ĐỀ CƯƠNG LUẬN văn (y dược) định danh được căn nguyên nấm gây viêm loét giác mạc phân lập được tại viện mắt trung ương

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Viờm loét giác mạc là bệnh phổ biến ở các nước đang phát triển, có thể dẫn
đến mờ đục giác mạc, giảm thị lực trầm trọng, là nguyên nhân chính trong các
ngun nhân gõy mự lịa do bệnh lý giác mạc [24], [37],[43].
Viờm loét giác mạc do nhiều nguyên nhân gây nên như: vi khuẩn, nấm,
virus, ký sinh trùng, hoặc nguyên nhân chưa rõ ràng [30]. Theo các báo cáo gần
đây, tỉ lệ viêm loét giác mạc do nấm ngày càng tăng, chiếm tới 16% đến 37%
các trường hợp viờm loột giác mạc [12],[16], [18],[35], [24].
Viờm loét giác mạc do nấm là một bệnh lý nặng nề ở mắt, nhưng có thể
điều trị được nếu được chẩn đốn sớm và kịp thời . Việc chẩn đoán xác định
được sớm căn nguyên nấm gây viêm loétgiác mạc sẽ có ý nghĩa rất quan trọng
giúp cho việc sử dụng thuốc chống nấm được thực hiện ngay từ đầu, làm tăng
hiệu quả của thuốc chống nấm, giảm thời gian và chi phí điều trị, giảm thiểu tối
đa sự hình thành sẹo đục gây giảm thị lực.
Hiện nay, chẩn đoán căn nguyên nấm gây viêm loét giác mạc vẫn chủ yếu
dựa vào hình ảnh tổn thương trên lâm sàng và kết quả nhuộm soi, nuôi cấy phân
lập nấm, chủ yếu dựa trên hình thái học để định danh căn nguyên nấm. Tuy
nhiên, thực tế có nhiều loại nấm gây bệnh cảnh lâm sàng khơng điển hình khơng
dễ cho việc chẩn đốn. Kỹ thuật nhuộm soi có độ nhạy thấp [11], kỹ thuật ni
cấy phân lập nấm cũng có những thất bại do các lồi nấm khó nuụi cấy hoặc
chưa ni cấy được. Do đó mà đã bỏ sút khụng chẩn đốn được một tỉ lệ khá lớn
trong các trường hợp bị bệnh. Trong những trường hợp nuôi cấy được nấm để
định danh bằng tính chất sinh vật hóa học thì cũng khơng đơn giản và sẵn có,
thời gian lâu vài ngày đến vài tuần do đó làm chậm tốc độ q trình điều trị. Vì
vậy, việc định danh chính xác căn ngun nấm gây viêm loétgiác mạc tại Việt


2

Nam chưa được thực hiện đầy đủ. Các nghiên cứu về các loài nấm gây viêm
loétgiác mạc ở Việt Nam cũng rất ít và nếu có cũng chủ yếu dựa trên những tiêu
chuẩn về hình thái học. Định danh được chính xác loại nấm gây viêm ltgiác
mạc, mơ tả được mối liên quan giữa căn nguyên nấm với một số yếu tố dịch tễ
học, nhận định được căn nguyên đang lưu hành sẽ giúp ích cho việc điều trị tốt
bệnh nhân. Từ đó, trong một số trường hợp cỏc bỏc sỹ lâm sàng có thể dựa vào
căn nguyên thường gặp,đang lưu hành mà có hướng điều trị ban đầu khi chưa có
kết quả định danh.
Kỹ thuật giải trình tự gen định danh căn ngun nấm gây viêm ltgiác mạc
có tính ưu việt hơn nhiều so với các phương pháp định danh kinh điển bằng
nhuộm soi và nuôi cấy [23],[24],[28][29],[30]. Kỹ thuật này cho phép định danh
chính xác căn nguyờn gây viêm loétgiác mạc ít nhất ở mức độ chi.
Tại Việt Nam đó cú một số nghiên cứu về căn nguyên nấm gây viêm
loétgiác mạc được báo cáo. Tuy vậy, chưa có một nghiên cứu đầy đủ, chính xác
về các căn ngun nấm gây VLGM. Chính vì vậy mà chúng tơi tiến hành nghiên
cứu này với mục tiêu:
1.

Định danh được căn nguyên nấm gây viêm loét giác mạc phân lập được
tại Viện Mắt Trung ương .

2.

Mô tả một số đặc điểm dịch tễ học liên quan tới căn nguyên nấm gây
viêm loétgiác mạc.


3

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN
1.1.

Viờm loét giác mạc
Giác mạc là một mảnh mơ trong suốt nằm phía trước con ngươi, độ dày

của giác mạc khơng đồng đều. Giác mạc bình thường khơng có mạch máu, được
dinh dưỡng chủ yếu nhờ sự thẩm thấu từ vựng rỡa vào do hai cung mạch nông
và sâu, nhờ thủy dịch và nước mắt. Giác mạc được cấu tạo gồm năm lớp từ
trước ra sau: biểu mô, màng Bowman, nhu mô, màng Descemet, nội mô.
Biểu mô giác mạc thuộc loại biểu mụ lỏt tầng, chiếm khoảng 1/10 chiều dày
giác mạc, có thể chia thành ba phần: màng đáy, các lớp tế bào và phim nước mắt.
Viờm loét giác mạc là tình trạng mất lớp biểu mơ giác mạc kèm theo
nhiễm vi khuẩn, nấm, virus, ký sinh trùng vào lớp nhu mô hoặc biểu mô giác
mạc. Viờm loột giác mạc là bệnh thường gặp và tỷ lệ dẫn đến mù lòa rất cao.
Bệnh thường xảy ra sau khi bị dị vật giác mạc như bụi, mạt sắt, hạt thóc hoặc
sau khi bị chấn thương vào giác mạc như cành cây, lá cây, lỏ lỳa, và có thể xuất
hiện tự nhiên. Khi bị bệnh, bệnh nhân thấy cộm chói, chảy nước mắt, đỏ mắt và
nhìn mờ.
Viờm loét giác mạc là một bệnh rất nguy hiểm vỡ nú để lại những di
chứng vĩnh viễn như sẹo giác mạc, teo nhãn, lồi mắt cua và làm mất một phần
hoặc toàn bộ thị lực.
Viờm loét giác mạc có thể xuất hiện tự nhiên nhưng đa số có yếu tố khởi
phát là một tổn thương của lớp biểu mô do các nguyên nhân ngoại lai.
Có nhiều yếu tố nguy cơ gây viêm loétgiác mạc do nấm, trong đó thường
gặp nhất là chấn thương (lỏ lỳa quệt vào,hạt bụi, mạt sắt,…). Ngoài ra, việc sử
dụng kính tiếp xúc, can thiệp phẫu thuật vào bề mặt giác mạc (mổ mộng, mổ thể


4

thủy tinh,..), các bệnh mạn tính ở bề mặt nhãn cầu, khô mắt, … cũng là nguy cơ
gây viêm loétgiác mạc do nấm.
1.2. Căn nguyên gây viêm loétgiác mạc
Các căn nguyên gây viêm loétgiác mạc thường gặp là: vi khuẩn, nấm,
virus. Cơ cấu nguyên nhân gây VLGM có thay đổi theo thời gian và vùng địa lý
khác nhau. Tại Việt Nam, theo Phạm Ngọc Đụng,Hoàng Thị Minh Châu (2007),
tỷ lệ VLGM do nấm là 59,8%, do vi khuẩn là 29,4%, do virus là 9,1%, do amip
là 1,8% [3]. Theo Hoàng Năng Trọng, tỷ lệ VLGM do vi khuẩn là 30,1%, do
nấm là 23,3%, không phát hiện được amip[18].
1.2.1.Vi khuẩn
Nhiều vi khuẩn có thể gây viêm ltgiác mạc. Tỷ lệ lồi vi khuẩn có thể
khác nhau và thay đổi theo thời gian và vùng địa lý. Theo một số tác giả, các vi
khuẩn gây bệnh có thể gặp là: Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus
aureus,

Pseudomonas spp, Enterobacteriaceae,Moraxella spp, Streptococcus

pyogenes, Enterobacteriacea…[12],[13],[42],[47].
1.2.2. Nấm
Có hơn 70 loại nấm khác nhau có thể gây viờm loét giác mạc [30], [34],
[40]. Nấm thường gây bệnh ở những giác mạc đã bị tổn thương sau sang chấn
[24]. Nấm có thể phân lập được từ mi mắt và túi kết mạc của người bình thường,
đặc biệt ở những người làm việc ngồi trời [38].
Nấm có cấu trúc giống như thực vật, thô sơ, không di động, không chứa
chất diệp lục, sống cộng sinh, ký sinh hay hoại sinh. Nấm có thể phát triển được
ở nhiệt độ từ 0-37oC, tốt nhất là từ 20-30oC. Màng tế bào nấm chứa nhiều sterol.
Nấm có thể phân biệt với vi khuẩn bởi sự có mặt của hạt nhân, ty thể, ribosom
80-S, tiêu thể trung tâm và sự ưa thích mơi trường acid[].

5

Có nhiều cách phân loại nấm, người ta thường phân thành 2 nhóm: nấm
sợi và nấm men để tiện cho xét nghiệm chẩn đoán và lựa chọn thuốc điều trị.
Nấm sợi là những vi sinh vật đa bào, gồm những sợi có nhánh dài, rõ rệt.
Nấm men bao gồm chủ yếu là các loài Candida, là những sinh vật đơn
bào có hình trịn hoặc ơ- van.
Cả nấm sợi và nấm men đều có khả năng gây viêm loétgiác mạc. Lần đầu
tiên Leber (1879) phát hiện nấm gây bệnh tại giác mạc. Viờm loột giác mạc do
nấm rất phổ biến ở các nước nhiệt đới. Theo Dunlop, tỷ lệ viờm loột giác mạc
do nấm tại Bangladesh là 35,9% [27]. Theo Srinivasan và cộng sự, ở miền Nam
Ấn Độ tỷ lệ VLGM do nấm là 44% [42].

Việt Nam , trường hợp nhiễm nấm

giác mạc đầu tiên được phát hiện vào năm 1965 [18]. Từ đó tới nay số bệnh
nhân nhiễm nấm giác mạc ngày một tăng
Các loại nấm gây bệnh trên giác mạc có thể là: Fusarium, Aspergillus,
Acremonium, Penicillium, Curvularia, Candida,... , [34], [40], [41].
Theo Maurin và Cornand [36], ở các nước nhiệt đới thường gặp nhất là
Aspergillus và Fusarium.
Ở các nước ôn đới thường gặp là nấm Candida.
Đối với viờm loột giác mạc do nấm, tỉ lệ gây bệnh của các chủng có thay
đổi theo từng năm.
Theo một số nhà khoa học Ấn Độ, trong 623 bệnh nhân viờm loột giác
mạc do nấm có ni cấy dương tính ở miền Đơng Ấn Độ từ tháng 1/ 2001 –
12/2003 có 373 trường hợp nhiễm Aspergillus spp (59,8 %), 132 trường hợp
nhiễm Fusarium spp (21,2%) [24],[25]. Theo một nghiên cứu ở bệnh viện Mắt
Bắc Kinh từ năm 1989 đến năm 2000, có 58,7% nhiễm Fusarium spp, 16,8%

nhiễm Aspergillus spp, 6,3% nhiễm Mycelia sterilia và 5,7% nhiễm Alternaria
spp[43].


6

Fusarium và nhất là Fusarium solani là tác nhân gây nhiễm nấm giác mạc
được báo cáo là có mặt ở tất cả cỏc vựng trờn thế giới, đặc biệt ở những vựng cú
khí hậu nóng [40]. Aspergillus hay gặp nhất là Aspergillus Fumigatus (90%) là
tác nhân phổ biến gây VLGM do nấm sợi trong các trường hợp được báo cáo ở
Ấn Độ [24]. Ở Florida và cỏc vựng miền nam nước Mỹ, Aspergillus ít gặp hơn
các lồi nấm khỏc gây viêm loétgiác mạc [34], [39], [40]. Candida albicans là
loại nấm chớnh gây viêm loétgiác mạc ở miền Bắc nước Mỹ.
Trước năm 1990, Nguyễn Hiền và Nguyễn Duy Tân, nghiên cứu tại Viện
Mắt Trung ương cho biết nấm gây viêm loétgiác mạc đứng hàng đầu là
Aspergillus [4]. Theo Trần Thu Phương (1994-1995) Aspergillus vẫn đứng
đầu.Theo Thỏi Lờ Na (2006) nấm Fusarium chiếm tỷ lệ cao nhất (43,3%), tiếp
đến là Aspergillus (17,9%) [7].
1.2.3. Virus
Các loại virus có thể gây VLGM là :Herpes simplex, herpes Zoster.
Thường gặp nhất là Herpes simplex virus.
Virus Herpes nằm trong họ Herpesvirinae. Bệnh Herpes giác mạc thường
gặp ở lứa tuổi trẻ. Sauk hi vào cơ thể, virus có thể tiềm tàng mãi ở hạch thần
kinh và không gây bệnh, song khi gặp điều kiện thuận lợi như: cơ thể bị sốt hoặc
bị nhiễm trựng, cỏc vi chấn thương tại mắt,… virus có thể tái hoạt và gõy viờm
tái phát.
1.2.4. Căn ngun khác
Ngồi ra, có thể gặp viờm loột giác mạc do Acanthamoeba. Nhiễm
Acanthamoeba giác mạc thường gặp sau chấn thương giác mạc mà tác nhân có
thể do cành cây, côn trùng, nước, mùn cưa, chất bẩn, bụi bặm [33] .

7

1.3. Phương pháp chẩn đốn phịng thí nghiệm căn ngun nấm gây viêm
loétgiác mạc
Hiện nay, có nhiều phương pháp được dùng để chẩn đoán căn nguyên nấm.
1.3.1. Soi tươi
Kỹ thuật này đơn giản, cho kết quả nhanh ,nhận định nhanh tác nhân gây
bệnh, nhưng độ nhạy thấp nên đã bỏ sót một tỷ lệ khá lớn các trường hợp bị
bệnh. Xét nghiệm này có thể nhận biết được trong bệnh phẩm có vi khuẩn hay
nấm, nhưng khơng xác định được loài nấm.
1.3.2.Nhuộm soi
Cho phép nhận định nhanh tác nhân gây bệnh, độ nhạy thấp nên cũng bỏ
sót căn nguyên gây bệnh. Có nhiều kỹ thuật nhuộm để tìm nấm như nhuộm
Gram, Giờmsa, KOH 10%, Lactophenol. Nhuộm Gram và Giờmsa khụng
nhuộm được vách tế bào và vách ngăn của sợi nấm nhưng chất nguyên sinh của
nấm sợi hấp thụ được các thuốc nhuộm này [24]. Nhuộm soi cho phép phân biệt
được nấm sợi hay nấm men, giúp sơ bộ cho chẩn đốn và hướng điều trị. Cũng
khơng định danh được loại nấm.
1.3.3.Nuôi cấy phân lập
Thạch Sabouraud cho thêm Gentamycin ở nhiệt độ phịng là mơi trường
nhạy cảm nhất cho việc phân lập nấm. Hình thái trên kính hiển vi ,đặc điểm ở
môi trường nuôi cấy, màu sắc, tốc độ phát triển và sắc tố ở phía dưới là đặc điểm
để nhận định sơ bộ loài nấm.
Bệnh phẩm lấy được đem cấy vào mơi trường Sabouraud. Nếu có nấm có
thể mọc sau 2-3 ngày. Nhưng có trường hợp mất thời gian lâu hơn, có thể 5-7
ngày ,thậm chí tới 2 tuần [6]. Có nhiều loại nấm khó ni cấy hoặc chưa ni
cấy được.

8

Để định danh được chính xác loại nấm cần phải qua ni cấy sau đó làm
các thử nghiệm tính chất sinh vật hóa học( các thử nghiệm đồng hóa đường,phân
giải ure,…). Nhưng hiện nay, thực tế những bộ tính chất sinh vật hóa học để
định danh nấm rất phức tạp, khơng sẵn có nờn ít làm được.Bờn cạnh đú, trờn thị
trường có những giá đường để giúp định danh nấm nhưng giá thành đắt và bộ
tính chất khơng đủ. Trong các xét nghiệm vi sinh thì định danh vi nấm có lẽ là
một trở ngại lớn nhất. Vì nếu sử dụng các phương pháp kinh điển thì khơng chỉ
phân tích hình thái đại thể và vi thể, vốn dĩ phức tạp và cơng phu, mà cịn phải
làm cho được các khảo sát sinh vật hóa học khác như đồng hóa đường, phân tích
các chất biến dưỡng,…Chớnh vì vậy thơng thường ít có phịng xét nghiệm vi
sinh làm được xét nghiệm định danh vi nấm.
PCR là cơng cụ giúp hồn thiện và mở rộng phổ áp dụng kỹ thuật giải trình
tự. Giải trình tự gen nấm rồi dựa vào ngân hàng gen nấm đối chiếu sẽ cho phép
định danh được chính xác căn nguyên nấm.
Tách chiết DNA
Những mẫu bệnh phẩm được giữ ở ống eppendorf được lấy ra và tách
chiết DNA. DNA được tách chiết bằng kít MasterPure

TM

DNA purification

kit (USA).
Quy trình được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất
PCR sử dụng cặp mồi ITS1 và ITS4 (AlphaDNA, Canada) [29] khuếch
đại đoạn gen ITS (intergenic transcribed spacer) nằm giữa đoạn gen mã hóa cho
tiểu phần 18S và 28S của RNA ribosom. Mỗi ống PCR chứa 25ml các thành

phần với nồng độ như sau: MgCL2 2mM; dNTPs, 200mM mỗi loại, AmpliTaq
polymerase, 0,025UI; cặp mồi, và 5ml DNA khuôn mẫu. Sản phẩm 550bp.


9

-Giải trình tự gene : PCR dựa trên giải trình tự gen nhằm vào vùng ITS đã
được thực hiện trong ABI Prism 3100 AVANT (Applied Biosystems, Foster
City, USA). Giải trình tự nấm dựa vào phân tích BLAST để xác định các chi và /
hoặc loài của nấm. Từ kết quả giải trình tự dựa vào ngân hàng gen của nấm để
định danh nấm.


10

CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng
Các chủng nấm gây viêm loétgiác mạc phân lập được tại Viện Mắt Trung
ương năm 2008, kèm theo hồ sơ và thông tin bệnh nhân. Các chủng này được
giữ tại bộ môn Vi sinh Trường Đại học Y Hà nội.
2.2. Vật liệu nghiên cứu
-Sổ sách, giấy tờ ghi chép.
-Vật liệu giữ chủng: nước cất, ống eppendorff, que cấy, đèn cồn,…
-Sinh phẩm dùng cho tách chiết DNA: Bộ kít MasterPureTMDNA
Purification Kit (Mỹ).
-Sinh phẩm, hóa chất, cụng cụ, máy móc dùng trong PCR, giải trình tự gen.
+ Sinh phẩm:
. Cặp mồi ITS1 (5’ – TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) và ITS4 (5’GCATATCAATAAGCGGAGGA -3’) (AlphaDNA, Canada) [29] khuếch đại

đoạn gen ITS nằm giữa đoạn gen mã hóa cho tiểu phần 18S và 28S của RNA
ribosom. Mỗi ống PCR chứa 25ml các thành phần với nồng độ như sau: MgCl2,
2mM; dNTPs, 200mM mỗi loại, Ampli Taq Polymerase, 0,25UI; cặp mồi và 5ml
DNA khn mẫu.
. Kít tinh sạch sản phẩm PCR: Big DyeTM Purification kit (Mỹ).
. Kít giải trình tự gen: Big Dyeđ XTerminator (Mỹ).


11

. Kít làm chứng chuẩn để kiểm tra q trình giải trình tự gen của các mẫu
nghiên cứu: Big DyeTM Terminator v1. 1/ Matrix Standard Kit.
+ Hóa chất
. Thạch Agarose dùng trong điện di gen.
. Ethidium bromide dùng để nhuộm gen.
.TAE (Tris Acetate EDTA).
. PBS (Phosphate buffer Saline).
2.3. Dụng cụ và máy móc
- Máy điều nhiệt tự động GeneAmp PCR System 9700 AB (Applied
Biosystem, Mỹ).
- Máy ly tâm lạnh.
- Bộ điện din gang Horizonđ 58 (Gibco-BRL).
- Máy soi gen Wealtec Corp Model MD-20 (Mỹ).
- Máy chụp ảnh gen.
- Máy đo nồng độ DNA Bio photometer (Đức).
-Máy giải trình tự gen ABI 3130 (Mỹ).
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1.Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu mô tả cắt ngang.
2.4.2.Cỡ mẫu nghiên cứu

Lấy mẫu thuận lợi.


12

2.4.3.Quy trình nghiên cứu
Chủng nấm đã phân lập được
Giữ trong ống eppendorff ở nhiệt độ phòng
Tách DNA
PCR khuếch đại vùng gen ITS
Kiểm tra sản phẩm khuếch đại
Tinh sạch sản phẩm PCR
Cycle giải trình tự
Giải trình tự gen
Hiệu chỉnh
Trình tự gen
Phân tích kết quả dựa vào phần mềm BLAST


13

2.4.4. Kỹ thuật
2.4.4.1. Giữ chủng
Lấy một miếng thạch chứa khuẩn lạc nấm (1cm2) từ môi trường
chủng nấm đã phân lập được cho vào ống eppendorff có chứa nước cất vơ trùng
đậy chặt nắp, để ở nhiệt độ phòng.
2.4.4.2. Tách chiết DNA từ chủng
- Chuẩn bị bệnh phẩm: lấy mẫu đã được giữ ra.
- Sử dụng bộ kít MasterPureTMDNA Purification Kit (Mỹ).
Quy trình tiến hành theo hướng dẫn của bộ kít

1. Chuyển 50μl mẫu bệnh phẩm đã được chuẩn bị vào một ống
eppendorf sạch, loại 1,5 ml.
2. Pha dung dịch Proteinase K như sau: 10μl dung dịch 50μg/ μl
Proteinase K cho vào 400 μl (1μl dung dịch 50μg/ul
Proteinase K cho 400 μl dung dịch ly giải Tissue and Cell
lysis Solution) (có trong bộ kít). Lắc đều trờn mỏy lắc, ly tâm
nhanh cho dung dịch xuống đáy.
3. Cứ mỗi bệnh phẩm đã chuẩn bị ở (1), cho 400μl dung dịch từ
(2). Lắc đều 1 phỳt trờn mỏy lắc.
4. Ủ ở 65oC trong 25 phút, cứ sau 5 phút lại lắc đều 1 lần.
5. Để hỗn hợp hạ nhiệt độ xuống 37oC, thêm 1μl dung dịch
5μg/μl RNAase vào mẫu, lắc đều trờn mỏy.
6. Ủ ở 37oC trong 30 phút.
7. Lấy tube ra cho vào đá vụn hoặc cho vào ngăn đá trong tủ
lạnh để trong 10 phút.


14

8. Thêm 250μl dung dịch tủa Protein MPC (MPC Protein
Precipitation Reagent) vào 450μl dung dịch bệnh phẩm ở
bước (7). Lắc đều trờn mỏy lắc 10 giây.
9. Ly tâm tube ở 12000 vũng/phỳt x 10 phút.
10.Chuyển cẩn thận phần nước nổi sang 1 ống eppendorf 1,5ml
sạch khác, bỏ phần cặn.
11.Thêm 600μl isopropanol, lắc đều xuôi ngược 40 lần.
12.Ly tâm tube ở 12000 vũng/phỳt x 10 phút ở nhiệt độ 4oC.
13. Hút bỏ nhẹ nhàng phần nước nổi, tránh làm bong phần DNA
tủa màu trắng.
14. Cho 500μl Ethanol 75%, lắc đều trờn mỏy lắc 1 phút. Ly

tâm tube ở 12000/phút x10 phút ở nhiệt độ 4oC. Hút bỏ nhẹ
nhàng phần nước nổi.
15. Nhắc lại (14) thêm một lần. Hút bỏ hoàn toàn phần nước nổi
và hạt nước dính ở thành tube.
16. Để nghiêng tube, mở nắp cho bay hơi ethanol, làm khô tủa
DNA trong 30 phút.
17.Cho 20μl dung dịch TE, dùng pipet và típ 200μl trộn đều cho
tan hết DNA. Dung dịch này làm template cho PCR.
2.4.4.3. Giải trình tự gen
*. Giải trình tự gen cho vùng gen ITS
- Tiến hành chạy PCR khuếch đại vùng gen ITS
Các thành phần tham gia phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen tương ứng
của vùng gen ITS theo Ferrer và cộng sự [29], hướng dẫn của bộ sinh phẩm
Mastermix (Mỹ).


15

Nước đã khử ion:

8,5 μl

PCR mastermix:

12,5μl

Primer 1(2,5 mM):

0,5 μl

Primer 2 (2,5mM):

0,5 μl

Tổng cộng:

22,0 μl

Cho vào 3μl DNA khuôn mẫu vừa tách
Tổng thể tích phản ứng là 25 μl
Chu kỳ nhiệt:

94oC-3 phút
30 chu kỳ: 94oC- 1 phút
60oC- 1 phút
72oC- 1 phút
72oC- 3 phút

Điện di: Xác định kích cỡ sản phẩm DNA bằng chạy điện di trên gel
Agarose nồng độ 1% trong dung dịch TAE 1X.
2μl loading dye + 10μl sản phẩm PCR cho vào mỗi giếng.
Điện di 120V trong 30-40 phút bằng bộ điện din gang Horizon đ58
(Gibco-BRL).
Nhuộm: bản gel sau khi chạy điện di nhuộm trong dung dịch Ethidium
bromide trong 15-20 phút. Vớt ra ngâm vào nước trong 5 phút.
Đọc kết quả: Sử dụng máy soi gel Wealtec Corp Model MD-20 (USA).
Kích cỡ sản phẩm PCR: 550bp.
-Đo nồng độ DNA của sản phẩm PCR
Sử dụng máy Bio photometer (Đức) để đo.
Tube chứng: 50μl dung dịch PBS hoặc nước cất.

Tube mẫu: 5μl sản phẩm PCR + 45μl dung dịch PBS hoặc nước cất
Đo ở bước songs260 nm: 1 đơn vị = 50 μg/ml


16
Đọc kết quả: Lượng DNA có trong mẫu (μg/ml) x10 x103/103 (μl) = ng/μl
(x 10: độ pha loãng 10 lần, x103/103: đổi từ đơn vị μg/ml sang ng/μl).
-Giải trình tựu gen cho vùng ITS
+Chạy phản ứng cho giải trình tự
Sử dụng bộ kít Dyeđ XTerminator (Mỹ). Pha mix theo hướng dẫn
của bộ kít:
Big Dyeđ Terminator (Ready mix) v 3.1 cycle sequencing RR-100: 4μl
Big Dyeđ Terminator v 1.1, v 3. 15X sequencing buffer:

2μl

Primer:

1μl

DNA template:

2,5μl

Nước khử ion:

10,5μl

Tổng thể tích phản ứng:

20μl

+ Tinh sạch sản phẩm
Sử dụng kít Big DyeTM Purification kit (Mỹ) để tinh sạch.
Cho vào mỗi tube PCR phản ứng có thể tích 20μl (sản phẩm PCR cho giải
trình tự gen) 2 dung dịch sau:
. SAMTM solution: 90 μl.
. X TerminatorTM Solution (Big Dye X): 20μl
Sauk hi cho 2 dung dịch trên vào, lắc thật kỹ trong 30 phút bằng máy.
Ly tâm 1000 vòng trong 2 phút.
Cho hỗn dịch trên vào mỗi giếng Gene Amp đ 96- Well microtiter plate 20μl
để chạy giải trình tự.
Giai đoạn này cần sử dụng chứng chuẩn Standard để kiểm tra quá trình giải
trình tự.
Sử dụng bộ kít Big DyeTM Terminator v 1. 1/Matrix Standard Kit:


17
Pha 170- 200 μl Hi-DiTM Formamid vào 1 tube Matrix
Standard và lắc cho đều.
Ủ ở 95oC trong 2 phút. Sau đó lấy ra ngâm vào đá.
Cho vào giếng chứng 20μl.
- Chạy giải trình tự gen trờn mỏy ABI PRISM 3130 (Mỹ) và phân tích kết
quả dựa vào phần mềm BLAST có đối chiếu với Genbank để xác định
các chi và / hoặc lồi của nấm.
2.5. Phân tích số liệu
Các số liệu được quản lý và phân tích bằng phần mềm 16.0. Sự khác
biệt giữa 2 tỷ lệ được đánh giá bằng test χ 2. Giá trị p≤ 0,05 được coi là
khác biệt có ý nghĩa thống kê.
2.6. Thời gian, địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành tại:
- Bệnh viện Mắt Trung ương: năm 2008 (lấy bệnh phẩm, thu thập thông
tin bệnh nhân, nuôi cấy)
- Bộ môn Vi sinh trường Đại học Y Hà Nội từ 1008-2010 (Giữ chủng,
tách chiết DNA)
- Khoa xét nghiệm Viện Các Bệnh Truyền Nhiễm và Nhiệt Đới Quốc
Gia: từ tháng 3 đến tháng 6 năm 2011 (Giải trình tự gen)
2.7. Tiến độ thực hiện
- 3/2011: Thơng qua đề cương
- 3-6/2011: Tiến hành giải trình tự gen
- Tháng 6 xử lý số liệu
- Tháng 7-8 viết luận văn
- Tháng 9 bảo vệ luận văn


18

2.8.Đạo đức nghiên cứu
Nghiên cứu xuất phát từ mong muốn định danh được nhanh căn nguyên
gây bệnh giúp điều trị đúng thuốc sớm nhất có thể ,hạn chế di chứng bệnh.
Xét nghiệm chẩn đoán vi sinh vật là xét nghiệm thường quy được phép tiến
hành tại bệnh viện Mắt Trung ương, được tiến hành bởi các nhân viên y tế đã
được đào tạo. Xét nghiệm được tiến hành với sự đồng ý của bệnh nhõn,chỳng
tụi không tham gia vào quá trình lấy bệnh phẩm và khơng can thiệp bệnh nhân.


19

CHƯƠNG 3
DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1.Các loại nấm định danh được
3.1.1. Danh sách và tỉ lệ phân bố các loài nấm định danh được
Từ các chủng đã phân lập được tiến hành giải trình tự gen từ đó dựa vào
ngân hàng gen của nấm để định danh tên loại nấm: Fusarium falciforme,
Fusarium solani, Aspergillus fumigatus, Aspergillus terreus, . . .
Trong số ... chủng đã phân lập được chúng tôi đã tiến hành giải trình tự
gen và định danh được

... nấm Aspergillus, ...Fusarium,...

Bảng3. 1.1. Tỉ lệ phân bố các loài nấm định danh được
Nấm định danh được
Aspe rgillus fumigatus

Số chủng nấm
a

A

Fusarium solani
….

b
…

B
…

Từ các kết quả thu được tính tỉ lệ phần trăm.

Tỉ lệ %


20

Biểu đồ 3.1.1. Tỉ lệ các căn nguyên nấm định danh được
3.1.2.Tỷ lệ phân bố nấm tế bào và nấm sợi
Bảng 3.1.2.Phân bố nấm sợi và nấm tế bào
Nấm sợi
Nấm tế bào
Tổng số

Số chủng nấm

%


21

Biểu đồ 3.1.2. Phân bố nấm sợi và nấm tế bào
3.2.Một số đặc diểm dịch tễ học liên quan đến căn nguyên nấm gây VLGM
3.2.1.Phân bố căn nguyên theo mùa

Biểu đồ3. 2.1.Căn nguyên nấm gây VLGM theo mùa


22

3.2.2.Phân bố căn nguyên theo các yếu tố nguy cơ
Bảng3. 2.2. Phân bố căn nguyên nấm theo các yếu tố nguy cơ

Căn nguyên
nấm Aspergillus

Fusarium

Candida

…..

Tổng số

Tác nhân
Chấn thương
Các bệnh mắt mạn
tính
Các bệnh suy giảm
miễn dịch
Kính tiếp xúc
Tỷ lệ %
3.2.3.Phân bố căn nguyên theo nghề nghiệp
Bảng3.2. 3.Phân bố căn nguyên theo nghề nghiệp
Căn nguyên
Aspergillus
Nghề nghiệp
Nông dân
Công nhân
Học sinh
….

Fusarium

Candida

…

Tổng số
Số lượng

%


23

CHƯƠNG 4
DỰ KIẾN BÀN LUẬN
Các loài nấm đã được định danh chính xác và nhanh bằng PCR-giải trình
tự gen
Tỉ lệ các loài nấm gây VLGM trong nghiên cứu này là: …. Có thay đổi
so với nghiên cứu khác …..
Loại nấm gây VLGM có liên quan đến các yếu tố nguy cơ bệnh: mùa,
nghề nghiệp,chấn thương,…


24

DỰ KIẾN KIẾN NGHỊ
Nên có nhiều nghiên cứu cụ thể hơn về căn nguyên nấm gây viêm
loétgiác mạc. Nếu có thể được thì định danh và làm kháng sinh đồ để giúp điều
trị tốt hơn, nghiên cứu tình hình kháng thuốc,…

KINH PHÍ

-Chi phí cho giữ chủng:
-Sinh phẩm, hóa chất:
-Chi phí khác:

5 triệu
50 triệu
15 triệu

( Lấy từ nguồn vốn đầu tư của đề tài cấp bộ)


TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tham khảo tiếng Việt
1.

Nguyễn Duy Anh. Nhiễm nấm giác mạc và tác dụng thuốc điều trị hiện nay.
Luận văn thạc sỹ y học.1996. Trường Đại Học Y Hà nội.

2.

Hoàng Thị Minh Châu. Viờm loột giác mạc. Nhãn khoa giản yếu. 2004 (1):
153-161.

3.

Phạm Ngọc Đơng, Hồng Thị Minh Châu. Đặc điểm viờm loột giác mạc
nhiễm khuẩn tại Viện Mắt Trung ương.Tạp chí nghiên cứu y học.
2007(50):92-97.

4.

Nguyễn Hiền, Nguyễn Duy Tân, Võ Thế Sao, Nguyễn Quý Phi.Nghiờn cứu
về cỏc loột giác mạc do nấm. Tạp chí y học Việt Nam. 1997.

5.

Đoàn Thỳy Hũa, Phạm văn Tần. Nhận xét tình hình viờm loột giác mạc do
nấm điều trị tại Viện Mắt Trung ương năm 2004. Kỷ yếu hội nghị nhãn
khoa toàn quốc. 2005.

6.

Vũ Thị Tuệ Khanh, Lê thị ngọc Lan, Hoàng thị minh Châu. Đặc điểm lâm
sàng của bệnh VLGM do nấm tại khoa kết giác mạc Bệnh viện Mắt Trung
ương. Tạp chí nghiên cứu y học. 2006 (41,2): 54-57.

7.

Thỏi Lê Na. Đánh giá hiệu quả điều trị viờm loột giác mạc do nấm bằng
phối hợp Amphotericin B tại chỗ và Itraconazole toàn thân. Luận văn thạc
sỹ y học. Trường Đại học Y Hà nội. 2006.

8.

Lê Hồng Nga và cộng sự. Kết quả nuôi cấy vi khuẩn và nấm tại Viện Mắt
từ năm 1991-1996. Nội san nhãn khoa. 1996 (2): 39-43

9.

Nguyễn Đỡnh Ngõn. Nghiên cứu ghép màng ối điều trị loét Mooren. Luận
văn thạc sỹ y học. Học viện Quân y. 2006.