thiết lập quy trình realtime pcr nhằm phát hiện kiểu gen hla b27 bệnh nhân viêm cột sống dính khớp tại việt nam

BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT (TỒN VĂN)

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

THIẾT LẬP QUY TRÌNH REALTIME PCR NHẰM PHÁT HIỆN KIỂU GEN
HLA-B27 BỆNH NHÂN VIÊM CỘT SỐNG DÍNH KHỚP TẠI VIỆT NAM

Mã số:
Chủ nhiệm đề tài: Cử nhân. LƯƠNG BẮC AN

Tp. Hồ Chí Minh, 04/2018


DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU
Chức danh trong
Họ và tên, học hàm học vị quá trình thực hiện
nhiệm vụ
1 CN. LƯƠNG BẮC AN

Đơn vị công tác

Chủ nhiệm đề tài

Trung tâm Y Sinh học Phân tử Đại học Y Dược TP.HCM

2 ThS. LÊ THÁI KHƯƠNG

Thành viên

Trung tâm Y Sinh học Phân tử Đại học Y Dược TP.HCM

3 PGS.TS. ĐỖ THỊ THANH
THUỶ

Thành viên

Trung tâm Y Sinh học Phân tử Đại học Y Dược TP.HCM

Nơi thực hiện đề tài: Đại học Y Dược TPHCM


MỤC LỤC
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 6
1.1.
1.2.
1.3.

Bệnh lý viêm cột sống dính khớp ................................................................. 6
Nguyên nhân và cơ chế sinh bệnh ................................................................ 6
Dịch tể .......................................................................................................... 6

1.4.
1.5.
1.6.

Triệu chứng .................................................................................................. 7
Biến chứng.................................................................................................... 7
HLA-B27 và cơ chế gây bệnh ...................................................................... 7

1.7.

Phương pháp phát hiện kiểu gen HLA-B27 .................................................. 9

1.7.1.

Phương pháp giải trình tự ..................................................................... 9

1.7.2.
1.7.3.

Phương pháp dịng chảy tế bào ............................................................. 9
Phương pháp Real – time PCR ........................................................... 10

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................... 16
2.1
Đối tượng nghiên cứu ................................................................................. 16
2.2. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................... 16
2.2.1. Thiết bị - Dụng cụ ............................................................................... 16
2.2.2. Hóa chất .............................................................................................. 16
2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 17
2.3.1.
2.3.2.

Thiết kế mồi ........................................................................................ 17
Phản ứng multiplex PCR .................................................................... 18

2.3.3. Qui trình multiplex realtime SYBR Green PCR .................................. 19
2.4. Thời gian và địa điểm thực hiện nghiên cứu .............................................. 19

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................................. 20
3.1. Kết quả thiết kế mồi ................................................................................... 20
3.2. Kết quả multiplex PCR............................................................................... 20
3.3. Kết quả realtime PCR ................................................................................. 21
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ........................................................................................ 25
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 27
TÀI LIỆU THAM KHẢO. ........................................................................................ 27


DANH SÁCH HÌNH
hình 1.1: biểu đồ đường biểu diễn khuếch đại của phản ứng realtime PCR. ............ 11
hình 3.1. kết quả điện di multiplex PCR ................................................................... 21
hình 3.2. điểm chảy mẫu dna dương tính HLA-B27 ................................................. 22
hình 3.3. điểm chảy mẫu dna âm tính HLA-B27 ....................................................... 22
hình 3.4 . các mẫu dna dương tính HLA-B27 ............................................................ 23
hình 3.5. các mẫu dna âm tính HLA-B27 .................................................................. 23

DANH SÁCH BẢNG
bảng 2.1. trình tự mồi phát hiện kiểu gen HLA-B27 và gen chứng nội. ................... 18
bảng 2.2. thành phần phản ứng multiplex PCR ........................................................ 18
bảng 2.3. thành phần phản ứng multiplex realtime sybr green PCR ........................ 19


THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

1. Thơng tin chung:
- Tên đề tài: thiết lập quy trình realtime pcr nhằm phát hiện kiểu gen HLA-B27
bệnh nhân viêm cột sống dính khớp tại việt nam

- Mã số:
- Chủ nhiệm đề tài: CN. Lương Bắc An.
Điện thoại: 0933 908 241

Email:

- Đơn vị quản lý về chuyên môn: Trung tâm Y Sinh học Phân tử
- Thời gian thực hiện: Tháng 6-2016 đến tháng 6-2017
2. Mục tiêu: Thiết lập quy trình realtime pcr nhằm phát hiện kiểu gen HLA-B27
bệnh nhân viêm cột sống dính khớp tại việt nam
3. Nội dung chính:
- Thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho kiểu gen HLA-B27.
- Tối ưu hoá các điều kiện phản ứng multiplex realtime PCR sử dụng SYBR Green
4. Kết quả chính đạt được (khoa học, đào tạo, kinh tế-xã hội, ứng dụng, ...):
 Thiết lập được quy trình thiết lập quy trình realtime pcr nhằm phát hiện kiểu gen
HLA-B27.

 Cơng bố trên tạp chí trong nước và quốc tế (tên bài báo, tên tạp chí, năm
xuất bản): thiết lập quy trình realtime pcr nhằm phát hiện kiểu gen HLA-B27 bệnh
nhân viêm cột sống dính khớp tại việt nam . Tạp chí Y Học Thành phố, tập 22, số
2, năm 2018.

5. Hiệu quả kinh tế - xã hội do đề tài mang lại


MỞ ĐẦU
Viêm cột sống dính khớp (VCSDK) là tình trạng bệnh lý viêm tại các vị trí
đốt sống và dính lại với nhau khiến các khớp xương kém linh động. Bệnh do nhiều
yếu tố tác động, như tuổi tác, giới tính và yếu tố di truyền. Khoảng 5% dân số mang
kiểu gen HLA-B27, nhưng 95% bệnh nhân VCSDK có mang kiểu gen dương tính

HLA-B27. Do đó, dấu ấn HLA-B27 có thể xem là dấu ấn di truyền cho bệnh lý
VCSDK. Phương pháp điều trị VCSDK chủ yếu là giảm đau và kháng viêm giúp
giảm các triệu chứng bệnh lý. Để tăng khả năng điều trị hiệu quả cho bệnh nhân thì
xác định được nguyên nhân gây bệnh là yếu tố quan trọng nhất. Vì vậy, đối với bệnh
nhân xuất hiện triệu chứng nghi ngờ bệnh lý VCSDK thì việc phát hiện kiểu gen
HLA-B27 sẽ là một phương pháp giúp chẩn đốn bệnh sớm để có hướng phịng ngừa
và điều trị kịp thời.
Thuốc nhuộm SYBR Green là một giải pháp thay thế hiệu quả cho các đoạn
do probe, giá thành cũng tương đối hợp lý. Hiện trên thế giới cũng có nhiều hãng
sản xuất kit phát hiện kiểu gen HLA-B27 sử dụng thuốc nhuộm SYBR Green. Tuy
nhiên, giá thành cho các bộ kít này khá cao, chưa phù hợp với điều kiện kinh tế hiện
nay tại Việt Nam. Do đó, chúng tơi thiết lập một quy trình phát hiện kiểu gen HLAB27 bằng phản ứng realtime PCR sử dụng thuốc nhuộm SYBR Green. Việc phát
triển bộ kít mới sẽ giúp giảm giá thành xét nghiệm cũng như chủ động hơn trong
việc chuẩn bị kit để làm xét nghiệm. Chính vì vậy, chúng tơi thiết lập quy trình
realtime PCR nhằm phát hiện kiểu gen HLA-B27 ở bệnh nhân viêm cột sống dính
khớp tại Việt Nam.


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Bệnh lý viêm cột sống dính khớp
Viêm cột sống dính khớp (VCSDK) là bệnh lý viêm mạn tính kéo dài đặc

trưng bởi tình trạng đau và cứng cột sống tiến triển. Ngoài các biểu hiện theo trục
của bộ xương, VCSDK cịn có thể chỉ có các biểu hiện ngoại biên bao gồm viêm các
khớp ngoại biên, viêm tại chỗ vào xương của các gân và dây chằng, viêm màng bồ
đào, viêm van động mạch chủ. Bệnh thường khởi phát ở tuổi thanh thiếu niên. Nam
giới có tỉ lệ mắc bệnh cao hơn gpaas 2-3 lần so với nữ giới. bệnh lý VCSDK nếu
không được điều trị sớm và đúng cách sẽ tiến triển đến viêm, dính các khớp cột sống

và khớp ngoại biên, gây gù vẹo, mất chức năng và tàn phế.
1.2.

Nguyên nhân và cơ chế sinh bệnh
Ngun nhân bệnh lí VCSDK hiện vẫn cịn chưa rõ ràng, tuy nhiên các

nghiên cứu cho thấy bệnh có thể liên quan đến yếu tố di truyền. Các nghiên cứu cho
thấy, ở các cặp sinh đôi cùng trứng, tỉ lệ đồng mắc bệnh là 63%; ở các cặp sinh đôi
khác trứng, tỉ lệ đồng mắc bệnh là 13%. Nếu có người thân trong gia đình (cha mẹ,
anh chị em, con cái) mắc bệnh, khả năng bị VCSDK tăng 6-16 lần.
Các nghiên cứu đã tìm ra nhiều gen có liên quan đến VCSDK, trong đó HLAB27 là một dấu ấn di truyền đã được chứng minh có liên quan đến cơ chế sinh bệnh
vì có tới 90% bệnh nhân VCSDK có hiện diện kháng nguyên bề mặt HLA-B27.
HLA-B27 là một protein ở >95% những bệnh nhân VCSDK ở chủng tộc Da trắng.
Tuy nhiên, HLA-B27 là marker được thấy xuất hiện nhiều ở bệnh nhân VCSDK,
khơng có nghĩa là tất cả những người mang marker này đều mắc bệnh VCSDK. Các
nhà khoa học cịn nghi ngờ có một số marker khác như HLA-B60, HLA-DR1 cùng
với các yếu tố môi trường (ví dụ nhiễm khuẩn) có vai trị kích hoạt VCSDK.
1.3.

Dịch tể
Tỉ lệ mắc VCSDK chiếm khoảng 1-1,4% dân số. theo thống kê tại nhiều

nước, tỉ lệ theo tuổi và gới của VCSDK là 0,4-14/100000 người / năm. Tỉ lệ
VCSDK tăng lên khoảng 5% trong số bệnh nhân có HLA-B27 dương tính. VCSDK


gặp nhiều hơn ở nam giới (nam gấp 2-3 lần nữ). VCSDK thông thường phát bệnh ở
người cao tuổi. Cụ thể, tỉ lệ VCSDK bắt đầu tăng cao vọt từ độ tuổi 20-30. Khoảng
80% bệnh nhân có triệu chứng ở độ tuổi trên 30 và chỉ 5% có triệu chứng ở độ tuổi
dưới 45, do đó các triệu chứng ban đầu của VCSDK thường không rõ ràng và dễ

nhầm lẫn với các bệnh lí khác, dễ bị bỏ qua. Thời gian dài khi các triệu chứng đã
biểu hiện rõ ràng thì khả năng điều trị và phục hồi thấp hơn, để lại nhiều di chứng về
sức khoẻ.
1.4.

Triệu chứng
không phải là bệnh quá hiếm gặp, việc chẩn đoán bệnh dễ bỏ sót hoặc chẩn

đốn muộn do nhiều lý do chủ quan lẫn khách quan như:
-

Bệnh nhân không đi khám bệnh, cố chịu đựng hoặc tự mua thuốc giảm đau

uống.
-

Bác sĩ chẩn đoán nhầm với các bệnh lý cột sống thường gặp khác như thoát

vị đĩa đệm, thoái hoá cột sống thắt lưng…
-

Các biểu hiện bệnh khơng đặc trưng, gây khó khăn cho chẩn đốn, đặc biệt là

các trường hợp chỉ có các biểu hiện ngoại biên.
Việc chẩn đoán và điều trị sớm sẽ giúp bệnh nhân tránh khỏi nguy cơ tàn phế,
trở thành gánh nặng cho bản thân, gia đình và xã hội.
1.5.

Biến chứng
Bệnh nhân VCSDK nếu không điều trị sớm sẽ dẫn đến biến chứng dính khớp

cột sống và các khớp ngoại biên. Dính khớp cột sống gây ra gù. Dính khớp háng,
khớp gối gây khó khan cho việc đi lại. Dính khớp xương ức với các sụn sườn gây
cứng lồng ngực làm giảm dung tích và chức năng của phổi.
Bệnh VCSDK làm tăng mất khống xương, do đó bệnh nhân thường dễ bị
loãng xương và tang nguy cơ gãy xương bệnh lý. Gãy xẹp hoặc gãy lún đốt sống là
một trong những gãy xương bệnh lí thường gặp nhất ở bệnh nhân VCSDK, góp phân
làm nặng thêm tình trạng gù và biến dạng cột sống.
1.6.

HLA-B27 và cơ chế gây bệnh


VCSDK là tình trạng bệnh lý viêm tại các vị trí đốt sống và dính lại với nhau
khiến các khớp xương kém linh động, lâu ngày các đốt sống này dính lại với nhau
khiến tư thế đứng gập về phía trước. Ngoài ra, xương lồng ngực bị ảnh hưởng cũng
gây khó khăn trong q trình hơ hấp. Bệnh lý viêm cột sống dính khớp thường ảnh
hưởng ở nam nhiều hơn ở nữ theo tỉ lệ 2:1 [2]. Hiện nay, bệnh lý viêm cột sống dính
khớp chưa có thuốc điều trị đặc hiệu. Phương pháp điều trị chủ yếu là giảm đau và
kháng viêm giúp giảm các triệu chứng bệnh lý, phục hồi chức năng hệ xương khớp.
Viêm cột sống dính khớp có rất nhiều dạng, phụ thuộc vào giới tính, độ tuổi, chủng
tộc. Các biến thể nucleotide trên gen kháng nguyên bạch cầu người (HLA), trong đó
chủ yếu là HLA-B27, được xem là tác động chính tới cơ chế gây bệnh VCSDK. Giả
thuyết đặt ra là kiểu gen HLA-B27 có liên quan chặt chẽ với bệnh VCSDK. Trạng
thái alen đồng hợp hay dị hợp của HLA-B27 gây ra mức độ nặng nhẹ của bệnh lý
vẫn còn nhiều tranh cãi. Nghiên cứu của Jaakkola trên dân số Phần Lan đưa ra một
kết luận: bệnh nhân mang kiểu gen HLA-B27 đồng hợp có nguy cơ bị viêm cột sống
dính khớp thể nhẹ hơn so với người mang kiểu gen dị hợp. Đồng thời, dân số mang
kiểu gen HLA-B27 có khả năng khởi phát bệnh VCSDK sớm hơn những người
không mang kiểu gen HLA-B27. Tuy nhiên, cơ chế gây bệnh của alen HLA-B27 vẫn

chưa rõ ràng. Ngồi ra, vấn đề chẩn đốn bệnh lý VCSDK gặp nhiều khó khăn do
giai đoạn sớm bệnh thường không biểu hiện triệu chứng lâm sàng rõ rang. Các triệu
chứng biểu hiện rõ khi bệnh đã tiến triển đến giai đoạn nặng; do đó, gây khó khăn
trong quá trình điều trị và phục hồi chức năng của hệ xương khớp, ảnh hưởng đời
sống sinh hoạt của bệnh nhân. Chính vì vậy, xét nghiệm phát hiện kiểu gen HLAB27 có thể giúp bác sĩ có thêm thơng tin kết luận bệnh viêm cột sống dính khớp mà
khơng phải các bệnh lí viêm khác; với đối tượng bệnh nhân nghi ngờ viêm cột sống
dính khớp có thể kiểm tra kiểu gen HLA-B27 để kịp thời đưa ra phương pháp điều
trị, tránh tình trạng bệnh lý chuyển biến nặng, gây ra các biến chứng nghiêm trọng.
HLA-B27 nằm trên nhiễm sắc thể 6 và có hơn 105 subtypes khác nhau và
đang ngày càng được khám phá thêm [3]. Trong đó, subtype B2702 đến B2705 là có


liên hệ tới bệnh lí VCSDK. Phần lớn các subtype HLA-B27 chỉ khác nhau tại một
vài vị trí amino acid. Kiểu gen HLA-B27 phân bố phụ thuộc vào chủng tộc người
trên thế giới. Theo ghi nhận ở bệnh nhân VCSDK, kiểu gen B2705 có ở người Da
trắng (86%-90%) trong khi đó kiểu gen B2704 hầu như khơng xuất hiện. Ngược lại,
ở người châu Á thì kiểu gen B2704 lại chiếm phần lớn bệnh nhân VCSDK (62%94%) và kiểu gen B2705 hầu như rất ít (2-6%) [4]. Kiểu gen B2706 và B2709 chủ
yếu thấy ở người bình thường và khơng liên quan tới VCSDK [4].
1.7.

Phương pháp phát hiện kiểu gen HLA-B27

1.7.1. Phương pháp giải trình tự
Phương pháp giải trình tự là phương pháp giúp ta quan sát thứ tự các
nucleotide trong trình tự DNA quan tâm một cách trực quan thơng qua các sóng
trình tự được đọc bởi phần mềm. Phương pháp được phát triển từ những năm 1977,
và có nhiều đóng góp lớn trong sự phát triển sinh học, cũng như y học, giúp chẩn
đốn nhiều loại bệnh, có khả năng phát hiện nhiều loại đột biến về cấu trúc gen như
đột biến điểm, thay thế, đột biến thêm, mất và đảo đoạn, thêm, mất nucleotide.
Có nhiều phương pháp giải trình tự khác nhau như phương pháp hóa học của

Maxam và Gilbert (1977), phương pháp dideoxynucleotide (phương pháp Sanger –
1977), giải trình tự tự động của Lerooy Hood (1986) và các phương pháp giải trình
tự thế hệ mới.
Ưu điểm:


Độ đặc hiệu và độ nhạy cao.



Khảo sát được nhiều loại đột biến.



Phân biệt được thể đồng hợp, dị hợp.

Nhược điểm:


Chi phí cao



Tốn nhiều thời gian, do quy trình có nhiều bước.

1.7.2. Phương pháp dòng chảy tế bào


Ngun lí: Phương pháp dịng chảy tế bào dựa vào ngun lí phát hiện sự có
mặt của kháng ngun HLA-B27 thông qua sự bắt cặp đặc hiệu với một kháng thể

đơn dịng kháng với kháng ngun HLA-B27 và có gắn kèm phân tử phát huỳnh
quang. Các mẫu máu của bệnh nhân sau khi được nhuộm trực tiếp với kháng thể đặc
hiệu sẽ được xử lí với dung dịch li giải hồng cầu. Mẫu sau khi xử lí được rửa nhiều
lần và cố định trước khi phân tích dịng chảy tế bào. Những tế bào nào có trình diện
kháng ngun HLA-B27 trên bề mặt sẽ được phát hiện khi tế bào đó đi ngang qua
cổng ánh sáng của máy phân tích nhờ vào tín hiệu huỳnh quang phát ra do kháng thể
đơn dịng đặc hiệu bám vào.
Ưu điểm:
-

Xác định chính xác sự hiện diện kháng nguyên HLA-B27 trên bề mặt tế bào.

Nhược điểm:
-

Mẫu máu cần phải được xử lí ngay sau khi thu nhận.

-

Quá trình chạy tốn kém nếu với số lượng mẫu quá ít.

1.7.3. Phương pháp Real – time PCR
1.7.3.1.

Nguyên lí hoạt động

Real-time PCR là kĩ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích được hiển
thị ngay sau mỗi chu kì nhiệt của phản ứng, dựa vào sự tương quan giữa tín hiệu
huỳnh quang và số lượng bản sao DNA.
Kết quả của phản ứng Realtime PCR được thể hiện qua mỗi chu kì nhiệt. Mỗi

phản ứng cho một kết quả thể hiện bằng một biểu đồ như hình 1.4.
Biểu đồ biểu diễn khuếch đại có trục hồnh (X) thể hiện số chu kì nhiệt, trục
tung (Y) thể hiện cường độ huỳnh quang. Cường độ huỳnh quang của mỗi sản phẩm
tỉ lệ thuận với lượng sản phẩm khuếch đại trong ống phản ứng.


Hình 1.1: Biểu đồ đường biểu diễn khuếch đại của phản ứng Realtime PCR.
Biểu đồ khuếch đại gồm ba giai đoạn.


Giai đoạn đầu tiên còn được gọi là giai đoạn ủ. Trong giai đoạn này,

các trình tự đích vẫn được nhân lên gấp đơi sau mỗi chu kì, nhưng tổng tín hiệu
huỳnh quang khơng đủ để máy phát hiện và ghi nhận, nên giai đoạn này cường độ
huỳnh quang xem là như nhau và biểu diễn bằng một đường nằm ngang.


Đến một thời điểm xác định, khi sản phẩm khuếch đại tăng đủ nhiều,

tổng tín hiệu huỳnh quang phát ra đủ để máy ghi nhận, đường biểu diễn bắt đầu đi
lên. Kể từ thời điểm này, cứ sau mỗi chu kì sản phẩm lại tăng gấp đơi, do đó đường
biểu diễn sẽ có dạng của hàm mũ. Giai đoạn này gọi là giai đoạn lũy thừa.


Sau đó, theo thời gian sản phẩm tạo ra càng ngày càng nhiều, hóa chất

phản ứng càng ngày càng cạn kiệt, hoạt tính enzyme cũng giảm dần. Vì vậy, điều
kiện phản ứng khơng cịn tối ưu như lúc đầu, thậm chí ức chế phản ứng, nên sản
phẩm tạo ra không đạt gấp đôi sau mỗi chu kì như lý thuyết, kết quả đường biểu
diễn sẽ đi ngang. Giai đoạn này gọi là giai đoạn bình nguyên.

Thơng thường sau một số chu kì đầu, máy Realtime PCR sẽ tự động ghi nhận
và lấy giá trị trung bình của các cường độ huỳnh quang này làm cường độ huỳnh
quang nền. Đường thẳng cắt ngang cường độ huỳnh quang nền gọi là đường nền.
Một thông số quan trọng trong phản ứng Realtime là chu kì ngưỡng Ct (threshold
cycle). Ct là giá trị chu kì nhiệt mà tại đó tín hiệu cường độ huỳnh quang của sản
phẩm vượt quá đường nền. Nếu số lượng trình tự đích trong phản ứng nhiều thì số
lần khuếch đại (số chu kì nhiệt) để đạt đến ngưỡng phát hiện tín hiệu cường độ
huỳnh quang của máy sẽ thấp hơn so với số lượng ít. Do đó, Ct sẽ thấp khi số lượng
trình tự mục tiêu ban đầu nhiều. Như vậy, giá trị Ct tỷ lệ nghịch với số lượng trình
tự đích.
1.7.3.2.

Chất phát huỳnh quang

Có nhiều chất phát huỳnh quang khác nhau được sử dụng trong phản ứng
Realtime PCR như màu huỳnh quang chèn như SYBR, hoặc đoạn dị đặc hiệu cho
trình tự đích như Beacon, Taqman. Trong nghiên cứu này sử dụng chất chèn huỳnh
quann SYBR.
Nguyên tắc
Màu huỳnh quang chèn vào sợi đôi DNA là một loại màu huỳnh quang có ái
lực rất cao khi có sự hiện diện của sợi đơi DNA và ái lực này là do khả năng chèn
của màu vào giữa sợi đôi DNA và làm cho sợi đôi DNA phát được ánh sáng huỳnh
quang khi nhận được nguồn sáng kích thích.
Nguyên tắc của kỹ thuật này là khi khơng có sự hiện diện sản phẩm khuếch
đại của PCR, chất huỳnh quang bị phân tán trong dung dịch PCR mix, do vậy mà
tube phản ứng sẽ không bị phát huỳnh quang hay chỉ phát huỳnh quang không đáng
kể khi bị chiếu bởi nguồn sáng kích thích. Nhưng khi có sự hiện diện của sản phẩm
khuếch đại của PCR thì màu huỳnh quang sẽ bị chèn vào và tập trung trên các sợi

đôi DNA của sản phầm khuếch đại và làm cho tube phản ứng bị phát huỳnh quan
khi bị chiếu bởi nguồn sáng kích thích.


Ethidium bromide được sử dụng cho nguyên tắc real-time PCR này, nhưng
sau này, một hợp chất có nhiều tính năng ưu việt và thân thiện hơn là SYBR I được
khám phá. SYBR I mang nhiều ưu điểm vượt trội như màu huỳnh quang nền rất
thấp, khả năng chèn vào sợi đôi cao nhưng không làm cho sợi đôi bị gắn chặt vào
nhau khi bị biến tính nhờ vậy mà ảnh hưởng ít lên hiệu quả PCR. Phổ quang học của
SYBR có bước sóng là 488 nm cho nguồn sáng khích thích và bước sóng phát ra là
522 nm.
Ưu điểm:


Độ đặc hiệu và độ nhạy cao.



Nhanh



Phát hiện được các đột biến điểm

Kĩ thuật Real-Time PCR sử dụng để phát hiện kiểu gen HLA-B27 đã được áp
dụng tương đối rộng rãi trên thế giới. Ở nước ta hiện nay, kĩ thuật phát hiện kiểu gen
HLA-B27 vẫn chưa được phổ biến rộng rãi.
1.7.3.3.

Chương trình phân tích nhiệt độ chảy.

Vì SYBR I là màu chèn cho bất cứ sợi đôi DNA nào xuất hiện trong ống
phản ứng sau các chu kỳ nhiệt kể cả các sợi đôi DNA không phải khuếch đại đặc
hiệu từ DNA đích, do vậy sự xuất hiện đường biểu diễn khuếch đại trong ống phản
ứng sẽ không đặc hiệu 100% cho sự có mặt của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ
DNA đích. Như vậy thì trong ống phản ứng, sản phẩm khuếch đại nào thường có thể
xuất hiện mà không phải là sản phẩm khuếch đại từ các dimer primer, thường xảy ra
vào các giai đoạn cuối của các chu kì nhiệt, khi mà enzyme Taq polymerase hoạt
động khơng còn hiệu quả và đặc hiệu nữa. Dimer primer là sự bắt cặp lẫn nhau giữa
mồi do có những vị trí trên trình tự mồi mang những base bổ sung được với nhau.
Tuy nhiên trong các chu kỳ đầu thì khi mà enzyme polymerase cịn hoạt động hiệu
quả thì sẽ không tạo được sản phẩm khuếch đại đặc hiệu do sự kéo dài của hai mồi
khi chúng bắt cặp lẫn nhau chỉ vài vị trí nucleotide mà khơng bắt cặp được ở đầu 3’.


Tuy nhiên trong các giai đoạn cuối của PCR, enzyme polymerase đã trở nên hoạt
động kém hữu hiệu nên nó vẫn có thể kéo dài được các mồi khi chúng bắt cặp lẫn
nhau dù ở đầu 3’ của mồi vẫn khơng có bắt cặp đặc hiệu với nhau, chính vì vậy nên
mới tạo được các sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu từ các dimer primer.
Sản phẩm khuếch đại từ dimer primer sẽ khác biệt với sản phẩm khuếch đại
từ DNA đích chính là ở chiều dài, nếu từ dimer primer thì chiều dài sẽ khơng bao
giờ vượt q 50-55 bps, cịn nếu từ DNA đích thì chiều dài thường quá 100bp. Như
vậy, để có thể phân biệt được đường biểu diễn khuếch đại của ống phản ứng là của
sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ bản DNA đích hay từ dimer primer, phải dựa vào
một tính chất đặc trưng giúp phân biệt được chiều dài của hai loại sản phẩm khuếch
đại này, và tính chất đặc trừng đó chính là nhiệt độ nóng chảy (melting T, Tm) là
nhiệt độ làm cho sợ đồi DNA bị biến tính 50% tức là có 50% số sợi đơi bị biến tính
hồn tồn. Nhiệt độ chảy của sợi đôi DNA tuỳ thuộc vào thành phần GC và chiều
dài của nó: Thành phần GC càng cao thì Tm càng cao, sợi đơi càng dài thì Tn càng
cao. Sản phẩm khuếch đại từ DNA đích dài hơn nên sẽ có Tm cao hơn là Tm của

sản phẩm khuếch đại từ dimer primer. Để biết được Tm của sản phẩm khuếch đại có
trong ống phản ứng, sau khi hoàn tất các chu kỳ luân nhiệt của realtime PCR, cần
tiếp tục phân tíchcho máy chạy thêm một chương trình phân tích nhiệt độ chảy, gọi
là chương trình melt-curve. Tuỳ thuộc vào từng loại máy realtime PCR mà sử dụng
chương trình cài sẵn trong máy, hay là tự tạo chương trình melt curve mà mình thấy
thích hợp hơn. Phân tích sự thay đổi trên biểu đồ chảy, cường độ huỳnh quang trong
ống phản ứng thay đổi với cường độ huỳnh quang phát ra sẽ giảm dần theo các bước
tăng nhiệt độ trong buồng ủ nhiệt, lý do là các sản phẩm khuếch đại có trong ống
phản ứng sẽ bị biến tính dần theo sự gia tăng nhiệt độ trong buồng ủ nhiệt. đến một
bước tăng nhiệt độ mà ở đó trùng khớp với Tm của sản phẩm khuếch đại trong ống
phản ứng thì cường độ huỳnh quang sẽ giảm đột ngột vì có đến 50% sản phẩm
khuếch đại này bị biến tính thành sợi đơn cùng lúc, do vậy ở bước nhiệt độ này
chúng ta sẽ thấy đường biểu diễn cường độ huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng


khơng cịn là một đường thẳng đi xuống đều như trước mà bị lao dốc xuống thấp
hơn nhiều so với độ dốc của nó. Nhờ vậy mà người làm thí nghiệm khi quan sát diễn
tiến của quá trình vẽ realtime biểu đồ chảy, sẽ hồn tồn có thể xác định được Tm
của sản phẩm khuếch đại có trong ống phản ứng.
Có nhiều kỹ thuật sinh học phân tử nhằm xác định kiểu gen HLA-B27. Thơng
thường, kiểu gen HLA-B27 có thể phát hiện bằng phương pháp giải trình tự vùng
gen exon 2 và 3 của gen HLAB, tuy nhiên phương pháp này địi hỏi nhiều thao tác,
đắt tiền, khơng thích hợp làm xét nghiệm nhanh. Phương pháp PCR với các cặp mồi
đặc hiệu cho kiểu gen HLA-B27 có thể phát hiện nhanh kết quả, nhưng sản phẩm
PCR cần được tiến hành điện di trên gel agarose để đọc kết quả, do đó nguy cơ
ngoại nhiễm tăng và địi hỏi nhiều bước thí nghiệm. Ngồi ra, một số phương pháp
cho phép đọc kết quả trực tiếp từ quá trình phản ứng (realtime PCR) như sử dụng
các đoạn do Taqman probe giúp xác định hiệu quả kiểu gen HLA-B27; tuy nhiên, giá
thành cho đoạn dò cao. Thuốc nhuộm SYBR Green là một giải pháp thay thế hiệu
quả cho các đoạn do probe, giá thành cũng tương đối hợp lý. Hiện trên thế giới cũng

có nhiều hãng sản xuất kit phát hiện kiểu gen HLA-B27 sử dụng thuốc nhuộm SYBR
Green. Tuy nhiên, giá thành cho các bộ kít này khá cao, chưa phù hợp với điều kiện
kinh tế hiện nay tại Việt Nam. Do đó, chúng tơi thiết lập một quy trình phát hiện
kiểu gen HLA-B27 bằng phản ứng realtime PCR sử dụng thuốc nhuộm SYBR
Green. Việc phát triển bộ kít mới sẽ giúp giảm giá thành xét nghiệm cũng như chủ
động hơn trong việc chuẩn bị kit để làm xét nghiệm. Chính vì vậy, chúng tơi thiết
lập quy trình realtime PCR nhằm phát hiện kiểu gen HLA-B27 ở bệnh nhân viêm cột
sống dính khớp tại Việt Nam.


CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu

2.1

Nghiên cứu này được thực hiện trên mẫu DNA của bệnh nhân được chẩn
đốn nghi ngờ viêm cột sống dính khớp. Kết quả kiểu gen HLA-B27 các mẫu DNA
được phát hiện bằng bằng bộ kít PG 27 Detection kit (Pharmigen, Đài Loan); bộ kít
được thương mại hố trên thế giới và có chứng nhận áp dụng trong chẩn đốn.
Chúng tơi chọn ra 10 mẫu DNA âm tính HLA-B27 và 10 mẫu dương tính HLA-B27.
Mẫu DNA được bảo quản tại -30oC
2.2.

Vật liệu nghiên cứu

2.2.1. Thiết bị - Dụng cụ


Máy ly tâm thường (Eppendorf, Đức).



Máy PCR (Mastercycler® vapo protect, Eppendorf, Đức)



Máy spin (Hanil, Đức)



Máy vortex (Heidolph, Đức).



Máy Real time AG 22331 Hamburg (Erpendorf, Đức).



Tủ ATSH cấp II (ESCO Labculture®, Hoa Kì).



Cân điện tử (Sartorius, Hoa Kì); lị vi sóng (SANYO, Nhật)



Máy điện di (ADVANCE, Mupid®-exU System, Đức)



Máy đọc gel UV (UVP, GelDoc-It® 310, Hoa Kì).



Tủ mát 4oC và tủ đơng -30oC, -80oC (SANYO, Nhật).



Vật liệu tiêu hao.

2.2.2. Hóa chất
-

Kit PCR TaKaRa®Taq HS (Takara, Nhật)
 TaKaRa HS Taq (5 units/µl).
 10X PCR buffer.


 100mM Tris-HCl (pH8.3)
 500mM KCl
 15mM MgCl2
 Thành phần dNTP
 2,5mM cho mỗi loại dNTP
 Hòa tan trong nước có pH 7-9.
-

Kit SYBR® Green Premix Ex Taq TM (Takara, Nhật)

-

Nước PCR (MiliQ), dung dịch EDTA 0.5 pH = 8 (Merck, Đức).
2.2.2.1.

2.3.

Điện di



Dung dịch 5X TBE



Tris (Merck, USA): 54g



Acid boric (Merck, USA): 27.5g



0.5M EDTA pH8: 20ml



Nước: thêm đủ 1000 ml (từ dung dịch 5X pha thành 0.5X)



Dung dịch nạp mẫu 6X (Thermo Scientific, Hoa Kì).



Agarose dạng bột (Promega, Hoa Kì).



GelRed Dye (Thẻmo Scientific, Hoa Kì).



Thang DNA 1kbplus (0.5 µg/µL) (Thermo Scientific, Hoa Kì).

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Thiết kế mồi
Mồi được thiết kế nhận diện vị trí xác định kiểu gen HLA-B27 trên vùng exon
2 và 3 của gen HLA-B. Các vị trí này được rất nhiều bài báo trên thế giới sử dụng để
thiết kế phản ứng nhận diện kiểu gen HLA-B27 [10,11]. Gen chứng nội được chúng
tôi sử dụng là gen G6PD (NG_009015). Phản ứng multiplex PCR gồm 2 cặp mồi:


cặp mồi gen chứng nội G6PD và cặp mồi nhận diện kiểu gen HLA-B27. Tên và trình
tự các cặp mồi được liệt kê chi tiết trong (bảng 2.1).
Bảng 2.1. Trình tự mồi phát hiện kiểu gen HLA-B27 và gen chứng nội.
Kích thước PCR

Tên mồi

Trình tự (5’-3’)

B27a

GTGGGCTACGTGGACGACACGCT

B27b

GTCAGTCTGTGCCTTGGCCTTGC

AN-G6PD-F

CATCTTCCACCAGCAGTGCAAGC

AN-G6PD-R

CCACACTGCTCCTTCTCTGTAGG

(bp)
150

178

2.3.2. Phản ứng multiplex PCR
Thành phần của phản ứng multiplex PCR gồm cặp mồi phát hiện kiểu gen HLA-B27
và cặp mồi chứng nội. Phản ứng PCR với tổng thể tích 15µl gồm các thành phần
(bảng 2.2).
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng multiplex PCR
Thành phần

Thể tích (µl)

Nồng độ phản ứng

10X buffer PCR

1.5

1X

dNTPs 250nm

1.2

20 nM

Primer B27a (10µM)

0.375

250 nM

Primer B27b (10µM)

0,375

250 nM

Primer AN-G6PD-F (10µM)

0,75

500 nM

Primer AN-G6PD-R (10µM)

0,75

500 nM

Taq Takara HS

0,1

DNA

1,5

50-100 ng

H2 O

8,45

Vừa đủ 15 µl

Chu trình ln nhiệt cho PCR được thực hiện trên máy Mastercycler@Pro S
(Eppendorf, Đức). Chu kì nhiệt: khởi đầu tại 98oC trong 3 phút; tiếp theo với 40 chu


kì lặp lại các bước 98oC: 10 giây, nhiệt độ lai tương ứng là: 58 oC, 60 oC, và 62oC

trong 30 giây, 72oC trong 30 giây; tiếp theo với bước nhiệt 72oC trong 3 phút. Sản
phẩm được giữ ở 4oC sau khi chương trình PCR kết thúc. Kiểm tra sản phẩm PCR
bằng điện di trên thạch agarose 2% có thuốc nhuộm GelRed và quan sát với hệ
thống chụp ảnh điện di GelDoc-ItTM (UVP, Mỹ).
2.3.3. Qui trình multiplex realtime SYBR Green PCR
Thành phần của phản ứng được thực hiện trong bảng (2.3).
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng multiplex realtime SYBR Green PCR
Thành phần

Thể tích (µl)

Nồng độ phản ứng

SYBR Green 2X

7,5

1X

Primer B27a (10µM)

0,2

133 nM

Primer B27b (10µM)

0,2

133 nM

Primer AN-G6PD-F (10µM)

0,4

267 nM

Primer AN-G6PD-R (10µM)

0,4

267 nM

DNA

1,5

50-100 ng

H2 O

4,8

Vừa đủ 15ul

Chu trình luân nhiệt và đọc tín hiệu huỳnh quang được thực hiện trong hệ
thống máy Mastercycler epgradients realplex (Eppendorf, Đức). Chu kì nhiệt: khởi
đầu tại 95oC trong 1 phút; tiếp theo với 35 chu kì lặp lại các bước: 95oC trong 15
giây, 60oC trong 30 giây, ghi nhận tín hiệu huỳnh quang ngay sau bước này. Nhiệt
độ melting curve: 98oC trong 15 giây, nhiệt độ từ 65oC trong 15 giây sau tăng dần

lên 98oC trong vòng 20 phút. Cuối cùng là bước 98oC trong 15 giây.
2.4.

Thời gian và địa điểm thực hiện nghiên cứu
Thời gian thực hiện nghiên cứu từ tháng 6/2016 đến tháng 6/2017.
Địa điểm thực hiện nghiên cứu: Trung tâm Y Sinh học Phân tử - ĐH Y Dược

Tp. Hồ Chí Minh, 217 Hồng Bàng, P11, Q5, Tp. Hồ Chí Minh.


CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1.

Kết quả thiết kế mồi
Cặp mồi được chúng tôi thiết kế bằng phần mềm CLC Main Workbench 5.5;

vị trí nucleotide thay đổi quy định kiểu gen HLA-B27. Cặp mồi của chúng tôi được
thiết kế và chỉnh sửa một số vị trí nucleotide quy định kiểu gen HLA-B27, đặc biệt là
tại vị trí c.167A>T tương ứng với đầu 3’ của mồi xi B27a và vị trí c.272A>G
tương ứng với vị trí đầu 3’ của mồi ngược B27b; kích thước khuếch đại là 150bp.
Do có sự khác biệt về nucleotide tại đầu 3’ của mỗi mồi nên khi mẫu DNA khơng
thuộc kiểu gen HLA-B27 thì sẽ khơng xuất hiện sản phẩm PCR. Các vị trí nucleotide
trên cũng được nhiều công bố trên thế giới sử dụng là điểm thiết kế mồi phát hiện
kiểu gen này [10,11]. Ngoài ra, để nâng cao độ tin cậy của phản ứng PCR, chúng tôi
thiết kế thêm cặp mồi AN-G6PD-F/R làm chứng nội chạy trong cùng 1 phản ứng;
kích thước khuếch đại là 178bp.
3.2.

Kết quả multiplex PCR
Phản ứng multiplex PCR đồng thời cặp mồi phát hiện kiểu gen HLA-B27 và

cặp mồi cho gen G6PD làm chứng nội trên mẫu DNA dương tính HLA-B27. Kết quả
từ hình 1 cho thấy, tại giếng chứng âm (giếng 5) không xuất hiện sản phẩm, phản
ứng PCR không bị nhiễm. Các giếng 1,2 và 3 lần lượt đại diện cho các mức nhiệt độ
lai là 58, 60 và 62oC với mẫu DNA dương tính với HLA-B27. Kết quả hình điện di
cho thấy, tại nhiệt độ 58oC (giếng 1) và 60oC (giếng 2) đều xuất hiện đồng thời 2
vạch gồm chứng nội (kích thước 178bp) và alen HLA-B27 (kích thước 150 bp) đúng
với kích thước quan tâm. Cịn tại nhiệt độ 62oC (giếng 3), chỉ xuất hiện duy nhất
vạch gen chứng nội. Nhiệt độ lai 60oC (giếng 2) cho sản phẩm thể hiện vạch sáng rõ
và đều giữa 2 vạch; do đó, nhiệt độ lai này là điều kiện thích hợp nhất cho phản ứng
multiplex PCR. Chúng tơi lựa chọn nhiệt độ lai 60oC cho mẫu DNA không mang
kiểu gen HLA-B27 (giếng 4); kết quả là chỉ xuất hiện duy nhất vạch gen chứng nội.
Chứng tỏ, cặp mồi được chúng tôi thiết kế đã hoạt động hiệu quả, có khả năng nhận
diện được chính xác kiểu gen HLA-B27.


L

1

2

3

4

5

300
200

75

Hình 3.1. Kết quả điện di multiplex PCR
Giếng L: thang chuẩn; giếng 1: nhiệt độ lai 58oC; giếng 2: nhiệt độ lai 60oC;
giếng 3: nhiệt độ lai 62oC; giếng 4: mẫu DNA âm HLA-B27; giếng 5: mẫu âm H2O.
Ngoài ra, nồng độ mồi tham gia trong phản ứng đóng vai trò quan trọng.
Nồng độ mồi giữa gen chứng nội G6PD và alen HLA-B27 có thể ảnh hưởng lẫn
nhau và ảnh hưởng tới kết quả PCR. Hiệu chỉnh nồng độ mồi dựa vào độ sáng của
vạch điện di và 2 vạch sản phẩm phải có độ đậm nhạt tương đương nhau. Tránh
trường hợp chiều hướng phản ứng nghiêng về khuếch đại gen chứng nội, làm ức chế
phản ứng của cặp mồi phát hiện kiểu gen HLA-B27, xuất hiện âm tính giả. Sau nhiều
kết quả điều chỉnh nồng độ mồi (khơng trình bày dữ liệu) chúng tôi đưa ra được
nồng độ cặp mồi AN-G6PD-F/R cao hơn 2 lần nồng độ cặp mồi B27a/b là thích hợp
nhất (bảng 2.2).
3.3.

Kết quả realtime PCR
Phản ứng multiplex realtime PCR sử dụng SYBR Green là thuốc nhuộm, kết

quả realtime PCR phải phân tích thơng qua đường cong nóng chảy của sản phẩm


khuếch đại (melting curve). Về nguyên tắc, nhiệt độ điểm chảy phụ thuộc vào chiều
dài sản phẩm khuếch đại và thành phần % GC trong chuỗi trình tự được khuếch đại.
87,1oC 88,8oC

Hình 3.2. Điểm chảy mẫu DNA dương tính HLA-B27
87,1oC

Hình 3.3. Điểm chảy mẫu DNA âm tính HLA-B27
Phân tích biểu đồ đường cong nóng chảy cho thấy, đối với phản ứng sử dụng
DNA dương tính HLA-B27 (hình 3.2), cặp mồi B27a/b cho sản phẩm khuếch đại có
kích thước là 150 bp và thành phần %GC trong trình tự khuếch đại là 65,3%; tương
đương với điểm nóng chảy là 88,8oC. Cặp mồi AN-G6PD-F/R cho sản phẩm khuếch
đại có kích thước là 178 bp và thành phần %GC trong trình tự khuếch đại là 58,4%;
tương đương có điểm nóng chạy tại 87,1oC. Kết quả phân tích đường cong chảy xuất
hiện 2 đỉnh sóng tương ứng với 2 điểm nhiệt độ tương ứng. Tuy 2 điểm nóng chảy


gần nhau (chênh lệch khoảng 2oC), kết quả hình đường cong chảy vẫn cho 2 đỉnh
sóng rõ ràng. Do chiến lược thiết kế mồi chưa thật chặt chẽ, các cặp mồi chứng nội
và alen B27 được thiết kế cho kích thước sản phẩm khuếch đại gần bằng nhau (150
bp và 178 bp) dẫn tới kết quả 2 điểm nóng chảy gần nhau, gây khó khăn trong phân
tích kết quả. Trong những nghiên cứu tiếp theo, cần chú ý vấn đề chiều dài đoạn
khuếch đại để các đỉnh sóng tách biệt nhau rõ hơn. Kết luận, cặp mồi chứng nội và
alen HLA-B27 đồng thời hoạt động tốt.
87,1oC 88,8oC

Hình 3.4 . Các mẫu DNA dương tính HLA-B27
87,1oC

Hình 3.5. Các mẫu DNA âm tính HLA-B27


Tương tự, đối với mẫu sử dụng DNA âm tính với kiểu gen HLA-B27 (hình
3.3). Kết quả chỉ xuất hiện duy nhất 1 đỉnh chảy duy nhất tại 87,1oC ứng với sản
phẩm khuếch đại từ cặp mồi chứng nội. Kết luận, cặp mồi chứng nội hoạt động tốt,
cặp mồi B27a/b khơng bắt nhầm vào vị trí khác trong bộ gen người và phân biệt
được chính xác kiểu gen HLA-B27.

Khi thực hiện chạy đồng thời 10 mẫu DNA được xác định kiểu gen HLA-B27
dương tính bằng bộ kít PG27 (Pharmigene, Đài Loan), kết quả phân tích đường cong
nóng chảy cho kết quả gồm nhiều đỉnh sóng khác nhau chồng lên nhau tại nhiệt độ
88,8oC và 87,1oC (hình 3.4). Ngược lại, 10 mẫu DNA âm tính về kiểu gen HLA-B27
thì các đỉnh sóng sẽ hội tụ tại một đỉnh duy nhất tại nhiệt độ 87,1oC (hình 3.5). Do
đó, kiểu gen HLA-B27 được xác định bằng phương pháp multiplex realtime PCR
SYBR Green và bộ kít PG27 (Pharmigene, Đài Loan) cho kết quả tương đồng 100%
Phản ứng realtime PCR của chúng tôi thiết kế dưới dạng multiplex kết hợp
mồi chứng nội và mồi phát hiện kiểu gen HLA-B27, điều đó giúp tránh trường hợp
âm tính giả do thao tác kỹ thuật hoặc chất lượng hoá chất sử dụng trong phản ứng,
tiết kiệm được chi phí hố chất.