Phát triển quy trình phân tích các hoạt chất cordycepin, adenosin và inosin trong thực phẩm chức năng đông trùng hạ thảo bằng phương pháp điện di mao quản

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
------------***------------

VŨ MINH TUẤN

PHÁT TRIỂN QUY TRÌNH PHÂN TÍCH CÁC HOẠT CHẤT
CORDYCEPIN, ADENOSINE VÀ INOSINE
TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO
BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2020


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
------------***------------

VŨ MINH TUẤN

PHÁT TRIỂN QUY TRÌNH PHÂN TÍCH CÁC HOẠT CHẤT
CORDYCEPIN, ADENOSINE VÀ INOSINE
TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO
BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN

Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 8440112.03

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS. PHẠM HÙNG VIỆT
PGS.TS. DƯƠNG HỒNG ANH

Hà Nội – 2020


LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn GS.TS. Phạm Hùng Việt và PGS.TS. Dương Hồng
Anh đã giao đề tài, nhiệt tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tơi
trong suốt q trình thực hiện luận văn.
Tơi xin chân thành cảm ơn ThS. Nguyễn Thanh Đàm cùng tồn thể các anh,
chị, em trong nhóm điện di mao quản thuộc trung tâm CETASD – Trường Đại học
Khoa học Tự nhiên đã giúp đỡ và hỗ trợ trong quá trình thực hiện nghiên cứu này.
Tơi xin chân thành cảm ơn Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia
(NAFOSTED) đã tài trợ cho nghiên cứu này thông qua đề tài mã số 104.042016.50.
Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy cơ trong Bộ mơn Hóa Phân tích nói riêng
và trong khoa Hóa học nói chung đã dạy dỗ, chỉ bảo và động viên tôi trong thời
gian học tập tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội.
Hà Nội, tháng 11 năm 2020
Học viên

Vũ Minh Tuấn


MỤC LỤC
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ...................................................................... 3
1.1.

Đông trùng hạ thảo....................................................................... 3

1.1.1. Nguồn gốc .................................................................................. 3
1.1.2. Nghiên cứu và phát triển ......................................................... 3
1.1.3. Các thành phần hóa học của Đơng trùng hạ thảo (Cordyceps
militaris)

....................................................................................................6

1.1.4. Giá trị dược liệu của đông trùng hạ thảo (Cordyceps
militaris)
1.2.

....................................................................................................8
Cordycepin, Adenosine, Inosine trong Đông trùng hạ thảo ..... 9

1.2.1. Cordycepin ................................................................................ 9
1.2.2. Adenosine ................................................................................ 12
1.2.3. Inosine ..................................................................................... 14
1.3.

Tổng quan các phương pháp phân tích adenosine, cordycepin

và inosine …………………………………………………………………...15
1.3.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC .................. 15
1.3.2. Phương pháp điện di mao quản ............................................ 19
1.3.3. Nhận xét và đề xuất phương pháp thích hợp ...................... 20
1.4.

Tổng quan về phương pháp điện di mao quản ........................ 21

1.4.1. Nguyên lý tách chất và cấu tạo cơ bản của thiết bị điện di mao
quản

..................................................................................................21
1.4.2. Nguyên tắc nhận biết các chất và cấu tạo cơ bản của detector

độ dẫn không tiếp xúc ................................................................................. 23
1.4.3. Các thông số đánh giá trong điện di mao quản ................... 24


1.4.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chất .............. 25
1.5.

Cơ sở thiết kế thí nghiệm xác định các hợp chất adenosine,

cordycepin và inosine bằng phương pháp CE-C4D ..................................... 26
CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM .............................................................. 29
2.1.

Mục tiêu và nội dung nghiên cứu .............................................. 29

2.1.1. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................... 29
2.1.2. Nội dung nghiên cứu .............................................................. 29
2.2.

Hóa chất và thiết bị .................................................................... 30

2.2.1. Hóa chất .................................................................................. 30
2.2.2. Hệ thiết bị điện di mao quản ................................................. 31

2.2.3. Thiết bị và dụng cụ phụ trợ ................................................... 33
2.2.4. Chuẩn bị mẫu ......................................................................... 33
2.3.

Phương pháp nghiên cứu ........................................................... 33

2.3.1. Khảo sát điều kiện phân tích adenosine và cordycepin trên
kênh 1

..................................................................................................34

2.3.2. Khảo sát điều kiện phân tích inosine trên kênh 2 ............... 34
2.4.

Xác định các thơng số đánh giá phương pháp phân tích ........ 34

2.4.1. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) . 35
2.4.2. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn ..................................... 35
2.4.3. Độ chính xác của phương pháp ............................................. 35
2.5.

Áp dụng phân tích mẫu thực ..................................................... 37

2.6.

Xử lý số liệu ................................................................................. 37

CHƯƠNG 3. Kết quả và thảo luận ........................................................ 39

3.1.

Phát triển quy trình phân tích adenosine và cordycepin trên
…………………………………………………………………..39

kênh 1

3.1.1. Kết quả khảo sát các BGE ..................................................... 39
3.1.2. Kết quả khảo sát điện thế tách .............................................. 42
3.2.

Phát triển quy trình phân tích inosine trên kênh 2 ................. 43

3.2.1. Khảo sát thành phần của dung dịch điện ly nền ................. 43
3.2.2. Khảo sát pH của dung dịch điện ly nền ............................... 45
3.2.3. Khảo sát nồng độ dung dịch đệm điện ly ............................. 46
3.3.

Đánh giá phương pháp............................................................... 49

3.3.1. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng .......................... 49
3.3.2. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn ..................................... 50
3.3.3. Độ lặp lại và độ tái lặp ........................................................... 53
3.3.4. Độ đúng của phương pháp .................................................... 53
3.4.
Kết luận

Áp dụng phân tích mẫu thực ..................................................... 55
…………………………………………………………….58

Tài liệu tham khảo ..................................................................................... 59


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Một số phương pháp sắc ký lỏng phân tích adenosine, cordycepin
và inosine……………………………………………………………………….16
Bảng 3.1. Điều kiện tối ưu quy trình phân tích ............................................... 49
Bảng 3.2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ..................................... 50
Bảng 3.3. Thông số đánh giá đường chuẩn ...................................................... 51
Bảng 3.4. Độ lặp lại và độ tái lặp ...................................................................... 53
Bảng 3.5. Kết quả phân tích đánh giá độ đúng của phương pháp phân
tích………………………………………………………………………………54
Bảng 3.6. Kết quả phân tích mẫu thực ............................................................. 56


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cordyceps sinensis tìm thấy trên đồng cỏ ở độ cao 4200 m trên mực
nước biển tại Tây Tạng ........................................................................................ 4
Hình 1.2. Quả thể nấm C. militaris trên ký chủ nhộng ..................................... 5
Hình 1.3. Sơ đồ cấu tạo của hệ thống điện di mao quản ................................ 21
Hình 1.4. Mơ hình của đo độ dẫn khơng tiếp xúc và mạch điện tương đương
.............................................................................................................................. 24
Hình 2.1. Hệ thiết bị điện di mao quản hai kênh loại xách tay ...................... 31
Hình 2.2. Sơ đồ cấu tạo của bộ phận dẫn lưu lỏng 2 kênh…………………..32
Hình 3.1. Điện di đồ thu được khi khảo sát các BGE với thành phần acid hữu
cơ khác nhau để tách adenosine và cordycepin ............................................... 39
Hình 3.2. Điện di đồ thu được khi khảo sát các BGE với thành phần acid acetic
ở các nồng độ khác nhau ................................................................................... 40
Hình 3.3. Biểu đồ minh họa sự thay đổi về diện tích pic của Cor (PA1) và Ade
(PA2) cũng như độ phân giải giữa Cor và Ade (R) thu được khi khảo sát các

BGE với thành phần acid acetic ở các nồng độ khác nhau ............................ 41
Hình 3.4. Điện di đồ thu được khi khảo sát BGE với thành phần acid acetic
0,25 M trên nền mẫu thực …………………………………………………….42
Hình 3.5. Điện di đồ thu được khi khảo sát ảnh hưởng của điện thế tách đối
với q trình phân tích adenosine và cordycepin với BGE acid acetic 0.25 M
(pH =2.54)............................................................................................................ 43
Hình 3.6. Điện di đồ lựa chọn thành phần BGE (tại pH 9,0; 50 mM Tris) phân
tích inosine .......................................................................................................... 44


Hình 3.7. Điện di đồ khảo sát các pH khác nhau của dung dịch 50 mM
Tris/For phân tích inosine (20 mg/L) ............................................................... 46
Hình 3.8. Điện di đồ khảo sát nồng độ BGE phân tích inosine ...................... 47
Hình 3.9. Điện di đồ khảo sát nồng độ Tris trong dung dịch BGE phân tích
inosine trên nền mẫu thực……………………………………………………...48
Hình 3.10. Biểu đồ đường chuẩn Adenosine ...................................................... 52
Hình 3.11. Biểu đồ đường chuẩn Cordycepin .................................................... 52
Hình 3.12. Biểu đồ đường chuẩn Inosine ........................................................... 52
Hình 3.13. Điện di đồ đánh giá độ đúng của phương pháp .......................... 544
Hình 3.14. Điện di đồ phân tích inosine trong mẫu thực ................................ 57
Hình 3.15. Điện di đồ phân tích adenosine và cordycepin trong mẫu thực .. 57


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Tên viết tắt

Tên đầy đủ

Ade

Adenosine

Ace

Acid acetic

BGE

Dung dịch điện ly nền

C4D

Detector độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện

CE

Phương pháp điện di mao quản

CHES

Acid N-Cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic

Cit

Acid citric

Cor

Cordycepin

CZE

Điện di mao quản vùng

ĐTHT

Đơng trùng hạ thảo

EOF

Dịng điện di thẩm thấu

For

Acid formic

GC-MS

Sắc ký khí – detector khối phổ

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IDL

Giới hạn phát hiện của thiết bị

Ino

Inosine


IQL

Giới hạn định lượng của thiết bị

Lac

Acid lactic

Leff

Chiều dài hiệu dụng của mao quản

Ltot

Tổng chiều dài mao quản

MDL

Giới hạn phát hiện của phương pháp

MQL

Giới hạn định lượng của phương pháp

MEKC

Điện di mao quản điện động học Mixen

MES

Acid 2-(N-morpholino) ethanesulfonic

MOPS

Acid 3-(N-morpholino) propanesulfonic

Suc

Acid succinic

Tris

Tris(hydroxymethyl)aminomethane

UV – Vis

Quang phổ hấp thụ phân tử

%RSD

% độ lệch chuẩn tương đối

%SD

% độ lệch chuẩn

MỞ ĐẦU
Ngày nay, nhu cầu sử dụng các thảo dược có nguồn gốc từ thiên nhiên như:
đơng trùng hạ thảo, nấm linh chi, nhân sâm, sâm Ngọc Linh,… để phòng và trị
bệnh đã trở nên phổ biến. Trong đó, đơng trùng hạ thảo (ĐTHT) là một loại dược
liệu tự nhiên quý hiếm, được dùng như thuốc chữa bệnh và bồi bổ cơ thể. Loại
thảo dược này có sự hình thành đặc biệt, là sự kết hợp giữa nấm và ấu trùng. Sử
dụng đúng cách đông trùng hạ thảo sẽ mang lại nhiều cơng dụng tốt cho sức khỏe
như có thể ni dưỡng phổi, thận, có tác dụng điều hịa miễn dịch, chống oxy hóa,
kháng u, chống viêm...[45]. Nhu cầu thị trường đối với đông trùng hạ thảo dùng
làm thuốc, thực phẩm hoặc thuốc bổ là rất lớn, đặc biệt là ở Trung Quốc và Việt
Nam. Số lượng đông trùng hạ thảo ngồi thiên nhiên rất hạn chế do vịng đời phức
tạp, ký sinh bắt buộc và môi trường sống nghiêm ngặt, thêm vào sự khai thác quá
mức đã làm sụt giảm trầm trọng khiến dược liệu này đắt hơn vàng, thậm chí có giá
lên tới 100000 USD/kg [29]. Do giá cao và số lượng đông trùng hạ thảo mọc trong
tự nhiên gần như cạn kiệt, chúng ngày càng được nuôi cấy nhiều hơn. Đồng thời,
rất nhiều hàng giả, hàng kém chất lượng đã được đưa vào thị trường và rất khó
nhận biết dựa trên hình thái của chúng. Cho đến nay, các nucleoside ở dược liệu
tự nhiên đem lại nhiều tác dụng quý cho con người, được công nhận là các thành
phần hoạt tính sinh học chính và được sử dụng làm chất đánh dấu hóa học chính
để kiểm tra chất lượng của đông trùng hạ thảo [26]. Trong số các nucleoside này,
cordycepin (Cor, 3’-deoxyAdenosine), adenosine (Ade) và inosine (Ino) là các
thành phần quan trọng nhất, có thể được sử dụng làm chỉ số để đánh giá chất lượng,
đảm bảo tính xác thực của ĐTHT cũng như thực phẩm chức năng có thành phần
ĐTHT [5]. Do đó, việc thiết lập một phương pháp kiểm soát chất lượng adenosine,
cordycepin và inosine nhanh, nhạy và đáng tin cậy là rất quan trọng để phát triển
và sử dụng dược liệu đông trùng hạ thảo.
Các phương pháp phân tích để xác định nucleoside trong đông trùng hạ thảo
và các sản phẩm từ đông trùng hạ thảo chủ yếu dựa trên sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC) sử dụng các loại detector khác nhau [21, 22, 27, 34, 41, 56, 59, 60]. HPLC

1


cũng là phương pháp thường xuyên được sử dụng để kiểm soát chất lượng sản
phẩm này tại Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia. Tuy nhiên,
chi phí cao cho việc thiết lập cơng cụ, bảo trì và phân tích mẫu khiến việc sử dụng
nó để sàng lọc và phân tích nhanh các nucleoside trong kiểm sốt chất lượng đông
trùng hạ thảo không phù hợp với nhiều trung tâm phân tích địa phương với chun
mơn hạn chế và nguồn tài chính khiêm tốn. Với khả năng phân tích nhanh, hiệu
quả và sử dụng ít dung mơi hóa chất, điện di mao quản (CE) có thể được coi là một
giải pháp thích hợp thay thế cho HPLC. Việc sử dụng các kỹ thuật CE để tách
nucleoside trong đông trùng hạ thảo đã được thực hiện, sử dụng các thiết bị CE
thương mại kết hợp với detector khối phổ (MS) hoặc tử ngoại (UV) [13, 26, 35,
52]. Việc sử dụng kết hợp giữa thiết bị CE tự chế tạo loại xách tay và detector đo
độ dẫn không tiếp xúc (C4D) có thể là giải pháp hợp lý khi CE-C4D có u cầu chi
phí đầu tư và vật tư tiêu hao không cao cũng như tương đối đơn giản trong vận
hành. Bởi vậy, với ý tưởng phát triển phương pháp điện di mao quản trong phân
tích các nucleoside trong đơng trùng hạ thảo, đề tài luận văn “Phát triển quy trình
phân tích các hoạt chất Cordycepin, Adenosine và Inosine trong thực phẩm
chức năng Đông trùng hạ thảo bằng phương pháp điện di mao quản” đã được
thực hiện.
Nghiên cứu này trình bày việc phát triển quy trình phân tích trên cơ sở sử
dụng thiết bị CE-C4D hai kênh để xác định nhanh các nucleoside khác nhau, cụ thể
là adenosine, inosine và cordycepin, trong các sản phẩm thực phẩm chức năng có
thành phần đông trùng hạ thảo trên thị trường. Kết quả phân tích thu được với CEC4D được kiểm tra chéo với phương pháp tham chiếu (HPLC-DAD) nhằm chứng
minh độ tin cậy của dữ liệu phân tích. Nghiên cứu này là một nỗ lực trong việc phổ
biến rộng rãi CE-C4D trở thành một công cụ hợp lý cho các hoạt động kiểm soát
chất lượng thực phẩm.

2


CHƯƠNG 1.
1.1.

TỔNG QUAN

Đông trùng hạ thảo

1.1.1. Nguồn gốc
Đông trùng hạ thảo được hình thành khi ấu trùng các lồi bướm thuộc chi
Thitarodes bị nấm thuộc chi Ophiocordyceps và/hoặc Cordyceps ký sinh [42].
Thường gặp nhất là sâu non của loài Thitarodes baimaensis hoặc Thitarodes
armoricanus. Ngồi ra cịn 46 lồi khác thuộc chi Thitarodes cũng có thể
bị Ophiocordyceps sinensis ký sinh. Các loài nấm này phân bố rộng ở châu Á và
châu Úc với trung tâm đa dạng là vùng Đông Á, đó là các vùng cao nguyên cao
hơn mặt biển từ 4000 đến 5000m như: Tây Tạng, Tứ Xuyên, Thanh Hải, Cam Túc,
Vân Nam...
Vào mùa đông, nấm bắt đầu ký sinh vào sâu non và làm chết sâu non vì ăn
hết chất dinh dưỡng của chúng. Những con sâu này có thể đã ăn phải bào tử nấm
hoặc chúng mắc bệnh nấm ký sinh từ các lỗ thở. Đến khi sợi nấm phát triển mạnh,
chúng xâm nhiễm vào các mô vật chủ, sử dụng hoàn toàn các chất dinh dưỡng
trong cơ thể sâu. Đến một giai đoạn nhất định thường là vào mùa hè ấm áp, nấm
bắt đầu mọc ra khỏi sâu như một ngọn cỏ và vươn lên khỏi mặt đất phát triển thành
dạng cây (hình dạng giống thực vật) và phát tán bào tử. Hiện nay nhiều loài nấm
thuộc chi Ophiocordyceps và Cordyceps được nuôi trồng trên quy mô cơng nghiệp
để tinh chế các cơ chất có dược tính.
1.1.2. Nghiên cứu và phát triển
Nấm dược liệu từ lâu đã là một phần quan trọng của văn hóa và nền văn

minh nhân loại, đăc biệt các loài trong giống Cordyceps được đánh giá cao do chứa
nhiều hợp chất dược liệu [31]. Hiện nay, có khoảng 680 lồi nấm thuộc chi
Cordyceps [16]. Hai lồi nấm đơng trùng hạ thảo được sử dụng lâu đời trong y học
cổ truyền Trung Quốc là Cordyceps sinensis (tên khác: Ophiocordyceps sinensis)
và Cordyceps militaris, hiện nay đang được nghiên cứu rất nhiều về chiết xuất và
sản xuất do có giá tri dược liệu và giá trị kinh tế cao [27, 30].

3


Nấm đơng trùng hạ thảo Ophiocordyceps sinensis (hay cịn gọi là
Cordyceps sinensis) là một loại nấm dược liệu có phân bố rất hạn chế trong tự
nhiên, chủ yếu ở các vùng núi cao thuộc dãy núi Hymalaya có độ cao trên 4000 m
so với mực nước biển như vùng Tây Tạng (Trung Quốc) (Hình 1.1), một số vùng
Nepan và Butan; chỉ được ni trồng trong điều kiện hoang dã, lồi nấm này hiện
tại vẫn chưa được nuôi trồng thành công trong mơi trường nhân tạo, do đó sản
lượng nấm thu được không đáp ứng đủ nhu cầu của thị trường [27,40, 55].

Hình 1.1. Cordyceps sinensis tìm thấy trên đồng cỏ ở độ cao 4200 m trên mực
nước biển tại Tây Tạng (Daniel Winkler, 2010)
Lồi đơng trùng hạ thảo Cordyceps militaris (thường được gọi nấm cam sâu
bướm), chứa các hợp chất hóa học tương tự như của O. sinensis, được tìm thấy ở
vùng núi thấp hơn, có độ cao 2000 – 3000 m, phân bố rộng (Trung Quốc, Nhật
Bản, Hàn Quốc và các nước trong khu vực Đông Nam Á) [27, 43, 46], và có thể
dễ dàng ni trồng trong mơi trường nhân tạo [11]. Hiện nay, đã có nhiều nghiên
cứu về quy trı̀nh nuôi trồng nấm C. militarisis nhằm thay thế cho lồi O. Sinensis
và có nhiều nghiên cứu quan trọng về gen, nhu cầu dinh dưỡng, môi trường nuôi
cấy, các đặc tính sinh hóa và dược lý của nấm C. militaris [57].

4

Có hơn 400 phân lồi Cordyceps đã tìm thấy và mơ tả, tuy nhiên chỉ có
khoảng 36 lồi được ni trồng trong điều kiện nhân tạo để sản xuất quả thể [27,
43, 46]. Trong số những lồi này, chỉ có lồi C. militaris đã được trồng ở quy mơ
lớn do nó có dược tính rất tốt và có thời gian sản xuất ngắn [27]. Quả thể của nấm
Cordyceps militaris (Hình 1.2) dùng làm thực phẩm, dùng trong các món hầm,
súp, trà... ở các nước Đông Nam Á như Hongkong, Đài Loan, Trung Quốc. Liều
dùng an toàn được khuyến nghị là ıt́ hơn 2,5 g/kg thể trọng [8]. Quả thể và sinh
khối nấm cũng được sử dụng làm thuốc và bồi bổ sức khỏe [47]. Các loại thuốc từ
nấm này dùng duy trì chức năng thận, phổi, chống lão hóa, điều hịa giấc ngủ, viêm
phế quản mãn tính [10].

Hình 1.2. Quả thể nấm C. militaris trên ký chủ nhộng
Hiện nay không thể thống kê được có bao nhiêu chế phẩm chứa đông trùng
hạ thảo được bán trên thị trường. Đông trùng hạ thảo được đưa vào trong chế phẩm
một thành phần hoặc kết hợp với một số dược liệu bổ, quý hiếm khác như nhân
sâm, tam thất, tổ yến. Các dạng bào chế thường gặp là dạng rắn (viên nang,
viên hoàn, gói bột) và dạng lỏng (nước uống, cao lỏng). Có thể kể tên một vài
chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo như sau:

5


- Dạng rắn: viên nang Pure cordyceps capsule, viên Đông trùng hạ thảo
Tenken, bột Cordyceps extract…
- Dạng lỏng: cao lỏng đông trùng hạ thảo tam thất, nước Yến Đông trùng hạ
thảo, nước uống Đông trùng hạ thảo He Yuan Tang – King of cordyceps, nước
cốt gà Đông trùng hạ thảo…
Ở Việt Nam, đã có nhiều cơng ty và đơn vi ̣ nghiên cứu sản xuất thành công

nấm Đông trùng ha ̣thảo (C. militaris). Trong đó Cơng ty Cổ phần Dược thảo Thiên
Phúc được xem là công ty sản xuất đông trùng hạ thảo với qui mô lớn nhất với nhà
xưởng đặt tại Hà Nội và Đà Lạt. Hiện nay, các sản phẩm có nguồn gốc từ đơng
trùng hạ thảo tại Việt Nam rất đa dạng như: dạng đông trùng hạ thảo sau thu hoạch
chỉ được sấy khô, đông trùng hạ thảo dạng viên nén hoặc viên nhộng, đông trùng
hạ thảo kết hợp với linh chi, đông trùng hạ thảo dạng nước,…Tuy nhiên, đặc điểm
chung là các sản phẩm đông trùng hạ thảo có giá thành tương đối cao.
Do giá trị kinh tế cao và quý hiếm nên các sản phẩm hàng giả, hàng kém
chất lượng về Đông trùng hạ thảo và thực phẩm chức năng có chứa Đơng trùng hạ
thảo đã xuất hiện nhiều trên thị trường Việt Nam nói riêng và thị trường thế giới
nói chung.
1.1.3. Các thành phần hóa học của Đơng trùng hạ thảo (Cordyceps militaris)
Theo số liệu nghiên cứu về thành phần hóa học của thể quả nấm C. militaris
cho thấy loài nấm này chứa các thành phần như protein chiếm 40,69%; các loại
vitamin: vitamin A (34,7 mg/gam), vitamin B1 (13,0 mg/gam), vitamin B6 (62,2
mg/gam), vitamin B12 (70,3 mg/gam), vitamin B3 (42,9 mg/gam); các nguyên tố
khoáng: Se (0,44 ppm), Zn (130,0 ppm), Cu (29,15 ppm); hợp chất hóa học và
nhóm hợp chất quan trọng: cordycepin (1,52%), acid cordycepic (11,8%),
polychaccarit (30%) [37].
Acid amin

6


Kết quả nghiên cứu của Hur (2008) cho thấy trong quả thể nấm Cordyceps
militaris có chứa lượng acid amin tổng số cao hơn trong sinh khối nấm (69,32
mg/g trong quả thể và 14,03 mg/g trong sinh khối nấm) [18]. Khối lượng acid amin
mỗi loại trong quả thể và sinh khối nấm cũng có sự chênh lêch, dao động từ 1,15 ̣
 15,06 mg/g và 0,36  2,99 mg/g. Thành phần acid amin của mỗi loại trong quả
thể bao gồm: lysin (15,06 mg/g), acid glutamic (8,79 mg/g), prolin (6,68 mg/g),

threonin (5,99 mg/g), arginin (5,29 mg/g), và alanin (5,18 mg/g). Số liệu phân tích
của Chang và cộng sự (2001) cho thấy phần lớn trong sinh khối nấm chứa acid
aspartic (2,66 mg/g), valin (2,21 mg/g) và tyrosin (1,57 mg/g) [7].
Acid béo
Quả thể nấm Cordyceps militaris chứa nhiều acid béo không no, chiếm 70%
tổng số acid béo, trong đó lượng acid linoleic chiếm đến 61,3% trong quả thể và
21,5% trong sinh khối. Lượng acid béo no chủ yếu là acid palmitic, chiếm 24,5%
trong quả thể và 33,0% trong sinh khối.
Adenosine và Cordycepin
Adenosine và cordycepin là hai hợp chất có dược tính cao của nấm Cordyceps
militaris. Adenosine chiếm 0,18% trong quả thể và 0,06% trong sinh khối nấm.
Đối với hợp chất cordycepin, trong quả thể có hàm lượng cao gấp 3 lần so với sinh
khối (0,97% so với 0,36%) [18].
Polisaccarit
Các polisaccarit CPS-1 và CPS-2 được tách chiết từ nấm Cordyceps militaris
cho thấy chúng có thành phần từ các đơn phân là các đường monosaccarit,
mannoza và glactoza. Kết quả nghiên cứu cho thấy hai loai polisaccarit này có khả
năng phục hồi các tổn thương gan do etanol, và tác dụng này tăng lên khi tăng liều
dùng. Yan et al., 2008 cho rằng tác dụng này có thể do chức năng chống oxy hóa
của các polisaccarit từ nấm [51].

7


1.1.4. Giá trị dược liệu của đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris)
Nấm Cordyceps được gọi là “Đông trùng hạ thảo” đã được sử dụng như là
loại dược liệu dân gian truyền thống và là thành phần thực phẩm có tác dụng tăng
cường hệ thống miễn dịch, phục hồi năng lượng tương tự nhân sâm của các quốc
gia Châu Á như Hàn Quốc, Nhật Bản và Trung Quốc. Các hợp chất có hoạt tính
sinh học có trong đơng trùng hạ thảo đã được nghiên cứu ly trích, đánh giá khả

năng trong tri ̣liệu và đã được ứng dụng rộng rãi trong điều tri ̣bệnh và nâng cao
sức khỏe cho con người với kết quả rất tốt. Adenosine và cordycepin là hai hợp
chất có dược tính cao của đơng trùng hạ thảo.
Hoạt tính kháng oxy hóa: Các nghiên cứu cho thấy chất CM-hs-CPS2 chứa
trong dịch chiết nấm Cordyceps militaris có tính kháng DPPH, hoạt tính khử và
tạo phức ở nồng độ (8mg/m) là 89%, 1,188 và 85% [12].
Tăng số lượng tinh trùng: Nghiên cứu trên lợn cho thấy khi dùng chế phẩm
từ Cordyceps militaris số lượng tinh trùng tăng, số phần trăm tinh trùng di động
và hình dạng bình thường tăng. Hiệu quả này được duy trì thậm chí sau 2 tuần
ngưng sử dụng chế phẩm. Lượng cordycepin trong tế bào tăng trong thời gian sử
dụng chế phẩm nên có khả năng chất này làm tăng lượng tinh dịch và chất lượng
tinh trùng ở lợn [49].
Hạn chế virus cúm: Polisaccarit có tính acid (APS) tách chiết từ nấm
Cordyceps militaris nuôi trồng trên đậu nành nảy mầm có khả năng ứng dụng trong
điều trị cúm A. Chất này góp phần điều hịa hoạt động miễn dịch của các đại thực
bào [54].
Kháng khuẩn, kháng nấm và kháng ung thư: protein CMP tách chiết từ
Cordyceps militaris có kích thước 12kDa, pI 5,1 và có hoạt tính trong khoảng pH
7-9. Protein này ức chế nấm Fusariumoxysporum và gây độc đối với tế bào ung
thư bàng quang [6]. Hợp chất cordycepin còn cho thấy khả năng kháng vi khuẩn
Clostridium [53]. Cordycepin ngăn sự biểu hiện của gen T2D chịu trách nhiệm
điều hịa bệnh tiểu đường thơng qua việc ức chế các phản ứng viêm phụ thuộc NF-

8


κB, do đó được hi vọng sẽ ứng dụng được như một chất điều hòa miễn dịch dùng
trong điều trị các bệnh về miễn dịch [36].
Tan huyết khối: Enzym tiêu sợi huyết tách chiết từ nấm Cordyceps militaris
có hoạt tính gắn fibrin và do đó xúc tiến việc phân hủy fibrin. Enzym này có khả

năng sử dụng trong điều trị tan huyết khối tương tự như các enzym fibrinolytic
mạnh khác như nattokinaza và enzym chiết từ giun đất. Khi enzym này có thể sản
xuất ở quy mơ lớn sẽ là một giải pháp thay thế hữu hiệu cho các enzym fibrinolytic
giá thành cao hiện đang được sử dụng cho bệnh tim lão hóa ở người [19].
Tính kháng viêm: Để xác định tác dụng kháng viêm của nấm, dịch chiết từ
quả thể nấm Cordyceps militaris (CMWE) đã được thử nghiệm về tác dụng kiểm
sốt lipopolisaccarit (LPS) (chịu trách nhiệm kích thích việc sản xuất nitric oxit),
việc giải phóng các yếu tố hoại tử khối u α (TNF-α) và interleukin-6 (IL-6) của tế
bào RAW 264.7. Các đại thực bào được xử lý với nồng độ khác nhau của CMWE
làm giảm đáng kể LPS, TNF- α và IL-6 và mức độ giảm theo nồng độ của dịch
chiết. Những kết quả này cho thấy rằng CMWE có tác dụng ức chế mạnh đến việc
sản xuất các chất trung gian gây viêm của tế bào [50].
1.2.

Cordycepin, Adenosine, Inosine trong Đông trùng hạ thảo
Các thành phần hoạt tính sinh học chính trong Đơng trùng hạ thảo bao gồm

các nucleoside, polysacarit và sterol. Trong số này, các nucleoside như cordycepin,
adenosine và inosine được công nhận là thành phần hoạt tính sinh học quan trọng
và được sử dụng làm chất đánh dấu hóa học để kiểm tra chất lượng, đảm bảo tính
xác thực của đơng trùng hạ thảo cũng như thực phẩm chức năng có thành phần
đơng trùng hạ thảo.
1.2.1. Cordycepin
Cordycepin (hay 3'-deoxyAdenosine) là một dẫn xuất của nucleoside
adenosine, khác với chất sau là khơng có nhóm hydroxy ở vị trí 3 ' của gốc ribose
của nó. Ban đầu nó được chiết xuất từ nấm Cordyceps militaris , nhưng bây giờ có

9

thể được sản xuất tổng hợp. Nó cũng được tìm thấy trong các lồi Đơng trùng hạ
thảo khác cũng như Ophiocordyceps sinensis.

Cordycepin
Tên khoa học: 9-(3-deoxy-β-D-ribofuranosyl) adenin
Công thức phân tử: C10H13N5O3
Trọng lượng phân tử: 251,24
pKa1= 3,8; pKa2 = 12,3
Phân tử cordycepin tính kiềm, dạng bột hoặc tinh thể bơng tuyết.
Nhiệt độ nóng chảy: 228 – 231oC
Tan trong DMSO, methanol, ethanol
Bước sóng hấp thụ cực đại 259,0 nm.
Bởi vì cordycepin tương tự như Adenosine, một số enzym không thể phân
biệt giữa hai loại. Do đó, nó có thể tham gia vào các phản ứng sinh hóa nhất định
(ví dụ, kết hợp vào phân tử mRNA, dẫn đến kết thúc sớm quá trình tổng hợp
protein). Cordycepin, là chất tương tự Adenosine đáng chú ý nhất từ một số loại
Đông trùng hạ thảo, cho thấy các hoạt động dược lý khác nhau, chẳng hạn như các
hoạt động kháng khuẩn, kháng u, chống viêm và điều hòa miễn dịch [20, 44, 58].

10


Cordycepin đã thể hiện độc tính tế bào chống lại một số dòng tế bào bạch
cầu trong ống nghiệm. Cordycepin tạo ra tác dụng chống trầm cảm nhanh chóng
và mạnh mẽ thơng qua con đường truyền tín hiệu AMPA [28].
Về tác dụng trị liệu của cordycepin, một nghiên cứu về cordycepin trong
Đông trùng Hạ thảo cho thấy hợp chất này có hai tác dụng trên tế bào:
(1) Ở liều thấp, cordycepin ức chế tăng trưởng khơng kiểm sốt và phân hóa
tế bào.
(2) Ở liều cao, cordycepin chặn đứng tế bào khơng cho dính chặt với nhau

nên sẽ ức chế tăng trưởng.
Cả hai tác dụng này có lẽ cùng dưới một cơ chế là cordycepin can thiệp vào
sự tổng hợp protein của tế bào. Ở liều thấp, cordycepin can thiệp vào sản xuất
ribonucleic acid messenger) và ở liều cao, cordycepin tác dụng trực tiếp lên sự sản
xuất protein. Chính vì vậy, các nhà khoa học cho rằng Đông trùng Hạ thảo có tác
dụng mạnh trong việc chống ung thư. Hợp chất cordycepin từ nấm cho thấy có
hoạt tính kháng vi sinh vật, kháng ung thư, ngừa di căn, điều hòa miễn dịch [38].
Các nghiên cứu của một số nhà khoa học khác cho rằng, cordycepin khi đi
vào bên trong tế bào sẽ được chuyển hóa thành mono, di, hoặc tri-phosphate và có
tác dụng ức chế các enzym tổng hợp purin. Bên cạnh đó, nghiên cứu cũng cho thấy
cordycepin có tác dụng kích hoạt sự kết thúc q trình tổng hợp DNA hoặc RNA
bên trong tế bào [9].

11


1.2.2. Adenosine

Tên khoa học: 9 - β-D-ribofuranosyl adenin
Công thức phân tử: C10H13N5O4
Trọng lượng phân tử: 267,24
pKa1 = 3,6; pKa2 = 12,5
Adenosine dạng bột tinh thể màu trắng.
Nhiệt độ nóng chảy: 234 – 235oC.
Tan trong Ethylen glycol, nước, methanol, ethanol…
Bước sóng hấp thụ cực đại 259 nm
Adenosine là một hợp chất hữu cơ xuất hiện rộng rãi trong tự nhiên dưới
dạng các dẫn xuất đa dạng. Phân tử bao gồm một adenin gắn với một ribose thông
qua liên kết β-N9 - glycosidic. Adenosine là một trong bốn khối cấu tạo nucleoside
của RNA, chất cần thiết cho mọi sự sống. Adenosine đóng một vai trị quan trọng

trong các q trình sinh hóa ở sinh vật, là một nucleoside chính trong Đơng trùng
hạ thảo và được cơng nhận là chất đánh dấu hóa học để kiểm tra chất lượng của
Đông trùng hạ thảo (Ophiocordyceps sinensis) và các sản phẩm thay thế của nó ở
Trung Quốc [33]. Hoạt chất này được chứng minh với khả năng điều tiết các q
trình sinh lí trong cơ thể con người bao gồm: bảo vệ tim cùng các chức năng của
tiểu cầu, giãn nở mạch máu.

12


Các cơng trình nghiên cứu và các ứng dụng trong thực tế đã chỉ ra adenosine
có những tác dụng dưới đây:
Ổn định huyết áp, hỗ trợ điều trị và phòng tránh các bệnh tim mạch:
adenosine có mặt ở mọi tế bào trong cơ thể con người đồng thời tham gia vào mọi
hoạt động sống của chúng ta. Hoạt chất này tham gia vào q trình điều hịa nhịp
tim, khắc phục hiện tượng loạn và chậm nhịp tim, cải thiện hệ tuần hoàn ngoại
biên và tim mạch, tăng lượng oxy trong máu. Bên cạnh đó, adenosine cịn được
ghi nhận với khả năng ức chế hoạt động ngưng trệ tiểu cầu quá mức, đồng thời hạn
chế tình trạng mắc và phịng chống các bệnh về mạch máu như: nhồi máu cơ tim,
tắc mạch máu não, máu lưu thơng kém…[32].
Duy trì q trình tuần hồn, tăng cường oxy trong máu: adenosine có trong
đơng trùng hạ thảo giúp gia tăng lượng oxy trong máu, hỗ trợ sự giãn nở của các
mạch máu, cung cấp dưỡng khí cho sự tuần hồn máu của cơ thể.
Cải thiện sức khỏe: adenosine cùng các thành phần khác trong đơng trùng hạ
thảo có khả năng cung cấp năng lượng cùng các chất dinh dinh dưỡng cần thiết
giúp duy trì các hoạt động sống của cơ thể đồng thời hồi phục sức khỏe cũng những
người mới ốm dậy, cơ thể suy nhược...
Cải thiện khả năng sinh lí: adenosine có tác dụng tích cực trong việc cải thiện
tuần hồn vi và lưu lượng máu cục bộ của thận, bên cạnh đó, hoạt chất này có thể
điều tiết hàm lượng prostaglandin trong thận cùng các nội tiết tố, các tổ chức thần

kinh của chức năng sinh dục.
Ổn định thần kinh: Hoạt chất này giúp ổn định tinh thần, giải tỏa căng thẳng,
mệt mỏi, giảm bớt tình trạng đau đầu, chóng mặt, hỗ trợ hoạt động của hệ thần
kinh. Bên cạnh đó, adenosine giúp điều tiết q trình sinh hóa của giấc ngủ, giúp
chúng ta có giấc ngủ sâu, ổn định thơng qua tác dụng ổn định và chống thiếu dưỡng
khí. Theo một số kết quả nghiên cứu trên thế giới, adenosine được ghi nhận với

13


tác dụng giảm kích thích thần kinh, hoạt chất này có nồng độ thấp bất thường trong
những bệnh nhân bị động kinh đồng thời làm giảm các cơn co giật của căn bệnh
này khi thí nghiệm trên chuột [39].
Hoạt chất adenosine trong đông trùng hạ thảo được ghi nhận với hàm lượng
khá cao. Bởi vậy, việc sử dụng đông trùng hạ thảo sẽ giúp cơ thể hấp thụ được các
dưỡng chất đồng thời thu nhận được những giá trị tích cực của adenosine với sức
khỏe con người.
1.2.3. Inosine
Inosine là một nucleoside được hình thành khi hypoxanthine được gắn vào
vịng ribose (cịn được gọi là ribofuranose) thơng qua liên kết β-N9 -glycosidic.

Inosine
Tên khoa học: 9-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]6,9-dihydro-3H-purin-6-one
Công thức phân tử: C10H12N4O5
Khối lượng phân tử: 268.229 g·mol−1
pKa1 = 1,2; pKa2 = 8,9
Tan trong nước, methanol, ethanol.

14