Nghiện cứu quy trình tổng hợp doxophyllin làm thuốc điều trị hen suyễn và copd

NGHIỆN CỨU QUY TRÌNH TỔNG HỢP DOXOPHYLLIN
LÀM THUỐC ĐIỀU TRỊ HEN SUỲẼN VÀ COPD
T rương Văn Đạt* (Thạc sĩ, Giảng viên Bộ mơn Hóa Hữu Cơ, Đại học Y Dược Tp. HCM),
Đậu Quỳnh Hương (Dược sĩ, Bộ mơn Hóa Dược, Đại học YDược Tp. HCM)
Hướng dẫn: PGS. TS. Trần Thành Đạo (Phó Trưởng Bọ mơn Hóa Dược, Trương Ban Quản /ý đảo tạo,
Khoa Dược - Đ ạĩhọc Y Dược Tp, HCM)

TÓM TẮT
Đặt vấn đề và mục tiêu nghiên cứu: Doxophyllin là 7-(1,3-ơioxoỉan-2-methyi) theophyllin thuộc nhóm dẫn
chất xanthin được sư dụng làm thuốc giãn phe quản trong điều trị hen suyễn và COPD. Doxophyllin có tốc dụng
tốt và ít tảc dụng phụ so với theophyllin. Nghiên cứu được thực hiện nhằm tìm ra nhiều phương pháp tổng hợp

doxophyllin phù hợp với điều kiện Việt Nam, nâng cao hiệu suất phản ứng, chủ động nguồn nguyên liệu thuốc
trong nước, giảm giá thành sản phẫrri.
Đối tượng, nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu: - Nguyên liệu: theophyllin, doxofyllin chuẩn (USP) và các

hóa chất khac.
- Phương pháp: Doxophyllin được tồng hợp bằng 03 quy trình khác nhau, m ỗi quy trình sẽ được tổi ưu hóa để

tìm ra cấc thong sổ phản ưng cho hiệu suẩt cao nhất. Phương pháp 1 gồm 3 giai đoạn khởi đẩu từ theophyllin
qua trung gian dyphỳllin, kế đến 7-acetaldehyd theophyllin và sau cùng doxophyllin. Phương pháp 2 chỉ duy nhất
1 giai đoạn, theóphỵllin phản ứng với 2-bromomethyl-1,3-dioxolan tạo thành sấn phẩm mong muốn doxophyllin.
Phương pháp 3 gốm 3 ]bước đ ĩ từ theophyllin qua trúng gian 7-(2,2-diethoxyeihyl) theophyllin tiếp theo là 7acetaldehyd theophyllin và sau cùng doxophylìin. Doxophylìín được kiềm nghiệm bang TCCS và đành già độ ổn
định ỉrong điều kiện khắc nghiệt, lão hóa cấp tốc và nghiên cứu độ ổn định dài hạn ở điều kiện bảo q u ả rĩ
Kết quả : Dọxophyllin được tổng họp từ m ỗi quy trình được xác định cẩu trúc và độ tinh khiết bằng các

phương pháp: SKLM, đo điểm chảy, DSC, IR, MS, NMR so sánh với doxophyllin chuẩn (USP). Sau khi tối ưu
‘hóa, hiệu suất tồn phần tương ứng cho tưng quy trình là: 62%; 90,44% và 81,85%. Sản phẩm doxophyllin kiểm
nghiệm đạt tiêu chuẩn cơ sở. Doxophyllin đạt độ on định trong thời gian nghiên cứu.
Két luận: Đã tổng hợp thành công doxophyllin theo 03 quy trình với hiệu suất cao, đạt độ ồn định. Các qui
trình này có thể được nghiên cứu nâng cap cỡ lô lớn hơn để phát triển thành qui trinh công nghệ sản xuất

cịoxophyllin tại Việt Nam.
Từ kh óa : Doxophyllin.

SUMMARY
SYN TH ESIS OF DO XO FYLLINE AS A NOVEL XANTHINE BRONCHODILATOR
Van-Dat Truong*, Quynh-Huong Dau, Thanh-DaoTran
Faculty of Pharmacy, University of Medicine and Pharmacy, Ho Chi Minh City, VietNam
Background : Doxofylline (7-(1,3-dioxolan-2-ylmethyl) theophylline), a new methylxanthine derivative is wildly

used in the treatment o f asthma and COPD. It show to have similar efficacy with significantly less side effects in
adults. This study is aimed to find more approach to produce doxofylline in Vietnam with high yield so that to
contribute to reduce the cost price.
Materials and method: - Materials: theophylline, doxofyiline RS (USP) and other chemicals.
- Method: doxofylline are synthesized by 3 different procedures. M ethod 1 consists o f 3 steps from

theophylline via intermediate dyphylline and 7-acetaldehyd theophylline to obtain the final product. Method 2 has
unique step, in which 2-bromomethyl-1,3-dioxolane is substituted on xanthine ring at position o f 7 to obtain the
final product. The last one includes 3 steps as the method 1 but via intermediate 7-(2,2-diethoxyethyl)theophylline
instead o f dyphylline.
Results: Structure and purity o f doxofylline was identified by melting point, DSC and spectroscopic methods
(IR, MS NMR). The total yield o f each corresponding procedure is: 62%, 90.44% and 81.85%. The quality o f final
product meet the specifications o f doxofylline issued in the home specifications.
Conclusion: Doxofylline was synthesized from 3 procedures with the yields rankings from respectively. These

could be further studied in more big scale to develop a suitable procedure for producing doxofylline in Viet Nam.
Keywords: Doxofylline

ĐẶT VẮN Đ Ế V À MỤC TIÊU NGHIÊN c ứ u
Doxophyllin có tên khoa học là 7-(1,3-dioxolan-2ylmeỉhyl) theophỵilín thuộc nhộm đẫn chất xanthin sử
dụng đế giãn phế quản đièu tri hen suyên và bệnh tăc

nghen phối man tính (COPD). Doxophyllin ià dằn chấí
thế hệ mới có nhiều ưu điểm như ít tác động phụ so
với theophyilin, được sử dụng phổ biến ở châu Âu và

bẳí đầu có mặt trong nước ta trong vài năm gần đậy
[3,4,6,8,16]. Với mục tiêu tìm ra nhiêu phương pháp
liệu thuốc trong nước, giảm giá thành sản phầm,
nghiên cửu này được thực hiện nhằm mục tiêu íối ưu
hoa 03 quy trinh tổng hợp Doxophyilin từ theophyilin,


xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm và đánh giá độ ổn
định của doxophỵilin
_

2.1. Xây dựng và tối ưu hóa quy trình tổng hợp:
doxophyllin đữợc tổng hợp bằng 03 quy trinh khac
nhau, xác định cấu true sản phẩm bằng các phừơng
pháp phổ hghiệm; mỗi quy trinh sẽ được tối ưu hóa đe
tim ra các thông số phản ứng cho hiệu suat cao

NGUYỀN LIỆỤ, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u
1. N guyên liệu: Theophiin,
(USP) và các hóa chẩt khác.

doxotyllin chuẩn

2. Phương pháp

1.9,11-13,15,17

Quv trình 1 : quy trình 3 bước
h

3c .

Ẳ

OH

h

J

[

p

//

+

Cl

Y

OH

in

h

3c .

+ N aO H -------

L

Ấ

J

CH3

h

II
ch

+ NaCI + HsO

3

OH
Q

ĩ
O ^S i

ỵ—

0

II }

+ N a l0 4 --------------

y —C
CHO

1 1 }

+ H C H O + N a !0 3 + H 20

N

CH3

Ổh 3

H
T

L />

+

H * -0

- 8O,H

h ,c , nX

J
HO

ch

^

II ỳ

J

Ọ
+ h 2o

C r ^ N j^ J

3

\ =

/

c h

3

Phương pháp tối ưu hóa: tối ưu đa biến, một đáp ứng dưới sự hỗ írợ cùa phần mềm MODDLE 5.0.
Q uv trinh 2: quy írình 1 bước

0X

VX >
ch

*

»

^

v

3

ch

3

Phương pháp tối ưu hóa: tối ưu đa biến, đa đáp ứng (íối ưu hóa thơng minh) dưới sự hỗ trợ của phần mềm
Design Expert 7.1.6 và BCPharsoft.
Quv trinh 3 : quy trình 3 bước
,0CH2CH3

H,cW l
ch

* vBr

- O
cCH2C
r M3

0X

3

HX
ch

Ì

3

O C H í C H3

-A < r CH0
CH3

CHs

ỵ — CHO

HO.


Phương pháp tối ưu hóa: kết hợp hai phương pháp

tổi ưu hỏa cua quy trình 1 và 2.
2.2. Xây dựng quy trình và thực hiện kiểm
nghiệm thieo tiêu chuẩn c ơ s ở (TCCSJ: thực hiện

kiem nghiệm ỉheo T C C S với các chỉ tiêu như tính chất,
định tính (phồ IR, UV-Vis), ỉạp chất (phương pháp
HPLC), giới hạn kim loại nặng, tro sulfat, mất khổi
lượng do làm khô và định lượng (phương pháp HPLC)
với chuẩn ià doxophyilin (USP). Kết quả được thẩm
định íại Viện kiểm nghiệm thuốc Tp. Hồ Chí Minh.
2.3. Đánh giá đọ ổn đĩnh của doxophyllin:

doxophyilin được đánh giá độ ồn định bang các

phườncỊ pháp như nghiên cứu sự phân hủy ơ điều
kiện khac nghiệt, nphỉen cứu độ ổn định bằng phương
pháp lão hỏa cap toe và nghiên cứu độ ổn định dài hạn
ơ điều kiện bảò qn. C ac chì tiêu đánh giá !à tính
chất, tạp chấí liên quan và hàm lượng.2,5,7,10,
KẾT QUẢ

1. Xác định cấu trúc sản phẩm
Sản phẩm được tổng hợp từ mỗi quy trỉnh được
xác định cấu trúc và độ tinh khiết, kết qua như sau:
Nhiêt đố nóng chầv: điểm chảy đo bằng phương
pháp mao quản (144 °C), đo theo phương pháp phô
quét nhiệí vi sai (sản phẩm doxophyiiin có độ tinh khiết

99,43% và nhiệỉ độ nong chảy 144,37 °C) phù hợp với
nhiệt độ nóng chảy của doxophyllin (144-146 °C).

Phế IR (KBr. c n í!): cho các dao động ứng với phổ
IR tham khảo của doxophyliin 2954,25 (oCh3-n);
2877,40 (UCH3-N); 1700,61 ( io o ) ; 1657,54 (Oc-c);
1546,82 (oc=n). 1232,76 (uc-o).

Phổ MS: m/z [M+Naf - 289,0929, phù hợp với
khối lượng phân íử dự kiến của dịxophyilìin là

266,0929.
Phổ 1H-NMR (DMSO-đg. 500 MHz, ơ. ppm): 3,20
(s, 3H, N-CH3); 3,41 (s, 3H, N-CH3); 3,79-3,87 (/77, 2H,
0-C H 2-CH2-0 ); 4,41 (ơ, J = 4,0 Hz, 2H, N-CH2-CH);
5,19 (?, J = 4,0 Hz, 1H, N-CH2-CH); 7,99 (s, 1H, N=CH-

N).
Phổ 13C-NMR (DMSO-dg. 125 MHz. 5. ppm): 27,45

(N-CHs); 29,35 (N-CH3); 64,52 (0 -C H 2-C H 2-0); 47,58
(N-CHrCH); 100,60 (N-CH rCH ); 143,02 (N=CH-N);
106,15 (C-C-N); 147,98 (N-C-N); 154,43 (CH3-N-C-C);
150,89 (CH 3-N -C-N -CH 3).
So sánh số liệu pho với tài liệu tham khảo và phổ
doxophyilín chuẩn (USP) cho thấy sản phẩm đúng !à
doxophyjlin.
2. Kết quả tối ưu hóa quy trình tổng hợp: thực
hiện tối ưu hóa ở quy mơ 5 g và nâng cap len cỡ lô

100 g nguyên liệu theophlin.
Quv trình 1:

Bước 1: kết quả tối ưu của 15 thí nghiệm với 3 yếu
tố Xi.»3 và 1 đáp ứng y nh sau
ô T l mol theophyllin: NaOH = 1:1,454
ã
Nhit độ 89,19 °Ĩ
• Thời gian: 86,16 phút
•
Hiệu suất trung bình: 78,67%
Bước 2: kết quả khảo sát Sơ bộ mà không cần tối

ưu, được các thơng số tối ưu sau
•
•

Tỷ iệ mol dyphyliin : N a i0 4 = 1 :1,2.
Thời gian: 10 phút

•

Nhiệt độ : 35 °c

•

Hiệu suất truncj bình: 92,81%

Bước 3: kết quả toi ưu cùa 15 thí nghiệm với 3 yếu
tố x^ 3 và 1 đáp ưng y như sau
• Tỷ lệ mo! ethylen glycol
acetaldeỉíyd = 6,22 : 1
• Thời gian: 128 phút

» Nhiệt độ: 108 °Ị
•
Hiệu suất trung bình: 84,92%

theophylin-7-

Hiệu suất tồn phần của quy trình 1 là 62%.

Quv trinh 2: kết quả tối ưu cùa 20 thí nghiệm với 4
yếu tố Xi^4 và 2 đáp ứng y-i-^như sau
®

Tỷ lệ mol của 2-bromomethyl-1l3-dioxoiane :

theophyiíin = 1,32 : 1
ã

Nhit : 134 c

ằ
ã
đ

Thi gian: 6 gi
T l mol Na2C 0 3 : theophyllìn = 0,658 :1
Hiệu suấỉ của sản phẩm doxophyllin thơ:

102,543%
®

Độ tinh khiết của sản phẩm doxophyliin thơ:

96,496%
Hiệu suất tồn phần của quy trình 2 /ả 90,44%.

Quv trinh 3:
Bước 1:
•

Sử dụng kết quả tối ưu hóa ở bước 1 của quy

trình 2, tuy nhiên, phản ứng xảy ra nhanh hơn (4 giờ)
•
Hiệu suất trung bình: 96,23%
Bước 2: phản ng xy ra gn nh hon ớon
ã

Tỏc nhõn: HC110%

đ

Thi gian: 1,5 giờ

Nhiệt độ: 60 °c
Bước 3:
•

Sử dụng kết quả tối ưu hóa ở bước 3 của quy

trinh 1

•

Hiệu suất trung bình: 85,06%

Hiệu suất tồn phần của quy trình 3 là 81,85%.

Ket quả nâng cấp lến cỡ lô 100 g nguyên liệu
theophyllin phù hợp với kết quả sau khi toi ưu hỏa.

3. Kết quả xây dựng quy trình và thực hiện kiểm nghiệm theo tỉêu chuẩn cơ sở
Nội dunq
Tính chất
Định tính

Kết quả
Dạng tính thế màu trâng, tan trong nước, ethanol, methanol, ethyl acetat, diclomethan và
cioroform.
~ Phổ hồng ngoại (!R): phổ IR của doxophyllin có các dao động đặc trưng theo cấu trúc
hóa học của đoxophyllin là 2877,40 và 2954,25 (UCH3-N); 1657,54 (uc=c); 1700,61 (uc=o);
1546,82 (uc=n); 1232,76 (óoo)
- Phổ íử ngoại khả kiến (UV-Vis): phổ UV-Vis của mẫu thử có đỉnh hấp thu cực đại ở
bước sóng 273 nm.

Nhận xét
Đúng
Đúng


Tạp chất

Giới hạn
kim ioạỉ nặng
Trosulfat
Mât khối lượng
do làm khô
Định lượng

- Trên sắc ký đồ mẫu (b): Rs pic theophyllin và doxophyliin là 9,6.
- Trên sắc ký đồ mẫu thử: không có pic có thời gian lưu tương ứng với pic theophyllin và
các pic khác pic chính doxophyilin.
< 20 ppm

Đạt

< 0,2 %
< 0,5 %

Đat (0,12%)
Đạt (0,14%)

Hám lượng ơoxophyỉìĩn từ 98 đến 102 % tính trên chê Dhầm khan
: _UỈA----ÍL.Ẳ
■ / 11---------------------------------- V

Đạt

Đạt (100,7%)

nghiệm kèm theo).
4. Kết quả đánh giá độ ổn đình của doxophyllin

! _»1_ í £ _

1_ i

L .A . . 2 .

Điêu kiện

NaOH
0,1 M
H20 2 3%
Đèn uv
65 °c
65°c và
RH = 75%
.

í.f _ Ặ _

l.‘ M

Thời gian iưu của cảc pic trên sằc ký
đồ
7,25
2,66
7,31
1,37
1,48
3,39
7,28

1,56
7,30
7,33
7,33

Mâu chuán
HCI 0,1 M

r-N

í . . I .! í

7,33

I I - ' " ' T ........................ - t i •

'

V

. .

Hàm lượng doxophyllin cịn % doxophyllin bị phân hủy
iại (mq/ml)
0,500
0
0,198
60,4
0,04

92,0

0,430

14,0

0,500
0,500

0
0

0,500

0

T '"

Nghiên cứu độ ổn định bằng phương pháp lão hóa cếp tốc: két quả thực hiện trẽn 03 lơ
Lơ

Chỉ tiêu
Tính chất

Tạp chất liên quan

Hàm lương
(%)
kễt iuặri
-T..À , , .... .......

Lơ 1
LƠ 2
Lơ 3
Lơ 1
Lơ 2
Lơ 3
Lơ 1
Lơ 2
Lơ 3
Lõ 1
Lơ 2
LƠ 3

0
Đat
Đạt
Đat
Đat
Đạt
Đat
100,62
100,79
100,67
Đat
Đai
Đ

Đat
Đạt

Đat
Đạt
Đat
Đat
100,61
100,91
100,14
Đat
Đat
Đat

Thời qian khảo sát (thánq)
2
3
4
Đạt
Đat
Đat
Đạt
Đat
Đạt
Đat
Đat
Đat
Đat
Đạt
Đat
Đat
Đat
Đat

Đ
Đạt
Đat
100,56
99,96
100,23
99,56
99,82
100,37
100,79
100,77
99,71
Đat
Đat
Đạt
Đạt
Đat
Đat
Đat
Đat
Đat

5
Đat
Đat
Đat
Đat
Đat
Đat
100,45

100,63
99,66
Đat
Đat
Đat

6
Đ
Đ
Đat
Đat
Đat
Đạt
100,34
99,89
99,93
Đat
Đạt
Đat

thấy hàm lirợng của 3 lơ trong íhời gian 6 tháng khác nhau không ý nghĩa (x2 = 0,010 < x20,05 = 12,592 và p =
0,586 >= 0,05). Vậy, doxophyliin ổn định trong thời gian 6 tháng ờ điều kiện 40 ± 2 °c và độ ẩm tương đổi 75 ±
5% .
Nghiên cửu độ ổn định dải hạn ở điều kiện bảo quản: két quả thực hiện trẽn 03 lố
Chỉíiêu
Tính chấí

Tạp chét Hên quan

Hàm lương

(%)
Kêí ln

Lơ
Lơ 1
Lơ 2
Lơ 3
Lơ 1
Lơ 2
Lơ 3
Lơ 1
Lơ 2
Lơ 3
Lơ 1
Lơ 2
Lơ 3

0
Đat
Đạt
Đat
Đat
Đat
Đạt
100,67

100,62
100,79
Đat
Đạt

Đạí

Thời gian khảo sát (thổnq)
3
6
Đạí
Đat
Đat
Đat
Đạí
Đat
Đạt
Đat
Đạt
Đ
Đat
Đạt
99,87
99,63
100,95
99,68
100,19
100,66
Đat
Đat
Đạt
Đat
Đạt
Đạt

Tiến hành phân tích phương sai hai yếu tố có lặp hàm lượng doxophyllin của 3 lô trong thời gian 0 3 và 6
tháng cho thấy hàm ỉượng của 3 lô trong thời gian 6 tháng khác nhau không ý nghĩa (v2 = 0,002 < x20 05 =
5,991 và p = 0,306 >= 0,05). Vậy, doxophyliin đạt độ ổn định trong thời gian khảo sát. Can tiếp tục theo dõi đề
xác đinh tuồi íhọ của doxophyllin ở điều kiện bảo quản thực.
BÀN LUẬN
So sánh 03 quy trình như sau
Nội dunq
Hiệu suất toàn phằn
Độ tinh khiêt
Thời gian phản ứng
toàn phần
Phương pháp tối ưu
hóa
Khác

Quv trình 1
62%
> 99%
3 bước, tịng thời gian phản
ứng khoẳnq 3,7 qiơ
Phương pháp co điến (đa yếu
tố, 1 đáp ứng), với sự trợ giúp
của phan mem MODDLE 5.0

Quv trình 2
90,44%
> 99%
1 bước, íơng thời gian phản ứng
khoảng 6 qiờ

Phương pháp thông minh (đa
yếu tố, đa đáp ứng)7với sự trợ
giúp của phần mem Design
Expert 7.1.6 và BCPharsofi
~ Giá thành nguyên liệu rẻ
- Gỉá thành nguyên iiệu 2- _
- Sản phẩm trung gian
bromomethy!-1,3-dioxoian đắt
dyphyliin có trong chuyên luận
(100g = 344 SGD)
USP35, có tác dụnj3 giãn phế
quản, tiêu chuẩn dê kiểm sốt

Quy trình 3
81,85%
> 99%
3 bước, tơng thời gian phản ứng
khoảnq 676 qiờ
Kêt hợp cả hai phương pháp tối
ưu hóa
- Giá thành nguyên liệu
bromoacetaldehyd dỉethyl acetal
(2,2-dietoxyethyl bromid) rẻ hơn
(ioog = 54 SGD), có thê tổng
hợp từ vinvl acetat

Xéỉ về tính khả thi ở quy mơ cơng nghiệp, quy trình 3 có thể sử dụng để nâng cấp lên những cỡ iô cao hơn.
Tuy nhiên, íùy từng điều kiện và mục đích mà co thể chọn quy trinh cho phù hợp.
K ẾT LUẬN V À KIẾN NGHỊ
Như vậy, nghiên cứu đã tổng hợp íhành công

doxophyllin tuy cỏ hiệu suất khác nhau nhưng mỗi quy
trình đều có ưu điểm và nhược điểm. Sản phẩm đúng
cấu trúc so vởj doxophlin chuẩn, có độ tỉnh khiết cao
và đạt tiêu chuẩn cơ sở. Doxophyllin được tổng hợp
với hiệu suất cao hơn các patent đã công bố trước đây
và hồn tồn có ìhể triển khai trong điều kiện tại Việỉ
Nam với quy mơ iớn. Ngồi ra, cơng írlnh đã áp dụng
phương pháp tốí ưu hóa thơng minh trong quy hoạch
thực nghiệm để tối ưu hóa quy trinh tổng hợp. Kết quả
đánh giá độ ổn định cho thấy doxophyllin đạt độ ổn
định trong íhời gian khảo sát. Trong thơi gian tới, cần
nâng cấp cỡ lô quy trinh tổng hợp doxophyllin ở quy
mơ 500 g ngun líẹu theophlin và các cỡ iô cao hơn
để đánh gia được hiệu quả của từng quy trình, đồng
thời tiến hành tiếp tục 5 đánh giá độ ổn định ơ điều
kiện bảo quản íhực, nghiên cứu độc íính cấp, độc tính
bán trường diễn của doxophyllin, từ đó, tiến hành bào
chế thành các dạng thuốc phù hợp (viên nén, thuốc
tiêm, siro,...).
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Ị. Asian YC (2006), “Application of Box - Behnken

design

and

response

surface

methodology

for

modeling of some Turkish coas”, Elsivier Inc., 86,

pp.912. Akhilesh Gupta e t al. (2011), "An Analytical
Approach of Doxofylline: A Review", Asian J. Pharm.
Ana., 1(4), pp. 67-70.
3. David B. Ishay (1956), 7-(2:3-dihydroxypropyl)
Theophyline, J. Chem. S o c 3975
4. Furukawa CT, Shapiro GG, Pierson WE,

Bierman c w (1983), “Dyphylline versus theophylline: a
double-biind comparative evaluation”, Journal o f
clinical pharmacology, 23, pp.414-422.
5. ÍCH (2003), “Q1A(R2) stability Testing of New

Drug Substances and Products”, pp. 1-22.
6. Jean Bousquet and Nikolai Khaltaev (2007),
Global surveillance, prevention and control o f Chronic
Respiratory Diseases: a comprehensive approach,

WHO, pp. 15-21.
7.

Jens T.

Carstensen

(2005),

Drug stability

principles and practices, Wilmington, North Carolina,

pp. 329-384.
' 8 Jhuma Sankar, Rakesh Lodha, s. K. Kabra
(2008),
"Doxofyiiine:
The
Next
Generation
Methylxanthine", Indian Journal o f Pediatrics, 75(3), 59
9. Kim H. Esbensen (2004), Multivariate Data

Analysis - In Practice 5th Edition: An Introduction to
Multivariate Data Analysis and Experimental Design,
CAMO Software Inc., pp. 20-147.
10.
Namdeo
G.
Shinde
et
al.
(2013),

“Pharmaceutical Forced Degradation Studies with
Regulatory Consideration” , Asian J. Pharm. Ana., 3(4),

pp. 178-188.
11.

Patent

CN1106404

A

(1995),

“Synthetic

process of, new drug dosotheophyiline”.
12. Patent CN 102936248 A (2012), “Method for
preparing doxofyiiine”.
13. Patent CN 1041728 c (1999), “Synthesis of
doxofyliine”.
14. Ranjit Singh et ai. (2012), “Current trends in
forced degradation study for pharmaceutical product
development”, J. Pharm. Educ. Res., 3(1), pp. 54-63
15. Stat-Ease, Inc., Design expert 7.1.6.

16. Shukla D, Chakraborty s , Singh s , Mishra B
(2009),

"Doxofylline:

a

promising

methylxanthine

derivative for the treatment of asthma and Chronic
Obstructive Pulmonary disease”, Opin. Pharmacothe.r,
10(14), pp.2343-2399.
17. The United States Pharmacopoeial Convention
(2012), USP35, pp. 14 1,14 5 , 15 1, 317, 2999.