Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử định danh loài một số chủng nấm men và xác định tỷ lệ đề kháng với thuốc kháng nấm bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch

Yersinia pesiis in sputum by real-time PCR. J Clin
Microbiol. 2003. 41 (10) pp. .4873-5.
_
11. Lovchik, J. A., Drysdale M., Koehler T. M , et aỉ.
Expression of either lethal toxin or edema toxin by Bacillus
anthracis is sufficient for virulence in a rabbit model of
inhalational anthrax. Infect Immun. 2012. 80(7), pp. 241425.
12. Ngan, G. J „ Ng L. M., Lin R. I ., et a!.
Development of a novel multiplex PCR for the detection
and differentiation of Salmonella enterica serovars Typhi
and Paratyphi A. Res Microbiol. 2010.161(4), pp. 243-8.
PHỤ LỤC

Phụ lục gồm:
Phụ lục 1. Các bài báo đã cơng bố liên quan đến cơng
trình
Đinh Thị Thu Hằng và Nguyễn Thái Sơn. Nghiên cứu
tồn bộ trình tự gen pagA ỉren một số chủng Bacilius
anthracis phân íập ở miền Bắc Việt Nam. Tạp chí Y Dược
học Quân sự. 2015.40(3), pp. 135-143.

Đinh Thị Thu Hằng, Nguyễn Thái Sơn, Đoàn Trọng
Tuyên và CS. Thiết kế chửng nội tại tái tổ hợp trong phản
ứng multiplex PCR chẩn đoan Bacillus anthràcis. Tạp chí
Y Dược học Quân sự. 2015.40(6), pp. 17-26.
Đinh Thị Thu Hằng, Nguyễn Thái Sơn, Nghiêm Ngọc
Minh. Phát triền phàn ưng multiplex PCR chứa chửng nội
tại tải tổ hợp xác định đổng thời vi khuẩn Bacillus
a n iu ia ^ iS

VO

to r s in ic a

p c ? d ik > .

i
Ỵ

It y is

U Ự fJ iiU n y .

2015. XXV(8 (168)), pp. 239-246.
Phụ lục 2, Đăng ký sáng chế của Cục Sở hữu Trí tuệ
Việt Nam và Phiếu kết quả phân tích cua Viện Kiểm định
Quốc gia vắc xin vồ Sinh phẩm y tế
Phụ lục 3 -17. Trinh tự các gen giải trình tự của các
chủng B. anthracis phân lập ở Việt Nam được đăng ký
trên Genbank.
Phụ lục 18. Giấy xác nhận ứng dụng kết quả đề tài
(Phụ íục có minh chứng kèm íheo trong Báo cáo toàn
văn đầy đu)

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỊNH DANH LOÀI MỘT
SỐ CHỦNG NẤM MEN VÀ XÁC ĐỊNH TỶ LỆ ĐÈ KHÁNG VỚI THUỐC
KHÁNG NÁM BẰNG PHƯƠNG PHAP KHUẾCH TÁN TRÊN ĐĨA THẠCH
Ths. Ngô Thị Minh Châu, TS.Tơn Nữ Phương Anh, CN. Đ ỗ Thị Bích Thảo

Bộ môn Ký Sinh Trùng - Đại học Y Dược Huế, Việt Nam

TS. Antoneila Santona, TS. Siĩvana Sana, GS.Piero Cappucineỉli

Khoa Vi sinh lâm sàng và thực nghiệm - Đại học Sasarí, Cộng hịa Ý
TĨM TẮT

Nấm men là tác nhàn gây bệnh quan trọng ờ người, đặc biệt bệnh do nấm Candida sp. là bệnh phị biến.
Nghiên cứu của chúng tơi được tiến hành irên 121 chung nấm men phân lập ở Bệnh viện Trường Đại học Y
Dược Huế và Bệnh viện Trung ương Huế.
Mục tiêu: Định danh loài một so chủng nấm men phân lập được từ câc bệnh nhàn được chẩn đốn nhiễm
nấm nơng hoặc nấm sâu vả xác định tỷ lệ đề kháng với một số thuốc kháng nấm. Phương pháp nghiên cứu:
Chúng tôi âp dụng kỹ thuật khối phổ MALD! - TOF (Maldi Tof Mass: Matrix-assisted laser desorption/ionization
Mass Spectrometry), kết hợp với kỹ thuật PCR và giải trình tựgen để định danh lồi vi nấm. Kháng nấm đồ được
thụ-c hiền bằng phương pháp khuếch tán trên đa thạch. Kết quả: Có 121 chủng nấm phân lập được, trong đó
C.albicans 43,80% và các lồi c. non albicans khàc gồm: C.ỉrópicalis 17,35%, c.parapsilosis 12,41%, c.glabrata
7,44%, c.orthopsilosis 4,96%, c.metapsilosis 0,83%, c.krusei 3,30%, c.guilliermondii 3,30%, c.famata 1,65%,
c.norvegensis 0,83%, c.mesorvgosa 0,83%. Ngoài ra chúng tơi cũng phân lập được 1 số lồi nấm men khác
như: Geotríchum capitatum 1,65%, Tríchosporon asahii 1,65%. Đânh giá sự nhạy cảm của 6 loài vi nấm Candida
sp. có tần xuất phân lập cao trong nghiên cứu này ghi nhận 100% nhạy càm với amphotericin B và nystatin. Tỷ lệ
đề khàng của C. non albicans yà c. albicans với fluconazole và itraconazole lần lượt là 40,74%, 3,77% và 5,66%,
50%. Kết quả của chúng tôi cũng ghi nhận 20,37% c. non albicans và 18,86% c. albicans đề kháng với 5fluorocystocine. Tỷ lệ đề kháng với caspofungin của c. non albicans và c. albicans lần iưọt là 7,41% và 13,2%.
Kết luận: Giống Candida sp. chiếm ƯU thế với loài c. albicans có tỷ lệ cao nhất. Một số lồi Candida non albicans
biếm gặp được phân lập trong nghiên cứu này: c. orthopsilosis, c.metapsilosis, c.norvegensis, và
c.mesorugosa. Ngoài ra cắc loài nấm men khác cũng được định danh gồm Geotríchum capitatum và
Trichosporort asahii. Tất cả loài Candida sp. nhạy càm tot với amphotericin B và nystàtin, nhưng có một tỷ lệ
đáng kề c. non albicans đề kháng với kháng nấm thuộc nhóm azole.
Từ khóa: Nấm men, Candida sp, kỹ thuật khối phổ MALDI - TOF, khống nấm đồ, đề kháng.
SUMMARY

APPLICATION OF MOLECULAR TECHNIQUE TO IDENTIFY YEASTS SPECIES AND EVALUATION
ANTIFUNGAL SUSCEPTIBỈL YTI TESTING BY DISK DIFFUSION METHOD

' _ _ _
_
Ths. Ngo Thi Minh Chau, TS.Ton NuPhuongAnh, CN. Đo Thi Bich Thao
(Parasitology Department- Hue University o f Medicine and Pharmacy, Vietnam)
TS. Antonella Santona, TS. Silvana Sana, GS.Pieró Cappucinelli
(Microbiology laboratory, Department Biomedical Science in Sassari, Italy)
Background: Yeasts are important opportunistic pathogen in human, in which Candida sp. are the most

484


common causative agents. The present study was earned out on 121 yeast strains collected in Hue Medicine and
Pharmacy Hospital and Hue Central Hospital. Objective: 1. To identify yeasts species from systemic mycoses and
superficial mycoses. 2. To determine the resistance rate to antifungal drugs o f Candida species by disk diffusion
method. Method: We applied MALDI - TOP Mass Spectrometry techniques, PCR and sequencing type to detect
yeasts species. Antifungal susceptibility testing was checked by disk diffusion method. Results: There wem 121
yeast strains collected, in which C.albicans 43.80% and other c. non albicans species including C.tropicalis
17.35%, c.parapsilosis 12.41%, C.glabrata7.44%, c.orthopsilosis 4.96%, C.metapsilosis 0.83%, c.krusei 3.30%,
c.guilliermondii 3.30%, c.famata 1.65%, C.norvegensis 0.83%, c.mesorugosa 0.83%. In addition, other yeast
species were indentified including Geotrichum capitatum i.65%, Trichosporon asahii 1.65%. Antifungal
susceptibility testing was done to determine the resistant rate o f the six most Candida species isolated in this
study. The resuls showed that 100% strains susceptible to amphotericin B and nystatin. The resistant rate o f c.
non albicans and c. albicans to fluconazole and itraconazole were 40.74%, a 77% and 5.66%, 50% respectively.
Our results showed that 20.37% o f c. non albicans and 18.86% o f c. albicans were resistance to 5Fiuorocystocine. The resistant rate to caspofungine o f c. non albicans and c. albicans were 7.41% and 13.2%
respectively. Conclusion: Yeast isolations from patients in Hue city showed that Candida sp was the most genus
identification, in which c. albicans was the most species. This study reported some rare species o f c. non
albicans, including c. orthopsilosis, c.metapsilosis, c.norvegensis, and c.mesorvgosa. Moreover, other yeasts
non Candida were identified including Geotrichum capitatum and trichosporon asahii. All Candida species were
susceptible to amphotericin B and nystatin. There was a significant resistance o f c. non albicans to the azole
drugs.

Keywords: Yeast, Candida sp., M ALDI- TOF Mass Spectrometry, antifungal susceptibility testing, resistance.
ĐẬT VÁN ĐỀ
Nấm men gây bệnh cho người gồm các giống
Candida
sp,
Cryptococcus .sp,
Rhodotorula,
Malassezia, Trichosporon... [15j. Trong các giống nấm
men này thỉ giống Candida sp. là giống gây bệnh phổ
biến nhat [4,8,15]. v ề mặt bệnh sinh, ơ người khỏe
mạnh một số giống Candida sp. có thể sống hoại sinh
ờ một số vị trí của cơ íhể và trở thành tác nhân gây
bệnh trong một số điều kiện thuận lợi nhất định [15].
Bẹnh lý ở người do nấm Candia sp. rất đa dạng, bệnh
có thể là các thề bệnh nấm nông như viêm âm đạo âm hộ, viêm da, viêm quanh móng - viêm móng, viêm
giác mạc, viêm ống tai... cho đến các thể bệnh nấm
sâu xâm lấn như viêm phổi, viêm nội mạc cơ tim,
nhiễm trùng huyết...{15]. Candida sp. là tác nhân gây
nhiễm trùng huyết phổ biến, xếp thứ 4 trong 10 tác
nhân vi sinh vật gây nhiễm trùng huyết phổ biến nhất ở
bệnh nhân điều tri tại các đơn vị chăm sóc tích cực
[4.8.12], và nhiễm Candida sp. xâm lấn ở các bệnh
nhân vởi các bệnh lý nặng đã làm tăng tỷ lệ tử vong
cũng như tăng chi phí điều trị [4,9]. Sự đa dạng trong
bệnh nguyên của bệnh thuộc giống nấm Candida sp.
và sự khác nhau ìrong đáp ứng đề u trị với thuổc
kháng nắm đâ làm cho việc điều trị, tiên lượng bệnh,
đặc biệt là trong những trường hợp bệnh nấm lan tỏa
[7.9.10.12]. Vì vậy nghiên cứu về bệnh nguyên thuộc
giống Candida sp. va mức độ nhạy với thuốc kháng

nấm của các loài vi nấm thuộc giống này đang là vấn
đề được sự quan tâm của nhieu nhà nghiên cửu ở
nhiều quốc gia khác nhau.
Kỹ thuật phân lập định đanh nấm men có thể !à
những kỹ thuật đơn giản như ni cấy trên mơi trường
chun biệt, hoặc íàm các thử nghiệm sinh hóa khác
nhau [15]. Tuy nhiên giới hạn của các kỹ thuật truyền
thống là mất nhiều thời gian, và trong một số trường
hợp rất khó để phân biệt một số lồi [13,16]. Sự chậm
trê trong chẩn đốn các tác nhân vi sinh vật có thể gây
cản trở trong cơng tác đề u trị và làm tăng chi phí điều
írị [8]. Vì vậy, hiện nay kỹ thuật khối phổ MALDl - TOF
được nhiều nghiên cứu trên thế giới đề cập đến với ưu

điểm là có độ nhạy, độ chính xác cao, thực hiện tự
động hóa và ít tổn thời gian. Những ưu điểm này iàm
cho kỹ thuật khối phổ được ứng dụng rộng rãi trong
nghiên cứu các tác nhân VI sinh vật gây bệnh ờ người
trong đó có nấm men. Trong thực tế ky thuật khối phổ
MALDI - TOF có thể giúp định danh bệnh nguyên từ
khuẩn iạc trong vài phút [13]. Bên cạnh đó, thử nghiệm
đánh giá về mức độ nhạy cảm của nấm Candida sp.
với các thuốc kháng nấm chưa được nghiên cứu nhiểu
ở Việt Nam. Một so nghiên cứu được thực hiện nhưng
chỉ khảo sát đáp ứng bằng điều trị lâm sàng hoặc
nghiên cứu với íi loại thuốc kháng nẩm. Vì vậy chúng
tơi thực hiện nghiên cứu này với các mục tiêu sau:
Áp dụng ky thuật sinh học phân tử định danh loài
nấm men phấn lập được từ bệnh nhân bị bệnh nắm
nông vá nấm sâu.

Xâc định tỷ lệ đề khâng với các thuốc kháng nấm
cửa một số loài riam Candida sp. phân lập được
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGiÊN cứ u
Có 121 chủng nấm men được phân lập từ 103
bệnh nhân từ Bệnh viện Trung ương Huế và Bệnh
viẹn Trường Đại học Y Dược Huế trong thời gian từ
1.2013 - 6.2014. Qui trình phân lập được tiến hành
như sau: bệnh phẩm được nuôi cấy trên môi trường
Sabouraud dextrose agar Chloramphenicol (Biorad,
France), 72 giờ sau được cấy chuyền sang mơi trường
Chromogennic agar (Oxoid, UK). Các lồi vi nấm phân
lập được sau đỏ được cất giữ ơ -200C trong dung dịch
gỉyceroi15%.
Các kỹ thuật sinh học phân tử định danh loài vi
nấm được thực hiện tại Khoa Sinh học phân tử, ĐH
Sassari, Cộng hịa Ý. Trong đó kỹ thuật khối phổ
MALDI - TỎF tiến hành để đỉnh danh loài vi nấm trực
tiếp từ khúm nấm nuôi cấy và đọc kết quả bằng hệ
íhổng máy khối phổ Bruker Daltonik MALDI Biotyper.
Các chủng vi nấm có kết quả độ tin cậy thấp khi
định danh bằng khối phổ sẽ được áp dụng kỹ thuật
PCR với cặp mồi đặc hiệu ITS1 và ITS2 đế xác định
vùng giao gen (interna! transcribed spacer: ITS) trong
cấu trúc ribosom DNA của vi nấm. Qui trình tách chiếc

485


Tố chửc xoang
Dịch âm đạo

Bơt mónq
Mủ vêí íhươnq
Tổ chức ioẻt giác mac
Dich màng bụnq
Tông cộng

DNA của vi nấm được thực hiện theo phương pháp
của Zang và cộng sự [18]. DNA của vi nấm được iàm
tinh sạch theo kít DNA Clean and Concentrator TM -5
(ZYMORESEARCH, USA), và được gửi đi giải trinh tự
gene để xác định ioài tại Sequencing Service LMU
Munich,
Germany
( Kết quả giải
trình tự gen được phân tích với ph in mềm Geneious
4.8.4 và đối chiếu với GeneBank để định danh loài với
độ
phù
hợp
là
từ
99%
trờ
lên
( />Từ các chủng vi nấm phân lập đứợc, chủng tôi tiến
hành đánh giá sự nhạy cam vởi thuốc kháng nấm cíia
6 lồi vi nấm có tần xuất phân lập với íỷ iệ cao trong
nghiên cứu bao gồm: c. albicans, c. tropicalis, c.

khuếch tán trên đĩa thạch theo hướng dẫn của CLSI,

M - 44 A (Clinical and Laboratory Standars Institute,
USA) với loại thuốc kháng nấm bao gồm amphotericin
B 10ụg, nystatin 100UI, fluconazole 25 Mg,
itraconazole 8pg, 5-fiuorocytosine 1 ụg và caspofungin
5|jg (Các loại đĩa kháng nấm là sản phẩm cùa
Liofilchem Laboratory, Cộng hòa Ý). Các chùng c.
albicans ATCC 90028, c . parapsiiosis ATCC 22019 và
c . krusei ATCC 6258 được làm các chứng chuẩn của
thừ nghiệm kháng nắm. Thử nghiệm kháng nấm đồ
được thực hiện tại Bộ môn Ký sinh trùng, Trường Đại
học Y Dược Huế.
KÉT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Đặc điểm cúa đối tượng nghiên cứu
Có 103 bệnh nhân được chọn vào trong nghiên
cứu của chúng tôi trong thời gian từ 1.2013 - 6.2014.
Trong đó có 81 bệnh nhân đến từ Bệnh viện trường
ĐH Y Dược Huể gồm các khoa: Khoa Hồi sức tích cực
(ICU Intensive Care Unit) 16 người (15,53%), Khoa
Mắt 2 người (1,94%), Khoa NỘI 19 người (18,45%),
Khoa Ngoại chấn thương 2 người (1,94%), Khoa Tai
Mũi Họng 3 người (2,91%), Khoa Nhi 5 người (%),
Khoa Úng Bướu 13 người (12,62%), Phòng khám Da
iiễu 11 người (10,68%) và Phòng khám Phụ Khoa 10
người (9,71%). Ngồi ra có 22 bệnh nhân đến từ Bệnh
viện Trung ương Huế: Khoa Huyét học lâm sàng 14
người (13,59%), Khoa Nhi thận - Tiết Niệu 8 người
(7,77%). Tuổi trung bình của đối tượng trong nghiên
cứu chúng tôi là 45 tuổi, tuổi nhỏ nhất là 21 ngày tuổi,
tuổi iớn nhất là 89 tuổi. Trong kết quả của chúng tơi có
41 bệnh nhân nam (39,81%) và 62 bệnh nhân nữ

(60,19%).
2. Nguồn gốc bệnh phẩm phân lập của các
Nquôn gốc phân ỉập
Máu
Nước tiếu
Niêm mac miệng
Dich chọc rửa phế quản
Dịch dạ dày
Đàm
Phân
Chat tiết mũi

Sơ íượng

1
16
26
7
19

6
1

2
10

1,94
9,71
8,74
1,94

1,94
0,97

9

2
2

100

103

nghiến cứu cua chúng tơi là niêm mạc miệng
(25,24%), đàm (18,45%); nước tiểu (15,53%), tuy vậỵ
chúng tôi cũng ghi nhận sự đa dạng trong phân bố vế
nguồn gốc phân lập được.
3. Sổ lượng chủng vi nấm phân Ịập
Từ 103 bệnh nhân nói trên chủng tơi phân lập
được 121 chung nấm men. Kết quả này được giai
thích là do có 87 bệnh nhân chỉ nhiễm duy nhất 1
chủng vi nấm từ 1 vị trí phân lập, 14 bệnh nhân nhiễm
2 chủng vi nấm khác nhau từ 1 vị trí phân lập và 2
bệnh nhân nhiễm 3 chùng nấm khác nhau từ 1 vị trí
phân lập;
4. kết quả định danh bằng kỹ ỉhuật khối phổ
MALDi - TOF
Với kỹ thuật khối phỗ kết quả định danh như sau:
C.albicans là loài phổ biến (53 chủng chiếm 43,80%).
Các loài c. non albicans phân lập được trong nghiên
cứu là C.tropicaiỉs (21 chủng chiếm 17,35%),

c.parapsilosis
(12
chủng
chiếm
9,93%),
c.orthopsilosỉs (5 chủng chiếm 4,13%), c.metapsiíosis
(1 chủng chiếm 0,83%), c.glabrata (9 chủng chiếm
7,44%),
c.krusei
(4
chùng
chiếm
3,30%),
c.norvegensis (1 chủng chiếm 0,83%), c.guilíiermondii
(4 chủng chiểm 3,30%). Ngồi ra chúng tơi ghi nhận
các loại nấm men khác íà Geotrichum capỉtatum
(1,65%), Trichosporon asahii (0,83%) và có 8 chùng
(6,61 %) nấm men khơng định danh được với kỹ thuật
khối phố MALDI-TOF.
5. Kết quả glảì trình trình tự gen của 8 chùng vi
nấm không đĩnh danh được băng kỹ thuật khối
phổ M ALDI-TO F
3
chùng Candida parapsilopsis, 2 chủng
Debaryomyces hansenii (Candida famata), 1 chùng
Candida orthosilopsis, 1 chủng Candida mesorugosa,
1 chủng Trichosporon asahii.
6. Kết quả định danh loài dựa trên kết quà tổng

Tỷ lệ %

0,97
15,53
25,24
6,80
0,97
18,45
5,83
0,97

486

Loài vi nám
C.albicans
C.tropicalis
c.parapsilosis
c.glabrata
c.orthopsilosis
c.metapsiiosis
c.non aỉbicans
c.krusei
c.guilliermondii
c.famata
c. norvegensis
c.mesorugosa
Geotrichum capitatum
Loài nẫm
men khác
Trichosporon asahii
Tống

Số lương
%
53
43,80
17,35
21
12,41
15
7,44
9
4,96
6
1
0,83
4
3,30
4
3,30
2
1,65
0,83
0,83
2
1,65
2
1,65

121

100

7. Tỷ lệ đề kháng với một số thuốc khàng nấm cùa các chùng nắm Candida sp.
Candida sp.
5{Số chủng nấm thử nghiệm kháng Amphotericine Nystatine Fluconazole itraconazole
B
Fiuorocytosine
nấm)
C.albicans (53)
0
0
2 (3,77%)
3 Í5,66%>
10(18,86%)
c. non albicans (54)
C.tropicalias (21)
c.gỉabrata (14)
c.parạpsiỉosis (9)
c.orỉhopsiiosis 6)
c.krusei (4)

0
0
0
0
0
0

22

0

(40,74%)

11

0
0
0
0
0

(52,38%)
1 (7,14%)
1 (11 ,11 %)
5 (83,33%)
4(100%)

Tất cả các loài vi nám thuộc giống Candida sp.
trong nghiên cứu này đều nhạy cảm với amphoỉericỉn
B và nystatin. Trong khi đó, c . non albicans đề kháng
với fluconazole và itraconazole hơn c . albicans và sự
khốc biệt này có ý nghĩa thống kê (p<0,0001). Tỷ lệ
khác biệt về đề kháng của C. albicans và c. non
albicans với 5-fluorocystocine và caspofungin khơng
có ý nghĩa thống kê (p>0,05).
BAN LUẬN
Theo y van, nấm Candida sp có thể sống hoại sinh
trên mộỉ số vị trí của cơ thể và trờ thành tác nhẩn gây
bệnh khỉ có yếu tố thuận lợi [8,151. Các đối tượng

ĩrong nghiên cứu của chúm tôi đen từ nhiều khoa
phòng khác nhau nhưng chiem tỷ lệ cao là các bệnh
nhân bệnh nặng tại các đơn vị như ICU, Khoa Nội,
Khoa Ung bướu, Huyết học lâm sàng, Nhi Tiết niệu.
Sự đa dạng của các loài nấm men phân lập từ các
khoa phòng khác nhau trong nghiên cứu này cho thấy
sự phỗ biến của bệnh lý do nấm men trên những bệnh
nhan có yểu tố nguy cớ. Theo báo cáo tổng quan của
Gary w . yếu tố vật chủ có vai trị quan- trọng trong
bệnh do vi nấm, cẩc bệnh nhân bị bẹnh nặng điều tri
tại ICU, bệnh bong, phẫu thuật, chấn thương là các
nhóm nguy cơ của bệnh nấm do giảm sức đề kháng,
hoặc luôn dùng kháng sinh íiều cao phổ rộng làm roi
loạn khuẩn chí tạo moi trường thuận lợi cho nấm phát
triển [3]. Vi vậy bệnh nấm sâu, đặc biệt bệnh do nấm
Candida sp. đang được đánh giá là nhóm bệnh mới
nồi trong các bệnh nhiễm trùng ở các đối tượng suy
giảm mien dịch bầm sinh hoặc mắc phải. Nghiên cứu
của chúng tôi cũng ghi nhận được một tỷ ỉệ nhất định
nhiễm 2 đen 3 loài VI nấm từ một vị trí phân iập.
Theo kết quả nghiên cứu của các tác giả ở nhiều
quốc gia khác nhau về mặt bệnh nguyên thuộc giống
Candida sp., có 5 loài gây bệnh pho biến là Candida
albicans,
Candida
giabrata,
c.parapsiiopsis,
C.tropicalis và c.krusei [4,8,15]. Kết quả nghiên cứu
của Nguyễn Khắc Lực và cọng sự ở Học viẹn Quân y
ghi nhạn các loài Candida sp phổ biến !à ò.albicans

65%, c. giabrata 6,67%, c . tropỉcalis 6,67%,
c.parapsolosis 5%, c.krusei 3,33% [2]. Theo báo cáo
tồng quan của Giri s. về bệnh nguyên nấm Candida
sp. gây nhiễm trùng huyết thỉ hơn 90% thuộc các lồi
nói trên [4]. Nghiên cứu của Li F. và cộng sự tại Trung
Quốc từ 2006 -2011 ghi nhận trong tống số 91 chùng
vi nấm phân lập từ máu và dịch tiết của cơ thể tỷ !ệ

Caspofungine
7(13,2%)

27 (50%)

11 (20,37%)

4(7,41%)

11 (52,38%)

4(19,05%)

3 (14,29%)

7 (50%)

1 (11 ,11 %)

0
2 (22,22%)

5 (83,33%)
3 (75%)

1 (16,67%)
4 (100%)

0
1 (11 ,11 %)
0
0

nhiễm nấm Candida sp. lần lượt là: c . albicans với tỷ
lệ 41,29% ở bệnh phẩm máu vắ 59,06% trong các dịch
tiết cua cơ the, tỷ íệ này là 18.06% và 25,72% với c.
tropicalis, c.parapsilosỉs !à
17,42%
và
5,43%, c.glabrata là 11,61% và 3,99%, mộí số !oài
Candida khác là 11,61% và 5,80% [10]. Yashavanth R
và cộng sự nghiên cứu về nhiễm nấm Candida sp.
đường tiết niệu ghi nhận Candida albicans 30,3%,
Candida giabrata 9,09%, C.tropicalis 45,45% và
c.krusei 15,15% [17j. Ngoài ra một số loài vi nấm
thuộc giống này cũng được ghi nhận là bệnh nguyên
như
c.kefur,
c.guiiiìermondii,
c.lustitaniae,
c.steiiatoidea, c.dubliniensis [4]. Kết quả định danh
loài thuộc giống Candida sp. trong nghiên cứu cùa

chúng tôi cho thấy C.albicans chiếm tỷ lệ 43,80% cao
hơn so những loài khác, đều này phù hợp với y văn là
C.aibicans là loài gặp phồ biến nhất [3,15]. Tuy nhiên
chúng tơi cũng ghi nhận tỷ lệ nhiêm nhóm" c.non
bicans !à 52,9%, tương đương tỷ lệ C.bicans
(43,80%), điều này phù hợp với ghi nhận của những
nghiên cứu gần đay ỉà cố sự trội len cùa nhóm
Candida non bicans. Nghiên cưu cua Hail G. và cộng
sự tại Mỹ 2003 về nhiễm trùng huyết do Candida sp.
ghi nhận 57% thuộc nhóm c.non albicans [6]. Trong
nhóm ị.non albicans, chúng tơi ghi nhận các ỉồi có ty
lệ cao là C.tropicalis 17,35%, tiếp đến là c.parapsilosis
9,09%, c.giabrata 7,44%. Đánh giá về sự phổ biến
cua C.tropỉcaiis, nhiều khảo sáí cho kết quả đây là lồi
được ghi nhận VỚI tần suất xếp thứ 2 - 3 trong nhóm
c.non albicans [ 1 1 Ị. c . giabrata thường được ghi nhận
có tần suất phổ biển thứ 2 sau C.albicans trong giống
Candida sp nói chung [14], tuy vậy kết quả nghiên cứu
của chúng tôi ghi nhận sự trội hơn về tỷ iệ cùa
C.tropicaiis và c.parapsilosis, có thể đây ià một điểm
khác biệt về phân bố loài của giống Candida ơ người
Việt Nam. Ngoài c.parapsilosis, định danh dựa vào kỹ
thuật khối phổ có thể phân biệt các đồng phân khác là
c.orthosiiosis và c.nietapsilosis, đây chính íà điểm
mạnh cùa kỹ thuật khối phổ so với các kỹ thuật định
danh cổ điền khắc như dựa vào hình thai học hoặc
định danh dựa vào các phản ứng lên men đường hoặc
đồng hóa đường [1 53. Nghiên cứu của chúng tơi cũng
phân íập được các loài nấm Candida non albicans CO
xu hướng đề kháng thuốc đã được cơng trình trong

nước và trên thế giới công bố như c.glabrata,
c.krusei, c.norvegensis [1,5,7].

487


Trong kết quả của chúng tơi có 6,61% nấm men
khơng định danh được với kỹ thuật khối phổ MALDI TOF. Điều này cũng tương tự với ghi nhận của một số
tác giả khác trên the giới, ván đề này được giải íhích là
do thiếu cơ sở dữ liệu và đã được đề cập tới trong một
số công trinh của các tác giả khác nhau [13,16]. Với
các chủng không xác định này, kết quả qiải trinh tự
cho
các lồi
nấm
men
là
c.parapsilosis,
c.orthopsilosis,
c.famata,
c.mesorugosa,
Trichosporon asahii. Trong đó một số lồi nấm rất
hiếm gặp ở người và có thể là lần đầu tiên được báo
cáo phân lập ở Việt Nam như c.orthopsilosis, c.
metapsiiosis, c.norvegensis, c . mesorugosa.
Kết quả của thử nghiệm kháng nầm trong nghiên
cứu của chúng tôi cho thấy các loài vi nấm thuộc giổng
Candida phân lập được tại thành phố Huế đều nhạy
cảm tốt với các ỉhuốc kháng nấm thuộc nhóm polyene
(amphotericin B và nystatin). Trong khỉ đó, c. albicans

được ghi nhận ít đề kháng với thuốc kháng nấm thuộc
nhóm azoie (fluconazole và itraconazole) hơn là
những lồi c . non albicans. Những lồi Candida sp. có
tỷ iệ đề kháng cao với fluconazole, một loại thuốc
kháng nấm thường dùng phồ biến trong điều trị bệnh
nấm sâu cũng như dự phòng nhiễm trùng cơ hội do
nấm ở bệnh nhân AIDS tại Việt Nam là C. tropỉcaiis
(52,38%), c . orthopsilosis (83,33%) và c . krusei
(100%). Tỷ lệ đề kháng của các loài c . non albicans
với itraconazole mặc dù thấp hơn so với fluconazoie
nhưng nhìn chung vẫn có tỷ lệ đề kháng cao: c.
tropicalis (52,38%), c . ortbopsilosis (83,33%) và c.
krusei (75%). Một số công trinh nghiên cứu khác ở
Thổ Nhĩ Kỳ, Malaysia cũng ghi nhận tỷ iệ đề kháng
đáng kể cua Candida sp, với azole [5,7]. Chúng tôi
cũng ghi nhận tỷ lệ đề kháng với 5-fluorocystocine của
c . albicans (18,86%), C.tropicalis (19,05%), c.
parapsilosis (22,22%), c . orthopsiiosỉs (16,67%) và c.
krusei (100%). Ngoài ra, kết quả kháng nấm đồ từ
nghiên cứu này cũng bước đầu cho thấy có tỷ lệ đề
kháng nhất định của Candida sp. với caspofungin, đây
íà thuốc kháng nấm mới thuộc nhóm echinocandin
chưa được dùng phổ biến ờ Việt Nam. Tuy nhiên do
giới hạn của nghiên cứu này là chỉ mới đánh giá thử
nghiệm kháng thuốc với một lượng nhỏ của từng
chủng nấm thuộc nhóm c. non albicans vì vậy để kểí
luận chính xốc cho vấn đề này cần tiếp tục nghiên cứu
ờ cỡ mẫu lớn hơn.
Tóm lại, từ kết quả nghiên cứu này cho thấy sự đa
dạng trong bệnh nguyên của các loài nếm men phân

lập được từ bệnh nhân ở thành phố Huế và kết quả
kháng nấm đồ bước đầu cho thấy tỷ lệ đề kháng của
các lồi c . non albíans với fluconazole và itraconazole
là cao hơn so với lồi C.albicans. Từ đó cho thấy việc
định danh íồi và làm thử nghiệm kháng nấm ià cần
thiết và hữu ích trong việc định hướng đề u trị và tiên
lượng bệnh do nấm Candida sp.
KETLUẬN
Đề tài cua chúng tôi áp dụng kỹ thuật khối phổ
MALDI - TOF và giải trình tự gen để xác định lồi của
121 chủng nấm men phân íập từ 103 bệnh nhân thuộc
Bệnh viện trường ĐH Y Dược Huế và Bệnh viện Trung

Ương Huế. Kết quả nghiên cứu cùa chứng tôi ghi nhận
tỷ lệ của các ỉoài nắm men như sau: C.albicans
43,80% và 52,9% các loài c . non albicans bao gồm:
C.tropicalís 17,35%, c.parapsilosis 12,41%, c.glabrata
7,44%, c.orthopsilosis 4,96%, c.metapsilosis 0,83%,
c.kruseí 3,30%, c.guilliermondii 3,30%, c.famata
1,65%, c.norvegensis 0,83%, c.mesoruaosa 0,83%.
Ngồi ra chúng tơi cũng phân lập được 2 loài nấm
men khác: Geotrỉchum capitatum 1,65%, Trichosporon
asahỉi1,65%.
Đánh giá sự nhạy cảm của 6 loài V! nấm Candida
sp. có tần suất phân lập cao trong nghiên cứu này ghi
nhận 100% nhạy cảm với amphotericin B và nystatin.
Tỷ íệ đề kháng của c . non albicans và c . albicans với
fluconazole và itraconazole lần iượt là 40,74%, 3,77%
và 5,66%, 50%. Kết quả của chủng tôi cũng ghi nhận
20,37% C. non albicans và 18,86% c . albicans đề

kháng vởi 5- fluorocystocine. Tỷ lệ đề kháng với
caspofungin cùa c . non albicans và c . albicans lần
iượilà 7,41 % và 13,2%.
KIẾN NGHỊ
Tiếp tục nghiên cứu với số lượng chùng vi nấm
phân lập nhiều hơn để có sổ liệu xác thực về đề khống
với nhóm azole cùa c . non aibicans. Định danh ioài và
kháng nấm đồ là cần thiết và hữu Ich với bệnh nấm
Candida sp., đặc biệt là trong tường hợp bệnh nấm
sâu.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Phan Tuấn Anh, Cừ Thị Kim Loan (2010), Xác định
tỷ lệ và đặc điềm dịch tễ học viêm âm đạo tái phát do
nẩm, Tạp chí Y hoc TP Hồ Chí Minh, 14(1), trang 194 199.
2. Nguyễn Khắc Lực, Đỗ Ngọc Anh (2013), Xác định
loài một so nắm men phân lập từ ngươi bằng kỹ thuật
PCR-RFLP, Tạp chí Phịng chống bệnh sốt rét và các
bệnh Ký sinh trùng, Chuyên đề hội nghị Khoa học - Đào
tạo chuyên ngành Ký sinh toàn quốc lan thứ 41, ỉrang 93100 .

3. Gary w . Procop, Glenn D. Roberts (2004),
Emerging fungal diseases: the importance of the host,
Clin Lab Med, 24, 691-719
4. Giri s, Kindo AJ, A review of Candida species
causing blood stream infection., Indian J Med Microbiol.,
30(3): 270-8.
5. Guze! AB, Aydm M, Mera! M, Kalkanci A, ilkit M
(2013), Clinical Characteristics of Turkish Women with
Candida krusei Vaginitis and Antifungai Susceptibility of
the c. krusei Isolates, Infect Dis Obstet Gynecol., doi:

10.1155/2013/698736.
6. Mali G, Hail L, Joyce M, Lodge B, Procop G, et al.
Multicenter evaluation of Candida albicans PNA FISH
probe in biood cultures that contained yeast. Presented at
the ASM General Meeting; May 18, 2003.
7. Jacinta Santhanam, Nazmiah Yahaya, Muhammad
Nazri Aziz, Species distribution and antifungal
susceptibility patterns of Candida species: is low
susceptibility to itraconazole a trend in Malaysia ?, Med J
Malaysia, 68 (4), p.343 -347.
8. Julie Deialoye, Thierry calandra (2014), Invasive
candidiasis as a cause of sepsis in the critically ill patient,
Virulence, 5 (Ị), 154-162
9. Juyal D, Sharma M, Pal s, Rathaur VK, Sharma N

488


(2013), Emergence of rton-aibicans Candida species in
neonatal candidemia, N Am J Med Sci., 5(9), p.541-545.
10. Li F, Wu L, Cao B, Zhang Y, Li X, Liu Y (2013),
Surveillance of the prevalence, antibiotic susceptibility,
and genotypic characterization of invasive candidiasis in a
teaching hospitai in China between 2006 to 2011, BMC
infect Dis., 3(1), p.353-356.
11. Melyssa Negri,, Sónia Silva, Diogo Breda, Mariana
Henriques, Joana Azeredo, Rosario Oliveira (2012),
Candida tropicaiis biofilms: Effect on urinary epithelial
cells, Microbial Pathogenesis, 53, 95-99.
12. Piayford EG, Marriott D, Nguyen Q, Chen s, Ellis

D, Slavin M, Sorrell TC (2008), Candidemia in
nonneuỉropenic critically ill patients: risk factors for non­
albicans Candida spp. Crit Care Med, 36, p.2034-2039
13. Giovanna Pulcrano, Dora Vita lula, Antonio
Voiiaro, Aiessandra Tucci, Monica Cerullo, Matilde
Esposito.Fabio Rossano, Maria Rosaria Catania (2013),
Rapid and reliable MALDi-TOF mass spectrometry
identification of Candida non-albicans isolates from

bloodstream infections, Journal of Microbiological
Methods, 94, p. 262-266.
14. Rupinder Kaur, Renee Domergue, Margaret L
Zupancic and Brendan p Cormack (2005), A yeast by any
other name: Candida giabrata and its interaction with the
host, Current Opinion in Microbiology, 8, p.378-384
15. William E.Dismukes et al (2003), Clinical
mycology, Oxford University press.
16. Gốrkem Yaman, lẹin Akyar, Simge Can (2012),
Evaluation of the MALĐI TOF-MS method for identification
of Candida strains isolated from biood cultures, Diagnostic
Microbiology and Infectious Disease, 73, p. 65-67.
17. Yashavanth R. et all (2013), Candiduria:
prevalence and trends in antifungai susceptibility in a
tertiary care hospital of mangalore, J Clin Diagn Res.,
7(11), p.2459-2461.
18. Zhang, Y-, et al. (2010), A simple method of
genomic DNA extraction suitable for analysis of bulk
fungal strains. Letters in applied microbiology, 51(1): p.
114-118.

NGHIÊN Cứu ỨNG DỤNG KỸ THUẬT GENEXPERT MTB/RIF
TRONG PHÁT HIỆN VI KHUẢN 'l a o t ạ i h ả i p h ò n g
Hà Thị Bích Ngọc (Tiến s ĩ Sinh học, Bộ mơn Vi sinh Đại học Y Dược Hải Phịng)
Chu Thị Nga (Thạc s ỉ Bác sĩ, Khoa Vi sinh Bệnh viện Hữu nghị Việt Tiệp Hài Phòng)
Trần Đức (Tiến s ĩ Bấc sĩ, Khoa Vi sinh Bệnh viện Hữu nghị Việt Tiệp Hải Phòng)
Nguyễn Hùng Cường Ợiến s ĩ Bác sĩ, Bộ môn v ị sinh Đại học Ỷ Dược Hải Phòng)
Phạm Văn Quang (Thạc sĩ, Khoa Xét nghiệm Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Hải Phịng)
TĨM TẤT
Đặt vấn đề: Năm 2011, WHO đă khuyển cáo mờ rộng trìền khai kỹ thuật GeneXpert MTB/RIFIà hệ thống chẩn
đoán phân tử tự động sử dụng kỹ thuật PCR để xác định sự có mặt cùa vi khuần lao và phát hiện đột biến khàng
rifampicin trong gen rpoB cồa vi khuẩn lao [2,7]. Mục tiêu nghiên cứu: Đánh giả hiệu quảứng dụng kỹ thuật
GeneXpert tại Hải Phòng vể xấc định tỷ lệ nhiêm vi khuẩn lao và phât hiện tình trạng khảng rifampicin đồng thời
xác định vùng gen đột biến kháng rifampicin. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Xét nghiệm GeneXpert
MTB/RIF được tiến hành song song với kỹ thuật soi đờm trực tiếp bằng nhuộm Ziehl Neelsen 436 mẫu bệnh
phẩm đờm của 436 bệnh nhàn. Kết quà: Bệnh nhân được phát hiện có VI khuẩn lao ở nam cao gấp gần 5 lần so
với nữ và những bệnh nhân mắc lao thường ở độ tuổi ngoài 40. Tỷ lệ phàt hiện MTB(+) trong 436 mẫu đờm là
94/436 (21,56%) cao gấp hai lần tỷ lệ phát hiện AFB(+) là 47/436 (10,77%). Trong 94 mẫu đờm có MTB(+) kỹ
thuật GeneXpert phái hiện 10 mẫu kháng rifampicin, tương đương 10,64%. Phât hiện tỷ lệ đột biến tại vùng lõi
cùa gen rpoB bơi các mẫu dò probe E (60%), probe B (30%) và probe D (10%).Ket luận: Kỹ thuật GeneXpert
MTB/RIF giúp chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao và tính kháng rifampicin với qui trình thao tác đơn giản và đạt hiệu
quả tốt, cho phép phât hiện vi khuẩn lao với số lượng rất ít.
Từ khố: GeneXpert, Mycobacterium tuberculosis, kháng rifampicin.
SUMMARY
RESEARCHON IMPLEMENTING GENEXPERT TECHNIQUE TO DIAGNOSIS MYCOBACTERIUM
TUBERCULOSIS IN HAI PHONG
Ha Thi Bich Ngoc
(Doctor o f Biology, Department o f Medical Microbiology, Hai Phong University o f Medicin and Pharmacy)
Chu ThiNga (Master Doctor, Faculty o f Microbiology, Vietnam Czech General Hospital)
Tran Due (PhD Doctor, Faculty o f Microbiology, Vietnam Czech General Hospital)
Nguyen Hung Cuong

(PhD Doctor, Department o f Medical Microbiology, Hai Phong University o f Meciicin and Pharmacy)
Pham Van Quang (Master, Laboratory Faculty, HaiPhong Pulmonary Tuberculosis Hospital)
Background: In 2011, WHO recommendedusing Xpert MTB/RIF techniquewidely (MTB: Mycobacterium
tuberculosis; RIF: rifampicin), is asemi quantitative nested real-time PCR invitro diagnostic test for. the detection
MTB and the detection o f rifampicin resistance associated mutation o f the rpoB gene [2 ,7Ị. Purposes: To evaluate
the effectiveness o f implementing GeneXpert technique in Haiphong city, about determine the rate o f MTB
infection and detection o f rifampicin resistance with gene region associated mutation o f the rpoB gene.

489