nam đã có những cơng trình nghiên cứu về
thịt đỏ cá ngừ, đặc biệt là việc tìm cách sử dụng nguồn phế phẩm này để phục vụ cho
cuộc sống con ngƣời. Các nghiên cứu này phát triển theo hƣớng sử dụng chính enzyme
protease nội tại trong con cá ngừ hoặc enzyme thƣơng mại để thủy phân thịt đỏ cá ngừ
nhằm thu hồi protein [10, 13, 20, 38, 43]. Tuy nhiên, khi sử dụng enzyme nội tại thì
khả năng thủy phân khơng cao, cịn với enzyme thƣơng mại thì khơng hiệu quả về mặt
kinh tế.
Chính vì vậy, đề tài này đặt ra mục tiêu nghiên cứu khả năng thủy phân protein
trong thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme protease tái tổ hợp nhằm tiết kiệm chi phí sản xuất
cũng nhƣ nâng cao khả năng thủy phân thịt đỏ cá ngừ.
2. Mục đích nghiên cứu
- Biểu hiện gen nprC10 mã hóa protease từ Bacillus subtilis C10 trong chủng E.
coli M15 nhờ hệ thống vector pQE 30 nhằm thu nhận enzyme protease tái tổ hợp.
- Xác định hoạt độ enzyme protease tái tổ hợp từ vi khuẩn Bacillus subtilis C10
trên cơ chất thịt đỏ cá ngừ.
- Thu nhận dịch đạm thủy phân từ thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme protease tái tổ

hợp
3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
- Sản xuất chế phẩm enzyme protease npr C10 từ Bacillus subtilis C10 bằng vi
khuẩn E. coli M15 tái tổ hợp.
- Khảo sát các thông số thực hiện phản ứng thủy phân thịt đỏ cá ngừ thu mua
trên địa bàn Đà Nẵng bằng enzyme protease tái tổ hợp.
- Nghiên cứu đƣợc thực hiện ở quy mơ phịng thí nghiệm.
4. Phƣơng pháp nghiên cứu
Phương pháp vi sinh
- Nuôi cấy tế bào E. coli M15.
Phương pháp hóa sinh
- Xác định hoạt độ của enzyme theo phƣơng pháp Anson cải tiến [12].
- Xác định nồng độ protein sử dụng phƣơng pháp Bradford (1976) [29].
- Xác định hàm lƣợng nitơ tổng số và protein thô theo phƣơng pháp Kjeldahl
[57].
Phương pháp th ng ê v
s i u
- Phƣơng pháp xử lý số liệu: Tất cả số liệu đƣợc xử lý bằng excel.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
5.1. Ý nghĩa hoa học
Cung cấp quy trình sản xuất dịch đạm thủy phân thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme


3
protease tái tổ hợp dựa trên các thông số ảnh hƣởng đến quá trình thủy phân đƣợc
khảo sát trong nghiên cứu (tỉ lệ enzyme/cơ chất, nhiệt độ phản ứng, thời gian phản
ứng).
5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Việc thực hiện cơng trình nghiên cứu khoa học này có một số ý nghĩa thực tiễn
nhƣ sau:

- Chủ động đƣợc nguồn enzyme protease trong điều kiện phịng thí nghiệm cho
việc thủy phân các nguồn cơ chất giàu protein khác nhau.
- Tận dụng nguồn nguyên liệu phế phụ phẩm là thịt đỏ cá ngừ giàu protein từ
các nhà máy chế biến thủy sản trên địa bàn thành phố Đà Nẵng để sản xuất dịch đạm
thủy phân và từ đó nghiên cứu phát triển mặt hàng mới nhƣ bột dinh dƣỡng, bột gia vị
làm tăng giá trị cho nguyên liệu.
- Thịt đỏ cá ngừ giàu protein nếu thải ra mơi trƣờng là điều kiện thích hợp cho
vi sinh vật có hại phát triển. Việc nghiên cứu chế biến thịt đỏ cá ngừ nếu thành cơng
có thể góp phần ngăn ngừa nguy cơ gây ơ nhiễm mơi trƣờng.
6. Cấu trúc của luận văn
Luận văn gồm có những chƣơng mục sau:
Mở đầu
Chƣơng 1: Tổng quan
Chƣơng 2: Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu
Chƣơng 3: Kết quả và thảo luận
Kết luận và kiến nghị
Tài liệu tham khảo
Phụ lục


1
Chƣơng 1

TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về protease
1.1.1. Giới thi u chung
Nhóm enzyme protease là các enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptit (CONH) trong phân tử protein và polypeptide đến sản phẩm cuối cùng là axit amin. Ngoài
ra nhiều protease có khả năng liên kết este và vận chuyển acid amin.

Hình 1.1. Phản ứng thủy phân liên kết peptit

Trong cơ thể, các protease đảm nhiệm nhiều chức năng sinh lý nhƣ: hoạt hóa
zymogen, q trình đơng máu và phân hủy sợi fibrin của cục máu đơng, giải phóng
hormone và các peptide có hoạt tính sinh học từ các tiền chất, vận chuyển protein qua
màng...[6].
1.1.2. Phân oại enzyme protease
Các cơng trình nghiên cứu protease vi sinh vật ngày càng nhiều. Các kết quả
nghiên cứu cho thấy ngay cả các protease của cùng một lồi vi sinh vật cũng có thể
khác nhau về nhiều tính chất.
Việc phân loại enzyme protease có thể căn cứ vào các tiêu chí nhƣ sau [23]:
- Cơ chế phản ứng của enzyme protease tham gia.
- pH tối thích cho hoạt động của enzyme gồm protease acid, protease kiềm hay
protease trung tính.
- Những vị trí khu trú của enzyme nhƣ enzyme protease nội tạng, enzyme
protease cơ thịt...
Theo Barett và Donald (1956), protease đƣợc chia ra thành hai nhóm lớn là
nhóm endopeptidase và nhóm exopeptidase.
- Nhóm 1: Endopeptidase là các enzyme protease phân cắt các liên kết peptide
nằm trong mạch polypeptide. Dựa vào động học của cơ chế xúc tác endopeptidase
đƣợc chia thành bốn phân nhóm:
+ Phân nhóm 1: Protease - Serin là những protease mà trong trung tâm hoạt


2
động của nhóm enzyme này có nhóm (- OH) của acid amin Serin. Phân nhóm này gồm
các enzyme nhƣ Trypsin, Chymotrypsin.
+ Phân nhóm 2: Protease - Cystein là những protein mà trong trung tâm hoạt
động của nhóm enzyme này có nhóm thiol (- SH) của acid amin Cystein. Phân nhóm
này gồm các enzyme Cathepsin.
+ Phân nhóm 3: Protease - Aspartic là những protease mà trong trung tâm hoạt
động của nhóm enzyme này có nhóm carboxyl (- COOH) của acid amin Aspartic nhƣ

Pepsin.
+ Phân nhóm 4: Protease - kim loại là những protease trong trung tâm hoạt
động của nhóm này có ion kim loại. Nhóm enzyme này hoạt động trong mơi trƣờng
trung tính.
- Nhóm 2: Exopeptidase là nhóm enzyme protease có khả năng thủy phân liên
kết peptide ngoài cùng của chuỗi polypeptide, hoặc đầu amine hoặc đầu carboxyl, tuần
tự tách từng acid amin ra khỏi chuỗi polypeptide.
Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase đƣợc phân chia
thành hai loại:
- Aminopeptidase: Là những protease xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu
nitơ tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một acid amin, một dipeptide hoặc
một tripeptide.
- Carboxypeptidase: Là những protease xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu
cacbon của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một acid amin, một dipeptide hoặc một
tripeptide.
Bảng 1.1. Một số tính chất của Protease (P) vi sinh vật
Nhóm

Nguồn gốc E

Chất kìm hãm

Đặc điểm
pH
TTHĐ tối thích

B. subtilis
B. pumillus
S. griseus
P-Serin

P-

S. fradiae
Art hrobacter B22
Asp. Oryzae
Asp.flavus
Asp. Sojae
E. coli
Streplococcus

DFP+

Xerin

Kiềm

Indoaxeta-mit

-SH

7,5


3

Nhóm
Cystein

Nguồn gốc E

Clostridium histoly-ticum

Chất kìm hãm

Đặc điểm

pH

TTHĐ

tối thích

Ps.cloromer-

7,0

curbebzoat
Asp. Niger
Asp. Awamori
PAspartic

Sailoi penicillium

Dizoaxetil

Janthinellum
Rhizopus chinensis

Dlnorlox-inmetil
este

COOH

acid

Kim loại
hóa trị hai

Trung
tính

Mucor pucillus
Endothia parasilica
B. subtilis
B. subtilis NRRL B3411
B. subtilisamy
P-Kim
loại

Losaccarilicis
B. megaterium
Psuedomonasaeruginoa
Atreptomeces naraensis
Asp. Oryzae
Acremonium kiliense
Clostridiumhisttolytium

EDTA++
1,10 octafenantrolin

1.1.3. Nguồn thu nhận protease
Enzyme là protein đƣợc sinh vật tổng hợp trong tế bào và là chất tham gia xúc
tác cho mọi phản ứng sinh học. Chính vì thế, mọi sinh vật đều đƣợc xem là nguồn thu
nhận để sản xuất enzyme. Nhƣng chủ yếu vẫn là ba nguồn chính: động vật (có nhiều ở
gan, dạ dày bê...), thực vật (đu đủ, dứa...) và vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus).
- Protease từ nguồn động vật và thực vật đƣợc loài ngƣời khai thác và sử
dựng từ hàng ngàn năm trƣớc để phục vụ đời sống hằng ngày. Nhƣng hiện nay, lƣợng
enzyme protease thu nhận từ động vật và thực vật đƣợc thay thế từ vi sinh vật. Do,
nguồn enzyme ở vi sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật, nhƣ vi
khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn... có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp
nhất để sản xuất enzyme ở quy mơ lớn dùng trong công nghiệp và đời sống.
- Mặt khác, enzyme có nguồn từ vi sinh vật có những ƣu điểm hơn nhƣ sau:
o Vi sinh vật có khả năng chuyển hóa một khối lƣợng cơ chất lớn hơn khối
lƣợng cơ thể chúng hàng ngàn lần.


4
o

Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính cao

o

Tốc độ sinh sản của vi sinh vật mạnh, trong thời gian ngắn có thể thu nhận

đƣợc lƣợng lớn sinh khối, giúp trong thời gian ngắn thu đƣợc một lƣợng enzyme nhiều
hoặc các sản phẩm trao đổi chất cao.
o Một đặc điểm riêng có của vi sinh vật đó là cơ thể nhỏ bé nên việc vận
hành, kiểm soát thiết bị lên men trong quá trình sản xuất đơn giản hơn rất nhiều.
o Trong sản xuất, quá trình sinh trƣởng, phát triển và sinh tổng hợp enzyme

của vi sinh vật hồn tồn khơng phụ thuộc vào khí hậu bên ngồi.
o Nguồn nguyên liệu dùng cho việc sản xuất enzyme từ vi sinh vật thƣờng rẻ
tiền và dễ kiếm, không chỉ có ý nghĩa về mặt kinh tế mà cịn có ý nghĩa rất lớn về mặt
môi trƣờng sống. Bên cạnh đó, vi sinh vật khơng địi hỏi q khắc khe những yếu tố
dinh dƣỡng của môi trƣờng, nhất là những vi sinh vật tổng hợp enzyme từ nhiều nguồn
khác nhau.
o Vi sinh vật có thể tổng hợp cùng một lúc nhiều loại enzyme khác nhau [7].
1.1.4. Thu nhận enzyme
Enzyme thƣờng chứa ở các tế bào sinh vật gọi là các enzyme nội bào
(intracellular enzyme), nhƣng nó cũng có thể đƣợc các sinh vật tiết ra mơi trƣờng
sống. Đó là các enzyme ngoại bào (extracellular enzyme). Enzyme vi sinh vật thƣờng
chiết là enzyme ngoại bào.
Các phân tử enzyme nội bào không có khả năng đi qua màng của tế bào và màng
của các cấu tử của tế bào. Do đó, để có thể chiết rút các enzyme này, bƣớc đầu tiên là
phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào có chƣa enzyme và chuyển chúng vào dung dịch.
Có thể phá vỡ cấu trúc của các tế bào bằng các biện pháp cơ học nhƣ nghiền
với bột thủy tinh hoặc cát thạch anh, làm đồng hóa bằng thiết bị đồng hóa
(homogenizator).
Muốn tách đƣợc các enzyme trong các cấu tử của tế bào, ngƣời ta còn phải
dùng các yếu tố vật lý và hóa học khác nhau nhƣ sóng siêu âm, dùng các dung môi
hữu cơ nhƣ butanol, aceton, glycerin, ethyl acetate…và chất detergent. Các hóa chất
có tác dụng cho việc phá vỡ các cấu tử của tế bào vì trong các cơ quan này thƣờng có
chứa mỡ.
Sau khi đã phá vỡ các cấu trúc của tế bào, enzyme đƣợc chiết bằng nƣớc cất,
bằng các dung dịch đệm thích hợp hoặc các dung dịch muối trung tính để tách enzyme
ra khỏi sinh khối đã xử lý theo những phƣơng pháp trên. Dịch chiết thu đƣơc, ngƣời ta
gọi là chế phẩm enzyme thô. Sở dĩ gọi là chế phẩm enzyme thơ vì trong chế phẩm này,
ngồi enzyme ra cịn có nƣớc, protein khơng phải enzyme, các thành của tế bào.
Chế phẩm thu đƣợc ở các bƣớc ban đầu này thƣờng chứa rất nhiều protein và

5
các hợp chất không mong muốn, nồng độ enzyme quan tâm thấp.
Dịch chiết có thể đƣợc cơ đặc ở nhiệt độ thấp để làm tăng nồng độ enzyme,
hoặc đƣợc bổ sung tác nhân gây tủa protein enzyme để loại bỏ một số chất khơng
mong muốn, sau đó hịa tan enzyme trong một thể tích nhỏ dung dịch đệm thích hợp.
Để kết tủa protein cho mục đích tinh sạch, ngƣời ta thƣờng dùng dung môi hữu
cơ nhƣ ethanol hay aceton hoặc muối trung tính. Các dung mơi hữu cơ khi thêm vào
dung dịch nƣớc sẽ làm giảm hằng số điện môi của dung dịch, do đó làm thay đổi tính
tan của protein và dẫn đến làm kết tủa protein. Nồng độ của các dung môi gây kết tủa
protein thƣờng từ 80% (v/v) trở lên. Sự kết tủa có thể chọn lọc một phần, nghĩa là các
protein khác nhau có thể kết tủa bằng các nồng độ khác nhau của dung môi. Dung mơi
hữu cơ sau đó có thể đƣợc loại bằng cách cho bay hơi trong chân khơng, hay thậm chí
trong khơng khí.
Để kết tủa enzyme từ dịch chiết thơ, ngƣời ta cũng có thể dùng một số muối
trung tính, thƣờng dùng nhất là ammonium sulfate, do muối này có mức độ hịa tan rất
cao trong nƣớc, ít làm mất hoạt tính enzyme, thậm chí cịn có tác dụng làm bền
enzyme. Một số ƣu điểm nữa của muối này là khả năng kết tủa chọn lọc protein, do đó
sẽ loại bỏ đƣợc nhiều protein không mong muốn trong dịch chiết. Lƣu ý khi sử dụng
muối ammonium sulfate là phải bổ sung vào dung dịch enzyme một cách từ từ, kết
hợp khuấy đều để tránh khả năng tăng quá nhanh cục bộ của nồng độ muối, làm mất đi
tính kết tủa chọn lọc của nó, thậm chí có thể làm biến tính một số enzyme kém bền.
Hạn chế của phƣơng pháp sử dụng muối ammonium sulfate chính là mất nhiều thời
gian, do nồng độ ammonium sulfate cao nên tỷ trọng của dung môi lớn, để kết tủa
đƣợc các protein cần phải ly tâm ở tốc độ cao và nhiệt độ thấp, sau đó cần loại muối
khỏi chế phẩm khi chuyển sang bƣớc tinh sạch tiếp theo.
- Để loại bỏ muối khoáng và các loại đƣờng…là các tạp chất có phân tử lƣợng
thấp, ngƣời ta thƣờng dùng phƣơng pháp thẩm tích (dialysis) đối nƣớc hay đối các
dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel sphadex.
Để loại bỏ các protein tạp (protein cấu trúc, protein trơ) và các chất có phân tử

lƣợng cao khác, ngƣời ta hay dùng kết hợp các phƣơng pháp khác nhau: phƣơng pháp
biến tính có chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trƣờng, phƣơng pháp
kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ, các phƣơng pháp
sắc ký (sắc ký hập phụ, sắc ký trao đổi ion), điện di, phƣơng pháp lọc gel.
- Mục đích yêu cầu: Các chế phẩm enzyme đƣợc sử dụng ở các dạng khác nhau
theo mức độ tinh khiết (hoạt độ riêng). Trong một số trƣờng hợp, canh trƣờng ni cấy
vi sinh vật có chứa enzyme đƣợc sử dụng trực tiếp dƣới dạng thô không cần tách tạp
chất nếu chúng không gây ảnh hƣởng đáng kể đến sản phẩm và quy trình cơng nghệ


6
sau này (ví dụ: sản xuất rƣợu, nƣớc chấm thực vật, da). Cũng có khi ngƣời ta cần sử
dụng chế phẩm enzyme tinh khiết trong công nghiệp dệt, công nghiệp mạch nha, y
học, nghiên cứu khoa học.
Enzyme nói chung rất dễ bị giảm hoạt tính dƣới tác dụng của các tác nhân bên
ngồi, do đó khi tách và tinh chế enzyme, để tránh sự biến tính protein ảnh hƣởng lớn
đén hoạt tính enzyme, cần tiến hành nhanh chóng ở nhiệt độ thấp, độ pH thích hợp,
khơng có mặt các chất gây biến tính enzyme [6].
1.1.5. Thủy phân protein bằng enzyme protease
Để thủy phân protein có thể dùng phƣơng pháp hóa học nhƣ dùng acid HCl
hoặc NaOH. Tuy nhiên, quá trình thủy phân bằng phƣơng pháp hóa học làm phá hủy
một phần hoặc phá hủy hoàn toàn các acid amin thiết yếu. Do vậy trong công nghiệp
thực phẩm thƣờng dùng phƣơng pháp thủy phân bằng enzyme. Việc sử dụng enzyme
có nhiều ƣu điểm nhƣ khơng có sản phẩm phụ do enzyme có tính đặc hiệu cao, thủy
phân trong điều kiện nhiệt độ thấp nên ít ảnh hƣởng đến chất lƣợng sản phẩm và tiêu
tốn năng lƣợng ít.
Q trình thủy phân là quá trình phân cắt một số liên kết nhị dƣơng (dispositive
bonds) trong hợp chất hữu cơ thành các thành phần đơn giản dƣới tác dụng của các
chất xúc tác và có sự tham gia của các yếu tố nƣớc trong phản ứng [22]. Dƣới sự xúc
tác của enzyme protease, quá trình thủy phân protein diễn ra nhƣ sau:

Protein → polypeptide → peptone → peptide → acid amin
Nhƣ vậy, sản phẩm thủy phân protein gồm các polypeptide, peptone, peptide và
acid amin. Tùy thuộc vào từng loại enzyme protease khác nhau cũng nhƣ chế độ thủy
phân khác nhau mà sản phẩm thủy phân thu đƣợc các thành phần có tỷ lệ cũng khác
nhau.
a) Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein bằng enzyme
Quá trình thủy phân chịu ảnh hƣởng của nhiều yếu tố: nhiệt độ, pH, nồng độ cơ
chất và enzyme, sự có mặt hay khơng có mặt của chất hoạt hóa và chất kìm hãm,
lƣợng nƣớc thêm vào.
- Ảnh hƣởng của nhiệt độ: Trong một phạm vi nhiệt độ nhất định, tốc độ của
phản ứng tăng lên cùng với sự tăng của nhiệt độ. Nhƣng khi vƣợt quá phạm vi nào đó,
các phản ứng đƣợc xúc tác bị ảnh hƣởng do sự biến tính của phân tử protein-enzyme.
Kết quả này phụ thuộc vào nhiệt độ tối thích của enzyme, là nhiệt độ mà tại đó tốc độ
phản ứng enzyme đạt cực đại. Mỗi enzyme có nhiệt độ tối thích khác nhau. Sự khác
nhau này tùy thuộc vào nguồn gốc của các enzyme, tùy theo từng điều kiện hoặc sự
nhạy cảm với nhiệt độ của phân tử protein-enzyme. Ở nhiệt độ thấp hơn 100C sẽ kìm
hãm sự hoạt động của enzyme nhƣng nếu thấp quá thì enzyme sẽ mất hoạt động. Nhiệt


7
độ từ 600C trở lên đa số enzyme sẽ giảm hoặc ngừng hoạt động. Đa số enzyme mất
hoạt tính xúc tác ở nhiệt độ cao hơn 800C, trừ Papain, Myokinase có thể tồn tại ở
1000C. Nhiệt độ thích hợp của enzyme thông thƣờng từ 30 – 500C. Trong vùng nhiệt
độ thích hợp nếu nhiệt độ tăng 100C thì tốc độ thủy phân tăng 1,5÷2 lần. Nhiệt độ
thích hợp của enzyme có thể thay đổi khi có sự thay đổi về pH, cơ chất [23].
- Ảnh hƣởng của pH: Sự phân li khác nhau của một phân tử protein ở các giá trị
pH khác nhau làm thay đổi tính chất của trung tâm liên kết cơ chất và hoạt động ở phân
tử enzyme, dẫn đến giá trị xúc tác khác nhau phụ thuộc vào giá trị pH. Nhƣ vậy enzyme
rất nhạy cảm với sự thay đổi pH của môi trƣờng. Mỗi enzyme chỉ hoạt động mạnh nhất
ở một vùng pH xác định, gọi là pH tối thích. pH tối thích của mỗi enzyme khơng cố

định, có thể thay đổi tùy theo tính chất và nồng độ của cơ chất, nhiệt độ. pH tối thích của
đa số enzyme nằm trong vùng acid yếu, kiềm yếu hay trung tính, chỉ có một số enzyme
hoạt động tối thích nằm trong vùng acid mạnh hay kiềm mạnh. Cùng một loại enzyme
nhƣng thu từ các nguồn khác nhau cũng có pH tối thích khác nhau [23].
- Ảnh hƣởng nồng độ cơ chất và nồng độ enzyme: Khi mơi trƣờng có đầy đủ cơ
chất thì tốc độ phản ứng tỷ lệ thuận với lƣợng enzyme. Khi nồng độ cơ chất thấp,
không đủ để lôi kéo tất cả lƣợng enzyme vào phản ứng thì tốc độ phản ứng tăng tỷ lệ
thuận với nồng độ cơ chất. Tốc độ phản ứng đạt tối đa khi tất cả enzyme đều kết hợp
vào cơ chất [23].
- Ảnh hƣởng của chất hoạt hóa và chất kìm hãm enzyme: Những chất nào có
khả năng làm tăng hoạt tính xúc tác của enzyme thì đƣợc gọi là chất hoạt hóa enzyme.
Các chất đó thƣờng là các ion kim loại nhƣ: K+, Na+, Mg2+, Ca2+, Co 2+, Zn2+, Mn2+, …
Sự hoạt động của các enzyme đều có thể bị kìm hãm bởi các tác động gây biến tính
protein [23].
Đối với muối ăn (NaCl) khi cho vào hỗn hợp thủy phân thì sẽ làm thay đổi hoạt
độ của nƣớc (aw), dẫn đến ảnh hƣởng hoạt động sống của vi sinh vật. Vì vậy trong thủy
phân ngƣời ta thƣờng dùng NaCl để khống chế hoạt động của vi sinh vật gây thối rữa.
Do khả năng chịu muối của enzyme thủy phân tốt hơn vi sinh vật cho nên trong phạm vi
độ mặn nhất định enzyme vẫn có tác dụng thủy phân protein, thậm chí trong mơi trƣờng
muối bão hòa enzyme vẫn hoạt động đƣợc nhƣng tác dụng thủy phân rất chậm [11].
- Ảnh hƣởng của tỷ lệ nƣớc: Đối với phản ứng thủy phân bởi enzyme, nƣớc
không những là môi trƣờng để khuếch tán enzyme và cơ chất mà còn là tác nhân tham
gia vào phản ứng. Nƣớc khơng những có ảnh hƣởng đến vận tốc mà cả chiều hƣớng
của phản ứng thủy phân bởi enzyme. Việc bổ sung thêm nƣớc là tạo môi trƣờng lỏng
giúp cho enzyme hoạt động đƣợc dễ dàng, làm tăng khả năng thủy phân. Nếu lƣợng
nƣớc cho vào quá ít, tác dụng thủy phân của enzyme kém, nếu lƣợng nƣớc bổ sung


8
thêm q nhiều khơng khống chế đƣợc q trình thối rữa. Nhƣ vậy có thể dùng nƣớc

làm nhân tố để tăng cƣờng hay kìm hãm các phản ứng thủy phân có xúc tác enzyme
[5]. Lƣợng nƣớc bổ sung vào cho quá trình thủy phân là tùy thuộc vào đặc điểm của
nguyên liệu.
- Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân: Thời gian thủy phân có ảnh hƣởng đến
hiệu quả của quá trình thủy phân, thời gian thuỷ phân càng dài thì protease càng có
điều kiện thuỷ phân cơ chất càng triệt để. Nhƣng nếu thời gian thủy phân quá dài sẽ
dẫn tới vi sinh vật hoạt động làm sản sinh ra càng nhiều các sản phẩm thứ cấp nhƣ:
NH3, H2S, CO2, indol, … Nếu thời gian thủy phân rút ngắn, quá trình thuỷ phân
protein chƣa triệt để, hiệu suất thủy phân kém, gây lãng phí ngun liệu. Trong q
trình thủy phân, tốc độ của quá trình xảy ra mạnh mẽ trong thời gian đầu, càng về sau
do nồng độ cơ chất giảm trong khi nồng độ sản phẩm tạo thành tăng, đồng thời do độ
bền của enzyme giảm theo thời gian nên tốc độ của phản ứng thủy phân giảm dần [23].
- Ảnh hƣởng của diện tích tiếp xúc: Trong quá trình thủy phân yếu tố quan
trọng thúc đẩy quá trình thủy phân là diện tích tiếp xúc. Để tạo điều kiện cho quá trình
thủy phân diễn ra tốt hơn bằng cách làm tăng khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ
chất, muốn vậy phải làm nhỏ kích thƣớc cơ chất trƣớc khi thủy phân [23].
1.1.6. Ứng dụng của protease
1.1.6.1. Trong công nghiệp thực phẩm
Protease đƣợc ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp thực phẩm khác nhau
để tạo nên sự thay đổi về mùi vị, kết cấu và hình dạng của sản phẩm [14], ví dụ nhƣ
sản xuất phomát, sản xuất bia, làm bánh nƣớng, chế biến cá, sản xuất và làm mềm thịt.
- Chế biến phomat
Với mức độ tăng trƣởng nhanh của ngành công nghiệp sản xuất phomát, lƣợng
rennin thu nhận từ dạ dày bê và các protease từ các chủng vi sinh vật nhƣ Mucor miehi,
B. subtilis và Endothia parasitica đƣợc đƣa vào sản xuất, tuy nhiên vẫn không đáp ứng
đủ nhu cầu sử dụng. Do đó, cơng nghiệp sản xuất rennin đã thu hút sự chú ý của công
nghệ gen để tạo ra nguồn enzyme thay thế. Gen mã hóa prochymosin (chymosin B) đã
đƣợc chuyển vào một số cơ thể vật chủ là vi sinh vật nhƣ E. coli, Saccharomyces
cerevisiae, Aspergillus niger, Trichoderma reesei… Hiện nay, có nhiều loại chymosin
tái tổ hợp đã đƣợc sản xuất ở qui mô thƣơng mại bao gồm Maxiren (Hãng Gist

Brocades, Hà Lan sử dụng A. niger làm vật chủ) và Chymax (Pfizer, Mỹ sử dụng E.
coli làm vật chủ) [16]. Vai trò chủ yếu của các enzyme này trong sản xuất phomát là
thủy phân liên kết peptide đặc hiệu (Phe 105-Met 106) tạo ra para-k-casein và các
macropeptide, dẫn đến đông tụ sữa [25].
- Sản xuất bia


9
Bia là sản phẩm lên men từ lúa mạch với hàm lƣợng tinh bột và protein cao.
Trong quá trình đƣờng hóa, ngồi tác dụng của amylase chuyển hóa tinh bột thành
đƣờng, tham gia vào q trình lên men cịn có sự hiện diện của protease thủy phân
protein đại mạch thành dạng hòa tan ổn định vào dịch đƣờng và bia nhằm nâng cao giá
trị sinh học của bia thành phẩm. Vì vậy, ngƣời ta thƣờng sử dụng phối hợp các chế
phẩm enzyme từ vi sinh vật nhƣ: α-amylase, protease, enzyme chuyển hóa diacetyl
thành acetoin… [3].
- Chế biến thịt
Protease đƣợc dùng làm mềm thịt và tăng hƣơng vị thịt nhờ khả năng thủy phân
một phần protein trong thịt của protease, kết quả làm cho thịt có độ mềm thích hợp và
có vị tốt hơn, Ứng dụng phổ biến và thuận lợi nhất của protease trong công nghệ chế
biến thịt là dùng protease để ngâm thịt ở pH và nhiệt độ xác định-hay sản xuất các hỗn
hợp tẩm làm mềm thịt (enzyme, muối, bột ngọt)
Sản xuất dịch đạm: Keratin-thành phần protein trong da, lông vũ đƣợc dùng để
sản xuất dịch đạm nhờ chế phẩm keratinease thu nhận đƣợc từ q trình ni cấy
Streptomyces fradiae - Nếu dùng axit để thuỷ phân sẽ làm mất đi hoàn toàn các axit
amin chứa lƣu huỳnh, nếu dùng kiềm sẽ làm giảm giá trị sinh học của các axit amin do
q trình raxemic hố gây ra (chuyển axit amin từ dạng L sang dạng D). Ƣu điểm của
việc thuỷ phân protease bởi enzyme protease là bảo tồn đƣợc vitamin của ngun
liệu, khơng tạo ra các sản phẩm phụ, không làm sẫm màu dịch thuỷ phân. Trong nghên
cứu, chế tạo dịch truyền đạm y tế, để thuỷ phân sâu sắc và triệt để protein cần dùng các
protease có tính đặc hiệu cao và phổ tác dụng rộng. Do vậy, ngƣời ta thƣờng dùng phối

hợp cả 3 loại protease của 3 loài vi khuẩn, nấm mốc, thực vật với tỷ lệ tổng cộng 12% khối lƣợng protein cần thuỷ phân. [12].
- Sản xuất các sản phẩm đậu
Giá trị dinh dƣỡng của bột đậu nành thƣờng bị hạn chế do các yếu tố phản dinh
dƣỡng nhƣ chất ức chế trypsin và lectin, các chất này có tác dụng ngăn cản sự tiêu hóa
protein [56]. Do đó, khi bổ sung protease từ B. subtilis đã làm tăng hàm lƣợng chất hòa
tan và giảm mức độ ức chế trysin trong bột đậu nành. Marsman và cộng sự (1997) nhận
thấy rằng enzyme neutrase có thể thủy phân đƣợc β-conglycinin [3].
- Chế biến nước mắm
Khi sản xuất nƣớc mắm (và một số loại mắm) để thu đƣợc độ đạm cao, quá
trình thủy phân thƣờng chiếm nhiều thời gian do phƣơng pháp gài nén và nguyên liệu
cá của từng vùng miền. Hiện nay, bằng việc sử dụng chế phẩm enzyme thực vật
(bromelain và papain) và vi sinh vật, quy trình sản xuất nƣớc mắm đƣợc cải thiện đáng
kể về mặt thời gian và hƣơng vị. Tuy nhiên vẫn còn một số tồn tại cần phải hoàn thiện


10
thêm về công nghệ [14].
1.1.6.2. Trong công nghiệp sản xuất các chất tẩy rửa
Các enzyme dùng trong công nghiệp tẩy rửa chiếm khoảng 40% thị trƣờng
enzyme công nghiệp trên thế giới, trong đó protease chiếm khoảng 25%. Nhiều
protease kiềm thích hợp với sản xuất bột giặt đã đƣợc tìm thấy nhƣ subtilisin
(E.C.3.4.21.14) ở các chủng Bacillus đƣợc sử dụng những năm 1960, acalase và
savinase (Novozymes), maxacal và purafect (Genencor), KAP (Kao) và blap (Henkel).
Hiện nay, tất cả protease dùng để sản xuất bột giặt đƣợc sử dụng trên thị trƣờng là
serine protease của các chủng Bacillus [25].
1.1.6.3. Trong công nghiệp thuộc da
Các phƣơng pháp thuộc da thƣờng dùng các hóa chất độc hại nhƣ sodium
sulfide, làm ảnh hƣởng nghiêm trọng đến môi trƣờng. Việc sử dụng enzyme để thay
thế các hóa chất đã rất thành cơng trong việc nâng cao chất lƣợng da và làm giảm ô
nhiễm môi trƣờng. Protease đƣợc sử dụng để thủy phân một số thành phần phi

collagen của da và loại bỏ các protein phi fibrin nhƣ albumin, globulin trong quá trình
thuộc da [28]. Trƣớc đây, để làm mềm da ngƣời ta thƣờng dùng protease có trong cơ
quan tiêu hóa của động vật. Hiện nay, việc đƣa các protease của vi khuẩn (B.
mesentericus, B. subtilis), nấm mốc (A. oryzae, A. flavus) và xạ khuẩn (Streptomyces
griceus, S. rimosus) vào công nghiệp thuộc da đã đem lại nhiều kết quả và dần dần
chiếm một vị trí quan trọng [12].
1.1.6.4. Trong y học
Protease đƣợc sử dụng làm thuốc chống tắc nghẽn mạch máu, tiêu mủ vết
thƣơng, làm thông đƣờng hơ hấp, chống viêm làm tăng tiêu hóa protein, là thành phần
của các loại thuốc dùng điều trị các bệnh da liễu và mỹ phẩm, ngồi ra protein cịn
đƣợc dùng để sản xuất môi trƣờng để nuôi cấy vi sinh vật sản xuất ra kháng sinh, chất
kháng độc… và cô đặc tinh chế thành các huyết thanh kháng độc để chữa bệnh [2].
1.1.6.5. Trong xử lý ô nhiễm môi trường
Chất thải từ các khu công nghiệp và chất thải sinh hoạt là ngun nhân chính
góp phần gây ơ nhiễm mơi trƣờng nghiêm trọng. Trong thành phần của các chất thải
này chứa một lƣợng lớn protein là nguyên nhân gây ra các hiện tƣợng phú dƣỡng, ảnh
hƣởng đến các loài động thực vật sống ở các sông hồ mà chất thải này đổ vào. Sử dụng
biện pháp sinh học sẽ không gây tái ô nhiễm môi trƣờng, và giúp phân hủy những loại
chất thải có hại thành vơ hại.
1.1.6.6. Trong cơng nghiệp dệt
Protease vi sinh vật đƣợc sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo (các sợi
nhân tạo đƣợc làm bằng các dung dịch cazein, gelatin) để sợi đƣợc bóng, dễ nhuộm.


11
Protease có tác dụng thủy phân lớp protein serisin đã làm dính bết các sợi tơ tự nhiên,
làm bong và tách rời các loại tơ tằm, do đó làm giảm lƣợng hoá chất để tẩy trắng [12].
1.2. Tổng quan về cá ngừ
1.2.1. Giới thi u về cá ngừ
Cá ngừ thuộc họ cá thu ngừ (Scombridae) có giá trị kinh tế quan trọng nhất ở biển

Việt Nam. Cá ngừ phân bố ở khắp các vùng biển Việt Nam, kích thƣớc cá tƣơng đối lớn
(6 lồi có kích thƣớc từ 20 - 70 cm, khối lƣợng từ 0,5 - 4 kg. Riêng hai loài cá ngừ vây
vàng và cá ngừ mắt to có kích thƣớc lớn 70 - 200 cm, khối lƣợng 1,6 - 64 kg) [17].
Cá ngừ (tuna) là nguồn lợi hải sản có giá trị dinh dƣỡng, giá trị sinh học và giá
trị kinh tế cao. Theo Báo cáo xuất khẩu thủy sản Việt nam Quý II, năm 2011, Việt
Nam xuất khẩu gần 31 nghìn tấn cá ngừ, trị giá 148 triệu USD, tăng gần 16% về khối
lƣợng và 36,5% về giá trị so với cùng kỳ năm ngoái. Hiện nay, có 87 doanh nghiệp
tham gia xuất khẩu cá ngừ sang 73 thị trƣờng thế giới [1]. Tuy nhiên, ở thị trƣờng
Châu Âu chủ yếu ƣa chuộng cá thịt trắng (cá tra), trong khi cá thịt đỏ nhƣ cá ngừ chỉ
chiếm số lƣợng ít [1]. Vì vậy, cá ngừ cần đƣợc qua công đoạn chế biến thành các
thành phẩm khác phục vụ cho nhu cầu của con ngƣời.

Hình 1.2. Một số loại cá ngừ
Trong công nghiệp chế biến cá ngừ, thành phần khối lƣợng của thịt cá ngừ
chiếm khoảng 60%, phần còn lại là phế phẩm loại ra trong quá trình chế biến, gồm:
đầu, xƣơng, vây, thịt vụn… Phần khối lƣợng thịt đƣợc chế biến bao gồm cả phần thịt
trắng và thịt đỏ, tuy nhiên, ngƣời ta chủ yếu sử dụng phần thịt trắng hay sáng màu để