Nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ vào phôi hợp tử chưa trưởng thành của cây ngô thông qua vi khuẩn agrobacterium

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

PHẠM THỊ HƢƠNG

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN KHÁNG THUỐC TRỪ CỎ VÀO
PHÔI HỢP TỬ CHƢA TRƢỞNG THÀNH CỦA CÂY NGÔ
THÔNG QUA VI KHUẨN AGROBACTERIUM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2014


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

PHẠM THỊ HƢƠNG

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN KHÁNG THUỐC TRỪ CỎ VÀO
PHÔI HỢP TỬ CHƢA TRƢỞNG THÀNH CỦA CÂY NGÔ
THÔNG QUA VI KHUẨN AGROBACTERIUM

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 420 114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. PHẠM THỊ LÝ THU

Hà Nội – 2014


i

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này trước tiên tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành
và sâu sắc nhất tới TS. Phạm Thị Lý Thu đã tận tâm, nhiệt tình chỉ bảo, hướng dẫn
tơi trong suốt q trình học tập và thực hiện luận văn thạc sĩ này.
Tơi cũng xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới các thầy cơ giáo phịng Sau
Đại học, thầy cơ giáo khoa Sinh học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại
học Quốc Gia Hà Nội quan tâm và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời
gian hồn thành khóa học cũng như khi hồn thành luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn các cơ chú, anh chị em đồng nghiệp Phịng Thí
nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật – Viện Di truyền Nơng nghiệp đã
quan tâm, giúp đỡ nhiệt tình trong suốt thời gian tôi thực hiện luận văn.
Cuối cùng cho phép tơi được gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và tất cả
những người thân yêu đã luôn động viên, khích lệ, giúp đỡ tơi trong q trình học
tập và nghiên cứu.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành đối với những giúp đỡ quý báu đó.
Hà Nội, tháng 9 năm 2014
Học viên

Phạm Thị Hương


ii

MỤC LỤC

Lời cảm ơn .............................................................................................................................................. i
Danh mục bảng .................................................................................................................................... . iv
Danh mục hình ..................................................................................................................................... .. v
Ký hiệu viết tắt ..................................................................................................................................... . vi
MỞ ĐẦU ................................................................................................................................................. 1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................................. 3
1.1. Nguồn gốc, phân loại và vai trò của cây ngô......................................................................... .. 3
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây ngơ ................................................................................... .. 3
1.1.2. Vai trị của cây ngơ........................................................................................................... .. 4
1.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu quả chuyển gen vào cây một lá mầm nhờ vi khuẩn
Agrobacterium ................................................................................................................................. .. 6
1.2.1. Ảnh hưởng của kiểu gen .................................................................................................. .. 6
1.2.2. Dạng mẫu mơ đích .......................................................................................................... .. 7
1.2.3. Chủng Agrobacterium và plasmid ............................................................................ .. 8
1.2.4. Các điều kiện xử lý mẫu mơ đích, lây nhiễm và đồng ni cấy ........................... .. 8
1.3. Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào cây ngơ..................................................................... 10
1.4. Nghiên cứu tạo cây trồng biến đổi gen kháng thuốc trừ cỏ ................................................. 13
1.4.1. Thuốc trừ cỏ Glyphosate.................................................................................................. 13
1.4.2. Thuốc diệt cỏ gluphosinate .............................................................................................. 15
1.4.3. Các gen sử dụng trong tạo giống cây trồng biến đổi gen chống chịu thuốc trừ cỏ... 16
1.4.4. Giống cây trồng biến đổi gen kháng thuốc trừ cỏ - Thành tựu và triển vọng ............ 18
CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................. 20
2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị .................................................................................................... 20
2.1.1. Vật liệu ............................................................................................................................... 20
2.1.2. Hoá chất và thiết bị máy móc .......................................................................................... 21
2.1.3. Địa điểm thực hiện ........................................................................................................... 21
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ......................................................................................................... 21
2.2.1. Phương pháp biến nạp gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens.................................. 21
2.2.2. Chọn lọc nồng độ glyphosate để chọn lọc cây ngô chuyển gen trong điều kiện
nhà lưới ........................................................................................................................................ 23

2.2.3. Thử khả năng kháng thuốc trừ cỏ của các cây chuyển gen trong điều kiện nhà
lưới

........................................................................................................................................ 24


iii
2.2.4. Thí nghiệm nảy mầm của hạt ngơ thế hệ T0 .................................................................. 24
2.2.5. Phương pháp phân tích sinh học phân tử cây chuyển gen........................................... 24
2.2.6. Phương pháp thu thập số liệu thống kê .......................................................................... 27
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................................. 28
3.1. Nghiên cứu đánh giá khả năng tiếp nhận gen CP4 EPSPS của các dịng ngơ ................... 28
3.2. Chọn lọc nồng độ glyphosate để chọn lọc cây ngô chuyển gen trong điều kiện nhà lƣới .33
3.3. Kết quả phân tích PCR sự có mặt của gen kháng thuốc trừ cỏ EPSPS của các dịng ngơ
chuyển gen thế hệ T0....................................................................................................................... 34
3.4. Kết quả phân tích Southern blot các dịng ngô chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ ................ 39
3.5. Đánh giá sự có mặt của protein EPSPS trong các dịng ngô chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ .... 41
3.6. Kết quả đánh giá khả năng kháng thuốc trừ cỏ glyphosate của các dịng ngơ chuyển gen
EPSPS trong điều kiện nhà lƣới ..................................................................................................... 43
3.7. Đánh giá sự phân ly của gen EPSPS trong các dịng ngơ chuyển gen kháng cỏ thế hệ T1 . 45
CHƢƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................. 48
4.1 Kết luận ...................................................................................................................................... 48
4.2 Kiến nghị .................................................................................................................................... 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................................... 49

PHỤ LỤC


iv

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Công thức môi trƣờng ......................................................................................... 23
Bảng 2.2. Trình tự các đoạn mồi sử dụng trong phản ứng PCR .......................................... 26
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR gen EPSPS .............................................................. 26
Bảng 3.1. Kết quả biến nạp gen EPSPS vào các dịng ngơ vụ Đơng Xn ......................... 29
Bảng 3.2. Kết quả biến nạp gen EPSPS vào các dòng ngô vụ Hè Thu ............................... 30
Bảng 3.3. Khảo sát nồng độ glyphosate đối với các cây chuyển gen .................................. 33
Bảng 3.4. Hàm lƣợng ADN của các cây chuyển gen .......................................................... 35
Bảng 3.5. Kết quả phân tích PCR gen kháng thuốc trừ cỏ EPSPS trong các dịng ngơ
chuyển gen ........................................................................................................................... 36
Bảng 3.6. Hiệu quả chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens .............. 39
Bảng 3.7. Kết quả xác định protein EPSPS trong các dịng ngơ chuyển gen kháng thuốc trừ
cỏ .......................................................................................................................................... 42
Bảng 3.8. Đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ của các dòng chuyển gen ..................... 44
Bảng 3.9. Kết quả nảy mầm của hạt chuyển gen thế hệ T0 ................................................. 45


v

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cây ngơ ...................................................................................................... 3
Hình 2.1. Các dịng ngơ trồng làm vật liệu chuyển gen trong nhà lƣới cách ly
cơn trùng ...................................................................................................... 20
Hình 2.2. Cấu trúc vector chuyển gen mang gen EPSPS ......................................... 20
Hình 2.3. Tách phơi từ bắp ngơ dịng CM8 (Vụ Hè Thu, 8 ngày sau thụ phấn) ..... 22
Hình 3.1. Kết quả biến nạp gen EPSPS vào 3 dịng ngơ vụ Đơng Xn ................. 30
Hình 3.2. Kết quả biến nạp gen EPSPS vào 3 dịng ngơ vụ Hè Thu ....................... 31
Hình 3.3. Các giai đoạn của q trình chuyển gen EPSPS vào dịng ngơ VH1,
CM8, CH9 .................................................................................................... 32
Hình 3.4. Khảo sát nồng độ glyphosate xử lí trên bề mặt lá ngơ chuyển gen và mẫu

đối chứng (lá cây ngơ khơng chuyển gen) ............................................................... 34
Hình 3.5. Kết quả điện di kiểm tra mẫu DNA tổng số trên gel agarose 0,8% ......... 35
Hình 3.6. Kết quả phân tích PCR gen EPSPS ở các cây T0 của dịng CM8 ........... 37
Hình 3.7. Kết quả phân tích PCR gen EPSPS ở các cây T0 của dòng CH9 ............ 37
Hình 3.8. Kết quả phân tích PCR gen EPSPS các cây T0 dịng VH1 .............................. 39

Hình 3.9. DNA tổng số của các dịng ngơ chuyển gen đƣợc cắt bằng enzyme
BamHI .......................................................................................................... 40
Hình 3.10. Kết quả phân tích Southern blot các dịng ngơ chuyển gen kháng thuốc
trừ cỏ EPSPS ............................................................................................................ 41
Hình 3.11. Kết quả đánh giá sự hiện diện của protein EPSPS trong các dịng ngơ
chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ ................................................................................ 43
Hình 3.13. Kết quả đánh giá khả năng nảy mầm hạt của các dịng ngơ chuyển gen
thế hệ T1 trên mơi trƣờng chọn lọc. ......................................................................... 46
Hình 3.14. Cây chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ thế hệ T1 dòng CH9 sau 3 lần phun
Vifosate .................................................................................................................... 47


vi

KÝ HIỆU VIẾT TẮT
2,4D

Dichlorophenoxy acetic acid

ADN

Deoxyribonucleic Acid

AS

Acetosyringone

bp

Base pair

CTAB

Cetyltrimethylammonium Bromide

CIMMYT

International maize and wheat improvement center

EPSPS

5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetace Axit

FAO

Food and Agriculture Organization

nptII

neomycin phosphotransferase

OD

optical density

PCR

Polymerase Chain Reaction

Pat/bar

phosphinotricin acetyltransfer

T-AND

Transfer-DNA


1

MỞ ĐẦU
Ngô là một trong ba cây lƣơng thực quan trọng nhất trên thế giới (cùng với lúa
mì và gạo) và là cây lƣơng thực có vai trị kinh tế quan trọng bậc nhất. Tính đến năm
2013 diện tích trồng ngô thế giới vào khoảng 177 triệu ha [65]. Theo dự đốn vào năm
2020, nhu cầu ngơ sẽ tăng lên 50% với hơn 852 triệu tấn một năm và có thể vƣợt qua
cả gạo và lúa mì [35]
Hiện nay ngành sản xuất ngơ thế giới nói chung và nƣớc ta nói riêng đang phải
đối mặt với rất nhiều vấn đề nhƣ: khí hậu biến đổi phức tạp, hạn hán, lũ lụt ngày càng
nặng nề hơn, đặc biệt cỏ dại cũng là một vấn đề lớn trong nông nghiệp đã làm giảm
năng suất cây trồng từ 10 – 15%. Do đó, hàng loạt các biện pháp phòng trừ cỏ dại đã

đƣợc áp dụng nhƣ: sử dụng các loại thuốc diệt cỏ chọn lọc hoặc không chọn lọc. Đặc
biệt ở những vùng có hiện tƣợng xói mịn đất, thuốc diệt cỏ đƣợc sử dụng nhƣ một giải
pháp duy nhất để loại trừ cỏ dại. Tuy nhiên, việc lạm dụng một số thuốc diệt cỏ có độc
tính cao đã và đang gây ra các hậu quả nghiêm trọng đối với môi trƣờng, hệ sinh thái
và sức khỏe con ngƣời. Điều này đặt ra nhiệm vụ to lớn cho các nhà chọn giống, các
nhà nghiên cứu công nghệ sinh học chọn tạo ra các giống ngơ mới có năng suất cao,
chống chịu thuốc diệt cỏ.
Các giống cây trồng biến đổi gen mang các đặc tính khác nhau đã đƣợc nghiên
cứu và áp dụng vào thực tiễn nhằm nâng cao năng suất cây trồng, tăng thu nhập cho
ngƣời lao động. Hàng năm, số lƣợng nông dân và các quốc gia trồng cây trồng biến đổi
gen liên tục gia tăng. Cây ngô chuyển gen đầu tiên đƣợc thƣơng mại hóa vào năm
1996, đến năm 2013 diện tích trồng ngơ biến đổi gen đạt 57,4 triệu ha tại 17 nƣớc,
trong đó có 5 nƣớc trồng hơn 1 triệu ha bao gồm: Hoa Kỳ (35,6 triệu ha), Brazil
(12,9 triệu ha), Argentina (3,2 triệu ha), Nam Phi (2,4 triệu ha) và Canada (1,7 triệu
ha). Ngô chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ luôn là giống cây trồng ƣu thế, chiếm 7,8
triệu ha tƣơng đƣơng với 5% diện tích cây trồng chuyển gen toàn cầu và đƣợc trồng
tại 9 nƣớc [37]
Ở Việt Nam, trong thời gian gần đây, các nghiên cứu chuyển gen vào các loài
cây trồng đã đƣợc quan tâm, chú ý nhiều hơn, tuy nhiên với đối tƣợng cây ngơ, có


2

thể nói đây là lồi cây trồng tƣơng đối khó tính trong q trình ni cấy invitro
cũng nhƣ chuyển nạp gen, hiệu quả biến nạp gen còn rất thấp. Mặt khác, việc tạo ra
cây trồng chuyển gen có khả năng áp dụng vào sản xuất từ những nghiên cứu trong
nƣớc đang là đòi hỏi cấp thiết đối với lĩnh vực nghiên cứu công nghệ sinh học và
ngành nông nghiệp của Việt Nam. Các giống cây trồng biến đổi gen kháng thuốc
trừ cỏ đã mang lại hiệu quả kinh tế cao, góp phần làm giảm ơ nhiễm mơi trƣờng và
chi phí lao động của nông dân

Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn và dựa trên các cơ sở lý luận khoa học nêu trên
chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ vào phôi
hợp tử chưa trưởng thành của cây ngô thông qua vi khuẩn Agrobacterium”
Mục tiêu nghiên cứu
Đánh giá khả năng tiếp nhận gen kháng thuốc trừ cỏ của một số dịng ngơ
Việt Nam
Nơi dung nghiên cứu
1. Nghiên cứu đánh giá khả năng tiếp nhận gen EPSPS vào các dịng ngơ Việt Nam
2. Phân tích sinh học phân tử PCR sự có mặt của gen kháng thuốc trừ cỏ
EPSPS của các dịng ngơ chuyển gen thế hệ T0 và thế hệ T1
3. Phân tích Southern blot sự có mặt của gen kháng thuốc trừ cỏ
4. Đánh giá sự có mặt của protein EPSPS trong các dịng ngơ chuyển gen kháng cỏ
5. Đánh giá khả năng kháng thuốc trừ cỏ glyphosate của các dịng ngơ chuyển
gen EPSPS trong điều kiện nhà lƣới


3

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Nguồn gốc, phân loại và vai trị của cây ngơ

1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây ngô
Phân loại khoa học
Ngô (Zea mays. L) thuộc:
Chi :

Maydeae

Họ:

Poaceae (hịa thảo)

Bộ:

Poales (Hịa thảo)

Lớp:

Monocotyledons (Một lá mầm)

Ngành: Angiospermatophyta (Hạt kín)
Lồi: Zea mays. L

Hình 1.1. Cây ngơ
(Nguồn: www.nongnghiep.vn)

Ngơ, trong tiếng Anh “maize” xuất phát từ tiếng Tây Ban Nha (maíz) là thuật
ngữ trong tiếng Taino để chỉ loài cây này, là từ thông dụng Vƣơng quốc Anh để chỉ
cây ngô. Tại Hoa Kỳ, Canada và Australia, thuật ngữ hay đƣợc sử dụng là corn, là
từ trƣớc đây dùng để gọi cho một loại cây lƣơng thực, hiện nay thuật ngữ này dùng
để chỉ cây ngô, là dạng rút gọn của "Indian corn" là “cây lƣơng thực của ngƣời Anh
điêng”. Lịch sử nghiên cứu thuộc các lĩnh vực khảo cổ, di truyền học, thực vật học,
dân tộc học và địa lý học…quan tâm và đƣa ra nhiều giả thuyết. Có giả thuyết cho
là nguồn gốc cây ngô khoảng năm 5.500 tới 10.000 trƣớc công nguyên (TCN).
Những nghiên cứu về di truyền học gần đây cho rằng q trình thuần hóa ngơ diễn
ra vào khoảng năm 7000 TCN tại miền trung Mexico và tổ tiên của nó là loại cỏ
teosinte hoang dại gần giống nhất với ngơ ngày nay vẫn cịn mọc trong lƣu vực
sông Balsas. Liên quan đến khảo cổ học, ngƣời ta cũng đã phát hiện các bắp ngơ có

sớm nhất tại hang Guila Naquitz trong thung lũng Oaxaca, có niên đại vào khoảng
năm 4.250 TCN, các bắp ngô cổ nhất trong các hang động gần Tehuacan, Puebla, có
niên đại vào khoảng 2750 TCN. Một số giả thuyết cho rằng, có lẽ sớm nhất khoảng
năm 1500 TCN, ngô bắt đầu phổ biến rộng và nhanh, ngơ là lƣơng thực chính của
phần lớn các nền văn hóa tiền Columbus tại Bắc Mỹ, Trung Mỹ, Nam Mỹ và khu


4

vực Caribe. Với ngƣời dân bản xứ tại đây, ngô đƣợc suy tơn nhƣ bậc thần thánh và
có tầm quan trọng về mặt tôn giáo do ảnh hƣởng lớn của nó đối với đời sống của họ
Hiện trên thế giới đang tồn tại hai hệ thống phân loại đối với Zea: Wilkes
(1967) [63] và Doebly (1980) [23] . Theo hệ thống phân loại của Wilkes ngơ là
Zea mays, cịn theo hệ thống phân loại mới là Zea mays mays. Từ loài Zea mays
L. dựa vào cấu trúc nội nhũ của hạt đƣợc phân thành các loại phụ. Những lồi
phụ chính bao gồm:
Zea mays subsp. Indurata Sturt – Ngô đá
Zea mays subsp. Indentata Sturt – Ngô răng ngựa
Zea mays subsp. Ceratina Kulesh – Ngô nếp
Zea mays subsp. Saccharata Sturt – Ngô đƣờng
Zea mays subsp. Everta Sturt – Ngô nổ
Zea mays subsp. Amylacea Sturt – Ngô bột
Zea mays subsp. Tunecata Sturt – Ngơ bọc
1.1.2. Vai trị của cây ngơ
Cây ngơ là cây lƣơng thực quan trọng đứng thứ ba trên thế giới (sau lúa mỳ và lúa
gạo) và đứng thứ hai ở Việt Nam (sau lúa). Ngô đƣợc trồng rộng rãi trên toàn thế giới,
với tổng sản lƣợng hàng năm lớn hơn bất kỳ loại ngũ cốc nào khác. Hoa Kỳ sản xuất
khoảng 40% tổng sản lƣợng ngô trên thế giới, sau Hoa Kỳ là các nƣớc Trung Quốc,
Brazil, Mexico, Indonesia, Ấn Độ, Pháp và Argentina. Chỉ tính riêng trong năm 2013,
tổng diện tích trồng ngơ tồn cầu là hơn 177 triệu ha, đạt sản lƣợng 963 triệu tấn, nhiều

hơn gạo (745 triệu tấn) hoặc lúa mì (708,5 triệu tấn) [65]. Ngơ là loại cây lƣơng thực
nuôi sống gần 1/3 số dân trên toàn thế giới. Bên cạnh giá trị lƣơng thực, cây ngơ cịn là
cây thức ăn gia súc quan trọng, 70% chất tinh trong thức ăn hỗn hợp là từ ngơ. Cây ngơ
cịn là thức ăn xanh và ủ chua rất tốt cho chăn nuôi gia súc lớn, đặc biệt là bị sữa. Những
năm gần đây, cây ngơ cịn là loại cây thực phẩm đƣợc ƣa chuộng. Ngƣời ta dùng bắp ngô
bao tử để làm rau cao cấp. Đây là loại rau có hàm lƣợng chất dinh dƣỡng cao và khơng
có dƣ lƣợng các chất bảo vệ thực vật. Các loại ngô nếp, ngô đƣờng đƣợc dùng để luộc,
nƣớng hoặc đóng hộp làm đồ hộp. Ngơ có một số vai trị chính:


5

- Là nguồn có giá trị dinh dƣỡng: Ngơ có chứa các chất nhƣ protein (10,6%),
lipid (4-5%), glucid (69%), ngoài ra hàm lƣợng vitamin trong ngô cũng khá cao, tập
chung chủ yếu ở lớp ngồi hạt ngơ và ở mầm
- Làm lƣơng thực, thực phẩm cho con ngƣời
Cây ngô là một trong ba cây trồng quan trọng nhất đƣợc sử dụng làm thức ăn
cho ngƣời và gia súc. Toàn thế giới sử dụng 17% sản lƣợng ngô làm lƣơng thực cho
ngƣời trong đó ở các nƣớc đang phát triển là 30%, các nƣớc phát triển khoảng 40%.
Các nƣớc ở Trung Mỹ, Nam Á và Châu Phi sử dụng ngô làm lƣơng thực chính. Khẩu
phần ăn ở các nƣớc châu Mỹ La Tinh là bánh ngô, đậu đỗ và ớt giống nhƣ các nƣớc
châu Á sử dụng cơm (gạo), cá, rau xanh và các nƣớc châu Âu sử dụng bánh mỳ, khoai
tây, sữa.
Tại Mỹ, hơn 90% sản lƣợng ngô đƣợc sử dụng làm thức ăn chăn nuôi và
10% làm thức ăn cho ngƣời thông qua các sản phẩm chế biến công nghiệp. Ở châu
Phi và một số nƣớc châu á, hơn 90% sản lƣợng ngô đƣợc sử dụng làm lƣơng thực
cho con ngƣời, cung cấp 80-90% năng lƣợng [16]
- Ngô làm thức ăn chăn nuôi
Theo số liệu thống kê của CIMMYT, giai đoạn 1997 – 1999, thế giới dùng
ngô làm thức ăn chăn nuôi là 66% - khoảng 400 triệu tấn/năm. Các nƣớc phát triển

có tỷ lệ dùng ngơ làm thức ăn chăn nuôi cao, thƣờng trên 70%
Hiện nay, Việt Nam cũng dùng ngơ làm thức ăn chăn ni là chính (khoảng
90%) song tỷ lệ ngô trong tổng số chất tinh chỉ khoảng 50%, vì ta cịn dùng thêm
gạo gẫy, cám, bột sắn....
Từ ngơ hạt có thể xay vỡ ni gia cầm (gà, vịt, ngan, ngỗng…), nghiền thành
bột và chế biến làm thức ăn cho trâu bò, lợn và gia cầm, chế biến thức ăn cho cá. Thân
lá ngơ có thể cho trâu bò ăn tƣơi, sau khi thu hoạch (nhất là ngô thu bắp non) băm nhỏ
ủ chua làm thức ăn cho gia súc. Chế biến thức ăn chăn nuôi từ ngơ: Ngơ nghiền thành
bột và có thể trộn theo thành phần và tỷ lệ khác nhau với bột sắn (khoai mỳ), cám gạo,
khô dầu lạc, khô dầu đậu tƣơng, bột cá, vỏ tơm, vỏ sị …để chế biến làm các loại thức
ăn cho gia súc, gia cầm và thủy sản


6

Giá trị dinh dƣỡng của thân, lá ngô khá lớn, phụ thuộc vào giống ngô và thời
vụ thu hoạch. Trong 1 kg thân cây ngơ có 600 - 700 g chất khô, 60-70 g protein,
280-300 g xơ. Do vậy, thân, lá ngô là nguồn thức ăn thô quan trọng cho trâu bò ở
nhiều vùng. Giá trị dinh dƣỡng thân, lá ngơ cịn tăng lên nếu đƣợc chế biến theo
cách lên men ủ chua.
- Làm nguyên liệu cho một số ngành công nghiệp
Ngô đƣợc sử dụng làm nguyên liệu cho một số ngành công nghiệp: sản
xuất thức ăn gia súc, sản xuất rƣợu cồn, tinh bột dầu, glucose, bánh kẹo..... trong
thành phần khối lƣợng của hạt ngô, tinh bột chiếm tỷ lệ 65-83% là nguồn nguyên
liệu quan trọng trong công nghiệp gia công tinh bột. Nguồn tinh bột này đƣợc sử
dụng phổ biến trong công nghiệp chế biến các loại đƣờng: sản xuất glucose dùng
trong sản xuất bánh kẹo, công nghiệp keo dán, sản xuất xăng sinh học, chế biến
đồ giải khát, bia, rƣợu
1.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu quả chuyển gen vào cây một lá mầm nhờ vi
khuẩn Agrobacterium

Sự thành công trong việc tạo ra thực vật chuyển gen phụ thuộc vào một loạt
các yếu tố nhƣ tần số biến nạp, tác nhân chọn lọc hoặc sàng lọc và khả năng tái sinh
cây chuyển gen hoàn chỉnh từ các tế bào và mô mang gen chuyển nạp. Đối với
phƣơng pháp chuyển gen thơng qua Agrobacterium thì tần số biến nạp phụ thuộc
vào các yếu tố liên quan đến vi khuẩn và các yếu tố liên quan đến thực vật. Các yếu
tố liên quan đến vi khuẩn bao gồm: chủng vi khuẩn, mật độ vi khuẩn, thời gian lây
nhiễm, hoạt tính của gen vir, khả năng xâm nhập vào các cây chủ và loại vectơ. Các
yếu tố liên quan đến thực vật gồm loại cây, kiểu gen, dạng mẫu mơ, khả năng phân
bào của các tế bào đích, thành phần môi trƣờng [20]. Sau đây là một số yếu tố chính
1.2.1. Ảnh hưởng của kiểu gen
Nhìn chung, hiệu quả chuyển gen rất khác nhau giữa các kiểu gen của cùng
một loài. Đa số các báo cáo về chuyển gen chỉ đề cập ảnh hƣởng của kiểu gen đến
tần số chuyển gen bền vững, vì thế ngƣời ta khơng biết đƣợc kiểu gen có ảnh hƣởng
đến khả năng chuyển T-ADN hay phản ứng nuôi cấy in vitro. Trong số các loài cây


7

một lá mầm đã đƣợc chuyển gen, cây lúa là đối tƣợng chuyển gen ít phụ thuộc vào
kiểu gen nhất. Hơn 40 kiểu gen của các giống lúa indica, japonica và javanica đã
đƣợc chuyển gen. Đối với ngô, lúa mỳ, lúa mạch và mía, các dịng mơ hình đƣợc sử
dụng cho chuyển gen bằng súng bắn gen đều có phản ứng tốt trong chuyển gen
thơng qua Agrobacterium. Các dịng mơ hình đó là ngơ: A188 và các dịng lai với
A188; lúa mỳ: Bobwhite và Fielder; Lúa mạch: Golden Promise và Igri; Mía: Ja 605 [20]
Xây dựng đƣợc quy trình biến nạp khơng phụ thuộc vào kiểu gen của một
lồi cây trồng nhất định là một yêu cầu đối với các nhà nghiên cứu. Gần đây, các
cây chuyển gen đã đƣợc tạo ra từ các dịng/giống chọn lọc của nhiều lồi cây ngũ
cốc nhƣ: giống lúa miến PHI391; giống ngô PHP38 và PHN46; giống lúa mạch
Schooner. Tuy nhiên, tần số chuyển gen của các dòng chọn lọc này thấp hơn so với
các dịng mơ hình tƣơng ứng [59], [60], [20]

1.2.2. Dạng mẫu mơ đích
Mơ sẹo phơi hố
Mơ sẹo phơi hố tạo thành từ phôi trƣởng thành của các giống lúa japonica
đƣợc cho là dạng mơ thích hợp nhất cho biến nạp gen thơng qua Agrobacterium
[31]. Tiếp đó, dạng tế bào này đã đƣợc sử dụng để chuyển gen vào các giống lúa và
lúa mỳ có kiểu gen khác nhau [19]. Các nghiên cứu chuyển gen vào cây măng tây
A. officinalis [39]; cây hẹ tây [24], tỏi [38], và các loài hoa Lily [51] cũng sử dụng
hệ thống tế bào đích này. Mơ sẹo phơi hố tạo thành từ mơ phân sinh hoặc từ
cây mía in vitro [25]; từ lá của hai loài cây cảnh Agapanthus praecox ssp.
Orientalis L. và Muscari armeniacum Leichtl. Ex Bak., cũng đã đƣợc chuyển
gen thành công [51]
Phôi non mới tách
Phơi non mới tách đã đƣợc tìm thấy là dạng mẫu mơ đích tốt nhất, có
khả năng tái sinh cao, thích hợp cho lây nhiễm với Agrobacterium của các
kiểu gen của giống lúa indica [12], ngô [34], [42], [61], [27], [29], [58] và lúa


8

mạch [52]. Quy trình chuyển gen đối với các lồi Allium sử dụng phôi non đã
đƣợc xây dựng [25]
Huyền phù tế bào
Huyền phù tế bào là dạng tế bào đầu tiên đƣợc lựa chọn cho các
nghiên cứu biến nạp ở lúa [32]. Các nghiên cứu sau này cho thấy huyền phù
tế bào là các tế bào đích tuyệt vời khơng chỉ đối với chuyển gen ở cây lúa
[54], mà còn rất thích hợp cho các lồi khác nhƣ ngơ [46], lúa mạch [64], lúa
mỳ [19], chuối [28], mía [14], và cây cỏ [17]
1.2.3. Chủng Agrobacterium và plasmid
Các nghiên cứu chuyển gen thành công thông qua A. tumefaciens cho
thấy hiện tại chỉ có 3 chủng vi khuẩn đƣợc sử dụng hiệu quả ở các lồi cây

một lá mầm đó là LBA4404, C58 và EHA 101; và các chủng cải biên
(EHA105 từ EHA101, AGL0 & AGL1 từ EHA101) [20]. Dạng Ti-plasmid
của Agrobacterium cũng có vai trị trong q trình chuyển T-ADN vào tế bào
thực vật. Các nghiên cứu cho thấy, Ti-plasmid dạng nopalin có hiệu quả hơn
trong việc lây nhiễm Agrobacterium vào ngô so với Ti-plasmid dạng octopin
1.2.4. Các điều kiện xử lý mẫu mơ đích, lây nhiễm và đồng ni cấy
Tiền xử lý mẫu mơ biến nạp
Hệ thống chuyển gen có hiệu quả đã đƣợc xây dựng đối với phôi non
tiền nuôi cấy đƣợc xử lý co nguyên sinh [40]. Thổi khô phôi non lúa mỳ tiền
nuôi cấy sau khi lây nhiễm với Agrobacterium đã làm tăng rõ rệt hiệu quả
chuyển gen [19].
Xử lý chống thối hoại mô biến nạp
Các thao tác in vitro đối với mẫu mô thực vật sau khi lây nhiễm với
Agrobacterium là rất cần thiết để kích thích khả năng chuyển T-ADN vào tế
bào thực vật và để phục hồi tế bào sau khi biến nạp.
Xử lý áp suất thẩm thấu
Xử lý này có hiệu quả trong chuyển gen thơng qua Agrobacterium ở
một số lồi cây một lá mầm. Nghiên cứu của Uze và cộng sự (1997) [53] cho


9

thấy xử lý phôi lúa non tiền nuôi cấy trên môi trƣờng áp suất thẩm thấu 10%
sucrose đã cải thiện khả năng chuyển T-ADN. Tuy nhiên, ảnh hƣởng của môi
trƣờng xử lý áp suất thẩm thấu đến hiệu quả chuyển T-ADN và chuyển gen
bền vững không rõ rệt trong các nghiên cứu chuyển gen ở ngô [61], [27]. Điều
này cho thấy tác động của xử lý áp suất thẩm thấu đến chuyển gen thơng qua
Agrobacterium phụ thuộc nhiều vào lồi.
Thổi khô mẫu
Một yếu tố ảnh hƣởng đáng kể đến hiệu quả chuyển gen ở các lồi cây

một lá mầm đó là thổi khô mẫu trƣớc hoặc sau khi lây nhiễm. Thổi khơ huyền
phù tế bào mía với thời gian từ 10-15 phút đã kích thích khả năng chuyển TADN và tần số chuyển gen bền vững [14], [54]
Nhiệt độ đồng nuôi cấy mô thực vật với vi khuẩn Agrobacterium
Nhiệt độ thích hợp cho chuyển gen bền vững cũng cần phải đƣợc đánh
giá với mỗi dạng mẫu mơ đích và với mỗi chủng Agrobacterium biến nạp
[48]. Nghiên cứu của Kondo và cộng sự (2000) [38] cho thấy biểu hiện gus tạm
thời trong chuyển gen vào mô sẹo cây tỏi đạt đƣợc cao nhất ở 22 oC, trong khi
đó tần số chuyển gen cao hơn đã nhận đƣợc ở phôi ngô non sau khi biến nạp
đồng nuôi cấy ở 20oC [27], [29]
Thành phần môi trường lây nhiễm và đồng nuôi cấy
Thành phần môi trƣờng cũng là những yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến hiệu
quả chuyển gen. Trong chuyển gen vào phôi ngô non, Ishida và cộng sự
(1996) [34] đã sử dụng môi trƣờng LS, Zhao và cộng sự (2001) [61] sử dụng
mơi trƣờng N6 có bổ sung nitrat bạc. Mơi trƣờng với hàm lƣợng khống giảm
đã kích thích khả năng chuyển T-ADN trong biến nạp gen vào mơ sẹo phơi
hố ở phôi non ở ngô [15], [58].
Việc bổ sung acetosyringone (AS) - chất kích thích sự hoạt động của các gen
vir [13], [33], đã có trong hầu hết các quy trình chuyển gen ở cây một lá mầm.
Trong môi trƣờng không có AS, mức độ biểu hiện tạm thời của gen gus rất
thấp, không tái sinh đƣợc các cây lúa và cây hành chuyển gen [31], [19].


10

Các chất kháng sinh để loại bỏ Agrobacterium
Các chất kháng sinh nhƣ: cefotaxim, carbenicillin, timentin thƣờng đƣợc
sử dụng để loại bỏ vi khuẩn sau khi nuôi cộng sinh trong các nghiên cứu
chuyển gen thông qua A. tumefaciens [50]. Cefotaxim biểu hiện rất hiệu quả
trong các nghiên cứu chuyển gen ban đầu ở ngô và lúa
Mật độ vi khuẩn Agrobacterium

Mật độ vi khuẩn Agrobacterium cao thƣờng gây chết tế bào thực vật,
giảm khả năng tái sinh của các tế bào sau khi biến nạp, dẫn tới giảm tần số
chuyển gen bền vững. Tuy nhiên, mật độ vi khuẩn lây nhiễm cao là cần
thiết đối với chuyển gen vào các loài, các mẫu mơ khó, tần số chuyển gen
có thể đƣợc cải thiện bằng cách lây nhiễm thời gian ngắn, rửa mẫu sau khi
lây nhiễm hoặc bổ sung các chất kìm hãm vi khuẩn vào mơi trƣờng đồng
ni cấy [61], [58]
1.3.

Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào cây ngơ

Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào cây ngô trên thế giới
Chuyển gen vào thực vật hai lá mầm thông qua vi khuẩn A.tumefaciens đã đƣợc
biết đến nhƣ là một cơ chế đƣa ADN mong muốn vào thực vật với hiệu quả cao. Tuy
nhiên, hầu hết các cây một lá mầm đều không phải là vật chủ của A.tumefaciens, do
vậy những nghiên cứu chuyển gen vào cây ngô ban đầu đƣợc xây dựng và phát triển hệ
thống tái sinh từ việc chuyển gen vào các tế bào đặc biệt.
Vào năm 1993, cây lúa là cây một lá mầm chuyển gen đầu tiên đƣợc thu nhận
nhờ lây nhiễm phơi non với A.tumefaciens [18]. Tiếp đó, cây ngô chuyển gen cũng
đƣợc tạo ra bằng phƣơng pháp này. Một trong những nguyên nhân dẫn đến sự chậm trễ
trong các nghiên cứu biến nạp gen vào cây ngũ cốc thông qua A.tumefaciens là do thiếu
phản ứng gây tổn thƣơng hoặc phản ứng gây tổn thƣơng kém ở mô tế bào của cây ngũ
cốc. Phản ứng này là một trong những yếu tố cần thiết đối với sự lây nhiễm thành công
A.tumefaciens vào tế bào thực vật [45]
Cây ngô chuyển gen (Zea mays) đầu tiên đƣợc tạo ra bằng phƣơng pháp sử
dụng súng bắn gen vào năm 1990. Kể từ sau đó cơng nghệ chuyển gen vào cây ngơ


11

đã trở thành công cụ quan trọng trong nghiên cứu chất nguyên sinh của phôi và
nghiên cứu về các vấn đề sinh học cơ bản thông qua nghiên cứu về cây ngô chuyển
gen. Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi
khuẩn Agrobacterium tumefaciens là lựa chọn tốt hơn về sự kết hợp của gen vào
cây ngô so với việc sử dụng phƣơng pháp súng bắn gen. Hệ thống chuyển gen này
giúp cho tỉ lệ ổn định của gen cao hơn, số bản sao của gen chuyển trong cây thấp
hơn phƣơng pháp súng bắn gen [34], [60] và có ƣu điểm là có thể chuyển phân
mảnh ADN có kích thƣớc lớn tới các tế bào nhận, hiệu quả chuyển gen cao hơn.
Phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium cho hiệu quả cao đã
đƣợc chứng minh tại nhiều phịng thí nghiệm. Tần số chuyển gen có thể đạt từ 530% khi đồng ni cấy Agrobacterium mang vector nhị thể ”super-binary” với phôi
chƣa trƣởng thành của dịng ngơ A188 [34]
Một tiến bộ mới trong cải tiến quy trình biến nạp gen ở ngơ là sử dụng chủng
A.tumefaciens LBA4404 và hệ thống siêu vector hai nguồn đã tạo bƣớc đột phá trong
chuyển gen thông qua A.tumefaciens [34], cải thiện tần số chuyển gen lên đến 5 - 30%.
Các nghiên cứu chuyển gen vào tế bào ngơ thơng qua A.tumefaciens cho thấy q trình
chuyển gen thƣờng bị tắc nghẽn ở sự kết hợp của T-ADN trong hệ gen của thực vật
[41]. Sự kết hợp của ADN ngoại lai trong hệ gen thực vật có thể xảy ra thông qua sự tái
tổ hợp bất thƣờng. Sử dụng các siêu vector hai nguồn, gen hpt/bar đƣợc chuyển vào
phôi non dịng ngơ A188 và các dịng lai với A188 [34]
Negrotto và cộng sự (2000) [42] đã sử dụng phospho-mannose-isomerase
giống nhƣ chỉ thị chọn lọc đã thu đƣợc các cây ngô chuyển gen bằng phƣơng
pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium. Zhao và cộng sự (2001)
[61] đã tối ƣu hóa các điều kiện chuyển gen vào callus của giống ngơ Hi-II tăng
hiệu suất chuyển gen trung bình xấp xỉ 40%. Frame và cộng sự (2002 [27] sử
dụng vi khuẩn Agrobacterium mang vector nhị thể chuyển gen vào dịng ngơ
A188 thu đƣợc hiệu suất chuyển gen đạt 5,5%. Xueqing Huang và cộng sự
(2005) [56] đã cải tiến quy trình chuyển gen vào bốn dịng ngơ chọn lọc, hiệu
suất thu đƣợc đạt từ 2,35 – 5,26%.

12

Năm 2002, trong nghiên cứu của mình, Frame và cộng sự đã tiến hành
chuyển gen vào phôi non mới tách của dịng ngơ lai HiII, sử dụng vector hai
nguồn và bổ sung cystein trong môi trƣờng nuôi cộng sinh thu đƣợc hiệu quả
chuyển gen tƣơng đối cao lên đến gần 5,5%.
Gần đây nhất, Hensel và cộng sự (2009) [30] đã sử dụng hệ thống vector hai
nguồn pGH218 để chuyển thành công gen chỉ thị chọn lọc pat và gen gus vào phơi non
của dịng ngơ lai HiII với tần số lên đến 24%. Mặc dù vậy, các cơng trình chuyển gen
thành công ở ngô vẫn bị giới hạn bởi việc sử dụng dịng ngơ A188 hoặc dịng lai trong
đó dịng A188 là bố hoặc mẹ làm vật liệu.
Trong hầu hết các nghiên cứu biến nạp gen thành công ở ngô nhờ vi khuẩn
A.tumefaciens, phôi non mới tách đƣợc xem là dạng vật liện ban đầu có khả năng
chuyển nạp tốt nhất. Mặc dù vậy, một số nghiên cứu gần đây cho thấy các dạng mẫu
mô khác của cây ngô nhƣ cờ non, bao phấn, cây con in vitro và tế bào gốc là cũng có
khả năng tái sinh và sử dụng làm vật liệu cho biến nạp gen [20]. Các nghiên cứu
chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium của các dịng ngơ sử dụng các mẫu mơ
khác nhau bao gồm callus phơi hóa [22], callus bắt nguồn từ lá [11]. Năm 2006,
Sidorov và cộng sự đã nhận đƣợc cây chuyển gen khi biến nạp vector mang gen gfp và
nptII/CP4 vào mô sẹo tạo thành từ đốt thân mầm của cây con in vitro 7 - 10 ngày tuổi
của 5 dòng ngô khác nhau. Tần số biến nạp thu đƣợc từ 2 - 11% và có khoảng 60% cây
To có 1 – 2 bản copy của gen chuyển [55].
Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào cây ngô tại Việt Nam
Tại Việt Nam cùng với phƣơng pháp chọn tạo giống truyền thống ngày
càng hiệu quả hơn thì việc ứng dụng cơng nghệ sinh học trong chọn tạo các
giống cây trồng có khả năng chống chịu với điều kiện bất thuận sinh học và phi
sinh học đã đƣợc nghiên cứu. Bắt đầu từ các nghiên cứu ni cấy bao phấn, ni
cấy nỗn ngơ để tạo dịng ngơ thuần, Lê Huy Hàm và cộng sự (2003) [3],
Nguyễn Thị Khánh Vân và cộng sự (2005) [10] đã thực hiện và chuyển giao ứng
dụng thành công tại Viện Nghiên cứu Ngô.

13

Sử dụng chỉ thị phân tử để đánh giá đa dạng di truyền, tính khoảng cách di
truyền và tìm ra sự tƣơng quan di truyền để dự đoán ƣu thế lai sớm cho chọn tạo giống
ngô đã đƣợc một số tác giả nghiên cứu [4]
Xây dựng hệ thống tái sinh và chuyển gen vào cây ngô đã đƣợc bắt đầu nghiên
cứu một cách bài bản ở Việt Nam từ năm 2002 [5], [6], [7], [8], [9]. Tiếp đó, nhóm
nghiên cứu đã biến nạp thành công gen kháng sâu cry1Ac vào các dịng ngơ mơ hình
(HR8 và HR9) và các dịng ngơ chọn lọc, bƣớc đầu thu nhận đƣợc các dịng ngơ có
khả năng kháng sâu đục thân [1]. Ngồi đặc tính kháng sâu bệnh, các đặc tính chống
chịu với điều kiện bất lợi của môi trƣờng nhƣ hạn, lạnh .... cũng đã đƣợc bắt đầu đƣa
vào nghiên cứu trên các đối tƣợng cây trồng nhƣ ngô, lúa, đậu tƣơng ...
Nguyễn Văn Đồng và cộng sự năm 2013 [2] đã chuyển thành công vector mang
gen chịu hạn CaMV35S:: ZmNF-YB và SARK::IPT. Kết quả đã thu đƣợc 6 dịng ngơ
đƣợc xác định có khả năng kháng hạn
Đây là những nghiên cứu rất quan trọng, tạo tiền đề cho các nghiên cứu chọn
tạo giống cây trồng biến đổi gen ở Việt Nam.
1.4. Nghiên cứu tạo cây trồng biến đổi gen kháng thuốc trừ cỏ
1.4.1. Thuốc trừ cỏ Glyphosate
Glyphosate (N-(phosphonomethyl) glycine) là chất diệt cỏ phổ rộng, không chọn
lọc đƣợc sử dụng để diệt các lồi cỏ dại, cây có lá rộng và các cây lấy gỗ. Nó đƣợc phun
hoặc cho hấp thụ qua lá, hoặc tiêm vào thân và di chuyển tới phần mơ đang phát triển.
Sản phẩm thƣơng mại đầu tiên có tên là Roundup do Công ty Monsanto sản xuất vào
năm 1970. Theo số liệu thống kê ở Mỹ hằng năm sử dụng glyphosate khoảng từ 2500 4000 tấn ở mức độ gia đình và 40000 - 50000 tấn cho sản xuất nông nghiệp.
Glyphosate là một chất ức chế cạnh tranh với phosphoenolpyruvate (PEP)
trong quá trình tổng hợp 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate (EPSP). Dƣới sự xúc
tác đặc biệt của enzyme 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase (EPSPS),
glyphosate ngăn cản phản ứng của PEP và 3-phosphate-shikimate (S3P) để tạo

thành 5-enolpyruvul 3-phosphate-shikimate


14

Phản ứng tổng hợp EPSP từ S3P và PEP dƣới sự xúc tác của enzyme EPSPS
Glyphosate ức chế hoạt động của EPSPS thơng qua cơ chế cạnh tranh vị trí
hoạt động của PEP. Sự ức chế các tổng hợp acid shikimic, tiền chất để tổng hợp các
loại amino acids thơm nhƣ trypsine, tryptophane và phenylalanine, sẽ gây chết đối
với các loài thực vật và vi khuẩn. Con đƣờng sinh tổng hợp shikimate chỉ có mặt
trong thực vật, vi khuẩn và nấm; khơng có trong động vật, bởi vậy EPSPS là mục
tiêu tác dụng của chất diệt cỏ và các chất kháng khuẩn [21], [44]. Sử dụng
glyphosate không ảnh hƣởng tới con ngƣời và môi trƣờng, không gây độc hại đối
với thành phần của đất và thƣờng không phát sinh các loại cỏ kháng thuốc.
Ở đa số các loài cây trồng và cỏ dại đều khơng có khả năng kháng với
glyphosate. Tính tự kháng với glyphosate chỉ tìm thấy khi ni cấy mơ của một
số lồi thực vật. Tuy nhiên, ở các trƣờng hợp này khơng có giá trị sử dụng do
tính kháng glyphosate hoặc là khơng ổn định về mặt di truyền hoặc là khơng có
tính di truyền.
EPSPS là enzyme chìa khóa trong con đƣờng sinh tổng hợp các acid amino
thơm ở thực vật và vi khuẩn. EPSPS đã đƣợc quan tâm rất nhiều khi các nhà khoa
học phát hiện nó bị ức chế bởi glyphosate vào những năm 1980. Trong tự nhiên có
2 dạng EPSPS với độ tƣơng đồng về acid amino khoảng 50%, bao gồm: dạng
EPSPS I tồn tại ở thực vật và vi khuẩn, dạng này đã đƣợc đa số cơng trình tập trung
nghiên cứu cấu trúc và vị trí xúc tác của EPSPS. Dạng EPSPS II chỉ có ở một số vi
khuẩn, ví dụ Pseudomonas sp. strain PG2982, A.tumefaciens sp. strain CP4 và
Staphylococcus aureus [44]
Một số nghiên cứu cho thấy cấu trúc EPSPS I thay đổi sẽ làm giảm ái
lực của glyphosate. Điều này đã đƣợc chứng minh trong nghiên cứu cấu trúc và

15

động học của enzyme ở chủng đột biến E. coli G96A. [27]. Những nghiên cứu
về đột biến EPSPS kháng glyphosate không chỉ làm sáng tỏ cơ chế ức chế của
glyphosate, mà cịn trở thành cơng cụ để tạo cây trồng kháng glyphosate. Tuy
nhiên chƣa có cơng bố về hiệu quả kháng glyphosate ở các nghiên cứu cây
chuyển gen tăng cƣờng biểu hiện EPSPS dạng nguyên bản hay dạng đột biến
cho đến nay
Năm 1983, các nhà khoa học đã phát hiện gen mã hóa cho EPSPS từ chủng
A.tumefaciens CP4 có tính kháng glyphosate mức độ cao. Sử dụng các kỹ thuật
công nghệ sinh học trên cơ sở di truyền học, các cây trồng đã đƣợc chuyển gen này.
Các cây chuyển gen đều có chứa cả 2 dạng EPSPS: EPSPS từ chính bản thân cây
trồng sẽ chịu sự ức chế bởi glyphosate; EPSPS từ vi khuẩn CP4 biến nạp sẽ có tính
kháng lại glyphosate. Vì glyphosate khơng bám kết với EPSPS vi khuẩn nên EPSPS
vi khuẩn trong cây biến nạp tiếp tục sinh tổng hợp các aromatic amino acids, trong
khi đó dạng enzyme EPSPS của thực vật sẽ bị bất hoạt bởi sự ức chế của
glyphosate. EPSPS từ chủng vi khuẩn A. tumefaciens CP4 đã tỏ ra và ứng dụng
thành công trong các cây trồng chống chịu glyphosate
1.4.2. Thuốc diệt cỏ gluphosinate
Glufosinate là thuốc diệt cỏ khơng chọn lọc, kiểm sốt cỏ dại theo phƣơng
thức ức chế enzyme sinh tổng hợp glutamin. Quá trình tổng hợp glutamine là sự kết
hợp giữa glutamate và ammonia để hình thành nên glutamine. Ức chế hoạt động của
enzyme này là nguyên nhân làm tăng dần hàm lƣợng ammonia trong các tế bào thực
vật cũng nhƣ làm cạn kiệt nguồn amino acid và ức chế quang hợp ở cây.
L-phosphinothricin là thành phần thuốc diệt cỏ bialaphos, là một dạng tripeptide tự nhiên đƣợc tạo thành bởi ít nhất hai loài Streptomyces hygroscopicus
giống nhƣ sản phẩm ngoại bào. Glufosinate là tên của q trình tổng hợp hóa học
của hỗn hợp hai chất triệt quang D, L phosphinothricin. Sau khi tách chiết thuốc
diệt cỏ bialaphos từ loài Streptomyces hygroscopicus, các nhà khoa học đã tách
chiết đƣợc hai gen pat và bar

16

Dịng B. napus L. HCN92 chứa gen pat, là lồi thực vật chuyển gen đầu tiên
kháng lại L-PPT nhận đƣợc sự tán thành của chính phủ (CFIA, 1995b). Kể từ sau
đó có nhiều lồi thực vật chuyển gen kháng lại L-PPT bao gồm ngô, rau diếp và củ
cải đƣờng cũng đã đƣợc thƣơng mại hóa
1.4.3. Các gen sử dụng trong tạo giống cây trồng biến đổi gen chống chịu thuốc
trừ cỏ
Các loại thuốc trừ cỏ phổ rộng đƣợc sử dụng phổ biến hiện nay là glyphosate
(ức chế EPSPS synthase), glufosinate ammonium (ức chế glutamine synthetase),
nhóm imidazolinone và nhóm sulfonyurea (ức chế acetolactate synthase –ALS).
Bên cạnh đó bromoxynil (ức chế quang hợp do đình chỉ sự vận chuyển điện tử trong
hệ thống quang hóa II) là thuốc trừ cỏ chọn lọc cũng đƣợc sử dụng rộng rãi nhằm
điều khiển cỏ dại hai lá mầm. Việc phát triển cây trồng kháng cỏ dại dựa vào 3 cơ
chế sau:
- Tạo ra các enzyme không bị ảnh hƣởng bởi thuốc trừ cỏ: tạo ra những thay
đổi trong enzyme là mục tiêu của thuốc trừ cỏ nhằm mục đích ngăn cản sự tác động
của thuốc trừ cỏ vào enzyme đó
- Tăng cƣờng sự biểu hiện enzyme bị hại do thuốc trừ cỏ: Tăng cƣờng sự
biểu hiện của các protein (enzyme) mục tiêu bằng cách chuyển gen nhằm tăng số
bản sao/ tăng cƣờng sự biểu hiện của gen mục tiêu. Số lƣợng enzyme/protein mục
tiêu của thuốc trừ cỏ sẽ nhiều hơn so với lƣợng mà thuốc trừ cỏ có thể tác động nhờ
đó q trình sinh tổng hợp các hợp chất của cây vẫn đƣợc thực hiện bình thƣờng
ngay cả khi có mặt thuốc trừ cỏ
- Tạo ra các enzyme làm mất tính độc của thuốc trừ cỏ: Chuyển gen tổng hợp
enzyme có khả năng phá vỡ hoặc thay đổi cấu trúc hóa học của phân tử thuốc trừ cỏ
dẫn đến thuốc trừ cỏ bị mất hoạt tính
Gen EPSPS

Gen CP4 EPSPS hoạt động rất hiệu quả ở đậu tƣơng và cũng thiết thực ở ngô
[47]. Gen CP4 EPSPS đƣợc tổng hợp ở ngô sẽ đƣợc biến đổi bằng cách gây đột
biến điểm để làm tăng khả năng kháng lại glyphosate đƣợc cho rằng là gen chỉ thị


17

chọn lọc rất hữu hiệu ở ngô. Gen CP4 EPSPS cũng có khả năng kháng lại
glyphosate khi cho nó biểu hiện ở genome của lục lạp tuy nhiên các cây chuyển gen
đƣợc chọn lọc sử dụng tính kháng kháng sinh [57]
Sử dụng EPSPS tổng hợp trong các cây thực vật chuyển gen đƣợc đánh giá
là an toàn. Thực vật chuyển gen có khả năng kháng lại glyphosate đƣợc sử dụng
nhƣ một tính trạng nơng học hoặc là chỉ thị chọn lọc sẽ đƣợc sử dụng cho mục đích
thƣơng mại. Gen EPSPS còn đƣợc sử dụng rộng rãi hầu hết tạo nên tính kháng
glyphosate. Trong năm 2001 và 2002, đã có 507 bài báo nói về gen EPSPS đƣợc
tìm thấy ở cơ sở dữ liệu thử nghiệm động ruộng
Gen PAT
Gen pat/bar mã hoá cho enzym phosphinothricin acetyl transferase (PAT).
Gen pat đƣợc phân lập từ Streptomyces viridochromogenes, gen bar đƣợc tách từ
Streptomyces hygroscopicus. PAT xúc tác cho phản ứng acetyl hoá l-725010258
phosphinothricin, là enzym rất đặc hiệu, có ái lực rất thấp đối với các cơ chất so với
glufosinate. Gene bar và gene pat đều đƣợc sử dụng thành công khi chuyển gen vào
nhiều đối tƣợng cây trồng với mục đích tạo cây trồng kháng cỏ. Các dịng ngơ, lúa,
lúa mỳ và lúa mạch chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ đã đƣợc tạo ra.
Hai gene (pat và bar) mã hóa cho enzyme phos-phinothricin N-acetyltransferase
(PAT) đƣợc sử dụng để kháng lại L-PPT trong các loài thực vật chuyển gen. Gen
bar (kháng lại bialophos) đƣợc phân lập từ S. hygroscopi-cus và gen pat đƣợc phân
lập từ S. viridochromo. Hai gen này có độ tƣơng đồng về mức độ nucleotide là 87%.
PAT sử dụng acetyl CoA giống nhƣ một cofactor để xúc tác cho con đƣờng acetyl
hóa nhóm amino tự do của L-PPT. Khi L-PPT bị acetyl hóa nó khơng thể gắn và

làm bất hoạt đƣợc con đƣờng tổng hợp glutamine. Ức chế tổng hợp glutamine dẫn
đến sự tích lũy mức độ cao ammoniac gây ra cái chết ở thực vật [43]. Trong các bài
báo nghiên cứu đã công bố, gen bar là gen chỉ thị chọn lọc kháng lại thuốc trừ cỏ
đƣợc sử dụng phổ biến nhất (chiếm khoảng 4 – 31%). Tính kháng L-PPT cũng đƣợc
sử dụng rộng rãi trong các thử nghiệm đồng ruộng đối với các cây thực vật chuyển
gen, chỉ trong năm 2001 và 2002 đã có 327 hồ sơ chứa enzyme PART đƣợc liệt kê