Nghiên cứu điều kiện nhân giống chủng tetragenococcus halophilus CH6 2 và ứng dụng trong lên men dịch thủy phân cá

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
--------***--------

NGUYỄN THU PHƢƠNG

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NHÂN GIỐNG CHỦNG
TETRAGENOCOCCUS HALOPHILUS CH6-2 VÀ ỨNG DỤNG
TRONG LÊN MEN DỊCH THỦY PHÂN CÁ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT
CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội - 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
--------***--------

NGUYỄN THU PHƢƠNG

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NHÂN GIỐNG CHỦNG
TETRAGENOCOCCUS HALOPHILUS CH6-2 VÀ ỨNG DỤNG
TRONG LÊN MEN DỊCH THỦY PHÂN CÁ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS LÊ THANH HÀ

Hà Nội - 2018


LỜI CẢM ƠN
Với lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới:
PGS. TS. Lê Thanh Hà - Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm,
Trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội, ngƣời đã trực tiếp hƣớng dẫn, dạy bảo, động
viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo thuộc Viện Công nghệ sinh
học & Công nghệ thực phẩm, Trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội đã giảng dạy và
giúp đỡ tơi trong suốt q trình học tập và thực hiện luận văn.
Đ ng thời, t i xin g i lời ảm ơn tới nhóm nghiên cứu đề tài của sinh viên
Trinh, Hoài đã nghiên ứu phân lập chủng giúp t i định hƣớng, hoàn thiện luận văn và
tất ả

nh hị em, bạn bè thuộ ph ng th nghiệm C10-101, 102 bộ m n C ng

nghệ sinh họ đã nhiệt t nh giúp đỡ, tạo điều kiện s dụng trang thiết bị trong suốt qu
trình tơi thự hiện th nghiệm tại đây.
Tôi xin chân thành cảm ơn gi đ nh, bạn bè và đ ng nghiệp đã tạo điều kiện,
quan tâm và góp ý cho tơi trong suốt q trình học tập, nghiên cứu và hồn thành
luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 26 tháng 09 năm 2018
Họ viên

Nguyễn Thu Phƣơng

i

LỜI CAM ĐOAN
T i xin

m đo n đây là

ng tr nh nghiên ứu củ riêng t i, dƣới sự

hƣớng dẫn của PGS.TS Lê Thanh Hà. Luận văn này kh ng ó sự trùng lặp với
đề tài khác.

Hà Nội, ngày 26 tháng 09 năm 2018
Họ viên

Nguyễn Thu Phƣơng

ii


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................................... i
LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................................... ii
MỤC LỤC................................................................................................................................ iii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT.................................................... v
DANH MỤC CÁC HÌNH ..................................................................................................... vi
DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................................... vii
MỞ ĐẦU ................................................................................................................................... 1
1. Lý do họn đề tài ................................................................................................. 1
2. Nội dung nghiên ứu ........................................................................................... 2

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.............................................................................. 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ NƢỚC MẮM .................................................................... 3
1.1.1. Giới thiệu ................................................................................................... 3
1.1.2. Giá trị dinh dưỡng của nước mắm ............................................................ 4
1.1.3. Cơ chế lên men nước mắm......................................................................... 5
1.2. HỆ VI KHUẨN LACTIC ................................................................................. 9
1.2.1. Tổng quan về Tetragenococcus ............................................................... 10
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 11
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ........................................................................ 11
2.2. THIẾT BỊ, HĨA CHẤT, MƠI TRƢỜNG ..................................................... 12
2.2.1. Thiết bị ..................................................................................................... 12
2.2.2. Hóa chất ................................................................................................... 12
2.2.3. Mơi trường ............................................................................................... 13
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................. 14
2.3.1. Nghiên cứu điều kiện sinh trưởng tối ưu của chủng Tetragenococcus
halophilus CH6-2............................................................................................... 14
2.3.2. Ứng dụng chủng Tetragenococcus halophilus CH6-2 trong lên men dịch
thủy phân cá ....................................................................................................... 18

iii


CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ....................................... 24
3.1. NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NHÂN GIỐNG CHỦNG TETRAGENOCOCCUS
HALOPHILUS CH6-2............................................................................................ 24
3.1.1. Ảnh hưởng của pH môi trường ................................................................ 24
3.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ muối .................................................................. 25
3.1.3. Kết quả khảo sát điều kiện nhiệt độ ......................................................... 26
3.1.4. Kết quả khảo sát điều kiện môi trường dinh dưỡng ................................ 28
3.1.5. Dựng đường cong sinh trưởng và xác định thời gian thu sinh khối ........ 29

3.2. ĐỘNG HỌC TRONG LÊN MEN DỊCH THỦY PHÂN CÁ KHI BỔ SUNG
CHỦNG KHỞI ĐỘNG CH6-2 ............................................................................. 30
3.2.1. Sự thay đổi pH trong quá trình lên men .................................................. 30
3.2.2. Sự phát triển của vi sinh vật trong quá trình lên men ............................. 31
3.2.3. Sự thay đổi hàm lượng α-amino acid ...................................................... 32
3.2.4. Kết quả phân tích axit amin tự do trong dung dịch sau lên men ............. 33
3.2.5. Đánh giá cảm quan dịch lên men tại thời điểm 120 ngày ....................... 34
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................................. 36
1. KẾT LUẬN ....................................................................................................... 36
2. KIẾN NGHỊ....................................................................................................... 36
PHỤ LỤC ................................................................................................................................ 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................... 38

iv


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC

VIẾT TẮT

OD

Độ đo qu ng

LAB

Vi khuẩn l ti

TT

Thanh trùng

KTT

Không thanh trùng

CH6-2

Tetragenococcus halophilus CH6-2

CFU (Colony forming unit)

Đơn vị khuẩn lạ

VSV

Vi sinh vật

K1, K2

M i trƣờng Kho ng 1, Khoáng 2

v


DANH MỤC CÁC HÌNH
H nh 1.1. Nƣớ mắm

ơm ......................................................................................3

H nh 2.1. Đặ điểm khuẩn lạ và tế bào VSV ủ

hủng CH6-2 .............................11

Hình 2.2. M i trƣờng khảo s t pH trƣớ và s u nu i hủng CH6-2 .........................14
Hình 2.3. M i trƣờng khảo s t n ng độ muối trƣớ và s u nu i ..............................15
hủng CH6-2 .............................................................................................................15
Hình 2.4. M i trƣờng khảo s t MRS, K1, K2 trƣớ và s u nu i hủng CH6-2 .......17
Hình 2.5. Đƣờng huẩn Ninhydrin ở bƣớ sóng 570nm ...........................................20
Hình 3.1. Ảnh hƣởng

ủ

pH

m i trƣờng đến sự sinh trƣởng

ủ

hủng

T.halophilus CH6-2 ...................................................................................................24
Hình 3.2. Ảnh hƣởng ủ n ng độ muối đến sự sinh trƣởng ủ

hủng T.halophilus

CH6-2 ........................................................................................................................26
Hình 3.3. Ảnh hƣởng ủ nhiệt độ đến sự sinh trƣởng ủ
Hình 3.4. Ảnh hƣởng ủ

hủng CH6-2 ................27

m i trƣờng dinh dƣỡng đến sự sinh trƣởng ủ

hủng T.

halophilus CH6-2 ......................................................................................................28
H nh 3.5. Đƣờng ong sinh trƣởng ủ

hủng T. h lophilus CH6-2 ........................29

Hình 3.6. Sự th y đổi pH trong qu tr nh lên men ....................................................30
H nh 3.7. Kết quả khảo s t số tế bào tại

thời điểm lên men ...............................31

Hình 3.8. Kết quả khảo s t hàm lƣợng α- amino acid tại
Hình 3.9. Biểu đ phân t h

thời điểm lên men .....32

id min tự do (µg/100ml) trong dị h lên men ..........33

Hình 3.10. H nh ảnh 2 mẫu dị h lên men TT và KTT tại thời điểm 120 ngày ...............35
Hình 3.11. Kết quả đo màu ở bƣớ sóng 450nm ......................................................35

vi

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2. 1. Thành phần m i trƣờng MRS, Kho ng 1, Kho ng 2[13] ........................13
Bảng 2.2. Chế độ r

giải trong sắ ký HPLC ..........................................................22

Bảng 3.1. Kết quả phân t h

id min tự do (µg/100ml) trong dị h lên men .........37

vii


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Nƣớ mắm là sản phẩm từ
Á, đặ biệt ở

lên men, đƣợ s dụng rộng rãi ở nhiều nƣớ

hâu

nƣớ Đ ng Á và Đ ng N m Á nhƣ Nhật Bản, Trung Quố , Hàn

Quố , Th i L n, M l ysi , Việt N m [31]. Nƣớ mắm là sản phẩm giàu dinh dƣỡng,
hứ nhiều

id min kh ng th y thế nhƣ lysin, v lin…

nƣớ B1, B2, PP…và

vit mine hoà t n trong

nguyên tố C , P, S.

Ở Việt N m nƣớ mắm là sản phẩm truyền thống , đƣợ sản xuất theo một
quy tr nh th ng thƣờng. C và muối đƣợ ph trộn theo tỉ lệ 3:1và lên men từ 12-18
tháng, protein

bị thủy phân trong qu tr nh lên men bởi hệ vi khuẩn ruột

enzym nội bào [30]. Trong đó, hệ vi khuẩn l ti

và

ũng đóng v i tr là nhân tố tạo

hƣơng ho sản phẩm nƣớ mắm.
Nƣớ mắm lên men truyền thống ó mùi vị thơm ngon rất đặ trƣng nhƣng
có nhƣợ điểm là hàm lƣợng

id min kh ng

o, thời gi n lên men kéo dài.

Những năm trở lại đây, nhiều nghiên ứu nhƣ bổ sung enzym, xit hoặ kiềm đƣợ
thự hiện nhằm rút ngắn thời gi n lên men nƣớ mắm, tuy nhiên nhƣợ điểm là
kh ng tạo đƣợ hƣơng vị nhƣ nƣớ mắm truyền thống.
Hiện n y, ở nhiều quố gi trên thế giới trong đó ó Th i L n đã ó hƣớng
nghiên ứu bổ sung

vi khuẩn l ti

hịu mặn Tetragenococcus halophilus (n ng

độ N Cl <25%) nhằm ải tiến quy tr nh sản xuất nƣớ mắm ngắn ngày. Kết quả ho
thấy kh ng hỉ rút ngắn thời gi n lên men xuống
lƣợng đạm tổng, giảm

n 4- 6 th ng mà

n tăng hàm

min kh ng mong muốn nhƣ hist min, putres in trong sản

phẩm, đạt gi trị ảm qu n tƣơng đƣơng với nƣớ mắm lên men truyền thống.
Trong nghiên cứu của mình Udomsil đã phân lập đƣợc các vi khuẩn lactic,
x

định là Tetragenococcus halophilus phát triển ở n ng độ 25% N Cl và đóng v i

trị quan trọng trong qu
halophilus CH6-2 ó t

tr nh h nh thành hƣơng. Chủng Tetragenococcus

động tích cực trong q trình lên men nƣớc mắm đã đƣợc

lựa chọn từ các nghiên cứu trƣớc.

1


Xuất ph t từ những vấn đề thự tiễn nêu trên t i quyết định họn đề tài “
Nghiên cứu điều kiện nhân giống chủng Tetragenococcus halophilus CH6-2 và ứng
dụng trong lên men dịch thủy phân cá. “
2. Nội dung nghiên cứu
Nghiên

ứu điều kiện sinh trƣởng tối ƣu

ủ

hủng Tetragenococcus

halophilus CH6-2.
Ứng dụng hủng Tetragenococcus halophilus CH6-2 trong lên men dị h thủy
phân cá.

2


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ NƢỚC MẮM
1.1.1. Giới thiệu
Nƣớ mắm là một loại gi vị ó gi trị dinh dƣỡng
Việt N m mà
xuất bằng

n đƣợ ƣ

h trộn

huộng tại nhiều quố gi

o kh ng hỉ phổ biến tại

hâu Á. Nƣớ mắm đƣợ sản

với muối theo tỉ lệ thƣờng nhất là 3 : 1và lên men trong thời

gian từ 12 -18 tháng [25]. Mắm

đ ng muối đƣợ gọi là hƣợp. Khi hƣợp h n

đem lọ hoặ đem nấu r i lọ t đƣợ nƣớ mắm.

Hình 1.1. Nước mắm cá cơm
Nƣớ mắm đƣợ

hế biến theo phƣơng ph p truyền thống ó mùi vị thơm

ngon đặ trƣng nhƣng độ đạm kh ng

o, thời gi n lên men kéo dài từ 12 – 18

th ng, kh ng năng suất và kinh tế kh ng

o. V vậy, những năm trở lại đây nhiều

nghiên ứu nhƣ bổ sung enzym hoặ

xit, kiềm, giảm n ng độ muối h y tăng

nhiệt độ,… đƣợ thự hiện nhằm rút ngắn thời gi n lên men nƣớ mắm, tăng độ
đạm nhƣng

phƣơng ph p này đều ó nhƣợ điểm, chi phí cao và kh ng tạo đƣợ

hƣơng vị nhƣ nƣớ mắm truyền thống. V vậy, kh ng đƣợ ứng dụng trong sản xuất
nƣớ mắm thƣơng mại.

3


Hầu hết

protein trong

min. Lƣợng nhỏ peptide,

đƣợ thủy phân thành các peptide nhỏ và

id

id min tự do, moni và trimethylamine (TMA), góp

phần vào tạo mùi thơm đặ trƣng và hƣơng vị ủ nƣớ mắm. [9]
1.1.2. Giá trị dinh dưỡng của nước mắm
1.1.2.1. Chất đạm
Thành phần ủ nƣớ mắm ó hứ khoảng 20 g/L nitơ tổng số, trong đó

có16 g/L t n tại dƣới dạng
dạng

mon. C

cid amin, 25-28% dƣới dạng muối, 0,2-0,7% dƣới

hất đạm này quyết định gi trị dinh dƣỡng ủ nƣớ mắm, trong

đó đạm tổng số là tổng lƣợng nitơ ó trong nƣớ mắm (g/l), quyết định phân hạng
nƣớ mắm; đạm min là tổng lƣợng nitơ nằm dƣới dạng min (g/l), quyết định gi
trị dinh dƣỡng ủ nƣớ mắm và đạm mon là đạm thối, làm giảm hất lƣợng nƣớ
mắm. [1]
Mặt kh , trong nƣớ mắm ó hứ rất nhiều loại

id min, đặ biệt là

c

acid min kh ng th y thế nhƣ: isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine,
threonine, tryptophan, valine và histidine. Tùy theo nguyên liệu

mà tỉ lệ

loại

acid amin này khác nhau.
1.1.2.2. Các hợp chất bay hơi
Các hợp chất b y hơi trong nƣớc mắm rất phức tạp, đƣợc tạo ra từ q trình
thủy phân protein, oxy hóa lipid nhờ hệ enzim nội bào và enzym trong vi khuẩn ruột

cá. Các aminopeptidase chuyển peptide, oligopeptide thành amino acid, các amino
acid này là tiền chất quan trọng của các chất sinh hƣơng. Theo kết quả nghiên cứu
của Dougan và Howard (1975), hƣơng nƣớc mắm đƣợc tạo nên từ 3 loại hƣơng vị
đặc biệt [9] :
 Hƣơng thối củ

moni

đƣợc hình thành từ sự tổng hợp của amoniac, các

amin và các hợp chất chứa nitơ.
 Hƣơng phom t đƣợc hình thành từ các

id béo b y hơi có khối lƣợng

phân t thấp và ketonemethyl.
 Hƣơng thịt thì phức tạp hơn, đƣợc hình thành từ sự oxi hóa các ơ chất
nguyên liệu

trong nƣớc mắm và các ketoneacid.

4


Hàm lƣợng các chất b y hơi trong nƣớc mắm (mg/100g nƣớc mắm), bao
g m: cacbonyl b y hơi: 407-512 (form ldehyde),
(propioni ),

id b y hơi: 404-533

min b y hơi: 9,5-11,3 (izopropylamin), các chất trung tính bay

hơi: 5,1-13,2 (acetaldehyde).
Rossana R. Peralta và cộng sự (1996) đã báo cáo rằng: có khoảng 155 chất
b y hơi đã đƣợ x

định, trong đó b o g m 14 acid, 36 hợp chất cacbonyl, 17 hợp

chất chứa nito, 10 hợp chất chứ lƣu huỳnh,.. Trong đó số lƣợng lớn các acid,
cacbonyl và các hợp chất chứ lƣu huỳnh nhƣ dimethyl sulfide, dimethyl trisulfide
và 3-(methylthio) prop n l ũng nhƣ nhiều hợp chất chứa nito là những thành phần
chính tạo nên mùi hƣơng đặ trƣng ủ nƣớc mắm. [3]
Katsuya Fukami và cộng sự (2002) đã x

định các hợp chất b y hơi đặc biệt

trong nƣớc mắm. Kết quả là có 4 hợp chất tạo nên mùi hƣơng đặ trƣng cho nƣớc
mắm là 2 - methylpropanal, 2 - methylbutanal, 2 - ethylpridine và dimethyl
trisulfide. [11]
Từ những kết quả nghiên cứu về các hợp chất b y hơi trong nƣớc mắm giúp
các nhà khoa học có những nghiên cứu, bổ sung các hợp chất gây hƣơng,
enzyme, các vi sinh vật có tác dụng hình thành các hợp chất b y hơi trong quá trình
lên men nƣớc mắm. Từ đó ứng dụng vào nâng

o hƣơng nƣớc mắm trong sản xuất

nƣớc mắm ngắn ngày.
1.1.2.3. Các chất khác
Các chất v

ơ và hữu ơ: ngoài N Cl

n

nxi oxit, m gie oxit, anhidrit

photphori , denosintriphotph t, lƣu huỳnh t n tại ở dạng hữu ơ trong Cysteine,
brôm và iot ở dạng muối v
C

ơ hoặc tự do.

Vit min nhƣ B1, B2, B12, PP. Thành phần và hàm lƣợng vit min kh

nh u tùy vào từng loại

, độ tƣơi, phƣơng ph p hế biến.

1.1.3. Cơ chế lên men nước mắm
Bản hất ủ lên men nƣớ mắm là sự thủy phân protein
và peptid nhờ enzym prote se ủ vi sinh vật ó trong ruột
Protein> polypeptid > peptid > acid amin

5

thành acid amin

và hệ enzym nội bào.

Song song với qu tr nh thủy phân protein cá thành acid amin và peptid bậ
thấp là qu tr nh h nh thành hƣơng,

hợp hất b y hơi, tạo mùi hƣơng đặ trƣng

ho nƣớ mắm. Đây là một qu tr nh phứ tạp, đ i hỏi phải ó thời gi n nhất định
để huyển hó

hợp hất hữu ơ tạo thành hƣơng thơm. Theo Peralta, Shimoda,

và Osajim (1996) đã x
b o g m xit,

định 124-155

hợp hất hứ nitơ,

hợp hất dễ b y hơi trong nƣớ mắm
hợp hất lƣu huỳnh, andehit, xeton và

hydro rbon thơm. Hƣơng thịt đƣợ tạo thành bởi qu tr nh oxy hó lipid, axit
glut mi

ũng góp phần vào hƣơng vị thịt trong nƣớ mắm. [30]

1.1.3.1. Các yếu tố chính ảnh hưởng đến q trình lên men nước mắm
Nhiệt độ là yếu tố rất quan trọng để phát huy tác dụng tích cực của các loại
enzyme. Trong q trình chế biến, khi nhiệt độ tăng th vận tốc phản ứng của các
enzyme sẽ tăng, nhƣng nhiệt độ tăng

o qu sẽ ức chế enzyme và quá trình thuỷ

phân sẽ giảm. Vì enzyme mang bản chất là protein nên chúng khơng chịu đƣợc
nhiệt độ cao. Ngoài ra nhiệt độ ũng ảnh hƣởng đến sự phát triển của vi sinh vật.
Mỗi loại vi sinh vật thích ứng với một nhiệt độ nhất định, do đó t

ần tạo một nhiệt

độ tối ƣu ho vi sinh vật phát triển và sinh trƣởng.
pH ủ m i trƣờng ảnh hƣởng đến qu tr nh lên men nƣớ mắm, mỗi hệ enzyme
ó pH tối thiểu kh

nh u v vậy phải tạo pH th h hợp ho enzyme hoạt động.

Muối là nguyên liệu qu n trọng ho qu tr nh sản xuất nƣớ mắm, thiếu
muối nƣớ mắm sẽ kh ng h nh thành đƣợ . Tốt nhất là muối kết tinh hạt nhỏ, ó độ
rắn

o, màu trắng óng nh kh ng đóng ụ , kh ng ó vị đắng h t. N ng độ muối

thấp ó t

dụng thú đẩy qu tr nh thủy phân protein nh nh hơn, tạo thành xit

min nhiều hơn. N ng độ muối

o làm ứ

hế, làm mất hoạt t nh ủ enzyme, qu

tr nh thủy phân hậm lại, thời gi n thủy phân kéo dài.
Cá là nguyên liệu h nh để sản xuất nƣớc mắm, thƣờng là cá biển hoặc cá
nƣớc ngọt. Nƣớc mắm chủ yếu đƣợc sản xuất từ các loại cá biển nhỏ nhƣ: cá ơm,
cá nục, cá tạp… là những loài cá có giá trị kinh tế thấp, dễ kiếm, sinh sống ở tầng
nổi, có hàm lƣợng lipit thấp giúp hạn chế đƣợc mùi vị i khét, k h thƣớc nhỏ nên

6


dễ thủy phân, hoạt tính enzyme protease trong thịt và ruột

o hơn

loại cá

khác nên quá trình thủy phân xảy r nh nh hơn. Những loại cá có chứa tỉ lệ ơ thịt
đỏ

o nhƣ

ngừ, cá thu t đƣợc s dụng trong chế biến nƣớc mắm vì trong thành

ơ thịt đỏ có chứa nhiều

phần củ

id min histidin, đây là một tiền chất của amin

histamin, một amin gây ngộ độc ở n ng độ cao ho ngƣời.
Tỷ lệ cá và muối là một yếu tố khác ảnh hƣởng đến chất lƣợng nƣớc mắm. Ở

mỗi quốc gia khác nhau, tỷ lệ cá với muối th y đổi tùy thuộc vào loại cá và điều
kiện của mỗi đị phƣơng. Nói hung, tỷ lệ cá và muối sẽ th y đổi tùy thuộc vào kích
cỡ

đƣợc s dụng trong sản xuất. [39]

1.1.3.2.Quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày [8]
Có nhiều phƣơng ph p để rút ngắn thời gi n lên men bằng
enzym protease, bổ sung hó

h tăng lƣợng

hất xit - kiềm, điều hỉnh lƣợng nƣớ , pH, nhiêt độ

th h hợp.
Phương pháp hóa học:
Cơ hế ủ phƣơng ph p này là s dụng
H2SO4, Na2CO3 để thủy phân nh nh thịt

hó

hất nhƣ HCl 7N, N OH ,

thành cid amin. Ƣu điểm là rút ngắn

thời gi n sản xuất, màu sắ đẹp, đạm thối t nhƣng nhƣợ điểm là mùi vị kh ng
đƣợ đặ trƣng,
hó

n t n đọng độ tố trong sản phẩm do qu tr nh hế biến s dụng

hất ở nhiệt độ

o trong thời gi n dài 7-8h.

Phương pháp bổ sung enzym protease:
Cơ hế ủ phƣơng ph p này là s dụng enzym prote se từ bên ngoài đƣ
vào để tăng qu tr nh thủy phân protein thịt

thành

id min nhằm rút ngắn thời

gi n sản xuất nƣớ mắm, th ng thƣờng enzym này đƣợ t h hiết từ hủng nấm
mố Asp.Oryaze, s u đó đem lọ và điều hỉnh hất lƣợng ho đạt yêu ầu trƣớ khi
r thành phẩm.Ƣu điểm ủ phƣơng ph p này là t độ hại, thời gi n ngắn, lƣợng
mắm ốt nhiều. Tuy nhiên phƣơng ph p này

n hạn hế v thời gi n nên men ngắn

nên hƣ đ p ứng đƣợ mùi vị đặ trƣng ủ nƣớ mắm, để ải thiện ngƣời t
hạy qu

hƣợp tốt để lấy hƣơng vị nƣớ mắm, hi ph sản xuất

7

o.

ho

Phương pháp vi sinh vật:
Vi sinh vật trong sản xuất nƣớ mắm ngắn ngày sẽ huyển hó những
protein phứ tạp ủ nguyên liệu thành

id min. Ngoài r , vi sinh vật

vị đặ trƣng ho từng sản phẩm nƣớ mắm kh

n tạo mùi

nh u.

Việ rút ngắn thời gi n sản xuất nƣớ mắm bằng

h bổ sung hủng vi sinh

vật ƣ mặn đã đƣợ Ok và ộng sƣ nghiên ứu (1982). Khi Bacillus đƣợ phân lập
từ một loại nƣớ mắm ủ Trung Quố , đƣợ bổ sung vào hỗn hợp
ở 30oC , thời gi n sản xuất giảm

n 3 th ng. C

phẩm ó hƣơng vị tƣơng đƣơng

sản phẩm thƣơng mại. [21]

phép th

và muối, giữ

ảm qu n ho thấy sản

Gần đây, trong nghiên ứu ủ Yongs w tdigul, Rodtong, Raksakulthai
(2007) đã

hỉ r

Vigrilbacillus.sp ó khả năng sinh prote se giúp rút ngắn thời

gi n lên men, tăng lƣợng cid min ở nƣớ mắm lên men th ng 4. [40]
Ở Việt N m húng ta

ng nghệ sản xuất nƣớ mắm ũng tƣơng đối ph t

triển. Chính v thế việ nghiên ứu, ải tiến sản xuất nƣớ mắm thật sự ần thiết, để
từ đó mở rộng quy m và p dụng vào thự tế. Đặ biệt phuơng ph p nghiên ứu bổ
sung vi vinh vật ƣ mặn sinh prote se làm hủng khởi động trong lên men nƣớ
mắm ngắn ngày là hƣớng nghiên ứu triển vọng, thiết thự nhằm khắ phụ
nhƣợ điểm ủ

tất ả

phƣơng ph p ũ.

1.1.3.3. Tình hình nghiên cứu nước mắm hiện nay ở nước ta
Theo một nghiên ứu ủ Kho

ng nghệ Thự phẩm, Trƣờng Đại họ

Nh Tr ng năm 2013, tiến hành nghiên ứu thành phần xit min và

hất b y

hơi ó trong bốn loại nƣớ mắm thƣơng mại ở Việt N m. Bốn loại nƣớ mắm đƣợ
tuyển họn là nƣớ mắm Nh Tr ng, nƣớ mắm 584, nƣớ mắm Khải Hoàn và
nƣớ mắm Chinsu. Kết quả ho thấy bốn loại nƣớ mắm đều hứ
thiết yếu, tổng ộng ó 56 hất b y hơi và thành phần

xit min

hất b y hơi kh

nh u

tùy mỗi loại nƣớ mắm. [15]
Năm 2011, nhóm nghiên ứu ủ Trung tâm gi o dụ thƣờng xuyên và Đào
tạo

n bộ Quảng Ninh đã nghiên ứu và t m tỷ lệ kết hợp th h hợp 2 loại enzyme

Alcalase và Flavourzyme trong việ bổ sung vào qu tr nh lên men nƣớ mắm.

8


Nhóm nghiên ứu đã triển kh i kiểm nghiệm tồn bộ quy tr nh sản xuất tại C ng ty
CP Thuỷ sản C i R ng, với quy m 120kg
ng thứ

/lần hƣợp

trên 3 loại

, dự theo

ó tỷ lệ 0,4% Al l se + 0,6% Fl vourzyme. Kết quả ho thấy, s u 8

th ng, nhóm nghiên ứu thu đƣợ nƣớ mắm ốt ó hàm lƣợng Nito tổng số đạt
28,7g/l t đối với

ơm, 28,14g/l t đối với

nụ và 28,77g/l t đối với

tr h.

Trong khi đó, mẫu đối hứng kh ng bổ sung enzyme ở ùng thời điểm ó hàm
lƣợng Nito tổng hỉ đạt lần lƣợt là 22,01g/l t, 19,17g/l t và 19,45g/l t. Để sản phẩm
ó hƣơng vị thơm ngon và đậm đà hơn,
vị bằng

nhà nghiên ứu tiếp tụ

ải tiến hƣơng

h ủ với bã hƣợp truyền thống trong thời gi n từ 20-30 ngày. S u đó, bã

hƣợp thu đƣợ đem h n với 300l nƣớ muối 25%, ủ tiếp từ 1-2 tháng thì cho

hƣơng vị nƣớ mắm tƣơng đƣơng với hƣơng vị truyền thống. [4]
Theo một nghiên ứu ủ Trƣờng Đại họ n ng lâm TP.HCM, 5 hủng vi
khuẩn hiếu kh Bacillus sp. và 2 hủng kị kh Clostridium sp. đƣợ phân lập ó khả
năng sinh prote se, hịu đƣợ n ng độ muối

o, trong đó hủng Bacillus sp.1 và

Bacillus sp.4 là 2 hủng ó khả năng thủy phân protein
đó họn 2 hủng này để bổ sung vào hƣợp mắm làm t
thủy phân ù

o hơn

hủng kh

từ

nhân thú đầy qu tr nh

hƣợp mắm tốt và hủng Clostridium sp.1, Clostridium sp.2 là hủng

ó khả năng sinh hƣơng nƣớ mắm tốt hơn
liệu nấm từ đó họn 2 hủng này làm t

hủng

n lại trên ngu n nguyên

nhân bổ sung vào hƣợp mắm làm t

nhân thú đẩy qu tr nh sinh hƣơng nƣớ mắm nhằm tạo sản phẩm nƣớ mắm h y
ó mùi thơm đặ trong ủ nƣớ mắm

. [36]

1.2. HỆ VI KHUẨN LACTIC
Nƣớ mắm ó hứ n ng độ muối

o từ 25-30%, do đó vi sinh vật t m thấy

trong qu tr nh lên men nƣớ mắm thƣờng thuộ nhóm hịu mặn [26] . Gi i đoạn
uối ùng ủ qu tr nh lên men vào tháng 7 -12 là thời điểm mà màu sắ , hƣơng vị
đƣợ h nh thành đầy đủ [24]. Do đó, LAB ƣ mặn đƣợ t m thấy trong nƣớ mắm
ó thể đóng một v i tr qu n trọng trong việ tạo hƣơng thơm .
Vi khuẩn L ti là tên gọi hung ủ những vi khuẩn sinh xit l ti nhƣ là
sản phẩm h nh trong qu tr nh huyển hó

9

bonhydr t. Do đặ t nh hung này,


chúng đƣợ xếp hung vào họ L tob teri e e. Mặ dù húng kh ng đ ng nhất về
mặt hình thái, bao g m ả dạng que ngắn, que dài, h nh ầu nhƣng về mặt sinh lý
húng đều là vi khuẩn Gr m dƣơng, kh ng sinh bào t , hầu hết kh ng di động, kỵ kh
tùy nghi. Vi khuẩn L ti b o g m
Enterococcus,

Lactobacillus,

hi: Aerococcus, Alloiococcus,Carnobacter,
Lactococcus,

Leuconostoc,

Pediococcus,

Tetragenococcus, Streptococcus, Vagococcus và Bifìdobacterium. [20]
Vi khuẩn l ti đƣợ t m thấy khắp nơi trong tự nhiên: dƣới d , trong hệ tiêu
hóa, trên bề mặt ho quả và đặ biệt là

sản phẩm lên men nhƣ sữ

hu , kim hi,

r u ủ quả muối hu và nƣớ mắm, là một trong những vi khuẩn qu n trọng nhất
trong thự phẩm lên men [18]. Chúng đƣợ s dụng nhƣ là hủng khởi động ho
những thự phẩm lên men giúp giảm thời gi n lên men và ải thiện mùi hấp dẫn và
hƣơng vị. Theo Roling và Verseveld b o

o năm 1997 th Tetragenococcus là

giống vi khuẩn l ti duy nhất ó khả năng sinh trƣởng trong m i trƣờng ó n ng
độ muối >18%. [22]
1.2.1. Tổng quan về Tetragenococcus
Là một hi g m
trƣởng và

hịu đƣợ

vi khuẩn ƣ mặn, ần n tri loru (N Cl) ho sự tăng
n ng độ muối N Cl hơn 18% [6]. Hiện n y,

hi

Tetragenococcus b o g m bốn loài: T. halophilus, T. muriaticus, T. koreensis, và T.
solitarius.
Tetragenococcus là ầu khuẩn Gr m dƣơng (0,5-1,0 mm đƣờng k nh), khuẩn
lạ

h nh tr n, màu trắng, l i thấp, mịn và kh ng sắ

tố. Có một số

hủng

Tetragenococcus đã đƣợ t m thấy trong nhiều loại thự phẩm lên men, b o g m
nƣớ mắm [34], nƣớ tƣơng [32], đậu nành Indonesianghiền (Kecap). [27]
Trong nghiên ứu ủ Udomsil năm 2010, tất ả

LAB đƣợ lự

họn x

định là Tetragenococcus đều ph t triển ở n ng độ muối 25% trong m i trƣờng
MRS. Trong đó T.halophilus hiếm ƣu thế trong vi khuẩn l ti

hịu mặn. Ở n ng

độ muối 25% T.koreensis kh ng đƣợ t m thấy. Cũng theo nghiên ứu này T.

halophilus ó khả năng thủy phân protein. Bảy hủng đã đƣợ
trong hoạt động thủy phân protein và sinh
hủng T. halophilus đã đƣợ phân lập. [27]

10

họn vào ứng dụng

hợp hất gây hƣơng trong số 64


CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
 Vi khuẩn lactic chịu mặn Tetragenococcus halophilus CH6-2 đã đƣợc phân
lập từ các nghiên cứu trƣớc tại phịng thí nghiệm C101-102 Bộ mơn Cơng
nghệ sinh học, Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, Đại học
Bách khoa Hà Nội. Tetragenococcus halophilus CH6-2 đƣợc phân lập từ
nghiên cứu trƣớc là Gram +, có khuẩn lạc màu trắng sữa, mịn, hơi l i bóng,
mép mịn, đƣờng kính 1-1,5mm, có hình dạng tế bào cầu khuẩn, đứng riêng
lẻ, tạo cặp bốn, cặp đ i hoặc tạo thành đ m. Chủng CH6-2 thể hiện cả 2 hoạt
tính protease và lipase ở mứ trung b nh nhƣng hoạt độ thủy phân tạo
glut mi

o hơn nhiều so với việc thủy phân tạo leucin, thích hợp để chọn

làm chủng khởi động trong qu tr nh lên men nƣớc mắm. Các nghiên cứu đã
chứng tỏ ảnh hƣởng của axit glutamic hay muối củ nó đối với hƣơng vị và
đƣợc s dụng trong thực phẩm. [5]

Hình 2.1. Đặc điểm khuẩn lạc và tế bào VSV của chủng CH6-2

 C

ơm đƣợc cung cấp bởi Công ty cổ phần chế biến dịch vụ thủy sản Cát

Hải, Thị Trấn Cát Hải - Hải Phòng .

11


2.2. THIẾT BỊ, HĨA CHẤT, MƠI TRƢỜNG
2.2.1 . Thiết bị
Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đứ )
N i hấp Tommy (nhật)
Box vô trùng (Haraeus)
Bể ổn nhiệt ( Đứ )
M y li tâm Sorv ll (Mỹ)
Micropipet Jinson (Pháp)
M y đo pH
Cân (Precisa XT 320M - Thuỵ Sĩ)
M y ất nƣớ (Hamilton – Anh)
K nh hiển vi qu ng họ .
M y đo OD.
Tủ lạnh D ewoo, tủ lạnh sâu, hộp l ng, ống nghiệm, bình tam giác, que trang,đèn
n...và nhiều dụng ụ ho sinh th ng dụng kh .
2.2.2. Hóa chất
STT HĨA CHẤT

XUẤT XỨ

1

Đƣờng Glu ose

Việt N m

2

C o thịt (me t extr t)

Biokar Dianogstique (Pháp).

3

C o nấm men( Ye st extr t)

Việt N m

4

Tween 80

Trung Quố

5

Pepton

Trung quốc

6

Agar-agar

Việt N m

7

NaCl, acetat natri, triamon citrate,

Trung Quố

MgSO4, MnSO4, NaCl, CaCO3,
ninhydrin, pyridine,...
Enzym Flavouzyme, Alcalase

12

Đ n Mạ h


2.2.3. Môi trường
M i trƣơng MRS, Kho ng 1, Kho ng 2
Bảng 2. 1. Thành phần mơi trường MRS, Khống 1, Khoáng 2[13]
Thành phần

STT

MRS

Khoáng 1

Khoáng 2

(%w/v)

(%w/v)

(%w/v)

1

Pepton

1

2

C o thịt

1

3

C o nấm men

0.5

2

2

4

CH3COONa

0.5

1

1

5

K2HPO4

0.2

0.5

0.5

6

(NH4)3C6H5O7

0.2

7

Na3C6H5O7

1

1

8

Tween 80

0.1

0.1

0.1

9

MgSO4.7H2O

0.01

0.02

10

MnSO4.4H2O

0.005

0.002

11

Glucose

2

2

Định mứ nƣớ

2

ất tới 100ml, th nh trùng ở 1 tm, 121oC trong 20 phút.

13


2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Nghiên cứu điều kiện sinh trưởng tối ưu của chủng Tetragenococcus
halophilus CH6-2
2.3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của Tetragenococcus
halophilus CH6-2
 Chuẩn bị 6 ống thủy tinh chứ m i trƣờng nhân giống MRS (NaCl 5%),
chuẩn pH lần lƣợt là 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, thể tích m i trƣờng mỗi ống là 10ml và 1
ống chứ 5ml m i trƣờng MRS (NaCl 5%) để hoạt hóa vi khuẩn. Thanh trùng ở
121oC trong 20 phút.
 Hoạt hóa giống bằng cách lấy 1 khuẩn lạc chuyển vào ống chứa 5ml môi
trƣờng đã chuẩn bị, vontex đều, nuôi ở 30oC trong 5 ngày.
 Cấp 2% giống vào 6 ống nghiệm khảo sát và nuôi 5 ngày trong tủ ấm ở

30oC, s u đó đo OD ở 600nm.
 Thí nghiệm đƣợc tiến hành lặp lại 3 lần.
 Từ khảo sát này, ta chọn đƣợc pH thích hợp cho nhân giống.

a)

b)

Hình 2.2. Mơi trường khảo sát pH trước và sau nuôi chủng CH6-2
a) Trước nuôi; b) Sau nuôi

14


2.3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối đến khả năng sinh trưởng của
Tetragenococcus halophilus CH6-2
 Pha 6 ống thủy tinh m i trƣờng MRS với n ng độ muối lần lƣợt là 0%,
5%, 6.5%, 10%, 18%, 25%, tổng thể t h m i trƣờng mỗi ống là 10ml và 1 ống
chứa 5ml m i trƣờng đã chuẩn bị để hoạt hóa vi khuẩn. Thanh trùng bằng n i áp lực
cao ở 121oC trong 20 phút.
 Chuẩn bị giống T.halophilus CH6-2 dạng lỏng : lấy 1 khuẩn lạc chuyển
vào ống falcol chứa 5ml m i trƣờng MRS (NaCl 5%), vontex đều, nuôi ở 30oC
trong thời gian 5 ngày.
 Cấp 2% giống vào 6 ống thủy tinh m i trƣờng (tiến hành trong box cấy
vơ trùng.)
 S u đó, đem nu i 6 ống trong tủ ấm ở 30oC, thời gian 5 ngày và đo OD
600nm.
 Thí nghiệm đƣợc tiến hành lặp lại 3 lần.
 Từ khảo sát này, ta chọn đƣợc n ng độ muối thích hợp cho nhân giống.

a)

b)

Hình 2.3. Mơi trường khảo sát nồng độ muối trước và sau nuôi
chủng CH6-2
a) Trước nuôi; b) Sau nuôi

15


2.3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của
Tetragenococcus halophilus CH6-2
 Chuẩn bị 4 ống thủy tinh chứ

m i trƣờng MRS (NaCl 5%) với thể tích

m i trƣờng mỗi ống là 10ml và 1 ống chứa 5 ml m i trƣờng hoạt hóa. Thanh trùng
bằng n i áp lực cao ở 121oC trong 20 phút.
 Chuẩn bị giống T.halophilus CH6-2 dạng lỏng : lấy 1 khuẩn lạc chuyển
vào ống falcol chứa 5ml m i trƣờng hoạt hóa, vontex đều, ni ở 30oC trong thời
gian 5 ngày.
 Cấp 2% giống vào 4 ống thủy tinh (tiến hành trong box cấy vô trùng) .
 S u đó, đem nu i cấy 4 ống ở lần lƣợt 25oC, 30oC, 35oC, 40oC trong 5
ngày và đo OD ở 600nm.
 Thí nghiệm đƣợc tiến hành lặp lại 3 lần.
 Từ khảo sát này, ta chọn đƣợc nhiệt độ thích hợp để tiếp tục khảo sát các
thí nghiệm sau.
2.3.1.4. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng sinh trưởng
của Tetragenococcus halophilus CH6-2

 Chuẩn bị 3 ống thủy tinh chứ 3 m i trƣờng th nghiệm MRS, Khống 1,
Khống 2, với thể tích mơi trƣờng mỗi ống là 10ml, pH và n ng độ muối môi
trƣờng dựa vào kết quả của các khảo sát trên. Thanh trùng bằng n i áp lực cao ở
121oC trong 20 phút.
 Chuẩn bị giống T.halophilus CH6-2 dạng lỏng : lấy 1 khuẩn lạc chuyển
vào ống falcol chứ 5ml m i trƣờng MRS đã chọn lọ để hoạt hó , vontex đều.
 Cấp 2% giống vào 3 ống thủy tinh (tiến hành trong box cấy vơ trùng) .
 S u đó, đem nu i 3 ống trong tủ ấm ở nhiệt độ đã khảo sát, trong 5 ngày
và đo OD ở bƣớc sóng 600nm.
 Thí nghiệm đƣợc tiến hành lặp lại 3 lần.
 Từ khảo sát này, ta chọn đƣợ m i trƣờng dinh dƣỡng thích hợp để tiếp
tục khảo sát các thí nghiệm sau.

16