Phân lập tuyển chọn các chủng bacillus có khả năng sinh tổng hợp biofilm và nghiên cứu ứng dụng biofilm trong việc ức chế sự phát triển một số vi sinh vật gây hại

ĐẠI HỌC QUOC GIA HẢ NỘI
T R Ư Ờ N G Đ Ạ I H Ọ C K H O A H Ọ C T ự N H IÊ N
--------- 0 3 # s o ----------

P h â n
á n h

lậ p , tu y ể n

tổ n g

h ợ p

c h ọ n

b io film

tro n g v iệ c ứ c c h ế s ự

c á c c h ủ n g B a c illu s c ó k h ả n ă n g
v à n g h ỉê n

p h á t tr iể n

cứ u

ứ n g d ụ n g

m ộ t s ố v ì sin h

b io film

v ậ t g â y

M ã số: Q G 1 1 -1 6

C h ủ tr ì đ ề tà i: P G S .T S . N g u y ễ n Q u a n g H u y

H À NỘI - 2013

h ạ ỉ


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
T R Ư Ờ N G Đ Ạ I H Ọ C K H O A H Ọ C T Ụ 'N H IÊ N
Vr* * ilr■*Vc* * *

P h â n
tố n g

lậ p , tu y ế n
h ọ p

v iệ c

ứ c

ch ọ n

b io film
ch ế

sự

v à

cá c

c h ủ n g B a c illu s c ó

n g h iê n

p h á t tr iể n

cứ u

ứ n g

d ụ n g

m ộ t số v i sin h

k h ả

n ă n g

b io film

sin h

tr o n g

v ậ t g â y h ạ i

M ã số: Q G 1 1 -1 6

Chủ trì đề tài: PG S.T S. N g u y ễ n Q u a n g H u y
Cán bộ tham gia: PGS.TS. Bùi Thị Việt Hà, TS. Phạm Bảo Yên,
ThS. Trần Thị Hằng, ThS. N gơ Thị Kim Tốn,
ThS. Nguyễn Thị Giang, CN. Đoàn Diệu Linh,
CN. Trịnh Thị Hiền, CN. Nguyễn Thị Phương Liên

H à N ộ i-2 0 1 3


L Ờ I C Ả M ƠN

Đ ê t à i th ự c h iệ n c ỏ s ự t à i t r ợ k in h p h i c ủ a Đ ạ i h ọ c Q u ỏ c G i a H à N ộ i , n h â n d ị p
n à y , t ậ p t h ê c á n b ộ th ự c h iệ n đ ê t à i x in b à y tỏ l ò n g b i ê t ơ n s â u s ă c t ớ i s ự q u a n tà m ủ n g
h ò v à g i ú p đ ỡ c ù a Đ ạ i h ọ c Q u ố c g i a H à N ộ i.
T ậ p th e t á c g i ả x in g ì n l ờ i c á m ơ n s â u s ă c t ớ i lã n h đ ạ o T r ư ờ n g Đ ạ i h ọ c K h o a
h ọ c T ự n h iê n , c á c p h ò n g b a n c h ứ c n ă n g c ù a n h à t r ư ờ n g đ ặ c b i ệ t là p h ò n g K h o a h ọ c v à
C ô n g n g h ệ , p h ỏ n g K ê h o ạ c h t à i vụ . Đ ê t à i th ự c h iệ n c ó s ự t ạ o đ i ê u k iệ n v ề t r a n g th i ế t
b ị, c ơ s ở v ậ t c h á t c ù a B a n C h ù n h iệ m K h o a S in h h ọ c , B a n G i á m đ ỏ c P h ò n g th í n g h iệ m
t r ọ n g đ i ê m C ò n g n g h ệ E n z y m v à P r o t e i n , t ậ p th ê t á c g i ả x in g ử i l ờ i c ả m ơ n tr ù n tr ọ n g .
C u ô i c ù n g , t ậ p t h ê t á c g i ả x in g ử i l ờ i c á m ơ n đ è n c á c c á n b ộ , s in h v iê n , h ọ c v iê n
c a o h ọ c đ ã v à đ a n g là m v i ệ c P h ò n g e n z y m h ọ c v à p h â n tíc h h o ạ t tín h s in h h ọ c , p h ị n g
t h í n g h iệ m t r ọ n g đ i ê m C ò n g n g h ệ E n zy m v à P r o t e i n , B ộ m ô n S in h l ý th ự c v ậ t v à H ó a
s in h , K h o a S in h h ọ c đ ã h ợ p t á c v ê c h u y ê n m ô n t r o n g q u á tr ìn h t h ự c h iệ n đ ề t à i n à y .

H à N ộ i, n g à v 1 8 t h á n g 4 n ă m 2 0 1 3

T h a y m ặ t n h ỏ m n g h iê n c ứ u

---------------- ----------------- --------- ;----- Ị-----------------------i

B á o c á o tô n g k ê t đ ê tà i Q G 1 1 - 1 6


D A N H SÁ C H N H Ữ N G N G Ư Ờ I T H Ụ C H IỆ N ĐÈ TÀ I

1. PGS.TS. Nguyễn Quang Huy, Trường Dại học Khoa học Tự nhiên, ĐHỌGHN
2.

PGS.TS. Bùi Thị Việt Hà, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN

3. TS. Phạm Bao Yên,Trường Đại học Khoa học Tự nhiên. ĐHỌGHN
4. TS. Phạm Bao Yên. Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN
5. ThS. Ngơ Thị Kim Tốn, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN
6. T hs. Nguyền Thị Giang, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN
7. CN. Đoàn Diệu Linh,Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG H N
8. CN. Trịnh Thị Hiền, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQ G H N
9.

CN. Nguyền Thị Phương Liên, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN

--------------------------------------- ,-------------------J----------- ^----------------------------------------------------

ii

B á o c á o tò n g k ê t đ ê tà i Q G 11 -1 6

TÓM TẮT
ĐÈ TÀI NGHIÊN c ứ u KHOA HỌC
l ê n đ ề tài: P h ân lập, tu y ê n c h ọ n c á c c h u n g B a c i l l u s c ó k h a n ă n g s in h tô n g h ợ p b i o f i l m

và nghiên cứu ứng dụng biofilm trong việc ức chế sụ phát triển một số vi sinh vật gây
hại M ã số: ỌCi 11- 16.

( 0 q u an chủ quán: Đại học Ọuốc gia Hà Nội
( o q u a n chú trì: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên. ĐHỌGHN
Chú trì đề tài: PGS.TS. Nguyễn Quang Huy
Các cán bộ th a m gia: PGS.TS. Bùi Thị Việt Hà, TS. Phạm Bảo Yên, ThS. Ngơ Thị
Kin Tốn, ThS, Trần Thúy Hằng, ThS. Nguyễn Thị Giang, CN. Nguyễn Thị Phương
Liên, CN. Trịnh Thị Hiền. CN. Đoàn Diệu Linh
Thoi gian thực hiện: từ 8/2011- 5/2013.
K i r h p h í : 1 7 0 . 0 0 0 . 0 0 0 ( M ộ t tr ă m b ả y m ư ơ i t r i ệ u đ ò n g )

1. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu:
M ụ : tiê u : P h â n lập, t u y ê n c h ọ n c á c c h ủ n g B a c i l l u s c ó h o ạ t tín h tạ o b i o f i l m , n g h i ê n cứ u

ứnị. dụng biofilm đê ức chế sự phát triển một số vi sinh vật gây hại.

NộidurìịỊ'. Phân lập tuyển chọn các chùng vi sinh vật từ các điều kiện môi trường, sinh
thái khác nhau có hoạt tính tạo biĩlm
NgHên cứu các đặc điểm về sinh lý, sinh hóa khả năng phát triển tạo biofilm cùa một
sơ (hung Bacillus có hoạt tính tạo biofilm mạnh đồng thời có hoạt tính ức chế sự phát
triểa một số vi sinh vật gây bệnh.
Bưrc đầu xây dựng quy trình lên men quy mơ phịng thí nghiệm với 1 chủng Bacillus
và rghiên cứu thừ nghiệm sản phâm.

2. Các k ế t q u ả đ ạ t đ ư ợ c :
K ế t quá khoa học.

- Đà phân lập trên 90 chung vi sinh vật từ các nguồn đất, nước nông nghiệp cũng như
n ư c c thai c ó h o ạ t tính tạ o b i o í ì l m

- Đi tuyên chọn, phân loại được 05 chung Bacillus có hoạt tính tạo biofilm đồng thời
có tie dụng ức chế sự sinh trương một số nhóm sinh vật gây hại.

--------------------------------------- .--------Ị----------------------------------

iii

Báo cáo tông kêt đê tài QG 11-16


- Eã x â y d ự n g q u y trình tạ o b i o f i l m từ 01 c h u n g B a c i l l u s ứ n g d ụ n g c h o v i ệ c p h ị n g

chcng một số nhóm vi sinh vật gây bệnh.
K e, q u ả ú n g d ụ n g :
-

X ây d ự n g 01 q u y trình lên m e n 1 c h u n g B a c i l l u s

có h oạ t tính tạ o b io f i lm v à b ư ớ c

đầt thư nghiệm có hoạt tính ức chế sự phát triển của vi khuân gây bệnh ơ thực vậl.
K ếi q u a c ô n g b ỏ :

- Đì cơng bơ 06 cơng trình gơm 01 bài báo toàn văn tiếng Anh tại hội nghị khoa học

qucc tế (thành phố Hồ Chí Minh), 02 bài báo tiếng Anh trên tạp chí Khoa học
(Đ1IQGHN), 02 bài háo tiếng Việt trên tạp chí Sinh học và tạp chí Khoa học (Viện
Khja học và Công nghệ Việt Nam) và 01 báo cáo tại Hội nghị quốc tế (phối hợp với
trương Đại học Sogan, Hàn Quốc)
1. N g u y e n

Q uang

H uy,

N guyen

Thi

Phuong

L ie n ,

Tran

Thuy

Hang,

2011.

Characterization o f biofilm-forming bacteria isolated from soil in Vietnam. Journal of
Sciince VNU 27 (2S): 187-193.
2.

'ran T h u y H a n g , N g u y e n Q u a n g H u y , 2 0 1 1 . I s o la te b i o f i l m f o r m i n g B a c i l l u s strains

from contamination site in trade villages in Vietnam. Journal o f Science VNU 27 (2S):
157-162.
3. Nguyễn Ọuang Huy, Tran Thúy Hang, 2012. Phân lập các chủng

B a c illu s

có hoạt

tint tạo màng sinh vật (bioíĩlm) và tác dụng kháng khuân của chúng. Tạp chí Sinh học
34(1): 99-106.
4. Tỉguyen Ọuang Huy, Trinh Thi Hien, Ngo Thi Kim Toan, Pham Bao Yen, 2012.
Biớìlm

forming

bacteria

isolated

from

wastewater

in

Vietnam.

International

synposium on Green technology and Sustainable development. Ho Chi Minh city 2930/ 1/2012, pp : 13-19.

5. ĩíguyen Ọuang Huy, Nguyen Thi Phuong Lien, Tran Thuy Hang, Isolation and
Characterization o f Biofilm- forming bacterial strains from contamination sites in
Vienam. 1st HUS- SOGANG Internationa] symposium on Advance research and
T r a m n g , H a n o i 15 F e b , 2 0 1 2 .

6. T'guyen Quang Huy, Đoàn Diệu Linh, Nguyễn Thị Giang, Ngơ Thị Kim Tốn,
2012. Đặc điêm sinh học của hai chung vi khuân tạo biofilm phân lập từ nước thai ri
rác Tạp chí Khoa học và Công nghệ 50(3D): 127-134.
----------------- 9
iv

^---------- —
-----------

B á o c á o tô n g k ê t đ ẻ tà i Q G 1 1 - 1 6


Kết qua đào lạo :
Pào lạo được 03 thạc sĩ chuyên ngành sinh học thực nghiệm: Trần Thị Hằng, tốt
ng hệp năm 201 1; Nguyền Thị Giang, tốt nghiệp năm 2012; Ngơ Thị Kim Tốn, tốt
ngh ệp năm 2012.
~ Pào tạo được 03 cư nhân nềnh sinh học: Dồn Diệu Linh; Trịnh Thị Hiền và
Ngtyền Thị Phương Liên, tốt nghiệp năm 2011 và 03 cư nhân ngành sinh học và cơng
nghr sinh học sẽ tốt nghiệp 6/2013.

Thanh quyết tốn để tài: Đã hoàn thành.
C h ủ n h i ệ m K h o a Sinh học

C h ủ tr ì đề tài

L

Il u

ỉ

P G S . TS. N g u y ễ n Ọ u a n g H u y

T R Ư Ờ N G ĐẠ• I H Ọ• C K H O A H Ọ• C T Ụ• N H I Ê N

V

B á o c á o t ò n g k ê t đ ề t à i OCì 1 1 - 1 6


SUMMARY

P roject: Isolation o f biofilm formation active

B a c illu s

strains and effects of biofilm for

pathogenic bacteria
C o d e : QG 1 1-16
M anaging Institution: N a t i o n a l U n i v e r s i t y Hanoi
Implementing Institution: VNU, Hanoi University o f Science

K ey im p lem en te r: N gu y en Q uang Huy, PhD

P articip an ts: B u i T h i V i e t H a , P h D ; P h a m B a o Y e n , P h D ; Tran T h i H a n g , M S c ; N g o
Thi Kim Toan, MSc; Nguyen Thi Giang, MSc; Doan Dieu Linh, BSc; Trinh Thi Hien,
BSc and Nguyen Thi Phuong Lien, BSc.
D uration : from 8-2011 to 5-2013
B udg et : 170,000,000 V N D
O b je c ti v e s a n d m a i n actives:

Objectives: Isolation and characterization o f biofilm- forming Bacillus strains from
contamination sites in Vietnam and applied.
M ain activities:

Isolate bacteria strains which have biofilm forming activated from sites in Vietnam
Study on physiological and biochemistry characteristics o f Bacillus strains selected
and characterization of biofilm forming and antibacterial activities o f them.
Establish a standard operating procedure for fermentation one Bacillus strain and
research on applying.
Results

Scientific results:
Isolated more than 90 strains from soils, waters and wastewater have biofilm
forming activity

V/

B á o c á o tỏ n g k ê t đ è tà i Q G 1 1 -1 6


Selected and characterized 05

B a c illu s

strains which have b i o f i l m forming activity

and antibacterial
I stablished a standard operating procedure for fermentation one Bacillus strain

PuHications:
1.

Nụuyen

Quang Huy,

Nguyen Thi

Phuong

Lien, Tran Thuv Hang, 2011.

Characterization of biofilm-forming bacteria isolated from soil in Vietnam. Journal
o f Science VNU 27 (2S): 187-193.
2.

Tran T h u y H a n g , N g u y e n Q u a n g H u y , 2 0 1 1 .

I s o la te b i o f i l m

f o r m in g B a c i l l u s

strains from contamination site in trade villages in Vietnam. Journal o f Science
VNU 27 (2S): 157-162.
3.

N g u y ễ n Q u a n g H u y , Tran T h ú y H a n g , 2 0 1 2 . Ph ân lập c á c c h u n g B a c i l l u s c ó h oạ t
tính tạ o m à n tỉ s in h vậ t ( b i o f i l m ) v à tác d ụ n g k h á n g k h u â n c ủ a c h ú n g . T ạ p c h í S in h

học 3 4 (1): 99-106.
4.

N g u y e n Q u a n g H u y , T rinh T hi H ie n , N g o T hi K im T o a n , P h a m B a o Y e n , 2 0 1 2 .
B io film

fo r m in g

b a cte ria

i s o la t e d

fr o m

w astew ater

in

V ietn am .

In ternation al

symposium on Green technology and Sustainable development. Ho Chi Minh City
29-30/11/2012, pp: 13-19.
5.

Nguyen Quang Huy, Nguyen Thi Phuong Lien, Tran Thuy Hang, Isolation and
Characterization o f Biofilm- forming bacterial strains from contamination sites in
Vietnam. 1st HUS- SOGANG International symposium on Advance research and
Training, Hanoi 15 Feb, 2012.

6.

Nguyền Ọuang Huy, Đồn Diệu Linh, Nguyền Thị Giang, Ngơ Thị Kim Toán,
2012. Đặc điêm sinh học cùa hai chủng vi khuân tạo biofilm phân lập từ nước thải
ri rác. T ạ p c h í K h o a h ọ c và C ô n g n g h ệ 5 0 ( 3 D ) : 1 2 7 - 1 3 4 .

Resỉarch training:
Contribution in training bachelor’s degree: 3
Contribution in training m aster’s degree: 3
Bucgct: Payment in full

17/

----------------- ,---------------------- ———----------B á o c á o t ỏ n g k ê t đ ê tà i Q G 1 1 - 1 6


B Ả N G KÍ H I Ệ U V I É T T Ấ T

APS

Amoniuni persulfate

Per sunphat anion

bp

Base pair

Cặp base

cv

crystal violet

Tím kết tinh

CSLM

scan lazer microscope

Kính hiên vi tiêu điẻm quét

EPS

Extracellular Polymeric Substances

Hợp chất ngoại bào

kl)a

Kilo Dalton

Kilo Daltơn

LB

Luria Bertani

Môi trường LB

LPS

Lipopolysaccharide

lipoppolysacaride

PAGE

Poly Acrylamide Gel Electrophorensis

Điện di gel polyacrylamide

PNA

polysaccharide

polysaccharide nội bào

PNAG

poly-N-acetylglucosamine

poly-N-acetylglucosamine

TEMED

Tetra methyl ethylene diamin

Tetra methyl ethylene diamin

SDS

Sodium Dodecyl Sulfate

Sodium Dodecyl Sulfate

SEM

Scaning electro microscope

Kính hiển vi điện tử quét

VPS

Vibrio polysaccharide

Polysacarit của chủng Vibrio

w/v

Weight (g)/volume (ml)

Khối lượng (g)/thể tích (ml)

__--------------- _-------- .----- í-------- —
——---------viii

B á o c á o tỏng, k ê í đ ê t à i Q G 1 1 - 1 6


D an h m ụ c các b ả n g

Bang 1.1. Vai trò cua các hợp chảt plolymer ngoại bào có trong biofilm

Trang
5

Bang 1.2. Các u tơ anh hương đến sự bám dính tế hào và hình thành biofilm

9

Bang 3.1. Anh hướng cua nhiệt độ đên khá năng tạo biofilm cua các chung

31

phân lập
Bang 3.2. Anh hương cua pH mơi trường đến sự tạo thành biìlm cua các

32

chung vi sinh vặt phân lập

Báng 3.3. Anh hương cua các n g u ô n cacbon đên sự tạo thành m à n g biofilm

33

cua các chung vi sinh vật phân lập
Bảng 3.4. Anh hưởng cua các nguôn nitơ đên sự tạo thành màng biofilm của

35

các chung vi sinh vật phân lập
Bảng 3.5. Hoạt tính kháng khuân của các chủng vi khuân phân lập

45

Bang 3.6. Kha năng phối trộn tế bào B 1.10 với một số giá thể mang

47

ix

--------------- -------- .
;--------—
—-----------B á o c á o tỏ n g k ê t đ ê tà i Q G 1 1 -1 6


D a n h m ụ c các hình

Trang
H ìrh 1 . 1 C â u trúc b i o f i l m c u a S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s trên b ẽ m ặ t

2

H ìrh 1. 2. M ộ t s ố v í dụ v ề b i o f i l m

4

Hìrh 1.3. Câu trúc cellulose ơ vi khuân góp phần hình thành biofilm

6

Hìrh 1.4. Thành phần tế bào sap xếp trong một biofilm

7

Hìrh 1.5. Câu trúc hiên vi cua một biofilm

8

Hìrh 1.6. Các giai đoạn chính của q trình hình thành và phát triên biofilm

12

H ìrh 1. 7. C h u n g v i k h u â n B a c i l l u s s u b t i l i s

18

Hìrh 3.1. Hình thái khuân lạc một số nhóm vi sinh vật phân lập

26

Hìrh 3.2. Khả năng tạo thành màng sinh vật của các chủng vi sinh vật phân

27

lập từ mẫu nước thải làng miến Lại Trạch
Hỉrh 3.3. Khả năng tạo màng sinh vật của các chung vi sinh vật phân lập từ

28

m ẫi nước thải nhà máy san xuất bia
Hìrh 3.4. Kha năng tạo thành màng sinh vật của các chung vi sinh vật phân

28

lập từ mẫu nước thải làng nghề bún Phú Đơ
Hìrh 3.5. Kha năng tạo thành màng sinh vật của các chủng vi sinh vật phàn

29

l ậ p từ m ẫ u n ư ớ c th ài b c b i o g a s

Hìrh 3.6. Khả năng tạo thành màng sinh vật của một số chung vi sinh vật

30

phái lập từ mầu đất nơng nghiệp
Hìrh 3.7. Câu trúc dạng màng nôi biofilm của 5 chủng vi sinh vật

36

Hìrh 3.8. Cấu trúc màng sinh vật tạo thành trên bề mặt nhựa của 5 chung vi

37

sin) vật
Hìrh 3.9. Anh chụp cấu trúc màng sinh vật cua các chung phân lập

38

Hìrn 3.10. Hình thái khuân lạc và nhuộm Gram cùa các chung vi sinh vật

40

pìhái lập
H ìrn 3. 11. VỊ trí p h â n loại c ủ a c á c c h u n g M 3 . 8 , M 4 . 9 v ớ i c á c loài c ỏ q uan h ệ

42

h ọ là n g d ự a v à o trình tự g e n 1 6 S r D N A

X

B á o c á o tô n g k ê t đ ê tà i Q G 1 1 -1 6


Hình 3.12. Vị trí phân loại cua chủng U1.3 và U3.7 với các lồi có quan hệ

43

họ hàng dựa vào trình tự gen 16S rDNA

Hình 3.13. Vị trí phân loại cua chung B1.10 với các lồi có quan hệ họ hàng

44

dựa vào trinh tự gen 16S rDNA
Hình 3.14. Kha năne sinh trương cua chùng B 1.10 trong thiết bị lên men

xi

46

---------------_-------- -----Ị----------- —
—
---------B á o c á o t ô n g k ê t đ ê tà i Q G 1 1 - 1 6


M ỤC LỤC

M Ở Đ Ầ U ....................................................................................................................................................1
C H Ư Ơ N G 1: T Ò N G Q U A N T À I L I Ệ U ....................................................................................... 2
1.1.

K h á i n i ệ m v ề b i o f i l m ............................................................................................................................................................2

1.2.

Các dạng tôn tại biofilm ............................................................................................................................... 3

1 .2 .1 .

T r o n g m ô i tr ư ờ n g tự n h i ê n ...........................................................................................................................................3

] .2.2.

Trong các hệ thông thièt bị nhãn tạ o .................................................................................................... 3

1.2.3.

Trong cơ thể sinh vật số n g ...................................................................................................................... 3

13 .

T h à n h p h â n , c â u trúc c ủ a b i o f i l m .................................................................................................................................. 4

1 .3 .1 .

T h à n h p h ầ n c á c h ợ p ch ấ t p l o l y m e r n g o ạ i b à o ................................................................................................4

1 .3 .2 .

T h à n h p h à n tê b à o ...........................................................................................................................................................7

1 .3 .3 .

C ả u trúc b i o f i l m ................................................................................................................................................................. 8

1.4.

Q u á trinh hìn h th à n h b i o f i l m ............................................................................................................................................9

1.4. ] .

Các điều kiện tác động đèn sự hình thành

1.4.2.

Các giai đoạn chính trong quá trình hình thành biofilm.......................................................... 11

1.5.

b i o f i l i n ........................................................................ 9

Vai trị cua việc hình thành biofilm với vi sinh vật...................................................................... 13

1.5.1.

Bao vệ tê bào khoi các điều kiện bàt lợi cua mỏi trường....................................................... 13

1 .5 .2 .

T ậ n d ụ n g n g u ồ n d in h d ư ỡ n g c ủ a m ò i t r ư ờ n g ............................................................................................ 14

1.5.3.

Mối quan hệ hợp tác giữa các l o à i .................................................................................................. 14

1.6.

Hướng nghiên cứu ve b io film ...............................................................................................................15

1.6.1.

Lợi ích cua việc hình thành b io film ............................................................................................... 15

1.6.2.

Mối liên quan giữa việc tạo biofilm và kha năng đối kháng...................................................... 17

1.7.

Sơ lược về nhóm vi khuân B a c illu s .................................................................................................. 18

1 .7 .1 . Đ ặ c đ i ê m c h u n g c á c c h u n g th u ộ c n h ó m B a c i l l u s .......................................................................................... 18

1.7.2. ứ n g dụng cua các chùng B a c illu s ........................................................................................................ 18

C H Ư Ơ N G 2: N G U Y Ê N L I Ệ U VẢ P H Ư Ơ N G P H Á P N G H I Ê N c ứ u .......................20
2.1.

Nguyên liệ u ................................................................................................................................................ 20

2.2.

Hóa chất, thiết b ị .......................................................................................................................................20

2 .2 .1 .

M õ i tr ư ờ n g n u ô i c ấ y ..................................................................................................................................................2 0

2.2 .2 .

M á\ móc thiết b ị ............................................................................................................................................................. 21

xiị

B á o c á o t ỏ n g k ế t đ ê tà i Q G 1 1 - 1 6


2 .3 .

P h ư ơ n g p h á p n g h i ê n c ử u ................................................................................................................................................. 21

2 .3 .1 .

P h ư ơ n g p h á p p h à n lập v i k h u â n .............................................................................................................................21

2.3.2.

Phương pháp đánh giá kha nâng hình thành biofilm ....................................................................22

2 .3 .3 .

Q u a n sát c â u trú c b i o f i l m h ã n g c h ụ p a n h trên k ín h h iể n vi đ i ệ n từ q u é t ......................................2 2

2.3.4.

Tối ưu hóa các điều kiện hình thànhbiofilm................................................................................... 23

2.3.5.

Đánh giá khá năng đơi kháng với một sò chúng vi sinh vật gảy h ạ i...................................... 23

2.3.6.

Phương pháp phân loại phân từ dựa trên gen 16S r D N A ........................................................... 24

2 .3 .7 .

Q u á trình lẻn m e n .......................................................................................................................................................... 2 4

2.3.8.

Phương pháp thống kê sinh h ọ c .........................................................................................................24

C HƯƠNG 3: K É T ỌUẨ VÀ T H Ả O L U Ậ N ........................................................................25
■VI Phân lập vi sinh vật từ các điêu kiện mơi trường khác nhau có hoạt tính tạo biotìlm............... 25
3.1.1 Phân lập các chung vi sinh v ật.............................................................................................................. 25
3.1.2 Đánh giá kha năng phát triển và tạo màng sinh vật cùa các chung vi sinh vật phân lập .... 26
3.2 Nghiên cứu tối ưu hỏa các yêu tô anh hường đên việc tạo biotìlm cùa các chủng phân lập.... 31
3.2.1 Anh hương cùa nhiệt đ ộ ...........................................................................................................................31
3.2.2 Anh hương của điều kiện pH môi trường..........................................................................................31
3.2.3 Anh hương của các nguôn ca c b o n ....................................................................................................... 32
3.2.4 Anh hưởng của các nguồn n itơ ............................................................................................................. 34
3.2.5 Anh hướng tác động cua giá t h è ..............................................................................................................35
3.3 Nghiên cứu một số đặc tính sinh học và phânloại cua các chung phân lập......................................39
3.3.1 Đặc điếm hình thái cua các chung vi sinh vật phân lậ p .............................................................. 39
3.3.2 Phân loại các chung vi sinh vật phân lập dựatrẻn trinh tự gen mã hóa 16S r D N A .............. 41
3.4. Đánh giá kha năng kháng khuân và xây dựng quá trình lên m e n ...................................................... 45
K É r L U Ạ N .................................................................................................................................................................... 4 8

K I IN N G H Ị ...................................................................................................................................... 48
T À L IỆ U T H A M K H Ả O ........................................................................................................... 49
P H Ị L Ụ C ................................................................................................................................................ 54

xiii

------------------ ,-------- .----- ----------——
----------B á o c á o tỏm> k ê t d ê t à i O G 1 1 - 1 6


M Ở Đ ÀU

Vi sinh vật đã và đang là đối tượng chính trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu khác
nhcU từ lên m e n tr u y ề n t h ố n g đ ế n c ô n g n g h i ệ p , n ô n g n g h i ệ p v à k ỳ thuật di tr u y ề n h iệ n

đại T rong hâu hêt các nghiên cứu ơ phòng thi nghiệm vi sinh vật thường chi được xem
xét dưới góc độ là một tế bào đơn le tách ra khòi hệ thống sống cộng đồng tự nhiên.
1 U' nhiên trong điều kiện tự nhiên tế bào vi sinh vật ít khi tồn tại đơn le mà lại thường
liêr kết nhau và bám dính trên một bê mặt nhất định tạo thành một cấu trúc được gọi là
màig sinh vật (biofilm).
Biofilm là một dạng sống tồn tại khá phô biến trong tự nhiên và khác biệt với
dạrg tê bào sống tự do bởi mạng lưới các hợp chất ngoại bào bao quanh và những thay
đơi b iệt hóa trơng tế bào đê phù hợp với dạng sống mới. Hình thành biofilm đem lại
nhiìu lợi ích cho ban thân vi sinh vật như giúp tế bào tồn tại và chống chịu được những
điềi kiện bất lợi, tận dụng được nguồn dinh dưỡng của môi trường thông qua mối quan
h ệ ì ợ p tác g i ữ a c á c loài k h á c n h a u t r o n g b io f i lm .

Nghiên cứu mơ hình biotìlm giúp cho việc tìm hiểu sâu hơn về cơ chế tồn tại,
phác triên cũng như tương tác của vi sinh vật trong điều kiện tự nhiên từ đó giúp chúng
ta kiêm sốt tơí hưn sự phát triên của vi sinh vật trong đó các các vi sinh vật gây bệnh.

Hiện nay việc ứng dụng các vi sinh vật tạo biofilm có lợi cũng như hạn chế những vi
sinh

v ậ t tạo biofilm có hại đang thu hút sự quan tâm cùa nhiều nhà khoa học, các cơng

ty. ĩro n g các mơ hình nghiên cứu biofilmm chủng vi khuẩn Bacillus là một trong
n h ù ig chùng được nghiên cứu ứng dụng nhiều nhất do những ưu điểm như tạo bào tử,
khcng gây độc, có hoạt tính mạnh. Ở Việt Nam việc nghiên cứu về các chùng vi sinh
vật có khả năng tạo biofilm nói chung và biofilm tạo ra từ Bacillus cịn thiếu cả về số
lirợig và chât lượng, chưa có các nghiên cứu phân lập, tuyên chọn cũng như các yếu tố
ảnh hư ơ n g đêr) việc tạo biofilm của Bacillus. Đê góp phần hiểu rõ hơn về mạng lưới
b io ílm cũng như tìm ra hướng ứng dụng cùa bioíìlm từ các chung Bacillus trong điều
kiệi m ôi tr ư ờ n g Việt Nam c h ú n g tôi tiế n hành đ ề tài “ P h â n l ậ p , t u y ể n c h ọ n c á c
c h in g B a c i l l u s có khả năng sinh tổng hợp biofilm và nghiên cứu ứng dụng biofilm

t r o i g việc úc chế s ự p h á t t r i ể n m ộ t số vi sinh vậ t gây hại

1

--------------- --------- -----^---------—
——---------B á o c á o tô n g k ẻ t đ ê tà i Q G 1 1 -1 6


C H Ư Ơ N G 1: T Ò N G QUAN r À l LIỆU
1.1

Khái niệm về biofilm
Hiện tượng quân thê vi sinh vật gắn kết với nhau trên bề mặt (biofilm) đã được

quai sát từ rất lâu, ngay từ năm 1864 Anthony van Leewenhoek đã lưu ý đến sự bám

dim cua vi sinh vật trong mảng bám răng. Trong thập niên 1960, 1970 đã có rất nhiều
nghẽn cứu về lớp màng vi sinh vật nhưng thuật ngừ “biofilm” chỉ được cơng nhận
chíih thức vào năm 1984 [45], Ngày nay hướng nghiên cứu về biìhn cũng như
nhíng ứng dụng của nó ngày càng thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học đặc biệt
là t ong lĩnh vực công nghệ sinh học, công nghiệp xừ lý nước thai hay nghiên cứu bệnh
trirền nhiễm [57],

H ình 1.1 Cấu trúc biofilm của Staphylococcus aureus trên bề mặt [44]
Đã có rất nhiều khái niệm được đưa ra nhằm góp phần hiểu biết rị hơn về
bioilm. Theo O ’Toole một biofilm có thê được xác định là một tập họp của vi sinh vật
gắn kết trên bề mặt [20] ví dụ như cấu trúc biofilm của Staphylococcus aureus
(h ìĩh l.l). Wikipedia đinh nghĩa “một bioíĩlm được coi là một cấu trúc tập hợp của vi
sinl vật được bao quanh bời mạng lưới ngoại bào do chính nó tạo ra và được gắn kết
trêr bề mặt trên bề mặt hữu sinh hoặc vô sinh [56],
Nhìn chung có thê thấy một biofilm trong tự nhiên là cấu trúc cua các loài vi
si nỉ vật gồm hai thành phần chính là:
-

Thành phàn tê bào: gơm tập hợp các tế bào cua một hay nhiều loài vi sinh vật

khá; nhau, bám dính trên bề mặt nhàt định (có thê là hữu sinh hay vơ sinh).

2

------------------ ,-------- 7-----5------- —
-—----------B á o c á o t ò n g k ê í đ ẻ t à i QCỈ 1 1 - 1 6


-

Mạng lưới các hợp chất ngoại bào (extracellular polymeric substances-EPS)

bat quanh các tế bào, tạo ncn cấu trúc đặc trưng cho biofilm [26],
D ự a v à o n h ữ n g k h á i n i ệ m trên c ó thê th ấ y b i o í ì l m k h ơ n g p h ả i là m ộ t d ạ n g s ố n g

đặc biệt mà trên thực tê đây là một hình thức tồn tại phơ biến cua nhiều nhóm vi sinh
vật trong mơi trườniì tự nhiên.
1.2

C ác d ạ n g tồn tại biofilm
Trong tự nhiên dạng sơng biofilm có thê bắt gặp và quan sát trong rất nhiều

đạrg môi trường khác nhau từ môi trường tự nhiên như trên bề mặt cua các viên đá
nar .1 dưới đáy sông suối, trên bề mặt nước của các hồ, ao tù đến các hệ thống nhàn tạo
nhi vòi hoa sen, ống dẫn nước.
1.21. T ro n g môi trưcm g tự nhiên
Môi trường nước tự nhiên như trong các ao hồ, sông, suối là điều kiện thuận lợi
n h ấ c h o v i ệ c h ìn h

thành v à phát triển m ộ t m ạ n g lư ớ i b i o í ì l m . B i o f i l m c ó th ê đ ư ợ c h ìn h

thà:h n g a y trên b ề m ặt n ư ớ c ( k h o ả n g tiế p x ú c v ớ i k h ơ n g k h í) đ ê h ìn h

thành n ê n d ạ n g

cau trúc biofilm nơi (floating biofilm), có thể quan sát dưới dạnẹ những cặn hay váng
cùa vi sinh vật trên mặt ao, hồ hay bể lọc nước [32],
Một dạng khác của biofilm trong tự nhiên được tìm thấy là khi các vi sinh vật
bán dính trên bề mặt vật liệu ran như các viên sỏi, đá trong nước tạo thành dạng
bio ilm bề mặt.

1.22. T ro n g các hệ thống thiết bị nhân tạo

Biofilm cũng tồn tại trên bề mặt các thiết bị nhân tạo được cấu tạo chủ yếu từ
vật liệu vô sinh (nhựa, thủy tinh, thép....) như trên vị của tàu thuyền, bên trong lịng
các ơng dẫn nước, ống dần dầu hay dẫn khí đốt, trên sàn các quầy hàng thực phâm.
Trong các thiêt bị, đô dùng gia đình cùng có sự xuất hiện của biofilm khi các vi
sin} vật bám dính trong hệ thơng vịi hoa sen, bồn rua mặt, ống thoát n ư ớ c ...[53],
1.23. T r o n g c ơ th ể sinh vậ t sống

Ngay trong cơ thê sống như động vật hay người cũng xuất hiện biofilm chu yếu
đ ư c c h ìn h th à n h là sàn p h â m c ủ a n h ữ n g lo à i vi s in h vật g â y b ệ n h n h ư S t r e p t o c o c c u s

m um s, Staphylcoccus aureus. Biofilm có thê hình thành trên bê mặt lớp tế bào biêu
mơ như biêu mô ong dẫn niệu, xoang mũi, xoang miệng hay trên răng tạo thành cấu
----------------- ,-------- ;----- ;-----------------------B á o c á o tô n g k ê t d è tà i Q G 1 1 -1 6


trúc biìlm gọi là màng bám răng (hình 1.2). Thậm chí bề mặt cua những dụng cụ y tế
đặt trong cơ thê như van tim, niệu quan nhân tạo cũng có thể xuất hiện biofilm [50J.

A

B

C

H ì n h 1 .2 . Mộ t s ố v í d ụ v ề b i o f i l m
A: B i o f i l m nôi trên b ề m ặ t h ồ , B: B i o f i l m b á m trên b ề m ặ t b à n c h à i đ á n h ră n g ,

C: B i o í ĩ l m h ìn h th à n h n ê n m a n g b á m ră n g

1.3.

Thành phần, cấu trúc của biofilm

v ề c ơ b a n b i o f i l m đ ư ợ c c ấ u tạo g ồ m rất n h i ề u tế b à o c ủ a c ù n g một loài h a y từ

nhiềui loài vi sinh vật khác. Khối lượng tế bào vi sinh vật chiếm 2-5% tơng khối lượng
biofilm cịn lại là nước 97%, các hợp chất polym er ngoại bào (EPS) và ion chiếm từ 36% [5] Một tế bào riêng lẻ có thể tạo ra các chất ngoại bào khác nhau tùy thuộc vào
điều Bciện mơi trường, đặc tình của từng lồi vi khuẩn cũng như cách thức khác nhau
hình tthành biofilm.
1.3.1.. Thành phần các họp chất plolym er ngoại bào

Thành phần polymer ngoại bào (EPS) rất đa dạng tùy loài vi sinh vật, dạng
biofilm và điều kiện hinh thành nhưng về cơ bân đều bao gồm các đường đa cacbon
(poly saccharide) có khối lượng từ 40 đến 95%, protein có khối lượng từ lđến 60% là
protenn. axit nucleic chiếm từ lđến 10% và lipit chiếm từ lđến 40% trong biofilm [12],
[4 7 1- Thành phân các họp chất này thay đôi theo không gian và thời gian tồn tại cua
biofilm v ề cơ ban biofilm có độ dày càng cao và thời gian ton tại càng lâu thì có hàm
l ư ợ n g E P S c à n g n h iề u . M ậ t đ ộ tế b à o tập tr u n g c a o n h ấ t

ớ

lớ p đ in h trên c ù n g c u a

biofil m và giam dân theo độ sâu nhưng thành phân EPS lại phong phủ hơn ơ vùng phía
trong biofilm. Thành phân EPS cũng khác biệt so ờ dạng vi khuàn sống tự do so với

4

B á o c á o tô n g k ê t đ ê tài Q G 1 ì -1 6

dạrg sống trong các hệ thông nhân tạo [25]. Vai trị cua những thành phân chính trong
mộ' biofilm được trình bày qua bang I .
B a n g 1.1 V a i t r ò c u a c á c h ợ p c h ấ t p l o l y m e r n g o ạ i b à o c ó t r o n g b i o f i l m [ 1 4 ]

rác dụng cua

rhành phấn

Vai trò trong biofilm

Kiến tạo

Polysaccharide, Amyloid

Câu tạo nèn câu trúc biofilm

1loạt hóa

Enzyme ngoại bào

Phân huy chât hữu cơ

Ib ạt hóa bề mặt

Amphiphlic

Tương tác giữa các bề mặt

Truyên tin

Lectin, Axit nucleic

Truvền tin giữa các tế bào

Ciất dinh dưỡng

Các loại polymer

po ymer ngoại bào

Nguồn cung cấp

c, N,

p

\

1.31.1.

T h à n h p h â n p o l y s a c c h a r i t ng o ạ i b à o

Polysaccharide là thành phần quan trọng đê tạo nên cấu trúc biofilm hoàn chỉnh.
Các polysaccharide có thê rất đa dạng về cấu trúc, các đặc tính sinh lý, sinh hóa thơng
q dạng liên kết glycosidic giữa các phân tử (P-1,4, (3-1,3 hay a-],6) hay đưn vị
m oiom er cấu tạo nên. Polysaccharide có thể là các đồng phân tử cấu tạo bởi một đơn
p hái monosacharide duy nhất như cellulose, dextran hay dị phàn tử cấu tạo bởi 2 đến 4
đ-ạrg đơn phân khác nhau như alginate, emulsan, gellan [9], Các monosaccharit phổ

b iếi trong biofilm là D-glucose, D-galactose, D-mannose, L-fucose, nhóm axit uronic
n hi axit D-glucuronic, axit D-galacturonic. Thành phần các đường đơn có ảnh hường
đer đặc tính của polysaccharit và qua đó ảnh hường đến đặc tính của cả biofilm [9],
Vai trị của mạng lưới polysaccharide ngoại bào thô hiện ở rất nhiều giai đoạn
khác nhau trong quá trinh hinh thành biofilm như hồ trợ việc gắn kết tế bào lên bề mặt,
đ à n bao môi tương tác giữa các tế bào với nhau, kiến tạo cấu trúc đặc trưng cho
bioilm .
Một sỏ loại polysaccharide đóng vai trị quan trọng trong việc hình thành
b io ilm ơ một số lồi vi khuẩn là cellulose, PNA/PIA và VPS [44J.
-

Cellulose : Cellulose là polysaccharide phô biên nhât trong tự nhiên và được

tạo ra bời ca thực vật và vi khuân (Hình 1.3). Quá trình tạo cellulose cùa vi khuẩn và
v.ai trị cua cellulose trong việc hình thành biofilm được mơ tà trong 1 số lượng lớn các
5

----------------- ,-------- ------ -----------------------B á o c á o tỏ n g k ê t đ ê tài Q G 11 -1 6


loài vi

khuân như Sarcina ventriculi, Agrobacterium tumefaciens, Escherichia coli,

Salmonella spp. và Pseudomonas fluorescence [25], [39].
OH
OH

H O ---- T~~~

-C l­
//

ou

OH

OH

Hình 1.3. Cấu trúc cellulose ờ vi khn góp phần hình thành biofilm [25]

Các thí nghiệm cho thay các sợi cellulose có thê tương tác với lipolysaccharide
(1_PS) của các tê bào lân cận và chính tương tác này trong cầu nối với các yếu tố khác
chịu trách nhiệm trong việc qui định độ bền cũng như tính tồn vẹn cùa một biofilm
[24],
- P N A G / P N A : V a i trò của p o l y - N - a c e t y l g l u c o s a m i n e

như là

m ộ t th àn h

phần

ngoại bào cua biofilm được nghiên cứu rộng rãi ờ hai lồi vi khuẩn Gram âm có quan
hệ gân gũi là Staphylococcus epidermidis tông hợp nên các polysacharit găn kêt nội
bào (P1A) và Staphylococcus aureus tông họp nên poly-N-acetylglucosamine (PNAG).
Những nghiên cứu gần đây cũng nhận thấy những polysaccharit tương tự PNAG/PIA
cùng được tông hợp ờ các vi khuân Gram âm khác như Escherichia coli, Yersinia

pestis và ActinoBacillus sp. PIA và PNAG đều là những homopolysaccharides dạng

chuồi cấu thành bởi các D-glucosamine liên kết với nhau bằng liên kết a-1,6 glucozit
nhưng chúng khác nhau về chiều dài chuồi và sự thay đổi nhất định [31 ].
- VPS: V i k h u â n V ib r i o c h o l e r a e tạ o nên n h ư n g e x o p o l y s a c c h a r i d e g ọ i là

VPS

(Vibrio polysaccharide). Dạng polysaccharide này cấu tạo chủ yếu bời glucose và
galactose và một lượng nhỏ N-acetylglusoamine và mannose. c ấ u trúc này dẫn đến sự
hình thành khuàn lạc nhăn nheo trên bê mặt thạch và đóng vai trị quan trọng trọng việc
hình thanh biofilm trên bề mặt răn cũng như bề mặt long [51]. Các tế bào V. cholerae
trong biofilm cũng bộc lộ kha năng sống sót tốt hơn trong môi trường nước tây rưa và
chịu đựng với áp suât thâm thấu, axit, sự oxi hỏa tốt hơn khi so sánh với dạng sổng tự
do nhờ mạng lưới VPS bao phù quanh tế bào.

6

B á o c á o tỏ n g k ê t đ ê tài Q G 1 1 -1 6


1.3.1.2.

P r o t e i n ng oạ i b à o

Những phương pháp di truyền và chụp anh hiên vi cung cấp thơng tin về việc
protein đóng vai trị như là một u tơ kêt nối tế bào - tê bào trong quá trình hình thành
biofilm hơi các lồi vi khn. Protein ngoại bào có khối lượng dao động từ 10 kDa đến
200 kDa với 40-60% thành phần là axit amin kị nước. Những thành phần protein chính
trong mạng lưới ngoại bào được nối với nhau bơi các ion hóa trị 2 là C a2+ và M g2+ và
một lượng nho carbohydrat và axit nucleic [25],
Một protein ngoại bào được nghiên cứu phô biến là protein TasA ơ Bacillus

subtilis là thành phân chính trong mạng lưới ngoại bào bao quanh tế bào B. subtilis
trong suốt quá trình hình thành biofilm. Chức năng chính xác cùa protein TasA trong
mạng lưới ngoại bào vẫn chưa được sáng tò nhưng các kết quả nghiên cứu đã được ghi
nhận là có tác dụng kháng khuân [43],
1.3.2. T h à n h p h ầ n tế bào

H ình 1.4. Thành phần tế bào sắp xếp trong một biofilm
Biĩlm có thể được hình thành bời tập hợp các tế bào của một hoặc nhiều loài
V I

sinh vật khác như nấm, tảo, xạ khuẩn, vi khuẩn. Trong bioíĩlm các tế bào tập hợp

thành các đơn vị cấu trúc là các vi khuân lạc. Thành phần này đóng vai trị quan trọng
trong q trình hình thành biofilm đặc biệt là ờ giai đoạn đầu bơi nó qui định đặc tính
hình thành biofilm cho từng lồi vi sinh vật, đam nhiệm chức năng tiết các hợp chất
ngoại bào cũng như có chứa các u tơ phụ trợ tế bào như lông roi, lông nhung hồ trợ
cho việc bám dính cúa các tê bào khác lên bê mật giá thê (Hình 1.4).

7

------------------ 5-------- 7-----*--------—
——----------B á o c á o tô n g k ẻ t đ ê tà i ọ c 1 1 -1 6


1 . 3 .3 . C ấ u t r ú c b i o f i l m

Kính hiên vi quét tiêu điểm được sứ dụng hiệu quả trong việc quan sát cấu trúc
không gian 3 chiều cùa biofilm ờ các chung vi sinh vật khác nhau và cho phép quan sát
trực tiếp biìlm mà khơng cân phai phá vỡ cấu trúc quần thê

Vê cơ ban một mạng lưới ngoại bào (EPS) có độ dày từ 0,2 đến ] um. ơ một vài
loài vi khuân độ dày cùa lớp EPS mong hơn, không vượt quá 10 đến 30nm [12], Ọuan
sát dưới kính hiên vi qt cho thay biofilm khơng phai là một chất vơ định hình, hay
một khơi đặc sệt các polysaccharides và vi khuân như những nhận định trước đây.

A

B
H ìn h 1.5. Cấu trúc hiển vi của một biofilm

A. Cấu trúc khơng gian của một biìlm với mạng lưới ngoại bào bao quanh,
B. Anh hiên vi quét cho thấy cấu trúc khơng đồng đều bên trong biìlm và cấu trúc
những kênh dẫn truyền nước [ 14]
Cấu trúc biofilm bao gồm thành phần tế bào liên kết với nhau một cách có trật
tự dam bao sự trao đơi thông tin liên tục diễn ra giữa các tế bào. Mạng lưới các chất
ngoại bào có vai trị qui định sự sắp xêp tế bào đồng thời tạo nên những kênh dần
truvên nước bên trong biofilm đam báo cho việc khuếch tán, phàn phối chất dinh
dưỡng đên khap các tê bào trong biìlm cũng như mang đi những chất thai khơng cần
thiết (Hình 1.5) [28],
Các biĩlm được hình thành từ một lồi vi sinh vật khác với biìlm được hình
thành từ nhiẻu loài. Trong trường hợp biofilm được hinh thành theo nhiều lồi thường
8

B á o c á o tị n g k ê t đ ê tà i Q G 1 1 - 1 6


đ ư c c cấ u trúc t h e o k iê u g ồ m n h i ề u lớ p tr o n g đ ó vi k hu ân h iế u khí b ê n trcn v à n h i ề u lớp

vi ỉ huân kị khí bên dưới. Kiêu cấu tạo này có cấu trúc đặc trưng do các luồng nước
chay qua khuây động nên các vi khuân kị khí và hiếu khí có thê song song tồn tại khắp

các hốc nho có trong bioflm.
1.4

Q trình hình thành biofilm

1.4 1. Các điều kiện tác động đến sự hình thành biofilm

Biofilm có the được hình thành trên các bề mặt bao gồm mơ sống, các thiết bị,
dựrg cụ y khoa, các hệ thông ống nước có cấu tạo từ những vật liệu khác nhau. Tuv
nhiìn trong điêu kiện tự nhiên đê chuyên từ dạng sống dạng tự do trong môi trường
sang dạng câu trúc trong biofilm đòi hỏi một loạt những điều kiện nhất định. Ba yếu tố
chính qui định việc hình thành biofilm bao gồm
- T ín h c h ấ t b ề m ặ t g iá t h ể
- Đ i ề u k iệ n m ô i tr ư ờ n g
- Đ ặ c tín h c ú a c h u n g

vi sinh vật [ 14]

F ả n g 1 .2 . C á c y ế u tô ả n h h ư ờ n g đ ế n s ự b á m d ín h tế b à o v à h ìn h th àn h b i o f i l m [ 14]

Eặc tính bề mặt giá thể

Bề nặt trưn hay thơ ráp
Tím kị nước hay ưa nước

Điều kiện mơi trường

Đặc tính tế bào

Tốc độ dịng chảy

Tính kị nước bề mặt tế bào

Nhiệt độ

Lơng roi

lon đương

Lơng nhung

Sự có mặt các nhân tố

Khà năng tiết các chất ngoại

kháng khuân

bào

1.41.1. T í n h c h ấ t bề m ặ t giá t h ể

Đây là yếu tố quyết định đến việc hấp thụ chất hữu cơ và bám dính của tế bào
bởi vậy mồi lồi vi khn chi hình thành biofilm được trên một loại số bề mặt giá thê
với tính chất nhất định.
Diện tích bề mặt là một trong nhùng yếu tố chinh anh hương đến sự phát triển
bilm. Theo ngun tẳc diện tích bê mặt càng lớn càng làm tăng kha náng tiếp xúc
với tê bào, qua đỏ tạo điều kiện cho việc bám dính lên bề mặt giá thê. Các hệ thống ong
đầr khác với hâu hết các môi trường tự nhiên (ao hồ, sông) thường có một diện tích bề
m ặ khá lớn tạo điều kiện cho việc tiêp xúc giữa tế bào vi khuân và bề mặt.
----------------- J-------- ;----- í------------- ———-----------------9

B á o c á o tô n g k ê t đ ê tà i Q G 1 1 - 1 6


Sự phát triển cua các tế bào bên trong biofilm đã được chứng minh là có sự
tàng lên khi tăng mức độ thô ráp cua bề mặt [ 14], Diều này được giai thích là do lực cắt
giữa bề mặt và tê bào được giảm đi và diện tích tiếp xúc được tăng lên so với bề mặt
nhẵn.
Các tính chât câu tạo của bề mặt vật liệu cùng anh hương mạnh đến tốc độ và
mức độ găn kết tế bào lên bề mặt. Hầu hết các nghiên cứu nhận thấy rằng các vi sinh
vật găn kết với một bê mặt kị nước, không phân cực như Teflon và nhựa nhanh hơn là
so với một sô vật liệu khác như thủy tinh hay kim loại [26].
1.4.1.2. D iề u ki ệ n m ơ i t r i r ị n g

Các đặc trưng hóa lý của mơi trường nước nlnr pH, mức độ dinh dường, nồng
độ các ion, nhiệt độ có thê đóng vai trị quan trọng troni: mức độ gan kết vi sinh vật lẽn
bề mặt.
Việc tạo biofilm có thê được coi là một cách thức tồn tại, phát triển của vi sinh
vật trong những điều kiện dinh dưỡng thấp của mơi trường. Cơ chế của q trình này
có thê được hiểu như sau: khi trong môi trường sống tự do lượng chất dinh dường gồm
nguôn cacbon, nitơ bị giảm sút thì các vi sinh vật sống trơi nơi trong mơi trường nước
sè có xu hưcýng tập trung đen nơi có nguồn đinh dưỡng tích tụ. Khi các hợp chất hữu cơ
tích tụ lại trên bề mặt, chúng sẽ thu hút các vi khuân, tảo và động vật nguycn sinh thích
ăn chúng đến, theo thời gian sẽ phát triển thành một biofilm với nhiều loài sinh vật
khác nhau [26],
1.4.1.3. Đ ặc tí n h c ủ a tế b à o

Mặc dù biìlm là hình thức tồn tại phổ biến của vi sinh vật trong môi trường tự
nhiên nhưng khơng phái vi sinh vật nào cũng có khả năng hình thành biofilm. Các đặc
tính cùa tế bào bao gồm các cấu trúc phụ trợ như lông roi, lông nhung, khả năng di

động, khả năng tạo các chất ngoại bào (protein, polysaccharide) ảnh hường lớn đến
việc hinh thành biofilm.
Những vi sinh vật có lơng roi, lơng nhung sẽ giúp cho việc di chun trong mơi
trường nước tốt hơn nên có hiệu qua tạo biofilm cao hơn. Thí nghiệm so sánh giữa hai
chung Pseudomonas fluorescens cho thấy chung di động có kha năng hình thành
biofilm nhanh hơn so với chung khơng di động [13]. Đối với lồi có lơng roi, lơng
nhung cúng sẽ có ưu thế trong việc di chuyên đên một bề mặt giá thê xác định nơi có
-

---------------------------------- 3------------------7---------- í -------------------------------------------------

10

Báo cáo tông kêt đê tài QG 11-16