Sử dụng một số hệ izozym để nghiên cứu đa dạng di truyền ở một số loài cây dược liệu bản địa ở việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN
....... Q

SỬ DỤNG M ỘT SỐ HỆ IZOZYM

BÊ NGHIÊM cứu
ĐA DẠNG D I TRUYỂM ỏ m ộ t s ố LO À I CÂY DƯỢC U Ệ U
BẢN B ỊA Ỏ V IỆT MAM
•

•

•

MẢ SỐ: QT - 04 -15

CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI: THS. HỒNG THỊ HỊA
Các cán bộ tham gia: TS. Đinh Đoàn Long
KTV. Trần Thị Nhuận
ThS. Phạm Thanh Huyền

HÀ NỘI - 2005


BÁO CÁO TÓM TẮT
1.Tên đề tài:
SỬ DỤNG MỘT SỐ HỆ IZOZYM ĐỂ NGHIÊN c ứ u ĐA DẠNG DI TRUYỂN ở
MỘT SỐ LOAI CÂY DƯỢC LIỆU BẢN ĐỊA Ở VIỆT NAM

# Mã số: QT - 04 - 1 5

2.
Chủ trì đề tài:ThS. Hoàng Thị Hoà
3. Các cán bộ tham gia: TS. Đinh Đoàn Long
KTV. Trần Thị Nhuận
ThS. Phạm Thanh Huyền
4. Mục đích và nội dung nghiên cứu:
Mục đích:
Góp phần xác định tính đa hình di truyền, dấu chuẩn di truyền phân
loại loài và mối quan hệ di truyền giữa một số loài cây dược liệu bản địa ở
Việt Nam.
Nội dung nghiên cứu:
- Chọn và thu thập mẫu (Lựa chọn một số cây dược liệu bản địa ở Việt
Nam cịn ít được nghiên cứu). Đã chọn được hai loài cây thuốc diệp hạ châu
đắng (Phyllanthus amarus Schum. et. Thonn.) và diệp hạ châu (Phyllanthus
urinaria L.); thu thập mẫu tại một số vùng ở miền Bắc Việt Nam).
- Xử lý mẫu.
- Chạy điện di, nhuộm theo phương pháp phân tích hệ izozym Superoxide
dismutaza (SOD), Esteraza (EST), peroxidaza (PO), chụp ảnh mẫu.
- Phân tích số liệu.
- Viết báo cáo.
5. Các kết quả đạt được:
Vê mặt khoa học:
- Tổng quan có chọn lọc các nghiên cứu trong và ngoài nước về đối tượng
nghiên cứu và những nghiên cứu về izozym trên một số đối tượng khác.
- Kết quả cho thấy có thể sử dụng kỹ thuật phân tích izozym SOD, EST
và PO để đánh giá mức độ đa dạng, khoảng cách di truyền và phân loại
nhanh 2 loài Phyỉlanthus amarus và Phyỉỉanthus urinaria ngay từ khi cây
còn nhỏ (đặc biệt là hệ izozym SOD). Phát hiện quần thể Phyllanthus
urinaria L. Nội Bài - Sóc Sơn có phổ izozym SOD mang 3 băng đặc trưng
của lồi Phylỉanthus amarus. Có thể đây là con lai giữa 2 lồi Phylìanthus

amarus và Phỵllơnthus urinaria L.
Sản phẩm:
- Báo cáo tổng kết đề tài
- Một phần kết quả nghiên cứu đã được công bố trong 2 bài báo khoa
học (1 bằng tiếng Việt và 1 bằng tiếng Anh).
Vê mặt đào tạo:
- Đào tạo 1 cử nhân Sinh học: Sinh viên Cao Lệ Quyên lớp Sinh K46A
với đề tài khoá luận liên quan đến nội dung đề tài QT-04-15, bảo vệ
tốt nghiệp đạt 9,5 điểm.

1


- Khả năng ứng dụng
Kết quả nghiên cứu là cơ sở khoa học và góp phần phân loại hai lồi
cây thuốc diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum. et. Thonn.) và diệp
hạ châu (Phyllanthus urinaria L.) thu thập ở miền Bắc Việt Nam.
6. Tình hình kinh phí của đề tài:
Tổng kinh phí của để tài:
16.0Ơ0.000 VNĐ
- Chi phí nghiệp vụ chun mơn như dụng cụ, hố chất... 6,740.000 VNĐ
- Chi phí thuê mướn, thuê lao động
6.000.000 VNĐ
- Quản lý phí, hỗ trợ đào tạo và nghiên cứu khoa học
1.120.000 VNĐ
- Thanh toán điện nước
640.000 VNĐ
- Nghiệm thu để tài, in , mua tài liệu...
1.500.000 VNĐ
Đã thanh quyết toán

SUMMARY
a) The title of subject: Using some isoenzyme systems to assess the
genetic diversity of some Vietnamese native medicinal plants.
b) Numberical code: QT- 04-15
c) The grant holder: M.Sc. Hoang Thi Hoa
d) The Participants: Dr. Dinh Doan Long
M.Sc. Pham Thanh Huyen
Tech.. Tran Thi Nhuan
e) Objectives and contents:
* Objectives: The two native medicinal plant species Phyllanthus
amarus Schum. Et. Thonn. and Phyllanthus urinaria L. are colecting
from different areas in the north of Vietnam.
* Contents: In Vietnam, Phyllanthus amarus Schum. Et. Thonn. and
Phyllanthus urinaria L. are the two most well-known medicinal plants
among the species belonging to the genus Phyllanthus, family Euphobiaceae.
These medicinal plants have been used for centuries in the traditional
medicine for treatment of sore throat, furunculosis, eczema, hematometra,
hepatitis, ophtalmia, arthralgia, snake-bite.
Recently, numerous pharmaceutical products derived from these two plant
species, e.g. Livbilnic (Traphaco Co. Ltd), VG-5 (Central pharmaceutical
company N05), Hepaphyl (Central pharmaceutical company 25), Hepamarin,
Livsin-94 (Haphaco) etc. have been commercialized and widely used in
clinical treatment of liver ailments, including the hepatitis B infection.
In order to assess the genetic diversity of these medicinal plants and to
establish a method for rapid identification of these two plant species, we
performed the analysis of some isozyme markers: Izozym Superoxide

2

dismutaza (SOD), Izozym Esteraza (EST), Izozym Peroxidaza (PO). The
study revealed that the SOD, EST, PO isozymes profile of the two species are
obviously distinct. All collected samples of p. amarus accessions were
specified by electrophoretic markers of SOD isozyme at Rfs that are equal to
0.63; 0.71 and 0.75; EST isozyme at Rfs are 0,09; 0,42; PO isozyme at Rfs
are 0,85; 0,87 .Whereas, these markers were absent from most of p. urinaria
samples, except for some seemingly interspecific forms.
g) The obtained results:
In conclusion, our study indicated that the analysis of SOD, EST, PO
isozyme markers might be used as a simple and cost-effective technique for
assessment of genetic polymorphism and rapid distinction of the two
medicinal plant species - Phyllanthus amarus Schum. Et. Thonn. and
Phyllanthus urinaria L.

XÁC NHẬN CỦA BAN CHỦ NHIỆM KHOA

CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI

ThS. Hồng Thị Hồ

PGS.TS. Phan Tuấn Nghĩa

XÁC NHẬN CỦA TRƯỜNG
PHĨ HiỆb IRƯĨNB

PŨS.Ts. dí)ù.L ^ỈẰuiL^Ối.

3

MỤC LỤC
Mở đầu.........................................................................................................

5

Nội dung chính của đề tài..........................................................................

7

TThương 1. Tổng quan tài liệu .................................................................

7

1. Các nghiên cứu về Phyllanthus L..........................................................

7

1.1. Phân loại học thực vật và tên gọi.......................................................

7

1.2. Hình thái học, tế bào học và phân b ố ................................................

7

1.3. Phân bố và sinh thái ............................................................................

8

1.4. Sử dụng Phylỉanthus L. trong y học cổ truyền...................................

9

1.5/Thành phẩn hoá học của Phyllanthus L.............................. ............

9

1.6. Các nghiên cứu về tác dụng dược lý của Phyllanthus L.................

9

1.7. Các dược phẩm được bào chế từ p. amarus vàp. urinaria...............

10

2. Đại cương về izozym ......................................... ...............................

11

2.1. Izozym Superoxide dismutaza (SOD. E.c.1.15.1.1).....................

13

2.2. Izozym Esteraza (EST. E.C.3.1.1.2) ................................................

14

2.3. Izozym Peroxidaza (PO. E.c. 1.1.1.17)...........................................

14

Chương 2. Vật liệu và phương pháp..........................................................

16

2.1. Vật liệu thực v ậ t..................................................................................

16

2.2. Phương pháp phân tích đa hình izozym...........................................

18

2.2.1. Phương pháp thu m ẫ u ..................................................................

18

2.2.2. Phương pháp nghiền m ẫ u ............................................................

19

2.2.3. Phương pháp điện d i ......................................................................

19

2.2.4. Phương pháp phân tích kết quả nghiên c ứ u ..................................

19

Chương 3. Kết quả và thảo lu ậ n ..............................................................

21

3.1. Phổ điện di hệ izozym SOD c ủ a ....................................................

21

3.2. Phổ điện di hệ izozym E S T ..............................................................

25

3.3. Phổ điện di hệ izozym P O ...............................................................

27

3.4. Quan hệ di truyền giữa các quần th ể ..................... .........................

31

Kết L u ận ....................................................................................................

32

Tài liệu tham k h ả o ....................................................................................

33

4

MỞ ĐẨU
Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum. et. Thonn.) và diộp hạ
châu (Phyllanthus urinaria L.) ià hai loài cây thuốc thuộc chi Phyllanthus, họ
Ẽuphorbiaceae, phân bố tương đối rộng rãi ở Việt Nam. Hai loài cây thuốc
này đã được sử dụng lâu đời trong y học cổ truyền ở nước ta cũng như ở
nhiều nước khác thuộc vùng Đông và Nam Á như An độ, Malaysia, Thái
Lan, Campuchia, Lào, Trung quốc, Inđônêsia ... Tuy vậy, cho đến nay việc
sản xuất các dược phẩm từ hai loài p. amarus và p. urinaria L. chủ yếu dựa
trên các dược liệu thu hái tự nhiên, trong đó phần lớn là các dạng mọc hoang
dại, bộc lộ một số nhược điểm sau:
- Viêc thu hái khơng có quy hoạch dẫn đến nguy cơ mất đi các nguồn
tài nguyên di truyền,
-

Việc thu hái từ các dạng hoang dại không đáp ứng được yêu cầu của
công nghiệp dược do nguồn dược liệu ban đầu thường khơng ổn định và
khơng kiểm sốt được về mặt hóa học, hoạt tính sinh học.
- Dược liệu thu thập hoang dại có nguy cơ nhiễm với các dạng vi sinh
vật (nấm, vi khuẩn, virút ...), vì vậy có thể mang theo các nguồn chất độc
ngoài ý muốn.
- Các dạng nguyên liệu hoang dại có nguy cơ nhiễm độc với các nguồn
hóa chất độc khác nhau, như chất diệt cỏ, thuốc trừ sâu, các chất thải công
nghiệp ... nếu cây được thu hái từ các vùng bị ô nhiễm và thực tế tình hình
này rất khổ kiểm sốt.

Hình 1. Cây Diệp hạ châu đắng Phyllanthus amarus L. (A) và
Diệp hạ châu Phyllanthus urinaria L. (B) được dùng trong nghiên cứu

5

Ngoài ra, trong thực tế p. amarus và p. urinaria L. là hai lồi cây thuốc
có đặc điểm hình thái rất giống nhau (xem Hình la,b) và giống với một số
lồi Phyllanthus khác hiện đang có ở Việt nam, như p. niruri, p. reticulaĩus
... vốn ít được quan tâm hơn vì mục đích chế biến dược liệu. Việc phân loại
chính xác các lồi phyllanthus hiện nay chỉ có thể thực hiện nhờ các chuyên
gia phân loại thực vật sau khi cây đã phát triển đến giai đoạn trưởng thành.
Trước thực tế như vậy, việc thu thập dược liệu tự phát từ người dân đứng
trước nhiều nguy cơ nhầm lẫn và khó có thể đảm bảo chất lượng của nguồn
dược liệu sử dụng cho sản xuất dược phẩm ở quy mô cơng nghiệp.
Trong hồn cảnh đó, báo cáo đề tài này của chúng tơi nhằm góp phần
cung cấp một cơng cụ phục vụ cho việc phân loại nhanh hai loài cây dược
liệu dẻ nhầm lẫn này. Ngoài ra, kỹ thuật này cịn cho phép đánh giá mức độ
đa hình di truyền của các quần thể mẫu được thu thập từ một số địa phương
khác nhau ở miền Bắc nước ta, là dẫn liệu cơ bản cho việc chọn lọc nguồn
nguyên liệu phục vụ cơng tác chọn, tạo giống các lồi cây thuốc này ở Việt
Nam trong tương lai.
Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam cho thấy khả năng ứng dụng các
chỉ thị phân tử (molecular fingerprintings) trong việc phân loại và định danh
nhanh các loài thảo dược ở nước ta, vốn từ trước đến nay chỉ được thực hiện
chủ yếu dựa vào các chỉ thị hình thái (là chỉ thị dễ gây nhầm lẫn trong nhiều
trường hợp) và trong một số ít trường hợp là chỉ thị hóa học.

6


NỘI DUNG CHÍNH CỦA ĐỂ TÀI
CHƯƠNG 1. TỔ NG Q U A N TÀ I LIỆU
1.1 CÁC NGHIÊN CỨU VỂ PH YLLANTH U S L.

1.1.1. Phân loại học thực vật và tên gọi
Chi Phyllanthus là một trong những chi lớn nhất của họ Thầu dầu
(Euphorbiaceae), thuộc bộ Euphorbiales, phân lớp Hoa hồng (Rosidae), lớp
Hai lá mầm (Dicotyledons). Chi này gồm 11 phân chi: Isocladus, Kirganelia,
Cicca, Emblica, Phyllanthus, Conami, Gomphidium, Phyllanthodendron,
Xylophylỉa, Botryanthus, Eriococcus (ưnander et al., 1990) và có khoảng gần
700 loài. p. amarus và p. urinaria cùng thuộc phân chi Phyllanthus nhưng p.
amarus thuộc nhánh Phyllanthus còn p. urinaria thuộc nhánh Urinaria; trong
phân chi Phyllanthus cịn có 2 nhánh khác là Lysiandra và Pentandra [25].
Trong chi Phyllanthus, nhiều loài cây trong đó có p. amarus và p.
urinaria được sử dụng làm thuốc trong y học dân tộc ở nước ta và một số nước
nhiệt đới khác trên thế giới như Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Brazil, Peru,
Tanzania,... từ cách đây hàng nghìn năm. Nhưng, phải đến năm 1738 chúng
mới được Linné mô tả và đặt tên (tại Barbados). Mặc dù vậy, những tài liệu cổ
cho thấy từ lâu những loài cây này đã từng được ghi nhận và mô tả [25].
Về tên gọi, do được sử dụng rộng rãi trong nền y học dân tộc của nhiều
quốc gia từ hàng nghìn năm, nên hai loài p. amarus và p. urinaria được gọi bằng
rất nhiều tên địa phương khác nhau, như: herbe du chagrin, petit tamarin rouge,
surette (Pháp), Chanca piedra (Peru), quebra-pedra, arranca-pedras, erva
pombinha (Braxin), pemilla del pasto (Puerto Rico), Holy Friday (Colombia),
gale of wind (Florida và Caribe thuộc Anh), Hurricane weed (Bahamas), Creole
quinine, arrebentapedra, Paraparaimè (Paraguay), Santa Maria, San Pedro, herb of
San Pablo, sampasampalkan (Philippines), zhen chu cao, ye xia zhu, Hsieh-hsia
Chu (Trung Quốc), Komikansou (Nhật Bản), Pitirishi, Budhatri (An Độ),... Đôi
khi, tại một số địa phương, các tên thường được dùng lẫn lộn để gọi tên cả hai
loài hoặc một số loài khác thuộc chi Phyllanthus [25].
ỏ Việt Nam, các cây thuốc p. amarus và p. urinaria cũng được gọi tên
bằng những tên địa phương khác nhau, chẳng hạn như chó đẻ răng cưa, cam
kiềm, vườn kiềm, diệp hạ châu, diệp hoè thái, lão nha châu, trân châu thảo, rút
đất, khao ham... Và cũng giống như ở một số nước, ở nước ta các tên địa phương

đôi khi cũng được dùng lẫn lộn cho cả hai loài. Nhưng phổ biến nhất p. amarus
được gọi là diệp hạ châu đắng hay chó đẻ chân chim, chó đẻ thân xanh, phân biệt
với P. urinaria được gọi là diệp hạ châu hay chó đẻ răng cưa [1],
1.1.2. Hình thái học, tê bào học
Các đặc điểm hình thái cơ bản của p. amarus và p. urinaria có thể mơ
tả như sau: là những cây thân thảo, sống một năm hoặc nhiều năm, cao
trung bình 20-30cm, đơi khi có thể cao đến 60-70cm; Thân nhẵn, tròn; lá
7


mọc so le, hình bầu dục, xếp sít nhau thành hai dãy, mỗi cành như một lá
kép hình lồng chim, mặt trên xanh lục nhạt, mặt dưới màu xanh mốc;
phiến lá thuôn, dài 5-15mm, rộng 3-6mm, đầu nhọn hay hơi tù, mép
ngun; gân - phụ mảnh, có 4-6 cặp; khơng có cuống lá hoặc cuống lá rất
ngắn. Hoa mọc ở nách lá, nhỏ, có cuống ngắn, đơn tính cùng gốc; hoa đực
b đầu cành, hoa cái ở cuối cành, tiểu nhụy 3, chỉ nhị dính nhau; Quả nang,
hình cầu đường kính khoảng 2mm, mọc rủ xuống ở dưới lá nên được gọi là
diêp hạ châu (nghĩa là hạt dưới lá); mỗi quả có 6 hạt hình tam giác, màu nâu
nhạt, có vân ngang. Cây thường ra hoa từ tháng 4 đến tháng 6 và ra quả từ
tháng 7 đến tháng 9 [1,7].
Ngoài những đặc điểm chung trên, hai loài p. amarus và p. urinaria
cũng có một số điểm khác biệt về hình thái như: p. amarus thường mọc
thẳng, thân mầu xanh, ít chia nhánh trong khi p. urinaria lại thường phân
nhánh, thân có mầu xanh xẫm hoặc tím; cây p. amarus thường có quả nhẫn,
khơng gai cịn quả của cây p. urinaria thường có gai; hoa của p. amarus có 5
lá đài, cịn hoa của p. urinaria có 6 lá đài (Võ Văn Chi, 1997; Phạm Hoàng
Hộ, 1999). Tuy vậy, các đặc điểm phân biệt này thường chỉ rõ rệt khi cây đã
đạt đến giai đoạn trưởng thành (ra hoa, kết quả) và được phân loại bởi những
nhà phân loại học có kinh nghiêm. Trong thực tế q trình thu thập và chế
biến dược liệu hiện nay, những khó khăn trong phân loại như vậy rất dễ dẫn

đến việc thu thập nhầm lẫn giữa hai loài này [2,5].
Cho đến nay có rất ít những nghiên cứu về tế bào học của Phyllanthus
amarus và p. urinaria. Nghiên cứu của Bancilhon và cộng sự (1971) cho
thấy bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội của p. amarus là 2n= 26 hoặc 2n= 52;
Nghiên cứu của Rossignol và cộng sự (1987) lại cho thấy bộ nhiễm sắc thể
lưỡng bội của p. urinaria là 2n= 50. Một dẫn liệu khác cho rằng bộ nhiễm
sắc thể lưỡng bội của p. amarus cũng là 2n=26, còn của p. urinaria là
2n=14, 2n= 52, hoặc 2n= 50 tuỳ theo thứ (Phạm Hồng Hộ, 1999). Như vậy,
có thể nói, đến nay chưa có nghiên cứu hồn chỉnh về số lượng và đặc điểm
bộ nhiễm sắc thể cơ bản của các loài Phyllanthus [5,11,17],
1.1.3. Phân bố và sinh thái
Ở Việt Nam, chi Phyllanthus L. có khoảng 40 lồi. Trong đó có hai
lồi là Phyllanthus amarus và Phylỉanthus urinaria L. có hình dáng gần
giống nhau, mọc rải rác ở khắp mọi nơi trừ vùng cao lạnh. Trên thế giới, các
loài này cũng được phân bố rộng rãi ở Campuchia, Lào, Malaysia, Thái lan,
Trung quốc, Ấn độ, Brazil, Florida và Texas (Mỹ). Phylỉanthus L. là cây ưa
ẩm và ưa sáng hoặc có thể hơi chịu bóng, thường mọc lẫn trong các bãi cỏ, ở
ruộng cao ( đất trổng màu), nương rẫy, vườn nhà và đôi khi ở vùng đồi. Cây
con mọc từ hạt vào cuối mùa xuân, sinh trưởng nhanh trong mùa hè và tàn lụi
vào mua thu. Do khả năng ra hoa kết quả, nhiều hạt giống phát tán gần nên
cây mọc thành đám dày đặc, đôi khi lấn át cả cỏ dại và cây trồng khác [1],

8


1.1.4. Sử dụng Phyllanthus L. trong y học cổ truyền
Các tác dụng điều tri được biết đến rộng rãi của hai loài Phyllanthus
amarus và Phyllanthus urinaria bao gồm điều trị một số rối loạn đường tiêu
hóa (đặc biột là các bệnh lý về gan), bệnh tiểu đường, một số bệnh về thận,
đường tiết niệu, (Calixto et al., 1998). Gần đây, một số nghiên cứu lâm sàng

và dược lý đã chứng minh dịch chiết và thành phần của hai loài cây thuốc này
có tác dụng ức chế q trình sao chép của virút viêm gan B và nhiều
retrovirút khác (trong đó có HIV) nhờ tác dụng ức chế hoạt động của enzym
sao chép ngược reverse transcriptaza [13,21,22].
Ngoài ra, một số nghiên cứu khác cho thấy các dịch chiết Phyllanthus
có hoạt tính ức chế ACE (angiotensin-converting enzym) liên quan đến một
số biến chứng của bệnh tiểu đường [24,25]
1.1.5. Thành phần hoá học của Phyllanthus L.
Các chất hoá học của cây Phylanthus L. tìm thấy ở lá, thân và rễ gồm
một số chất chính như:
Lignan : phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin.
Flavonoid : phyllanthin flavonoid FG-1, phyllanthin flavonoid FG-2.
Tannin : repandusinic acid, geraniin.
Ngồi ra cịn một số thành phần hoá học như: glycoside, alkaloid,
elligitannin, phenylpropanoid, lipid, sterol, flavonol,...[12].

Hypophyllanthin

Phyllanthin

Niranthin

1.1.6. Các nghiên cứu về tác dụng dược lý của Phyllanthus L.
Từ giữa thập niên 60, Phyỉỉanthus L. đã trở thành đề tài nghiên cứu
hoá thực vật để xác định các phân tử hoạt động và các hoạt động dược lý của
chúng. Nguổn hố thực vật chỉ có thể tìm thấy ở giống Phyllanthus. Nhiều
phân tử hoạt động là thuộc tính hoạt động sinh học như lignan, glycoside,
flavonoid, alkaloid, elligitannin, phenylpropanoid tìm thấy ở lá, thân và rễ
cây. Các lipid, sterol, flavonol cũng thấy phổ biến trong cây [12, 17].
Hai chất phyllanthin và hypophyllanthin được xác định là có hoạt tính

chống viêm gan [18,20].

9


1.1.7. Các dược phẩm được bào chế từ p. amarus và p. urinaria
Hiện nay, các dược phẩm dưới dạng cao của p. amarus và p. urinaria có
mặt ở rất nhiều nước trên thế giới (Hình 3). Riêng ở nước ta, trong vài năm
gần đây, nhiều biột dược có nguồn gốc từ p. amarus và p. urinaria được sử
dụng rộng rãi. Trong đó, có thể kể đến Iivbilnic® (Cơng ty cổ phần dược
phẩm Traphaco), VG-5® (Cơng ty dược phẩm TW 5), Hepaphyl® (Cơng ty
dược phẩm TW25), Hepamarm®, Livsin-94® (Cơng ty cổ phần dược phẩm
Hà Tây), v.v... Hiện nay, những dược phẩm này đang được sử dụng rộng rãi
trong việc điều trị một số bệnh lý về gan, đặc biệt là viêm gan siêu vi B
Trong y học cổ truyền, toàn bộ cây Phylìanthus L. được rửa sạch, dùng tươi
hay phơi khơ. Dùng cây khô bằng cách như pha trà hoặc sắc thuốc uống hàng
ngày.

Hình 2. Một số biột dược có nguồn gốc từ Phyllanthus amarus (hình A) và p. urinaria
(hình B) đang được bán tại các nước Mỹ, Braxin.

10


Hình 3. Một số dược phẩm dang được tiêu thụ tại thị trường trong nước.
VG5® của cơng ty dược TW 5 có thành phần chính là p. amarus (A)
Livbiln® của cơng ty Traphaco có thành phần chính p. urinaria (B)
Mặc dù các loại dược phẩm nêu trên ở nước ta đang được nhiều người sử
dụng, nhưng phần lớn các công ty dược khơng có vùng trồng ngun liệu ổn
đinh, mà thường thu mua từ trong dân. Việc thu mua nguyên liêu một cách

tự phát như vậy biểu lộ một số nhược điểm như sau: (1) Gây nguy cơ làm mất
nguồn tài ngun di truyền; (2) Khó kiểm sốt tính ổn đinh về thành phần
hóa học và hoạt tính sinh học của dược liệu; (3) Dược liệu có mang theo các
hợp chất hố học khơng mong muốn (chất độc, chất ơ nhiễm,.. .)■
Trong hồn cảnh đó, viộc xây dựng các vùng nguyên liệu để có thể khai
thác ổn đinh, bển vững là điều cần thiết. Với ý nghĩa như vậy, việc sử dụng
các chĩ thị phân tử nhằm đánh giá đa dạng các nguồn gen hiên có sẽ cung cấp
dẫn liêu cần thiết cho việc đinh hướng, quy hoạch công tác chọn tạo giống và
tiêu chuẩn hóa nguồn nguyên liệu làm thuốc từ thảo mộc.
1.2. ĐẠI CƯƠNG VỂIZOZYM
Bản chất hoá học của enzym là protein, do đó cấu trúc khơng gian của
tồn bộ phân tử có vai trị quan trọng đối với hoạt tính sinh học xúc tác của
enzym.
Izozym là những biến dạng phân tử cùa enzym được xác định về phương diện
di truyền, khác nhau về cấu trúc bậc một và do các lôcut gen khác nhau xác

11


định. Hay nói cách khác izozym là những dạng enzym có hoạt tính xúc tác
tương tự hoặc giống nhau (cùng phản ứng hố học) nhưng có các đặc tính
hố học (độ pH tối ưu, điểm đẳng điện, chất ức chế, ...) khác nhau. Trên cơ
sở đặc điểm di truyền, có thể chia izozym làm 2 loại:
- Izozym đơn gen: là các izozym chịu sự kiểm sốt của một gen, được
hình thành từ các chuỗi polypeptít đơn, nhưng có các kiểu phân tử khác nhau
(v.d: về thành phần và trật tự các axít amin); vì vậy, có thể phân tách được
bằng điện di.
- Izozym đa gen: là các izozym được mã hố bởi 2 hay nhiều gen, có thể
phân biệt được bằng hố miễn dịch hoặc dựa trên đặc tính enzym.
Các biến dạng tương ứng của izozym là allozym. Allozym là sản phẩm

của những alen khác nhau của cùng một lôcut, nó khác với izozym là sản
phẩm của những lơcut khác nhau.
Các nhà khoa học đã đánh giá được tầm quan trọng của việc nghiên
cứu izozym để phục vụ cho nhiều lĩnh vực khác nhau. Một trong số đó là các
cơng trình nghiên cứu phân loại tiến hóa của các lồi sinh vật.
Với trình độ kỹ thuật tiên tiến và sự phát triển của khoa học, ngày càng
có nhiều phương pháp để nghiên cứu tính đa hình của izozym. Ban đầu là
những phương pháp đơn giản như: phương pháp pha loãng, phương pháp độ
nhớt, phương pháp làm mất hoạt tính bằng kéo dài thời gian ngoài cơ thể đến
những phương pháp sắc kỷ (chromatography), phương pháp điện di
(Electronphoresis) và phương pháp ghi hình (scanning). Trong các phương
pháp này phương pháp nghiên cứu bằng điện di trên gel polyacrylamid được
sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học, bởi nó dễ thực hiện, thời gian
thực hiện nhanh và có hiệu quả kinh tế [19].
Sử dụng phương pháp nghiên cứu phổ izozym esteraza bằng điện di
trên gel polyacrylamid theo gradien nồng độ 8-16% đã thành cơng trong việc
phân loại các lồi và dòng khác nhau của bèo hoa dâu [23].
Trong lĩnh vực di truyền và chọn giống, phương pháp điện di izozym
được coi như là biện pháp cực kỳ hữu hiệu. Đây là phương pháp thành công
để nhận biết các con lai một cách dễ dàng. Đã có nhiều cơng trình trong và
ngoài nước sử dụng một số hệ izozym để phân tích đa hình di truyền, phân
loại và nhận biết con lai ở thực vật.. .Các nhà chọn giống và di truyền học đã
sử dụng phương pháp điện di trên gel tinh bột để nghiên cứu về cấu trúc di
truyền của lồi lúa Oryza sativa [' ]. Từ đó phát hiện ra 5 lơcut gen đa hình
mã hóa cho 8 enzym đã được nghiên cứu trong số 1688 giống lúa truyền
thống ở Châu Á. Phân tích izozym của các enzym trên đã dẫn tới sự nhận
dạng của 6 nhóm lúa [4].
Sử dụng hệ thống izozym người ta đã nghiên cứu di truyền và phân loại
các loại cây an quả như táo, lê, đào, dâu tằm, vải, cam, xoài, chuối, khoai sọ
V.V. [ 1 5 , 1 9 ] .

12


Để xác định đặc điểm di truyền và hoạt tính của hệ enzym esteraza là
các enzym có liên quan đến tính kháng thuốc, người ta đã tiến hành phân tích
các izozym này để góp phần phân loại và phịng trừ muỗi, sâu tơ .. .[9].
Theo nhận xét của tác giả Trịnh Đình Đạt, người đã nghiên cứu về các
hệ izozym trong nhiều năm thì có thể phân loại muỗi, tằm, mối, sâu tơ, cá rơ
phi, lươn .. .bằng phân tích hệ izozym esteraza ở các mô và trong máu [3].
Đã có nhiều tác giả nghiên cứu về tính đa hình của izozym peroxidaza
ở thực vật và cho thấy hình thái izozym peroxidaza có nhiều biến đổi trong
q trình sinh trưởng của sinh vật., ở các giống lúa chịu hạn tốt, hoạt tính
peroxidaza cao hơn rõ rệt so với các giống lúa không chịu hạn [6, 10].
Những nghiên cứu về izozym trong lĩnh vực y học cũng đạt được
những kết quả rất có triển vọng. Hiện nay đã xuất hiện hàng loạt các cơng
trình hóa sinh lâm sàng mà theo đó thì những biến đổi vể phương diện
izozym của huyết thanh bệnh nhân có thể có ỷ nghĩa trong chẩn đốn phân
biệt. Ngồi ra phương pháp nghiên cứu izozym cịn được dùng để xác định
thành phần nhân chủng của một số tộc người ở Việt nam. Điểu đó góp phần
vào việc nghiên cứu các đặc trưng huyết học phục vụ cho nghiên cứu các
thông số sinh học của người Việt Nam [8].
1.2.1. Izozym Superoxide dismutaza (SOD. E .c .l.15.1.1)
Superoxide dismutaza (SOD) là enzym có mặt ở hầu hết các cơ thể
sống hiếu khí và các bào quan có sự hình thành dạng oxi hoạt động. SOD lần
đầu tiên được tách bởi Mann và Kellis vào năm 1938 và lúc bấy giờ các tác
giả này cho rằng đó là một protein có chứa kim loại đồng (Cu2+). Sau đó
người ta gọi enzym này với một số tên như: erythrocuprein,
indophenoloxidaza hay tetrazolium oxidaza. Đến năm 1969 Me Cord và
Fridovich đã phát hiện ra chức nâng xúc tác đặc biệt của enzym này và đặt

tên là superoxide dismutaza (SOD) xúc tác cho phản ứng biến đổi superoxide
(0*‘2) thành peroxide hydro (H20 2) và oxi (0 2) theo các phản ứng sau:
SOD-Cu

+ 0*2 — ►

SOD-Cu1+ + 0 2

SOD-Cu1+ + 2H+— ►

SOD-Cu2+ + H20 2

Phương trình tổng quát là:
SOD
0*2 + 0*2 + 2H+ ----- *

0 2 + H20 2

Như vậy SOD có vai trị là trung tâm trong việc triệt tiêu gốc
superoxide được tạo ra bởi q trình oxi hố.
Về mặt di truyền thì tất cả các enzym SOD đều được mã hoá trong
nhân và chuyển đến cơ quan đích nhờ trình tự tín hiệu dân đường .

13


v ề mặt phân loại các enzym SOD đều cẩn có các ion kim loại cho hoạt
động xúc tác của chúng và dựa trên thành phần cofactor kim loại mà người ta
chia SOD thành các dạng khác nhau bao gồm:
- Các SOD chứa Mangan (MnSOD)

MnSOD là một nhóm enzym được tách ra từ ty thể hệ thống oxi hoá
photphoryl hoá của tế bào nhân chuẩn (eukaryote) hay từ các tê bào nhân sơ
(procaryote) và ở tế bào chất của Staphylococcus xỵlosus.
MnSOD ơ các sinh vật nhân sơ hầu hết có dang dimer với mỗi
monomer có chứa 1 ion Mn2+. Các hợp chất hữu cơ đóng vai trị làm khung
bao lấy ion Mn2+ ở giữa .
- Các SOD chứa sắt (FeSOD)
Martin và cộng sự cho thấy rằng FeSOD ở tế bào vi khuẩn s. mutans
OMZ176 là một holoenzym có khối lượng vàokhoảng 43000 Da và mỗi
phẩn dưới đơn vị có khối lượng 20700 Da. Và cũng theo các tác giả này thì
trật tự axit amin của enzym này có đặc điểm giống với trật tự axit amin của
MnSOD cùng tìm thấy trong vi khuẩn đó.
- Các SOD chứa đồng và kẽm (Cu/ZnSOD)
Cu/ZnSOD lần đầu tiên được phát hiện ở Photobacter và sau đó được
phát hiện ra ở hầu hết các vi khuẩn nhân sơ như Brucella abortus, Legionella
sp, E. coli, Neisseria meningitidis và một số đại diện của chi Haemophilus,
Actinobaccilus và Pasteureỉìa, Salmonella. Gen mã hố và cấu trúc của
enzym này đã được xác định.
Cu/ZnSOD là một enzym có cấu trúc đặc biệt điển hình, dạng dimer có
khối lượng phân tử khoảng 32 kDa [19].
1.2.2. Izozym Esteraza (EST. E.c.3.1.1.2)
Esteraza (EST) là một nhóm các izozym khơng cùng nguồn gốc, ít
biểu hiện chuyên hóa chất, song tất cả esteraza có một đặc tính chung nhất là
phá hủy liên kết este của axit cacbonic trong các chất phát sinh từ naphthol,
indoxil và methylum billphrin. Izozym esteraza thuộc lớp hydrolaza xúc tác
cho phản ứng phân giải và tổ hợp các este theo sơ đổ sau:
ROORj + HOH

*

*

RCOOH + R,OH.

Năm 1957- 1961 ủy ban về enzym của Hội Hóa sinh quốc tế đã soạn
thảo sự phân loại thống nhất và danh pháp của các enzym. Qua đó các enzym
được phân ra làm 6 nhóm , mỗi nhóm chia thành các phân nhóm , dưới phân
nhóm và tiểu phân nhóm. Esteraza được xếp vào nhóm 3, phân nhóm thứ 1 và
tiểu phàn nhóm thứ 1.
Ở thực vật đã được chứng minh là có 3 nhóm esteraza: Arylesteraza
(A), Aliesteraza (B) và Cholinesteraza (C). Các A.esteraza thủy phân este
thơm nhanh hơn mạch thẳng, trong khi đó B.esteraza thủy phân những este

14


mạch thẳng nhanh hơn nhóm A.esteraza . c.esteraza có tác dụng mạnh nhất
đối với cholineste và cũng có thể thủy phân este mạch thẳng và este thơm
nhưng không dẽ dàng bằng 2 nhóm kia [19].
ị.2.3. Izozym Peroxidaza (PO. E .c .l. 1.1.17)
Izozym peroxidaza thuộc lớp enzym oxi hóa khử , chúng có khả năng
oxi hóa các hợp chất thơm khi có mặt H20 2. Peroxidaza có thể giết chết các
vi sinh vật và phá hủy các chất hóa học khi có mặt H20 2, phenol, alcohol.
Đây là loại izozym độc cho các tế bào động vật và thực vật. Các izozym
peroxidaza khác nhau được tìm thấy trong các mơ khác nhau. Các peroxidaza
thực vật có tính đặc hiệu cơ chất rộng rãi. Trong nghiên cứu peroxidaza cây
cải ngựa (HRP) ( Maehly, 1960) cho thấy cơ chế tác dụng peroxidaza gồm
có 3 giai đoạn:
HRP + H2O z

Complex I

Complex I + AH

Complex II + A
HRP + A + 2H ,0

Complex II + AH
Phương trình tổng quát là:
H20 2

Izozym peroxidaza được chia làm hai nhóm chính: nhóm axit và nhóm
kiềm. Bằng phương pháp điện di và sắc ký trên đối tượng lúa mạch người ta
thấy phần lớn các dạng peroxidaza nằm trong nhóm kiềm, cịn các dạng
thuộc nhóm axit chiếm một tỷ lệ rất thấp [19].

15


CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. VẬT LIỆU THỰC VẬT
Hai loài cây thuốc diộp hạ châu đắng (Phylỉanthus amarus Schum. et.
Thơnn.) và diệp hạ châu 0Phyllanthus urinaria L.) điển hình là đối tượng sử
dụng trong nghiên cứu của chúng tơi.

n

Phyỉlanthus amaru
Phyỉlanthus urinaria L.

Hình 4. Các địa điểm thu mẫu trên bản đổ

16


Bảng 1. Danh sách và địa điểm thu thập các mẫu quần thể hai loài
Phyllanthus amarus và p. urinaria

STT
1
2
3
4
5
6
7

Ký hiệu
mẫu
A hk
U-rx
UTO
a nt

A bđ
U rb
a nb

8
9

10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20

_ U nb
A đa
UữA
A cl
UcL

^HB
U hb

Apj
UpT

UpL
A th
^ĐD
^NH

21

22
23
24
25

U\1Đ
^HD
U hd
U rK

Loài
Phyllanthus
amarus
P. urinaria
P. urinaria
Phyllanthus
amarus
Phyllanthus
amarus
P. urinaria
Phyllanthus
amarus
P. urinaria
Phyỉlanthus
amarus
p. urinơria
Phyllanthus
amarus
P. urinaria
Phyllanthus

amarus
P. urinaria
Phylỉanthus
amarus
P. urinaria
P. urinaria
Phyỉlanthus
amarus
Phyllanthus
amarus
Phyỉlanthus
amarus
Phyỉlanthus
amarus
P. urinaria
Phyllanthus
amarus
P. urinaria
P. urinaria

Địa điểm thu mẫu
Tỉnh/Thành
Xã, huyện
phố

Thời gian
thu mẫu'
Đợt 1

Hoàn Kiếm

Thanh Xuân
Trâu Ọuỳ, Gia Lâm
Ngọc Trục, Từ
Liêm

Đơt 1
Đơt 1
Đợt 1
Đợt 4

Ba Đình
Đơt 1
Đợt 3
Nơi Bài, Sóc Sơn
Đơt 3
Đợt 3
Thị trấn Đông Anh
Hà Nội

Đơt 3
Đợt 3

Cổ Loa, Đông Anh
Đơt 3
Đợt 3
Hải Bối, Đông Anh
Đơt 3
Đợt 3
Phú Thị, Gia Lâm
Đơt 1

Đơt 3
Đợt 4

Phủ Lỗ, Sóc Son
Tây Hồ

Đợt 4

Đống Đa
Ngũ Hiêp, Thanh
Trì

Đợt 4
Đợt 2

Mao Điền, cẩm

Thành phố Hải
Dương
Tứ Kỳ

Hải Dương

Đơt 2
Đợt 2
Đợt 2
Đợt 2

1 Đợt 1: ngày 7-8/12/2004; Đợt 2: ngày 2-3/3/2005; Đợt 3: ngày 7-8/3/2005; Đợt 4: ngày
24-29/3/2005.

17


STT
26

Ký hiệu
mẫu

30
31

Uyr

Phyllanthus
amarus
P. urinaria
Phyllanthus
amarus
Phyllanthus
amarus
P. urinaria

UvL

P. urinaria

32
33

34
35

UphL
Ujijf
U ls

36

UTĐ

P. urinaria
P. urinaria
P. urinaria
Phyllanthus
amarus
P. urinaria

27
28
29

A vy
Uvv
A ln
A sđ

A yđ

Đia điểm thu mẫu

Tỉnh/Thành
Xã, huyện
phố

Loài

Thời gian
thu mẩu'
Đợt 2

Viêt Yên
Lục Ngạn

Bắc Giang

Đợt 2

Sơn Đông
Thuân Thành
Nghĩa Trai, Văn
Lâm
Phú Lãm, Hà Đơng
Thường Tín
Lương Sơn

Đơt 2
Đợt 2

Bắc Ninh
Hưng n

Hà Tây
Hồ Bình

n Định

Thanh Hóa

Tam Đảo

Vĩnh Phúc

Đợt 3
Đợt 4
Đợt 1
Đợt 4
Đợt 4
Đợt 4
Đợt 4

Để thu thập nguyên liệu, chúng tôi tiến hành bốn đợt điều tra xác định
vị trí phân bố tự nhiên của các quần thể hai loài p. amarus và p. urinaria à
một SỐ địa phương thuộc miền Bắc. Cụ thể, đợt 1 được tiến hành trong các
ngày 7-8/12/2004, tại Hà Nội, Hà Tây, đợt 2 trong các ngày 2-3/3/2005, tại
Bắc Giang, Hải Dương, đợt 3 trong các ngày 7-8/3/2005 tại ngoại thành Hà
Nội và đợt 4 từ ngày 24/3 đến ngày 29/3/2005 tại Hà Nội, Hưng n, Hà tây,
Hồ Bình và Vĩnh Phúc. Từ các mẫu thu được, dựa vào khốphân loại hình
thái, chúng tơi chọn ra 36 mẫu có các đặc điểm hình thái tương đối điển hình
của hai lồi cây thuốc được quan tâm nghiên cứu, trong đó 17 mâu thuộc loài
Phyllanthus amarus (được ký hiệu là A) và 19 mẫu thuộc loài Phyllanthus
urinaria (được ký hiệu là U).Danh sách, địa điểm và thời gian thu thập các

mẫu được nêu chi tiết trên Hình 4 và Bảng 1.
2.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐA HÌNH IZOZYM

Phương pháp phân tích đa hình izozym được thực hiện theo qui trình
của Tanksley s. D. và Orton T. J. (1983)[19] kết hợp với Zimmerman w . J.
(1989)[ 23] có cải tiến, với các bước thực hiện chính như sau:
2.2.1. Phương pháp thu mẫu
Để việc thu mẫu tương đối đổng nhất, tại mỗi địa điểm chúng tồi đều
chọn những cây có kích thước vừa phải, sinh trưởng và phát triển tốt. Sau đó
chung tơi đào cây lấy cả phần đất, cho vào túi ni lơng có sẵn giấy báo thấm
nước buộc êtiket vào cây, bảo quản và đưa vào về phịng thí nghiệm sao cho
cây vẫn tươi.

18


2.2.2. Phương pháp nghiền mẫu
Chúng tôi chọn và cắt những cành lá non, rửa sạch bằng nước cất, thấm
khô, cân 500 mg mẫu và chuyển vào cối sứ,bổ sung 500|il đệm và nghiền
cho đến khi thu được dung dịch huyền phù đồng nhất (quá trình nghiền được
giữ trong đá lạnh). Thu lấy dịch đổng nhất và chuyển vào ống eppendorf Ly
tâm lạnh (4°C) ở 14000 vòng/phút trong vòng 15 phút. Thu phần dịch phía
trên để tiến hành phân tích điện di các hệ izozym.
2.2.3. Phương pháp điện di
Bản chất hoá học của enzym là protein, do các alen khác nhau qui
định, nên cấu trúc bậc một của các protein enzym là khác nhau, vì thế hình
thành nên các enzym khác nhau về trọng lượng và kích thước phân tử.
Enzym là chất đa điện ly, vì vậy ở trạng thái dung dịch nó phân cực vẻ
điện tích. Trong điện trường của dòng điện một chiều, các phân tử trong hỗn
hợp protein sẽ chuyển động về phía catot (-) hoặc anot (+) theo tốc độ khác

nhau. Do vậy trên bản gel, các phân tử protein có kích thước khác nhau sẽ
nằm ở vị trí khác nhau sau khi chạy điện di.
Sự khác nhau giữa các băng điện di của các izozym được dùng để so
sánh, đánh giá sự khác nhau về bản chất di truyền của các lồi. Sự khác nhau
càng ít thì quan hệ họ giữa chúng càng gần và ngược lại.
Sử dụng gel polyacrylamid 2 lớp cho việc nghiên cứu: gel cơ có nồng
độ 4% polyacrylamid và gel tách có nồng độ 12% polyacrylamid .
Chúng tôi tiến hành điện di trên máy điện di Mini - ProteanR3(Biorad,
Mỹ). Kích thước bản gel 10 X 10 cm, cường độ dòng điện 120vol, hiệu điện
thế 40mA, nhiệt độ 5nc , thời gian 2h->3h cho đến khi vạch mầu chuẩn cách
đáy bản gel khoảng lcm. Sau khi điện di xong, gel được lấy ra khỏi khuôn và
tiến hành nhuộm.
Sau khi điện di đại đa số protein là khơng có mầu (trừ Hemoglobin), vì
vây ta phải tiến hành nhuộm để biết vị trí của protein sau khi chạy điện di,
đoi với mỗi loại prơtein có cơ chất chất xúc tác và thuốc nhuộm khác nhau.
Phương pháp phân tích hệ izozym SOD bằng phản ứng nhuộm màu với NBT
và Riboflavin. Phân tích hệ izozym esteraza bằng phản ứng nhuộm màu với
hỗn hợp 2 cơ chất oc-Naphthyl acetat, p-Naphthyl acetat với thuốc nhuộm
Fast Garnet và Fast blue RR salt. Phân tích hệ izozym PO bằng phản ứng
nhuộm màu của. bcnzidin trong A.accticl0% va được xac định tren đọ nhạy
earn với H 2o j[ 19,23].
2.2.4. Phương pháp phân tích kết quả nghiên cứu
Phương pháp tính Rf: Tính đa hình hệ izozym của các mẫu quần thể thuộc
hai loai p amarus và p. urinaria biểu hiện thông qua sự khác biệt về thành
phần và tốc độ di chuyển tương đối (Rf) của các băng điện di trên bản gel
phan tích. Để phân biẹt các băng đa hình, độ di chuyển tương đối Rf được

19

xác định bằng tỷ lộ khoảng cách từ đầu gel tách đến vị trí báng điện di so với
chiều dài gel tách [16].
R f =-

1

x: Khoảng cách từ đầu gel tách đến vị trí băng điện di
1: Khoảng cách từ đầu gel tách đến vạch kết thúc điện di.
Phương pháp tính khoảng cách di truyền dựa trên dấu chuẩn izozym:
Các băng đa hình được ghi nhận dựa trên sự có mặt hoặc vắng mặt của
chúng. Các số liệu được thu thập và xử lý bằng chương trình NTSYSpc 2.02h
(Rohlf F.J, 1993) để xác định hệ số tương đồng di truyền và xây dựng sơ đồ
hình cây quan hộ di truyền giữa các mẫu quần thể thu được.

20


CH Ư Ơ N G III. K ẾT QUẢ VÀ TH ẢO LUẬN

3.1. Phổ điện di hệ izozym SOD của các mẫu quần thể hai loài
Phyllanthus amarus và Phyllanthus urinaria thu thập ở một số địa điểm
tại miền Bắc Việt Nam.
Kết quả phân tích các băng điện di hệ izozym SOD của các mẫu quần thể
p. amarus và p. urinaria được thu thập ở các địa điểm khác nhau trong cả 4
đợt thu mẫu cho thấy có sự khác biệt rõ rệt về kiểu hình hệ izozym SOD giữa
hai lồi cây thuốc này. Mặc dù câc mẫu của hai loài được thu thập từ các địa
phương cách biệt về mặt địa lý và vào các thời điểm khác nhau (từ tháng
12/2004 đến tháng 3/2005), nhưng nhìn chung phổ điện di của các quần thể
trong phạm vi lồi'có tính đổng hình cao, đặc biột là đối với các quần thể của
loài p. amarus. Trong nghiên cứu này tất cả các mẫu quấn thể của loài p.

amarus (ký hiệu là A) đều cho phổ điện di phổ izozym SOD rõ nét, trong khi
các mẫu quần thể của loài p. urinaria (ký hiệu là U) chỉ cho các băng mờ
hoặc không phát hiện thấy băng điện di.

Rf
0,22

0,40
0,43
0,52
0,60

0,63
0,67
0,71
0,75

Hình 5: Phổ điện di hệ izozym SOD cùa các mẫu quần thể hai loài Phyllanthus amarus (ký hiệu
là A) và Phylỉanthus urinaria (ký hiệu là U) thu thập ờ một số địa điểm tại miền Băc Việt Nam

Khi phân tích 17 mẫu của lồi p. amarus ( Hình 5,6,7,8) chúng tơi thu
đươc tổng cộng 9 băng đa hình khác nhau tương ứng với các giá trị Rf là
0 22; 0,40; 0,43; 0,52; 0,60; 0,63; 0,67; 0,71; và 0,75. Trong số đó, đáng chu
y hơn cả là có ba băng đồng hình rõ nét xuất hiện ở tất cả 17 mẫu quần thể
cua loài p. amarus (Rf= 0?63; Rf= 0,71 và Rf= 0,75). Trong khi đó, việc

21


phân tích 19 mẫu quẩn thể của lồi p. urinaria chỉ thấy xuất hiện băng điên

di ở 4/19 mẫu (chiếm « 20%) đó là các mẫu UVY (Hình 6), lim (Hình 7),
U ThT> và ƯL5 (Hình 8) vói tổng sổ 5 băng đa hình (Rf = 0,45; Rf = 0,48- Rf =
0,63; Rf = 0;71 và Rf = 0,75). Đối với 15/19 mẫu p. urinaria cịn lại khơng
quan sát thấy băng điện di. Một điểm dáng chú ý nữa là trong số 4 mẫu kể
trên ( đặc biệt rõ đối với hai mẫu UVYvà UNB), băng điện di chỉ xuất hiên ở
cac VỊ tn Rf là 0,63; 0,71 và 0,75, như vậy giống với các băng đổng hình rõ
nét của các quần thể lồi p. amarus. Nhưng có một sự khác biệt la đối với
các mẫu P. urinaria này, các băng điện di chỉ biểu hiện mờ với cường độ ánh
sang băng 1/2 so với các mâu p. amarus. Ngoài ra, khi quan sát rhực tế
chúng tôi thấy hại mẫu UVY và UNBđược thu thập từ các khu vực có sự phân
bố của cả hai loài p . amarus và p. urinaria trong phạm vi hẹp. Điều đó dần
chụng tơi đến một giả thiết rằng: có thể các mẫu Uvy và UNB là “con lai” giữa
hại loài p. amạrus và p . urinaria, mặc dù về hình thái chúng mang đặc điểm
giống với lồi p. urianaria (vì vậy được xếp vào nhóm U). đây la một hiện
tượng đáng quan tâm, chưa từng được ghi nhận trong các nghiên cứu phân
loại các lồi Phyllanthus. Mặc dù trước đây đã có một số báo cáo cho thây có
sự tồn tại của các dạng trung gian về hình thái giữa các lồi thuộc chi
Phyllanthus (Taylor, 2003) [20].

Rf

0,40
0,43
0.52
0,63
0,67
0,71
0,75

Hình 6: Phổ điện di hệ izozym SOD của các mẫu quần thể hai loài phylỉanthus amarus (ký hiệu

là A) và Phyllanthus urinaria (ký hiệu là U) thu thập ở một sô địa điểm tại miền Bắc Việt Nam

22


Rf

^illì ^Cl

^I)A

^\B

^NB

^ rr

UphL ƯĐA

UCL ƯI1B

0,60
0,63
0 71
075

Hình 7: Phổ điện di hệ izozym SOD của các mảu quẩn thể hai loài Phyllanthus amarus (ký hiệu
là A) và Phyỉỉanthus urinaria (ký hiệu là U) thu thập ở một số địa điểm tại miền Bắc Việt Nam

0,63

0,67
0 71
075

Hình 8 ' Phổ điện di hệ izozym SOD của các mâu quần thể hai loài Phyllanthus amarus (ký hiệu
là A) và Phyllanthus urinaria (ký hiệu là U) thu thập ở một số địa điểm tại miền Bắc Việt Nam

23


Rf

^liK

^V t

^CL

^ĐA

^NB

^TH

A BĐ

A NH

0,22
•

0,40

0,60
0,63
0,71
0,75

Hình 9: Phổ điện di hê izozym SOD cùa các mẫu quần thể loài Phyllanthus amarus (ký hiệu là
A) thu thập ở một số địa điểm tại miền Bắc Việt Nam

Rf

ưpL

Ư TQ

U NB

UM

U nA

U HB

ư c,

u rr

ư-nc

M

0,63
0,71
0,75

Hình lơ: Phổ điện di hẹ izozym SOD của các mẫu quần thể loài Phyllanthus urinaria (ký hiệu
là U) thu thập ở một sô' địa điểm tại miền Bắc Việt Nam

24