Phân lập và xác định đặc tính sinh học của vi nấm chịu axit mạnh phân lập tại việt nam

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề tài: “Phân lập và xác định đặc tính sinh học của vi nấm
chịu axit mạnh phân lập tại Việt Nam” do PGS.TS. Vũ Nguyên Thành và PGS. TS
Bùi Thị Việt Hà hướng dẫn là cơng trình nghiên cứu của bản thân tơi và một số kết
quả cộng tác với các học viên khác.
Các kết quả công bố trong luận văn là trung thực, chính xác và tơi xin chịu
trách nhiệm hồn tồn về các số liệu, nội dung đã trình bày trong luận văn.
Hà Nội, ngày 15 tháng 12 năm 2020
Học viên

Lã Thị Mỹ Hạnh


Luận văn thạc sĩ

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS. Vũ Nguyên Thành, Giám đốc
Trung tâm Vi sinh vật công nghiệp, Viện Công nghiệp thực phẩm và PGS.TS. Bùi
Thị Việt Hà, Giảng viên trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN, những
thầy cô đã tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành luận văn này.
Tơi cũng xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình và trách nhiệm của tập
thể cán bộ Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp, Viện Cơng nghiệp Thực phẩm.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới các thầy cô giáo trường Đại học Khoa học Tự
nhiên- ĐHQGHN, những người đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt hai năm
học.
Cuối cùng, tôi xin được cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã ln động
viên, hỗ trợ để tơi có thể hồn thành quá trình học tập và nghiên cứu.
Kết quả của luận văn được sự hỗ trợ của đề tài “Khai thác ứng dụng nguồn
gen vi sinh vật bản địa phân hủy lignocellulose trong xử lý chất thải của nhà máy
sản xuất cồn sinh học, NVQG2020/ ĐT.01”.

Hà Nội, ngày 15 tháng 12 năm
2020
Học viên

Lã Thị Mỹ Hạnh

Lã Thị Mỹ Hạnh

3

K27 – Vi sinh vật học


Luận văn thạc sĩ

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................................. 2
LỜI CẢM ƠN....................................................................................................................... 3
MỤC LỤC ............................................................................................................................ 4
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................................. 6
DANH MỤC BẢNG............................................................................................................. 8
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................................... 9
MỞ ĐẦU ............................................................................................................................. 10
CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 12
1.1. Vi nấm chịu axit .................................................................................................................. 12
1.1.1. Đặc điểm nhóm vi nấm chịu axit ................................................................................................. 13
1.1.2. Ứng dụng của nhóm vi nấm chịu axit mạnh ................................................................................ 15
1.1.3. Một số nhóm vi nấm chịu axit phổ biến ...................................................................................... 17
1.1.4. Tình hình nghiên cứu vi nấm chịu axit trong nước ...................................................................... 21

1.2. Lignocellulose và enzyme thủy phân lignocellulose......................................................... 22
1.2.1. Giới thiệu lignocellulose.............................................................................................................. 22
1.2.2. Enzyme thủy phân lignocellulose ................................................................................................ 27

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ......................................................................................................... 31
2.2. Hóa chất và thiết bị ............................................................................................................ 31
2.2.1. Hóa chất ....................................................................................................................................... 31
2.2.2. Thiết bị và dụng cụ ...................................................................................................................... 32

2.3. Môi trƣờng nghiên cứu ...................................................................................................... 33
2.3.1. Môi trường PDA .......................................................................................................................... 33
2.3.2. Môi trường Malt 2Bx (pH 5.6) .................................................................................................... 33
2.3.3. Môi trường pH thấp (pH 1.0, pH 2.7) .......................................................................................... 33
2.3.4. Môi trường nuôi và tách chiết enzyme chủng mốc pH thấp ........................................................ 34

2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................................... 34
2.4.1. Phương pháp phân lập: ................................................................................................................ 34
2.4.2. Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào ............................................................................................ 34
2.4.3. Phương pháp điện di protein SDS-PAGE .................................................................................... 35
2.4.4. Phương pháp điện di Zymogram ................................................................................................. 36
2.4.5. Phương pháp tách chiết ADN tế bào vi nấm ............................................................................... 37
2.4.6. Phương pháp tinh sạch ADN ....................................................................................................... 37
2.4.7. Phương pháp phân loại nấm men dựa vào đọc trình tự rDNA..................................................... 38
2.4.8. Phương pháp điện di .................................................................................................................... 38
2.4.9. Nhuộn gel và đọc kết quả ............................................................................................................ 39
2.4.10. Nuôi cấy tách chiết enzyme ....................................................................................................... 39
2.4.11. Xác định hoạt độ enzyme bằng phương pháp DNS ................................................................... 39
2.4.12. Xác định hoạt tính enzyme ở các pH ở pH 1.0, pH 3.0 và pH 5.0 ............................................. 40
2.4.13. Đánh giá độ bền nhiệt của enzyme ............................................................................................ 45

Lã Thị Mỹ Hạnh

4

K27 – Vi sinh vật học


Luận văn thạc sĩ

2.4.14. Phương pháp xác định protein (Lowry) ..................................................................................... 45
2.4.15. Phương pháp xác định hoạt tính phân giải cellulose ................................................................. 46

Chƣơng 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................................ 48
3.1. Kết quả phân lập, phân nhóm và định tên các chủng vi nấm chịu nhiệt ...................... 48
3.1.1. Kết quả phân lập .......................................................................................................................... 48
3.1.2. Hình thái khuẩn lạc tế bào ........................................................................................................... 49
3.1.3. Phân nhóm và định tên 78 chủng nấm mốc.................................................................................. 53
3.2.1. Phân tích hàm lượng protein của các chủng vi nấm .................................................................... 57
3.2.2. Đánh giá khả năng phân giải cơ chất CMC của các chủng vi nấm .............................................. 59
3.2.3. Đánh giá khả năng phân giải cơ chất tinh bột của các chủng vi nấm .......................................... 61
3.2.4. Khảo sát khả năng sinh enzyme thủy phân lignocellulose........................................................... 63
3.2.5. Phân tích hệ protein và hệ enzyme thủy phân lignocelulose ....................................................... 69
3.2.6. Kiểm tra khả năng hoạt động enzyme ở các pH khác nhau ......................................................... 70
3.2.7. Kiểm tra khả năng bền nhiệt của enzyme bằng phương pháp DNS ............................................ 74
3.2.8. Kiểm tra khả năng bền nhiệt của enzyme bằng phương pháp điện di.......................................... 77

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................... 82
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 83
PHỤ LỤC............................................................................................................................ 90

Lã Thị Mỹ Hạnh

5

K27 – Vi sinh vật học


Luận văn thạc sĩ

DANH MỤC HÌNH
Hình 1. 1. Mơi trường axit cực mạnh. .......................................................................13
Hình 1. 2. Acidomyces acidophilus ..........................................................................19
Hình 1. 3. Acidothrix acidophila. [43] ......................................................................20
Hình 1. 4. Acidea extrema.........................................................................................21
Hình 1. 5. Cấu trúc của lignocellulose. ...................................................................22
Hình 1. 6. Cấu trúc phân tử của cellulose ...................................................................24
Hình 1. 7. Cấu trúc phân tử của CMC ........................................................................24
Hình 1. 8. Cấu trúc phân tử của Hemicellulose và Lignin...........................................27
Hình 1. 9. Cơ chế phản ứng của cellulase ................................................................29
Hình 1. 10. Cơ chế phản ứng của hemicellulase .......................................................30
Hình 2. 1. Đường chuẩn D-xylose ở pH 1.0, pH 3.0 và pH 5.0. ...............................41
Hình 2. 2. Đường chuẩn D-glucose ở pH 1.0, pH 3.0 và pH 5.0. .............................44
Hình 3. 1. Hình ảnh các mẫu phân lập ......................................................................49
Hình 3. 2. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào trên môi trường PDA (trái) và
môi trường Malt 2Bx pH 1.0 (phải) của chủng AS 173-2. (Thanh chèn 10 µm) .....50
Hình 3. 3. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào trên môi trường PDA (trái) và
môi trường Malt 2Bx pH 1.0 (phải) của chủng ASS 80-1 (Thanh chèn 10 µm) ......50
Hình 3. 4. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào trên môi trường PDA (trái) và
môi trường Malt 2Bx pH 1.0 (phải) của chủng ASS 45-1 (Thanh chèn 10 µm) ......51

Hình 3. 5. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào trên môi trường PDA (trái) và
môi trường Malt 2Bx pH 1.0 (phải) của chủng ASS 52-1 (Thanh chèn 10 µm) ......51
Hình 3. 6. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào trên mơi trường PDA (trái) và
môi trường Malt 2Bx pH 1.0 (phải) của chủng ASM147 (Thanh chèn 10 µm) .......51
Hình 3. 7. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào trên môi trường PDA (trái) và
môi trường Malt 2Bx pH 1.0 (phải) của chủng ASS 74-4 (Thanh chèn 10 µm) ......51
Hình 3. 8. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào trên môi trường PDA (trái) và
môi trường Malt 2Bx pH 1.0 (phải) của chủng ASS 46-2 (Thanh chèn 10 µm) ......52

Lã Thị Mỹ Hạnh

6

K27 – Vi sinh vật học


Luận văn thạc sĩ

Hình 3. 9. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào trên môi trường PDA (trái) và
môi trường Malt 2Bx pH 1.0 (phải) của chủng ASS 135-1 (Thanh chèn 10 µm) ....52
Hình 3. 10. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào trên mơi trường PDA (trên) và
môi trường Malt 2Bx pH 1.0 (dưới) của chủng ASS 96-1 (Thanh chèn 10 µm)......52
Hình 3. 11. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào trên mơi trường PDA (trên) và
môi trường Malt 2Bx pH 1.0 (dưới) của chủng AST 155-1 (Thanh chèn 10 µm) ...52
Hình 3. 12. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào trên môi trường PDA (trên) và
môi trường Malt 2Bx pH 1.0 (dưới) của chủng AST 175-2 (Thanh chèn 10 µm) ...53
Hình 3. 13. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào trên môi trường PDA (trái) và
môi trường Malt 2Bx pH 1.0 (phải) của chủng ASM 122 (Thanh chèn 10 µm) ......53
Hình 3. 14. Băng điện di protein fingerprinting. .......................................................54
Hình 3. 15. Cây phân loại các chủng vi nấm chịu pH thấp dựa trên trình tự ITS. ...54

Hình 3. 16. Hàm lượng protein của các chủng vi nấm phân lập được.....................58
Hình 3. 17. Vịng phân giải thể hiện khả năng thủy phân CMC. ..............................60
Hình 3. 18. Vịng phân giải thể hiện khả năng thủy phân Tinh bột ..........................62
Hình 3. 19. Đồ thị hoạt tính CMCase của các chủng vi nấm ....................................66
Hình 3. 20. Đồ thị hoạt tính Xylanase của các chủng vi nấm ...................................68
Hình 3. 21. Ảnh điện di SDS-PAGE và zymogram CMC, xylan của các chủng. ....70
Hình 3. 22. Hoạt tính CMCase một số chủng ở pH 1.0, pH 3.0, pH 5.0. .................72
Hình 3. 23. Hoạt tính xylanase một số chủng ở pH 1.0, pH 3.0, pH 5.0. .................73
Hình 3. 24. Độ bền nhiệt của xylanase của các chủng phân lập được. ....................75
Hình 3. 25. Độ bền nhiệt CMCase của các chủng phân lập được............................76
Hình 3. 26. Ảnh điện di SDS-PAGE và zymogram CMC, xylan khảo sát độ bền
nhiệt của các chủng vi nấm .......................................................................................78
Hình 3. 27. Khả năng phân giải CMC được đánh giá bằng sự tạo thành đường kính
vịng thủy phân. .........................................................................................................80

Lã Thị Mỹ Hạnh

7

K27 – Vi sinh vật học


Luận văn thạc sĩ

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. 1. Một số nhóm vi nấm chịu acid đã cơng bố trên thế giới .........................18
Bảng 1. 2. Thành phần lignocellulose trong rác thải và phế phụ liệu nông nghiệp
phổ biến ....................................................................................................................22
Bảng 1. 3. Hàm lượng cellulose trong một số nguyên liệu tự nhiên [16] .............23
Bảng 1. 4. Bảng phân loại hệ enzyme cellulase [12, 28]. ......................................28

Bảng 3. 1. Mơ tả hình thái khuẩn lạc ........................................................................49
Bảng 3. 2. Kết quả phân nhóm 85 chủng bằng fingerprinting. .................................55
Bảng 3. 3. Các chủng được sử dụng để đánh giá đặc tính ........................................59
Bảng 3. 4. Kích thước vòng phân giải CMC của enzyme vi nấm chịu pH thấp .......61
Bảng 3. 5. Kích thước vịng phân giải tinh bột của enzyme vi nấm chịu pH thấp ...63
Bảng 3. 6. Hoạt tính CMCase của các chủng vi nấm chịu pH thấp. .........................64
Bảng 3. 7. Hoạt tính xylanase của các chủng vi nấm chịu pH thấp ..........................67

Lã Thị Mỹ Hạnh

8

K27 – Vi sinh vật học


Luận văn thạc sĩ

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Bp: Base pair (cặp bazơ)
CBH: Cellobiohydrolase
CBM: Carbohydrate-binding module
CE: Carbohydrate esterase
CMC: Cacboxymethyl cellulose
dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate
DNS: Dinitrosalicylic acid
EG: Endoglucanase
FPU: Filter paper unit
GH: Glycoside hydrolase
ITS: Internal transcribed spacer
PCR: Polymerase chain reaction (kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase)

PDA: Potato Dextrose Agar
rDNA-Ribosomal DNA
rRNA-Ribosomal RNA
SDS- PAGE: Sodium dodecyl sulphat polyacrylamide gel electrophoresis
T – Type strain (chủng chuẩn)
U – Unit (đơn vị)

Lã Thị Mỹ Hạnh

9

K27 – Vi sinh vật học


Luận văn thạc sĩ

MỞ ĐẦU
Vi nấm đóng vai trị phân hủy chất hữu cơ và không thể thiếu được trong chu
trình chuyển hóa và trao đổi vật chất của hệ sinh thái. Nấm phân bố trên tồn thế
giới và có khả năng tồn tại, phát triển ở nhiều điều kiện môi trường khác nhau. Vi
nấm phát triển trong môi trường khắc nghiệt được quan tâm đặc biệt về mặt công
nghệ vì có thể cung cấp nguồn enzyme với đặc tính khác biệt, đáp ứng các yêu cầu
công nghệ đặc thù. Vi sinh vật, enzyme hoạt động trong điều kiện khắc nghiệt về
nhiệt độ, pH cũng có thể được ứng dụng trong sản xuất nhằm hạn chế nguy cơ tạp
nhiễm.
Là một nước nông nghiệp, hàng năm công nghiệp chế biến ở Việt Nam tạo ra
một nguồn phế phụ phẩm rất lớn và nếu không được sử dụng hợp lý sẽ dẫn tới các
vấn đề ô nhiễm môi trường. Tuy nhiên, phần lớn nguồn nguyên liệu này có thể được
ứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi bằng công nghệ vi sinh, enzyme. Bên
cạnh đó Việt Nam thuộc vùng khí hậu nhiệt đới với hệ vi sinh vật vô cùng đa dạng

và phong phú. Đa dạng nguồn gen có thể giúp ích trong việc tìm kiếm các tác nhân
phù hợp trong chuyển hóa, chế biến phế phụ phẩm nơng nghiệp thành những sản
phẩm hữu ích.
Nghiên cứu này đề cập tới nhóm vi nấm có khả năng phát triển trong điều kiện
mơi trường axit mạnh (1% H₂ SO₄ ) nhằm tìm kiếm các chủng giống, enzyme có
khả năng hoạt động ở pH thấp vốn thường gặp trong quá trình xử lý nguyên liệu
bằng axit. Ngoài ra, enzyme và vi sinh vật hoạt động ở pH thấp cũng có thể được
ứng dụng trong chăn nuôi do khả năng chống chịu điều kiện axit của dịch dạ dày
động vật. Nhằm mục đích nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enzyme phân giải vật
liệu lignocellulose của một số chủng nấm chịu axit trong tự nhiên, chúng tôi tiến
hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập và xác định đặc tính sinh học của vi nấm chịu
axit mạnh phân lập tại Việt Nam ”.
Đề tài nghiên cứu bao gồm các nội dung sau:
-

Phân lập, tuyển chọn vi nấm chịu axit mạnh

Lã Thị Mỹ Hạnh

10

K27 – Vi sinh vật học


Luận văn thạc sĩ

-

Phân nhóm và định tên các chủng lựa chọn

-

Tuyển chọn chủng có khả năng sinh enzyme thủy phân lignocellulose

-

Xác định hoạt tính enzyme thủy phân lignocellulose

-

Xác định hoạt tính enzyme ở các điều kiện pH, nhiệt độ khác nhau

Lã Thị Mỹ Hạnh

11

K27 – Vi sinh vật học


Luận văn thạc sĩ

CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vi nấm chịu axit
Các sinh vật nhân chuẩn có khả năng thích nghi cao, có mặt trong nhiều dạng
mơi trường khắc nghiệt khác nhau và môi trường axit không phải là ngoại lệ. Mặc
dù người ta thường cho rằng nồng độ kim loại cao trong môi trường axit sẽ hạn chế
sự phát triển của sinh vật nhân chuẩn do tính độc hại của chúng, tuy vậy môi
trường khắc nghiệt này lại có mức độ đa dạng khá cao của sinh vật nhân thực. Môi
trường axit mạnh thường đi kèm với với các thái cực khắc nghiệt khác như mức
dinh dưỡng thấp, nồng độ kim loại độc hại cao và / hoặc nhiệt độ khắc nghiệt [6, 8,

9, 12, 20, 45].
Môi trường sống có tính axit có hai nguồn gốc chính, một liên quan đến núi
lửa và một liên quan đến các hoạt động khai thác kim loại và than [32] (Hình 1.1).
Trong trường hợp đầu tiên, q trình oxy hóa sinh học nguyên tố lưu huỳnh từ hoạt
động núi lửa tạo ra axit sulfuric bởi vi sinh vật [31] (Hình 1.1a, b). Trong trường
hợp thứ hai, hoạt động khai thác than và khai thác kim loại làm cho khoáng chất
chứa lưu huỳnh, dưới sự kết hợp của nước và oxy, tạo điều kiện cho sự tấn công của
vi sinh vật [5, 54]. Những địa điểm có chứa khống chất pyrit được quan tâm đặc
biệt trong bối cảnh này (Hình 1.1 c, d). Ở mơi trường pH thấp, chất oxy hóa chính
của khống chất này là sắt.
FeS2 + 6 Fe3+ → 7 Fe2+ + S2O32 + 6 H+
Fe2+ + 0,25 O2 + H3O+ → Fe3+ + 1,5 H2O
Cả hai môi trường sống khác nhau rất nhiều về các đặc điểm hóa lý và hệ
sinh thái vi sinh vật của chúng.
Các sinh vật ưa axit, đặc biệt là Acidithiobacillus ferrooxidans và
Leptospirillum spp., đẩy nhanh tốc độ oxi hóa pyrit đồng thời pH thấp tạo điều kiện
cho kim loại hịa tan, vì thế nước có tính axit có xu hướng có nồng độ kim loại nặng
cao. Bất chấp những điều kiện môi trường khắc nghiệt này, hầu hết các môi trường
axit cho thấy mức độ đa dạng sinh vật nhân chuẩn cao không ngờ, chẳng hạn như

Lã Thị Mỹ Hạnh

12

K27 – Vi sinh vật học


Luận văn thạc sĩ

Chlamydomonas, Chlorella và Dunaliella thường được tìm thấy trong axit môi

trường, cũng như sinh vật nguyên sinh quang hợp Euglena mutabilis [4, 6, 20].

Hình 1. . Mơi trường axit mạnh.
(a) Khu vực địa nhiệt có tính axit Seltun, SW Iceland, (b) lưu huỳnh nguyên tố hình thành từ khí
thốt ra từ núi lửa Soufriere Hills trên Montserrat, Tây Ấn, (c) ruộng bậc thang hình thành bởi kết
tủa sắt ở Río Tinto, Tây Ban Nha, (d) Río Tinto, Tây Ban Nha.

1.1.1. Đặc điểm nhóm vi nấm chịu axit
Trong số các sinh vật nhân thực ưa axit, tảo và động vật nguyên sinh đã nhận
được chú ý nhiều hơn vi nấm. Dựa vào đặc tính thích nghi của các chủng nấm trên
các môi trường sống khác nhau mà các nhà khoa học đã chọn lọc và đưa ra những
tên gọi tương ứng với từng nhóm, đó là nấm chịu axit và nấm ưa axit. Hầu hết các
loại nấm sống trong mơi trường có axit nên được coi là chịu axit hơn là ưa axit
nghiêm ngặt vì chúng cũng có thể phát triển dưới pH trung tính hoặc thậm chí kiềm
[22]. Khơng có sự phân chia rõ ràng giữa nhóm ưa axit và nhóm chịu axit, nhưng
người ta thường cho rằng nấm ưa acid là những loại nấm có thể phát triển ở pH 1 và
tăng trưởng tối ưu ở pH 3 hoặc thấp hơn. Các loài chịu axit là những lồi có thể
phát triển trong mơi trường axit nhưng tối ưu ở pH 3 trở lên [26].

Lã Thị Mỹ Hạnh

13

K27 – Vi sinh vật học


Luận văn thạc sĩ

Nấm chịu acid có hai ưu điểm chính đáng được quan tâm bởi giá trị mà
chúng đem lại cho các ứng dụng thực tế. Đầu tiên, nhóm nấm này có khả năng hoạt

động trong mơi trường acid và tương tự là các enzyme của chúng. Ưu điểm này
đem lại những lợi ích trong ứng dụng cơng nghiệp. Đầu tiên phải kể đến ứng dụng
trong chăn nuôi. Việc bổ sung các enzyme có khả năng thủy phân lignocellulose
hoạt động trong môi trường axit dạ dày của động vật làm tăng giá trị dinh dưỡng đối
với thức ăn. Tiếp đến là một ứng dụng nữa trong sản xuất ethanol từ vật liệu
lignocellulose. Các vật liệu này ban đầu phải trải qua bước tiền xử lý bằng axit
trước khi bước vào giai đoạn thủy phân, việc sử dụng các loại enzyme có khả năng
hoạt động trong điều kiện axit thấp sẽ làm giảm thiểu chi phí trung hịa [40].
Ưu điểm thứ hai của nấm chịu axit bởi nó có khả năng tồn tại và phát triển
trong điều kiện axit mạnh làm giảm thiểu nguy cơ tạp nhiễm. Vấn đề thường gặp
trong nhiều quy trình cơng nghệ sinh học như lên men khối hoặc chuyển hóa chất
thải thành protein đơn bào là sự xâm nhiễm của các vi sinh vật ngoại lai [30]. Ứng
dụng nấm chịu acid cho phép thực hiện các quy trình này ở pH < 3 khi hầu hết các
vi sinh vật tạp nhiễm không thể phát triển.
Mô tả sớm nhất về nấm chịu axit có từ năm 1943, khi một chủng Acontium
velatum và một “Fungus D” được tìm thấy và chứng minh là có khả năng phát triển
trong môi trường glucose chứa axit sulfuric 1,25 M ở pH 0 [50]. Tuy nhiên, chủng
Acontium velatum xuất hiện đã bị mất kể từ đó, nhưng hiện nay, “Fungus D” được
cho là một chủng Acidomyces acidophilus thường được tìm thấy trong môi trường
cực kỳ axit [26]. Cho đến nay, đặc tính chịu axit đã được chỉ ra cho 6 lồi nấm, bao
gồm Acidomyces acidophilus (MB # 511856) (= Scytalidium acidophilum =
Acidomyces richmondensis = Fungus D), Acidomyces acidothermus (MB #
564520), Acid extrema (MB # 805425), Acontium velatum (MB # 142596, không có
mẫu vật sống) và Hortaea acidophila (MB # 367373) (= Neohortaea acidophila).
Chủng nổi tiếng Bispora sp. MEY-1 tạo ra một loạt các enzyme lignocellulolytic
chịu nhiệt và axit có lẽ thuộc về loài Acidomyces acidothermus [50, 38]. Về mặt
phát sinh, tất cả các loài ưa axit là Ascomycota và trạng thái teleomorphic chỉ được

Lã Thị Mỹ Hạnh

14

K27 – Vi sinh vật học


Luận văn thạc sĩ

biết đến với Acidomyces acidothermus (được mô tả là Teratosphaeria acidotherma,
MB 517415) [50].
Một loạt các gen mã hóa enzyme thủy phân lignocellulose trong nấm chịu
axit Acidomyces acidothermus MEY-1 đã được nhân bản và biểu hiện. Các enzyme
được tìm thấy là chịu nhiệt và có hoạt động chức năng trong điều kiện axit [36]. Do
sự quan tâm ngày càng tăng đối với các nguồn năng lượng và vật liệu sinh học có
thể tái tạo, các loại nấm thích nghi với điều kiện môi trường khắc nghiệt gần đây đã
nhận được sự quan tâm đặc biệt vì các nguồn enzyme thủy phân mới phù hợp cho
các ứng dụng công nghệ khác nhau. Trình tự bộ gen đã thu được cho một số lượng
lớn nấm ưa axit, bao gồm Acidothrix acidophila, Acidomyces acidophilus và
Hortaea acidophila [22, 54].
1.1.2. Ứng dụng của nhóm vi nấm chịu axit mạnh
Những loại nấm ưa axit này là nguồn chính của các enzym hoạt động trong
điều kiện axit có thể được sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp bao gồm các
ngành công nghiệp giấy, làm da, thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, nơi hoạt động của
các enzyme bị giới hạn bởi môi trường khắc nghiệt trong các quy trình cơng nghệ
đặc thù. Ứng dụng của nấm ưa axit với sự nhấn mạnh về sự đa dạng và cân bằng nội
pH của chúng, các cơ chế được áp dụng chống lại môi trường pH thấp, tổng quan về
các enzym có thể phân hủy axit thu được từ các loại nấm ưa axit này, các nguồn
chính và các ứng dụng tiềm năng của enzyme và vi nấm chịu axit mạnh.
Các nghiên cứu về vi sinh vật trong mơi trường có tính axit đã cung cấp
thơng tin chi tiết về sự đa dạng của vi sinh vật ưa axit cũng như nồng độ kim loại
cao trong môi trường đó. Cộng đồng vi sinh vật nhân chuẩn được cho là đóng vai

trị quan trọng trong mơi trường pH thấp. Trong một mỏ quặng nằm ở vùng núi
chứa sắt, California, vi nấm chiếm phần lớn sinh khối trong các quần xã màng sinh
học, những sợi nấm này gắn chặt màng sinh học trong mơi trường đá pyrit. Chúng
đóng vai trị là nơi gắn kết cho sinh vật nhân sơ bằng cách cung cấp một diện tích bề
mặt lớn. Hơn nữa, nấm điều chỉnh mức carbon hữu cơ và duy trì nó ở mức thấp hơn
bằng cách tạo ra các ion cacbonat, dẫn đến sự gia tăng mạnh mẽ của các sinh vật vi

Lã Thị Mỹ Hạnh

15

K27 – Vi sinh vật học


Luận văn thạc sĩ

sinh vật ưa axit, đặc biệt là sinh vật nhân sơ. Sự tương tác giữa các khoáng chất và
vi sinh có ý nghĩa to lớn vì nó tạo ra AMD trong môi trường axit. Khử lưu huỳnh
trong than, xử lý chất thải độc hại công nghiệp và kim loại tích tụ, là ứng dụng quan
trọng của những vi sinh vật ưa axit được sử dụng để tẩy rửa sinh học, chiết xuất kim
loại từ quặng cấp thấp và chất thải công nghiệp tương ứng của chúng.
Những vi sinh vật này cung cấp nguồn nguyên liệu đặc thù, các enzym phân
giải axit và các enzym có khả năng hoạt động trong điều kiện khắc nghiệt, cần thiết
cho các q trình cơng nghiệp hiện nay. Quan trọng nhất, những enzym này hiệu
quả, thân thiện với môi trường và đại diện cho nền tảng cho các công nghệ công
nghiệp bền vững.
Bảng 1.1. Tổng quan về các ứng dụng của enzym nấm ưa axit trong các
ngành công nghiệp khác nhau
Enzyme
Endopolygalacturonases

Exo-polygalacturonases

β-galactosidases

Lã Thị Mỹ Hạnh

pH tối
ƣu
3.5

Nhiệt độ
tối ƣu
40

3.5
2.0-3.0
4.0
4.2
4.3
5.0
5.0

50
37
25
30
50
45
30

4.5

30

4.0
5.0
5.3
3.4 - 4.2

65
40
40
60

4.5
4.0
1.5-5.5

40
60
37

1.5
3.5
4.0
7.0

37
65

30
25

Nguồn nấm ƣa axit
Penicillium
sp.
CGMCC 1669
Bispora sp. MEY-1
Aspergillus kawachii
Saccharomyces
cerevisiae
Aspergillus niger
Aspergillus carbonarius
Sclerotinia sclerotiorum
Aspergillus niger

Ứng dụng
1. Làm mềm trái
cây, nước ép và
các loại rượu.
2. Thức ăn chăn
nuôi
3. Các ngành nghề
giấy và dệt may
4. Điều chỉnh
pectic
nước thải
5. Lên men cà phê
và trà
6. Sản xuất

thức ăn cho trẻ em

Rhizoctonia solani Kuhn
(AG2-2)
Paecilomyces variotii
Trichoderma harziunum
Fusarium moniliforme
Aspergillus niger
Aspergillus carbonarius
Aspergillus niger
Teratosphaeria
acidotherma AIU BGA-1
Bispora sp. MEY-1
Aspergillus niger
Penicillium chrysogenum
Saccharomyces lactis

16

1. Sản xuất pho
mát
whey trong ngành
thực phẩm
2. Bổ sung trong
sản phẩm sữa
3. Dinh dưỡng và
dược phẩm
4. Sản xuất sữa

K27 – Vi sinh vật học

Luận văn thạc sĩ

Enzyme

pH tối
ƣu

Nhiệt độ
tối ƣu

Laccases

1.5-2.0
2.4

37
62

Xylanases

3.5-5.0

55-75

4.0
2.6
5.0

50-60
65
60

2.0
2.0
2.0
4.8

45
50
50
54

4.0

80

3.0
3.5
4.0
1.5
4.0
2.4
5.0

70
70
70
60

40
50
60

β-mannanases

Nguồn nấm ƣa axit

Hortaea acidophila
Sclerotium rolfsii

Penicillium
citrinum HZN13
Penicillium oxalicum GZ2
Bispora sp. MEY-1
Aspergillus terreus
(BCC129)
Aureobasidium pullulans
Aureobasidium
pullulans
var.
Melanigenum
Penicillium sp. 40
Aureobasidium pullulans
Penicillium oxalicum
GZ-2
Bispora antennata
Aspergillus niger LW-1
Penicillium pinophilum
C1

Phialophora sp. P13
Penicillium occitanis
Pol6
Aspergillus sulphureus
Penicillium oxalicum

Ứng dụng
chua và phô mai
tươi không đường
chất phụ gia
1. Khử màu thuốc
nhuộm và nước
thải
2. Màu và phenolic
loại bỏ nhà máy ô
liu
nước thải
3.
Loại
bỏ
phenolic,
hợp chất từ rượu
vang và ổn định
bia
4. Sản xuất bột
giấy
5. Sự phát triển
của nhiên liệu tế
bào và cảm biến
sinh học

1. Thức ăn chăn
nuôi
2. Sản xuất bột
giấy và giấy
3. Dệt may, chế
biến thực phẩm
4. Nông nghiệp

1. Các ngành nghề
giấy và bột giấy
2. Thức ăn chăn
nuôi
3. Thực phẩm và
khoan dầu

1.1.3. Một số nhóm vi nấm chịu axit phổ biến
Nấm chịu axit mạnh đã được phân lập từ môi trường ô nhiễm cao hoặc các
môi trường khắc nghiệt như nước thải khai thác mỏ có pH 1.1 [42], mỏ uranium

Lã Thị Mỹ Hạnh

17

K27 – Vi sinh vật học


Luận văn thạc sĩ

[53] và hệ thống địa nhiệt núi lửa [16]. Ví dụ, Hortaea acidophila được phân lập từ
than nâu có chứa axit humic và axit fulvic ở pH khoảng 0.6 [23]; hai chủng ưa axit,

Hortaea werneckii và Acidomyces acidophilum, được phân lập từ Rio Tinto ở Tây
Ban Nha, trong đó giá trị pH trung bình là 2,3 và chứa hàm lượng Fe cao, Cu, Zn,
As, Mn và Cr [56].
Bảng 1. 2. Một số nhóm vi nấm chịu acid đã cơng bố.
Lồi

pH

Enzyme

Acidea extrema

<3

-

<3

-

<3

-

<3

Multicopper oxidase

<3

Xylanase Mannanase
Galactosidase
Glucanase
Glucoamylase Endopolygalacturonase

Acidiella
bohemica
Acidiella
uranophilac
Acidomyces
acidophilus

Acidomyces
acidothermus

Acidothrix
acidophila

<3

e.g. Amidase
glucoamylase

Coniochaeta
fodinicola

<3

Mannanase

Nguồn gốc phân lập
Đất có tính axit cao ;
Biofilm từ sơng có tính axit cao
Đất có tính axit cao; Mỏ bỏ hoang;
Phụ phẩm từ đá phiến dầu có tính axit cao
Nước có tính axit cao từ mỏ uranium
Nước sơng và trầm tích có tính axit cao
Tảo ưa chua, kênh thốt axit; Đất gần đống
lưu huỳnh
Axit sulfuric; Đất núi lửa; Nước cơng nghiệp
có tính axit; Đất có tính axit cao
Suối nước nóng có tính axit cao; Nước có tính
axit cao từ mỏ uranium; Nước thải có tính axit
của mỏ uranium; Đất có tính axit cao; Bioflm
thốt nước mỏ axit; Đường ống chuyển axit
Đất có tính axit cao
Ni cấy giàu vi sinh vật cổ sinh Mỏ
Richmond ưa axit
Vi sinh vật nano từ màng sinh học ở mỏ
Nước có tính axit cao từ mỏ uranium
Nước thải có tính axit từ mỏ uranium
Đất có tính axit cao

Acidomyces acidophilus
Acidomyces acidophilus là một lồi nấm được mơ tả đầu tiên bởi Sigler &
J.W. Carmich và được mô tả lần nữa bởi Selbmann, de Hoog & De Leo năm 2008.
Acidomyces acidophilus thuộc chi Acidomyces và họ Teratosphaeriaceae, và cịn có
tên gọi khác là Scytalidium acidophilum, “Fungus D” hay Trichosporon
cerebriforme. Nó chứa melanin thành tế bào bảo vệ khỏi các điều kiện môi trường
bất lợi như pH, nhiệt độ và độc tố cực đoan [25, 30, 39, 51]. Khuẩn lạc sẫm màu và

Lã Thị Mỹ Hạnh

18

K27 – Vi sinh vật học


Luận văn thạc sĩ

gọn, phát triển chậm chạp trong môi trường trung tính nhưng nhanh hơn trong mơi
trường axit. Sợi nấm phân nhánh, màu nâu và có vách dày cuối cùng chuyển thành
mô phân sinh. Khuẩn lạc được tạo ra bởi sự phân chia khớp của các sợi nấm. Hình
thái của các lồi Acidomyces khơng dễ dàng được mơ tả vì xu hướng của nó là tăng
trưởng hồn tồn ở dạng sợi nấm [48].

Hình 1. . Acidomyces acidophilus
WKC-1 (a) của chủng nấm được phân lập trong môi trường CDA, (b) Các sợi nấm của chủng có
xen kẽ và sợi nấm khơng phân nhánh với các tế bào có màng đệm và thành dày và (c) Tế bào đầu
cuối sợi nấm sử dụng kính hiển vi điện tử quét (SEM) ở độ phóng đại 1000 × (b) và 2200 × (c), tỷ
lệ thanh ở (b) và (c) 2 μm [14].

Acidothrix acidophila
Acidothrix acidophila là một loại nấm đất ưa chua. Khuẩn lạc hình cầu,
elipsoidal hoặc lacrimose với hilum; bào tử sinh sơi nảy nở bằng sợi nấm và mang
các bào tử khác.

Lã Thị Mỹ Hạnh

19

K27 – Vi sinh vật học


Luận văn thạc sĩ

Hình 1. . Acidothrix acidophila. [41]
a, b Khuẩn lạc trên MEA pH 5,5 ở 24°C, 21 ngày; c Khuẩn lạc trên MEA pH 2 ở 24°C, 21 ngày; d
Bào tử hình cầu, hình elip; e-h Sinh sản bằng bào tử và bào tử; i Bào tử sinh sôi nảy nở bằng sợi
nấm và mang các bào tử khác. Thanh chèn 10 μm.

Acidea extrema
Acidea extrema là một loài nấm được mơ tả đầu tiên bởi Hujslová & M.
Kolarík, phân lập từ đất có tính chua (pH 2), thuộc chi Acidea. Khuẩn lạc trên MEA
(pH 5.5) ở 24 ° C, 21 ngày tách ra đường kính 17–36 mm, trên mơi trường axit
(MEA pH 2) đạt đường kính 17.5–23 mm trong 21 ngày ở 24 ° C. Trên cả hai môi
trường khuẩn lạc nhỏ gọn, một số chủng phân lập có rìa xù xì, xếp thành đám ở
trung tâm, nhăn nheo, hoặc giống nấm men, màu be trắng. Trên PCA ở 24 ° C quan
sát khuẩn lạc ở 21 ngày nhỏ gọn, xếp chồng lên nhau với bờ phẳng, không có sợi
nấm trên khơng, giống như nấm men; đường kính 25 mm, sợi nấm rộng 2.2–
0,5.5μm, phân nhánh thưa thớt, chứa đầy các đường hạt đơn, thường phân mảnh.

Lã Thị Mỹ Hạnh

20

K27 – Vi sinh vật học


Luận văn thạc sĩ

Hình 1. . Acidea extrema
Khuẩn lạc trên MEA pH 2 ở 24 ° C, 21 ngày; b Khuẩn lạc trên MEA pH 5.5 ở 24 ° C, 21 ngày; c,
d, e Sợi nấm vô trùng chứa đầy hạt; Soosiella minima. f Khuẩn lạc trên MEA pH 5.5 ở 24 ° C, 21
ngày; g, h Sợi nấm vô trùng dạng hạt không đều. Thanh tỷ lệ = 10 μm [41]

1.1.4. Tình hình nghiên cứu vi nấm chịu axit trong nước
Trong những năm gần đây, các nhà khoa học đặc biệt quan tâm đến các
chủng nấm có khả năng tồn tại và phát triển trong điều kiện môi trường khắc nghiệt,
trong đó các nghiên cứu trên thế giới và trong nước liên quan đến nấm chịu nhiệt đã
được nghiên cứu nhiều trong những năm gần đây [38], tuy nhiên liên quan đến nấm
chịu axit mạnh thì vẫn chưa có một nghiên cứu cụ thể nào trong nước. Chúng tôi
đặc biệt chú trọng đến tính đa dạng sinh học và đặc tính liên quan đến khả năng sinh
enzyme của các chủng. Bên cạnh enzyme của vi nấm chịu nhiệt gần đây nổi lên như
một lựa chọn thay thế đầy hứa hẹn trong các ứng dụng cơng nghệ sinh học thì
enzyme của vi nấm chịu axit vẫn là một vấn đề tương đối mới. Khoa học thế giới đã
và đang đi sâu hơn vào nhóm vi nấm đầy tiềm năng này tuy nhiên hiện nay trong
nước vẫn chưa có một cơng trình khoa học nào nghiên cứu chuyên sâu về lĩnh vực
này.

Lã Thị Mỹ Hạnh

21

K27 – Vi sinh vật học


Luận văn thạc sĩ

1.2. Lignocellulose và enzyme thủy phân lignocellulose

1.2.1. Giới thiệu lignocellulose
Sinh khối lignocellulose là nguồn tài nguyên dồi dào và có thể tái tạo từ thực
vật, là thành phần vật chất chủ yếu cấu tạo nên các loài thực vật thân gỗ và các
thực vật khác như cỏ, lúa, ngô,…thành phần chủ yếu bao gồm cellulose (25-55%),
hemicellulose (8-30%), và lignin (18-35%) [57]. Tùy thuộc vào loài thực vật, các
bộ phận và tuổi của thực vật mà các hàm lượng của các thành phần sẽ khác nhau.

Hình 1. . Cấu trúc của lignocellulose.
Lignocellulose là một cơ chất phức hợp bao gồm các polisaccarit, các
polyme có gốc phenol, và protein. Các thành phần của lignocellulose tạo thành
một dạng cấu trúc gọi là vi sợi, các vi sợi này được bao bọc bởi hemicellulose và
ligin tạo thành các bó sợi góp phần điều chỉnh độ bền cấu trúc của vách tế bào
thực vật, giúp bảo vệ cellulose khỏi sự tấn công của các enzyme và các hóa chất
trong q trình thủy phân. Thành phần của lignocellulose được trình bày ở bảng
1.2.
Bảng 1. 3. Thành phần lignocellulose trong rác thải và phế phụ liệu nông nghiệp
phổ biến

Lã Thị Mỹ Hạnh

22

K27 – Vi sinh vật học


Luận văn thạc sĩ

Nguồn lignocellulose
Thân gỗ cứng
Thân gỗ mềm

Vỏ lạc
Lõi ngơ
Giấy
Vỏ trấu
Vỏ trấu của lúa mì
Rác đã phân loại
Lá cây
Hạt bơng
Giấy báo
Giấy thải từ bột giấy hóa học
Chất rắn nước thải ban đầu
Chất thải của lợn
Phân bón gia súc
Cỏ ở bờ biển Bermuda
Cỏ mềm
Các loại cỏ (trị số trung bình
cho các loại)
Bã thô

Cellulose (%)
40-55
45-50
25-30
45
85-99
32.1
30
60
15-20
80-95

40-55
60-70
8-15
6
1.6-4.7
25
45

Hemicellulose (%)
24-40
25-35
25-30
35
0
24
50
20
80-85
May-20
25-40
10-20
28
1.4-3.3
35.7
31.4

Lignin (%)
18-25
25-35
30-40

15
0-15
18
15
20
0
0
18-30
5-10
24-29
2.7-5.7
6.4
12

25-40

25-50

10-30

33.4

30

18.9

Cellulose
Cellulose là thành phần cơ bản của vách tế bào thực vật chiếm 40-60% về
trọng lượng. Trong vách tế bào thực vật, cellulose tồn tại trong mối liên kết chặt
chẽ với các polysaccharide khác. Hàm lượng cellulose trong thực vật rất lớn thể

hiện qua bảng 1.3.
Bảng 1. 4. Hàm lượng cellulose trong một số nguyên liệu tự nhiên
Nguyên liệu
Bông
- Vỏ hạt
- Sợi
Gỗ thông
Giấy báo
Vỏ đậu tương
Mía
- Cây trưởng thành
- Bã

Lã Thị Mỹ Hạnh

23

% Cellulose
60
91
41
40-80
51
42
56,6

K27 – Vi sinh vật học


Luận văn thạc sĩ

Thân ngơ

36

Ở các nhóm OH đầu mạch có tính chất khác nhau, cấu trúc hemiacetal tại C1 có
tính khử, trong khi đó OH tại C4 có tính rượu [55].
Cellulose chứa nhiều liên kết hydroxyl tồn tại dưới dạng tự do, hydrogen của
chúng dễ bị thay thế bởi gốc metyl hoặc gốc acetyl tạo nên các dẫn xuất este hoặc
este cellulose. Trong số các dẫn xuất được tạo nên thì CMC được ứng dụng rất
nhiều, trong đó một số nhóm hydroxyl của cellulose được thay thế bằng gốc –
OCH2COOH [1].

Hình 1. . Cấu trúc phân tử của cellulose

Hình 1. . Cấu trúc phân tử của CMC
Cellulose có cấu trúc rất bền, không tan trong nước và trong nhiều dung mơi
hữu cơ, chỉ bị thủy phân khi đun nóng trong acid và kiềm. Tuy nhiên, dưới tác dụng
của acid tạo thành các sản phẩm thủy phân khơng hịa tan. Cịn với dung dịch kiềm
thì làm mạch cellulose trương phồng và hòa tan một phần các cellulose phân tử nhỏ.

Lã Thị Mỹ Hạnh

24

K27 – Vi sinh vật học


Luận văn thạc sĩ

Trong điều kiện bình thường một số vi sinh vật có thể thủy phân cellulose thành
đường đơn. [27]
Người và động vật khơng có enzyme phân giải cellulose (cellulase) nên khơng
tiêu hóa được cellulose, vì vậy cellulose khơng có giá trị dinh dưỡng. Tuy nhiên,
một số nghiên cứu cho thấy cellulose có thể có vai trị điều hịa hoạt động của hệ
thống tiêu hóa. Vi khuẩn trong dạ cỏ của gia súc, các động vật nhai lại và động vật
nguyên sinh trong ruột của mối sản xuất enzyme phân giải cellulose, nấm đất cũng
có thể phân hủy cellulose. Vì vậy, chúng có thể sử dụng cellulose làm thức ăn.
Hemicellulose
Hemicellulose là thành phần dồi dào thứ 2 trong nguồn nguyên liệu
lignocellulose (25-30%). Hemicellulose là polymer mạch thẳng, có nhánh với thành
phần đơn phân đa dạng bao gồm đường 5 carbon (D-xylose, L-arabinose) và đường
6 carbon (D-glucose, D-galactose, D-mannose), cũng như một số thành phần khác
như D-glucuronic acid và 4-O-methyl-D-glucuronic acid với số lượng đơn phân
dưới 200 và có thể bị acetyl hóa. Thành phần cơ bản của hemicellulose là β – D
xylopyranose, liên kết với nhau bằng liên kết β-(14).
Cấu tạo của hemicellulose khá phức tạp và đa dạng tùy vào nguyên liệu, tuy nhiên
có một vài điểm chung gồm:
- Mạch chính của hemicellulose được cấu tạo từ liên kết β-(14).
- Xylose là thành phần quan trọng nhất.
- Nhóm thế phổ biến nhất là nhóm acetyl O – liên kết với vị trí 2 hoặc 3.
- Mạch nhánh cấu tạo từ các nhóm đơn giản, thơng thường là disaccharide hoặc
trisaccharide. Sự liên kết của hemicellulose với các polysaccharide khác và với
lignin là nhờ các mạch nhánh này. Cũng vì hemicellulose có mạch nhánh nên tồn tại
ở dạng vơ định hình và vì thế dễ bị thủy phân. Khi thủy phân hemicellulose sẽ thu
được các monosaccharide thuộc nhóm hexose như manose, galactose, nhóm pentose
như arabinose, xylose.
- Hemicellulose là thành phần có ở tất cả các tế bào thực vật và có nhiều ở phần
như: vỏ trấu, rơm rạ, vỏ hạt,…Tùy thuộc trong thành phần của hemicellulose có

Lã Thị Mỹ Hạnh

25

K27 – Vi sinh vật học