Đa dạng di truyền một số chủng virus gây bệnh tai xanh prrsv ở việt nam dựa vào trình tự gen mã hóa protein màng m
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (476.25 KB, 20 trang )
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
..
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
MAI THỊ THU HẰNG
ĐA DẠNG DI TRUYỀN
MỘT SỐ CHỦNG VIRUS GÂY BỆNH LỢN TAI XANH
(PRRSV) Ở VIỆT NAM DỰA VÀO TRÌNH TỰ GEN MÃ HĨA
PROTEIN MÀNG (M)
LUẬN VĂN THẠC SĨ CƠNG NGHỆ SINH HỌC
Thái Ngun – 2013
Số hóa bởi trung tâm học liệu
/>
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
MAI THỊ THU HẰNG
ĐA DẠNG DI TRUYỀN
MỘT SỐ CHỦNG VIRUS GÂY BỆNH LỢN TAI XANH
(PRRSV) Ở VIỆT NAM DỰA VÀO TRÌNH TỰ GEN MÃ HĨA
PROTEIN MÀNG (M)
Chun ngành : Cơng nghệ sinh học
Mã số
: 60.42.02.01
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học
TS. Nguyễn Tường Vân
Thái Ngun - 2013
Số hóa bởi trung tâm học liệu
/>
1
MỞ ÐẦU
1. Tính cấp thiết của dề tài
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS - Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome), còn
gọi là bệnh “tai xanh” (Blue Ear), là bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm, lây lan nhanh và nguy cơ tử vong
cao [43]. Bệnh có một lịch sử dịch tễ học phức tạp và rất khó kiểm sốt đối với những điều kiện chăn ni lợn
cơng nghiệp thơng thường. Vì vậy đây là một trong những bệnh gây ra sự tổn thất vô cùng lớn trong công nghiệp
nuôi lợn không chỉ trên thế giới mà còn ở Việt Nam.
Bệnh được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1987 ở Mỹ và được gọi với nhiều tên gọi khác nhau như “bệnh
thần bí ở lợn”, “bệnh tai xanh ở lợn”, “hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn” [6]. Ở Châu Âu nhiều vùng
cũng ghi nhận dịch bệnh này như Đức (năm 1990), Hà Lan, Tây Ban Nha, Bỉ, Anh (1991), Pháp (1992). Năm
1998, bệnh được phát hiện ở các nước châu Á như: Hàn Quốc, Nhật Bản [45]. Từ năm 2006 đến năm 2010, khu
vực các nước Châu Á như Trung Quốc, Việt Nam, Philippines và Thái Lan, Lào, Campuchia liên tiếp bị các đợt
dịch PRRS hoành hành với chủng PRRSV độc lực cao. Cho đến nay PRRS đã trở thành dịch bệnh lưu hành ở
nhiều châu lục trên thế giới là một trong những bệnh gây tổn thất nặng nề về kinh tế cho ngành chăn nuôi ở
nhiều quốc gia.
PRRS là loại virus có vỏ bọc bên ngồi, có cấu trúc hệ gen là ARN sợi đơn dương, có tính thích ứng nhân
lên rất cao đối với các đại thực bào, đặc biệt là đại thực bào phế nang hoạt động ở phổi [32]. Trong cơ thể lợn
bệnh, sự phá hủy đại thực bào làm giảm về số lượng và chức năng, dẫn đến suy giảm miễn dich, nếu qua khỏi
cũng rất khó lấy lại cân bằng miễn dịch [25].
Bộ gen của PRRSV dài khoảng 15 kb và bao gồm ít nhất tám (ORF) bao gồm ORF1a, 1b, 2,3,4,5,6, và -7 ,
trong đó ORF 1a và ORF 1b là các gen mã hóa RNA polymerase, GP 2-3-4 là các gen mã hóa protein chức
năng, GP5 (hay E) là glycoprotein vỏ ngoài, M là protein màng và N là protein cấu trúc nucleocapsid [40]. Do
đa dạng và luôn biến đổi về thơng tin di truyền nên việc tìm ra một virus ổn định và có tính đại diện nhằm sản
xuất vaccine rất khó khăn.
Ở Việt Nam cuối tháng 2/2007, bệnh xảy ra trên các đàn lợn tỉnh Hải Dương và sau đó lan ra các tỉnh miền
Trung, miền Nam và đến nay bệnh vẫn diễn biến phức tạp gây thiệt hại vô cùng to lớn về kinh tế cho người chăn
nuôi. Hiện nay, trên thị trường Việt Nam có hai loại vaccine chống virus PRRS phổ biến bao gồm vaccine bất
hoạt và vaccine nhược độc, nhưng giá thành cao, hiệu quả chỉ đạt 40% và chỉ có khả năng điều trị các triệu
chứng lâm sàng mà không bảo vệ động vật miễn nhiễm với virus, đồng thời đòi hỏi nghiêm ngặt trong khâu bảo
quản và vận chuyển [22].
Do đó yêu cầu cấp thiết đặt ra đó là phải phân lập được các chủng virus lưu hành tại Việt Nam, phân tích các
kháng nguyên quan trọng để tạo cơ sở cho việc sản xuất vaccine. Từ những cơ sở lý luận về khoa học và thực
tiễn nói trên, chúng tơi tiến hành đề tài: “Đa dạng di truyền của một số dòng virus gây bệnh lợn tai xanh
(PRRSV) ở Việt Nam dựa vào trình tự gen mã hóa cho protein màng (M)”.
Trong khuôn khổ của luận văn, đặc điểm di truyền và phân tử của một số chủng PRRSV phân lập tại Việt
Nam trong năm 2010 sẽ được so sánh với các chủng khác của Việt Nam và thế giới dựa trên trình tự gen mã hóa
cho protein M (ở đây được gọi là gen M) – một trong những protein cấu trúc quan trọng của PRRSV. Kết quả
của nghiên cứu này có thể phục vụ cho việc chẩn đốn chủng gây bệnh và phát triển vaccine.
Số hóa bởi trung tâm học lieäu
/>
2
3. Ðối tuợng và phạm vi nghiên cứu của dề tài
Các bệnh phẩm dùng trong nghiên cứu là niêm mạc của hầu họng - khí - phế quản chứa virus PRRS thu
thập từ lợn mắc bệnh tai xanh ở 5 tỉnh của Việt Nam ( Quảng Ninh, Hưng Yên, Nghệ An, Bạc Liêu, Tiền giang)
do trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương cung cấp
Phạm vi nghiên cứu của đề tài là giải trình tự gen M, phân tích thành phần chuỗi nucleotide và amino
acid của gen M, nghiên cứu mối quan hệ nguồn gốc phả hệ các chủng thu nhận được với các chủng của Việt
Nam và thế giới dã đăng ký trong Ngân hàng gen và phát hiện các chủng mới ở Việt Nam.
5. Bố cục của luận án
Luận án gồm 54 trang, trong đó phần Mở đầu 2 trang; Tổng quan tài liệu 18 trang; Vật liệu và phương pháp
nghiên cứu 9 trang; Kết quả và bàn luận 15 trang; Kết luận và kiến nghị 1 trang; Tài liệu tham khảo 7 trang; Phụ
lục 1 trang.
Số hóa bởi trung tâm học liệu
/>
3
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình bệnh lợn tai xanh trên thế giới và ở Việt Nam
1.1.1. Tình hình bệnh lợn tai xanh trên thế giới
1.1.2. Tình hình bệnh lợn tai xanh ở Việt Nam
1.2. Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích
1.2.1. Triệu chứng lâm sàng
1.2.2. Bệnh tích
1.3. Nguyên nhân gây bệnh và phân loại
1.4. Giới thiệu về virus PRRS
1.4.1. Hình thái và cấu trúc của virus PRRS
1.4.2. Khả năng gây bệnh và sức đề kháng
1.5. Các con đường lây nhiễm
1.5.1. Sự lây truyền dọc
1.5.2. Sự lây truyền ngang
1.6. Đa dạng di truyền của virus PRRS
1.7. Giới thiệu về gen M
1.7.1. Chức năng
1.7.2. Cấu trúc gen M của virus PRRSV
1.7.3. Vai trò trong tạo đáp ứng miễn dịch
1.8. Tầm quan trọng của việc nghiên cứu tìm hiểu gen M
1.8.1.Ý nghĩa của việc nghiên cứu gen M
1.8.2. Triển vọng sử dụng gen M tái tổ hợp trong sản xuất vaccine
Số hóa bởi trung tâm học liệu
/>
4
CHƢƠNG 2. ÐỐI TUỢNG, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Ðối tuợng
Gen M của 5 chủng virus cúm PRRS gây bệnh lợn tai xanh ở Việt Nam đại diện ở một số địa phương
được thu nhận từ năm 2010. Các mẫu bệnh phẩm gồm 5 chủng được thu nhận tại Quảng Ninh, Hưng Yên, Nghệ
An, Bạc Liêu, Tiền giang
2.2. Nội dung
1. Tiến hành tách chiết được RNA tổng số của virus
2. Thiết kế mồi để thực hiện phản ứng PCR để thu nhận gen mã hóa cho protein màng (M).
3. Giải trình tự gen và tiến hành phân tích số liệu, so sánh sự tương đồng giữa các nucleotide và amino acid để
đánh giá sự đa dạng di truyền chủng PRRS của Việt Nam và thế giới dựa trên trình tự gen mã hóa cho protein M
2.3. Vật liệu
- Mẫu bệnh phẩm do trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương cung cấp.
- Chủng E. coli DH5α, các vector nhân dịng pBT do phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ
sinh học cung cấp.
- Cặp mồi F-M, R-M để nhân dịng gen mã hóa protein màng M của virus PRRS do phịng Cơng nghệ tế
bào thực vật, Viện Cơng nghệ sinh học cung cấp.
2.4. Hóa chất
Các hóa chất sử dụng duợc cung cấp bởi các hãng có uy tín trên thế giới:Qiagen,Invitrogen, Fermentas...
2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.5.1. Phương pháp thiết kế mồi cho phản ứng nhân dịng
Các cặp mồi được thiết kế với mục đích nhân dịng gen mã hóa protein màng M của virus PRRS được
thiết kế dựa trên phân tích trình tự của tất cả các chủng PRRSV có trong Ngân hàng gen.
2.5.2.Tách chiết RNA tổng số của virus
Sử dụng bộ kit Trizol Regents (của hãng Invitrogen ) để tách chiết RNA tổng số từ các mẫu bệnh phẩm
theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.
2.5.3.Tổng hợp cDNA và phản ứng PCR
RNA tổng số được sử dụng để tổng hợp sợi DNA bổ sung (cDNA) thứ nhất. cDNA từ phản ứng phiên
mã ngược được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR nhân đoạn gen M với cặp mồi đặc hiệu M-F và M-R. Sản
phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1% và tinh sạch theo kit thơi gel theo quy trình GeneJET™Gel
Extraction Kit (Fermantas).
2.5.4.Phương pháp tách dòng gen.
Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được gắn vào trong vector tách dòng pBT và biến nạp vào tế bào khả
biến E. coli DH5-α.
2.5.5. Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR)
Số hóa bởi trung tâm học liệu
/>
5
Sau khi nuôi khuẩn đã biến nạp trên môi trường chọn lọc. Để chắc chắn vector đã được biến nạp vào
trong tế bào vi khuẩn, chúng tôi đã tiến hành chọn ra các khuẩn lạc trắng để kiểm tra bằng phản ứng PCR, sử
dụng trực tiếp các tế bào vi khuẩn làm khn mẫu (hay cịn gọi là colony-PCR).
2.5.6. Tách chiết plasmid
Quy trình tách plasmid được thực hiện theo kit tinh sạch plasmid ”Plasmid Extraction Kit” của hãng
QIAGEN
2.3.7. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp
Để kiểm tra các plasmid tái tổ hợp chúng tôi sử dụng phương pháp enzym giới hạn. Trên vector pBT có
hai điểm cắt của enzym BamHI ở hai đầu điểm gắn gen do đó BamHI được lựa chọn để kiểm tra sự có mặt của
gen trong vector nhân dịng.
2.6. Phƣơng pháp xác định trình tự và xử lý số liệu
Sử dụng chương trình Neighbor Joining và Alignment trên phần mềm Mega 3.1 [37], chương trình
Multiple Sequence Aligment trên phần mềm DNAMAN 4.1.5 (Lynnon BioSoft) để thu nhận, xử lý, phân tích
các chuỗi nucleotide, amino acid và các đặc điểm sinh học, sinh học phân tử và xây dựng mối quan hệ phả hệ
xác định nguồn gốc chủng lồi.
Số hóa bởi trung tâm học liệu
/>
6
Chƣơng 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1.Phân lập gen M
3.1. Phân lập gen M
Năm mẫu bệnh phẩm PRRS thu thập ở Quảng Ninh, Bạc Liêu, Nghệ An, Tiền Giang, Hưng Yên nuôi
cấy trên tế bào thận khỉ Marc145 được sử dụng để tách chiết ARN tổng số. Sau đó tiến hành tách chiết ARN
tổng số bằng cách sử dụng bộ kit Trizol Regents và tổng hợp cDNA, sau đó gen M được nhân lên bằng kỹ thuật
PCR nhờ cặp mồi F-M, R-M.
600bp
Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm RT- PCR nhân đoạn gen M
(1 : 10-QuNi ; 2 : 10-BaLi ; 3 :10-NgAn ; 4 :10-TiGi ;5 : 10-HuY)
Kết quả nhân gen được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0.8% chỉ thấy một vạch duy nhất, có kích
thước khoảng hơn 600 bp tương đương với kích thước của gen M theo lý thuyết. Như vậy, bước đầu có thể sơ bộ
kết luận: đã nhân được gen M và cặp mồi dùng để nhân gen M từ khuôn cDNA sợi đơn là rất đặc hiệu.
Sản phẩm PCR được thơi gel và dịng hóa vào vector pBT tạo thành vector tái tổ hợp pBT-M. Vector tái
tổ hợp pBT-M được nhân bản trong E.coli.
600bp
Hình 3.2. Ảnh điện di sản phẩm clony – PCR từ E.coli để kiểm tra các dòng khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp
pBT-M (1-3 :10-QuNi ; 4-6 : 10-BaLi ; 7-9 :10-NgAn ; 10-13 :10-TiGi ;14-16 : 10-HuY)
Hình ảnh 3.2 là ảnh điện di sản phẩm colony-PCR từ E.coli để kiểm tra 16 dịng khuẩn lạc trắng.Kết quả
có 15 giếng ( Giếng số 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ) xuất hiện băng có kích thước khoảng hơn
Số hóa bởi trung tâm học liệu
/>
7
600bp tương đương với kích thước gen M theo lý thuyết. Như vậy ta có thể kết luận rằng có 15 dịng mang
vector tái tổ hợp pBT- M.
2700bp
600bp
Hình 3.3. Ảnh điện di sản phẩm cắt bằng enzyme giới hạn BamHI
(1 : 10-QuNi ; 2 : 10-BaLi ; 3 :10-NgAn ; 4 :10-TiGi ;5 : 10-HuY)
Tiến hành tách plasmid và cắt bằng enzyme giới hạn BamHI và điện di cho thấy sản phẩm cắt của 5
plasmid bằng enzyme giới hạn BamHI có 2 phân đoạn kích thước khoảng 2700bp tương ứng với kích thước
vector pBT và 620 bp tương ứng với kích thước của gen M. Điều này khẳng định gen M đã được dịng hóa thành
cơng vào vector nhân dịng pBT.
Các plasmid tái tổ hợp pBT-M-10NgAn, pBT-M-10TiGi, pBT-M-10BaLi, pBT-M-10HuY, pBT-M10QiNi được đọc trình tự để phân tích sự đa dạng di truyền của gen M
3.2. Phân tích quan hệ di truyền giữa các dịng virus PRRS
Khi có được trình tự nucleotid chuỗi gen M, chúng tôi tiến hành so sánh chuỗi trình tự nucleotid vừa giải
duợc với chuỗi trình tự nucleotid của các chủng virut PRRS trong Ngân hàng dữ liệu gen.
3.2.1. Phân tích quan hệ di truyền giữa các dịng virus PRRS dựa vào đa hình trình tự DNA gen M
Hình 3.4. Phân tích chủng loại dựa vào
đa hình trình tự DNA của gen M của 5
mẫu virus và của 38 chủng tham khảo
Chú thích : 1-5 ký hiệu nơi thu mẫu (
Hình 2.1);*) 07 QN 2007: chủng virus
có độc tính cao ở Quảng Nam [30] ;
**) JXA1: chủng virus có độc tính cao
ở Trung Quốc [55]. 2001-2012 sau tên
các chủng virus: năm thu mẫu (Bảng
1). EU genotype: chủng châu Âu; NA
genotype: chủng Bắc Mỹ; Sg1; Sg2:
nhóm phụ 1 và 2 của chủng virus Bắc
Mỹ .
Số hóa bởi trung tâm học liệu
/>
8
38 trình tự gen M gồm 5 trình tự trong nghiên cứu này và 33 trình tự đã cơng bố chia thành 2 nhóm lớn
trên cây phát sinh chủng loại: nhánh 1 (type 1) gồm các đại diện của châu Âu; nhánh 2 gồm các đại diện của
Trung Quốc, Việt Nam, Hoa Kỳ,Hàn Quốc, Thái Lan…. (type 2). Sự sai khác giữa 2 type này với độ tin cậy
tuyệt đối (giá trị bootstrap 100%). Các dòng virus PRRS phân lập từ Quảng Ninh, Hưng Yên, Tiền Giang, Bạc
Liêu, Nghệ An đều thuộc type 2. Type 2 được chia thành 2 nhóm phụ riêng biệt là : Nhóm phụ 1- Subgroup 1
(Sg1) và Nhóm phụ 2- Subgroup 2 (Sg2).
Subgroup 1 (Sg1): Bao gồm 4 dòng PRRS-M đã phân lập trong nghiên cứu này 10-QuNi, 10-HuY, 10TiGi và 10-BaLi cùng nhánh với các chủng virus có độc tính cao (High Pathogenic PRRSV : HP-PRRSV) như
JXA1 ở Trung Quốc và 07QN ở Quảng Nam, Việt Nam, và các chủng đã công bố ở Trung Quốc, Lào… từ các
năm 2001-2012.
Subgroup 2 (Sg2) : gồm chủng 10-NgAn và các chủng PRRSV gốc VR-2332 và chủng vaccine
RespPRRS MLV.
3.2.2. Phân tích quan hệ di truyền giữa các dịng virus PRRS dựa vào đa hình trình tự amino acid gen M
Hình 3.5. Phân tích chủng loại dựa vào đa hình trình tự amino acid của gen M của 5 mẫu virus và của 38 chủng
tham khảo.
Chú thích: 1-5 ký hiệu nơi thu mẫu (Hình 2.1) *) 07 QN 2007: chủng virus có độc tính cao ở Quảng Nam [30],
**) JXA1: chủng virus có độc tính cao ở Trung Quốc [55].2001-2012 sau tên các chủng virus: năm thu mẫu
Soá hóa bởi trung tâm học liệu
/>
9
(Bảng 2.1). EU genotype: chủng châu âu; NA genotype: chủng Bắc Mỹ; Sg1; Sg2: nhóm phụ 1 và 2 của chủng
virus Bắc Mỹ .
Kết quả phân tích bằng MEGA 3.1 cho thấy 38 trình tự amino acid ( 5 trình tự trong nghiên cứu này và
33 trình tự của các chủng mẫu tham khảo chia thành 2 nhánh chính của 2 chủng Châu Âu và Bắc Mỹ. Độ sai
khác tin cậy về di truyền giữa 2 nhóm này là 100%. Cả 5 chủng nghiên cứu đều thuộc type 2 (Bắc Mỹ) giá trị
bootstrap 91-99%.
- Nhóm 1 (Type 1): Gồm các đại diện của Châu Âu (type 1) như HKEU 16, BJEU06, Lelystad, 01CB1,
SD01-08 và Euro PRRSV là đại diện của các nước Trung Quốc, Hà Lan, Thái Lan và Hoa Kỳ.
- Nhóm 2 ( Type2): Các chủng PRRS phân lập từ Quảng Ninh, Hưng Yên, Nghệ An, Tiền Giang, Bạc
Liêu đều thuộc nhánh này . Type 2 được chia thành 2 Subgroup riêng biệt là Subgroup 1 (Sg1) và và Subgroup 2
(Sg2) (giá trị bootstrap 91-99%).
Subgroup 1 (Sg1): Bao gồm 4 chủng trong nghiên cứu này (10-QuNi, 10-HuY, 10-TiGi và 10-BaLi) và 25
chủng tham khảo. Trong đó có một số chủng có độc lực cao như chủng 07 phân lập ở Quảng Nam- Việt Nam
2007, chủng JXA1 là chủng virus có độc tính cao ở Trung Quốc [55].
Subgroup 2(Sg2): Bao gồm các chủng như VR-2332 chủng gốc Bắc Mỹ, RespPRRS Repro: chủng vaccine.
Chủng 10-NgAn có quan hệ gần gũi với các chủng này tuy nhiên vẫn có sự sai khác đáng kể. Cần có thêm
những nghiên cứu thêm về chủng này để có nhứng kết luận chính xác về chủng này.
Như vậy, trong số 5 dòng PRRSV-M đã phân lập được, các dòng Quảng Ninh , Bạc Liêu, Hưng Yên,
Tiền Giang có độ tương đồng DNA và axit amin cao và có quan hệ di truyền gần gũi với nhau. Chủng 10 –NgAn
lại có sự khác biệt trong quan hệ di truyền với các dòng trong cùng nghiên cứu.
Theo Feng và đồng tác giả (2008) [30], chủng Quảng Nam (2007) và các chủng Trung Quốc (2006) có
quan hệ di truyền gần gũi với nhau. Sự vận chuyển thịt lợn sống giữa hai nước cũng như giữa các tỉnh trong
nước có thể là nguyên nhân dẫn đến sự bùng phát của các chủng virus PRRS có độ tương đồng cao [33].Kết quả
phân tích do đồn chun gia của tổ chức Nơng lương thế giới (FAO) cho thấy 99% các chủng đang lưu hành tại
Việt Nam tương đồng với các chủng virus đang lưu hành tại Trung Quốc [29].
Các chủng PRRSV có đa dạng di truyền cao do tốc độ tiến hóa nhanh [17]. Do đó trong thời gian ngắn
nhiều chủng mới xuất hiện với độc tính cao và gây ra những vụ dịch nghiêm trọng [30]. Các chủng PRRSV mới
xuất hiện của Type2 có lẽ bắt nguồn từ chủng gốc với đại diện là VR2332 do áp lực chọn lọc [23]. Độc tính khác
nhau cộng thêm đa dạng di truyền cao của các chủng PRRSV đã hạn chế hiệu quả phòng trị bệnh bằng vaccine
[31]. Các chủng phân tử xuất hiện ở các thời điểm khác nhau đều có cấu trúc phân tử khác nhau thể hiện ở một
số gen hoặc tồn bộ hệ gen [26], [27].
3.3. Phân tích mức tƣơng đồng về trình tự DNA và amino acid
Kết quả phân tích bằng Mega 3.1 cho thấy 5 chủng virus PRRS được phân lập chia thành chia thành 2
nhánh chính của 2 chủng Châu Âu và Bắc Mỹ. Độ sai khác tin cậy về di truyền giữa 2 nhóm này là 100%. Cả 5
Số hóa bởi trung tâm học liệu
/>
10
chủng nghiên cứu đều thuộc type 2 (Bắc Mỹ). Chi tiết hệ số tương đồng về trình tự DNA và amino acid giữa các
chủng trong mỗi nhóm phụ được thể hiện như sau:
3.3.1. Kết quả so sánh các trình tự đại diện của nhóm 1
Bảng 3.1. So sánh mức tương đồng (%) về trình tự DNA và trình tự amino acid (in đậm) của một số chủng đại
diện trong Sg1
JXA1
JXA1
07BJ
07HEBTJ
100
100
100
07HEN
07NM
07QN
10TiGi
10QuNi
10HuY
10BaLi
100
100
100
98.9
98.9
99.4
100
100
100
100
98.9
98.9
99.4
100
100
100
100
98.9
98.9
99.4
100
100
100
98.9
98.9
99.4
100
100
98.9
98.9
99.4
100
98.9
98.9
99.4
100
98.9
99.4
98.9
98.3
98.9
07BJ
100
07HEBTJ
100
100
07HEN
100
100
100
07NM
100
100
100
100
07QN
100
100
100
100
100
10-TiGi
99.4
99.4
99.4
99.4
99.4
99.4
10-QuNi
99.0
99.0
99.0
99.0
99.0
99.0
98.9
10-HuY
99.4
99.4
99.4
99.4
99.4
99.4
99.2
98.9
10-BaLi
99.2
99.2
99.2
99.2
99.2
99.2
98.7
98.3
99.4
98.7
Chú thích: Nhóm phụ 1 bao gồm:10-QuNi, 10-HuY, 10-TiGi, 10-BaLi: 4 mẫu trong nghiên cứu này; JXA1,
07QN, 07NM, 07HEN, 07BJ, 07HEBTJ: các chủng HP-PRRSV tham khảo. Số gạch chân: biến thiên % mức
tương đồng.
- Mức độ đồng nhất về nucleotide và tương đồng về amino acid giữa các đại diện trong nhóm phụ 1
được trình bày ở Bảng 3.1. Kết quả cho thấy, qua so sánh 525 nucleotide ( tương ứng với 174 amino acid) 4
chủng trong nghiên cứu có tỷ lệ tương đồng rất cao về nucleotide ( 98,3- 99,2%) và tương đồng về amino acid
(98,3 - 99,4%).
- Mức tương đồng về trình tự DNA chung 99,71% trong đó của 4 mẫu so với các chủng tham khảo là
99-99,4%. Mức tương đồng về trình tự amino axit chung cũng là 99,71%, trong đó của 4 mẫu nghiên cứu so với
các chủng tham khảo: 98,9-100%.
3.3.2. Kết quả so sánh các trình tự đại diện Nhóm Phụ 2 (Sg2)
Bảng 3.2. So sánh mức tương đồng (%) về trình tự DNA và trình tự amino acid (in đậm) của một số chủng đại
diện trong Nhóm phụ 2 (Sg2)
10-NgAn
10-NgAn
RespPRRS Repro
97.7
VR-2332
93.9
RespPRRS Repro
94.1
Số hóa bởi trung tâm học liệu
VR-2332
RespPRRS MLV
97.7
97.7
98.9
98.9
99.4
/>
100.0
11
RespPRRS MLV
94.1
99.4
100.0
Chú thích: Nhóm phụ 2bao gồm: 10-NgAn: 01 mẫu trong nghiên cứu này; VR-2332 chủng gốc Bắc Mỹ,
RespPRRS Repro, RespPRRS MLV: 2 chủng vaccine
- Mức độ đồng nhất về nucleotide và tương đồng về amio acid giữa các đại diện trong nhóm phụ 2 được
trình bày ở Bảng 3.2. Kết quả cho thấy, mức tương đồng về trình tự DNA chung là 98,38%, trong đó của mẫu
10-NgAn so với các chủng tham khảo đạt từ 93,9 - 94,1%.
- Mức tương đồng về trình tự amino axit chung là 99,14%, trong đó của mẫu 10-NgAn so với các chủng
tham khảo là 97,7%.
3.3.3. Kết quả so sánh giữa các trình tự đại điện của 2 nhóm phụ (Sg1 và Sg2)
Bảng 3.3. So sánh mức tương đồng (%) về trình tự DNA và trình tự amino acid (in đậm) giữa một số chủng đại
diện trong Nhóm phụ 1 (Sg1) với nhóm phụ 2 (Sg2)
07QN
JXA1
07QN
JXA1
10TiGi
100
100.0
10BaLi
10HuY
10QuNi
RespPRRS
Repro
VR2332
10NgAn
98.9
100.0
99.4
98.9
97.1
97.1
97.1
98.9
100.0
99.4
98.9
97.1
97.1
97.1
98.9
98.3
97.7
96.0
96.0
96.0
94.4
98.9
97.1
97.1
97.1
98.3
96.6
96.6
96.6
96.0
96.0
96.0
98.9
97.7
10-TiGi
99.4
99.4
10-BaLi
99.2
99.2
98.7
10-HuY
99.4
99.4
99.2
98.7
10-QuNi
99.0
99.0
98.9
98.3
98.9
RespPRRS
Repro
95.2
95.2
94.7
95.2
95.0
94.3
VR-2332
95.0
95.0
94.5
95.0
94.9
94.1
99.4
10-NgAn
92.2
92.2
91.6
92.6
92.0
91.2
94.1
97.7
93.9
Chú thích: 10-QuNi, 10-HuY, 10-TiGi, 10-BaLi: 4 mẫu thuộc Sg1 trong nghiên cứu này; JXA1, 07QN: 2 chủng
HP-PRRSV tham khảo trong Sg1. 10-NgAn: 02 mẫu thuộc Sg2 trong nghiên cứu này; VR-2332 chủng gốc Bắc
Mỹ, RespPRRS Repro: chủng vaccine.
Dựa vào bảng 3.3 ta thấy mức tương đồng về trình tự DNA chung giữa 2 nhóm phụ Sg1 (10-QuNi, 10HuY, 10-TiGi, 10-BaLi, JXA1, 07QN ) và Sg2 (VR-2332, RespPRRS Repro.) là 97,74%, trong đó giữa các trình
tự đại điện của 2 nhóm phụ là 91,2- 95,2% và mức tương đồng về trình tự amino acid chung là 98,72%, trong đó
giữa các trình tự đại điện của 2 nhóm phụ: 96,0 - 97,1%..
3.4. So sánh thành phần nucleotide và amino acid của chủng PRRSV nghiên cứu với một số chủng trên
thế giới.
Để nghiên cứu cụ thể hơn mức độ biến đổi thành phần nucleotide của gen M và thành phần amino acid
do gen đó mã hóa ở các chủng nghiên cứu chúng tôi tiến hành lựa chọn một số chủng PRRSV đã đăng ký trên
ngân hàng gen, bao gồm : chủng HP-PRRSV có độc tính cao JXA1, 07QN, 07NM, 07HEN, 07BJ, 07HEBTJ
trong nhóm phụ 1 và các chủng gốc Nam Mỹ VR-2332, chủng vaccine RespPRRS Repro và RespPRRS MLV.
3.4.1. Dựa trên thành phần nucleotide
Số hóa bởi trung tâm học liệu
/>
12
10-QuNi
10_HuY
10-TiGi
10-BaLi
JXA1_2006
07QN_2007
O7NM_2007
O7HEN_2007
O7BJ_2007
O7HEBTJ_2007
10-NgAn
VR2332_1993
RespPRRS/Repro_1999
RespPRRSMLV_2005
ATGGGGTCGT
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
........A.
..........
..........
..........
CTCTAGACGA
..........
..........
..T.......
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..T....T..
.CT....T..
.CT....T..
.CT....T..
*
*
GCGTTTTCCA
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
........T.
........T.
........T.
CTTCTGCAAT
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
......TC..
......TC..
......TC..
......TC..
**
TTACCTACAC
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
GATAGCACAG
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..C.....G.
........G.
........G.
........G.
*
GCCAGTGATG
..........
..........
......A...
..........
..........
..........
..........
..........
..........
....A.A...
..........
..........
..........
10-QuNi
10_HuY
10-TiGi
10-BaLi
JXA1_2006
07QN_2007
O7NM_2007
O7HEN_2007
O7BJ_2007
O7HEBTJ_2007
10-NgAn
VR2332_1993
RespPRRS/Repro_1999
RespPRRSMLV_2005
GGTGCTTTTG
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
A.........
..........
..........
..........
TAAAGGTAAG
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
....A..G..
.......G..
.......G..
.......G..
*
10-QuNi
CTGAATTGTG
10_HuY
..........
10-TiGi
..........
10-BaLi
..........
JXA1_2006
..........
07QN_2007
..........
O7NM_2007
..........
O7HEN_2007
..........
O7BJ_2007
..........
O7HEBTJ_2007
..........
10-NgAn
..........
VR2332_1993
..........
RespPRRS/Repro_1999 ..........
RespPRRSMLV_2005
..........
TCGCGGCCGA
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
.A.A......
..........
..........
..........
CTGCTAGGGC
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
T..T.G....
..........
..........
..........
TTCTGCACCT
..........
..........
.C........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
.......T..
..........
..........
..........
CTTTTACCTT
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
....C.....
....C.....
....C.....
CGGGTACATG
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
ACATTCGTGC
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..C.......
..T....C..
..T....C..
..T....C..
10-QuNi
10_HuY
10-TiGi
10-BaLi
JXA1_2006
07QN_2007
O7NM_2007
O7HEN_2007
O7BJ_2007
O7HEBTJ_2007
10-NgAn
VR2332_1993
RespPRRS/Repro_1999
RespPRRSMLV_2005
GTCGCGCTCA
..........
.........G
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
CTATGGGAGC
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
AGTGGTTGCA
..........
..........
...A......
...A......
...A......
...A......
...A......
...A......
...A......
...A......
...A......
...A......
...A......
AGCCATAGAA
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
ACCTGGAAAT
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
TCATCACCCC
........T.
........T.
........T.
........T.
........T.
........T.
........T.
........T.
10-QuNi
10_HuY
10-TiGi
10-BaLi
JXA1_2006
07QN_2007
O7NM_2007
O7HEN_2007
O7BJ_2007
O7HEBTJ_2007
10-NgAn
VR2332_1993
RespPRRS/Repro_1999
RespPRRSMLV_2005
10-QuNi
10_HuY
10-TiGi
10-BaLi
JXA1_2006
07QN_2007
O7NM_2007
O7HEN_2007
O7BJ_2007
CACAAATAGG
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
......C.A.
T.......A.
T.......A.
T.......A.
*
GAGTGTACTC
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
Số hóa bởi trung tâm học liệu
CTCCACAGAA
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
.C.....A..
.......A..
.....G.A..
.....G.A..
*
ATATATGCTC
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
........C.
........C.
........C.
........C.
*
TTTGATCTTT
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
.........C
.........C
.........C
.........C
*
ATTTTGAGAG
.C........
.C........
.C........
.C........
.C........
.C........
.C........
.C........
.C........
.C...C....
.C...C....
.C...C....
.C...C....
*
CTTCTTTGGG
..C.......
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..C.......
..C.......
..C.......
..C.......
*
CAGATGCCGT
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
150
150
150
150
150
150
150
150
150
150
150
150
150
150
200
200
200
200
200
200
200
200
200
200
200
200
200
200
250
250
250
250
250
250
250
250
250
250
250
250
250
250
300
300
300
300
300
300
300
300
300
/>
13
O7HEBTJ_2007
10-NgAn
VR2332_1993
RespPRRS/Repro_1999
RespPRRSMLV_2005
..........
.G........
.G........
.G........
.G........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
........T.
........T.
........T.
........T.
........T.
..........
..........
..........
..........
..........
300
300
300
300
300
TTGTGCTTGC
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
......C...
..........
..........
..........
TAGGCCGCAA
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
.........G
..........
..........
..........
GTACATTCTG
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
A.........
..........
..........
..........
GCCCCTGCCC
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
350
350
350
350
350
350
350
350
350
350
350
350
350
350
AAGTGCCGCG
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
G........A
.........A
.........A
.........A
*
10-QuNi
TCGTCCGGCG
10_HuY
C.........
10-TiGi
..........
10-BaLi
..........
JXA1_2006
..........
07QN_2007
..........
O7NM_2007
..........
O7HEN_2007
..........
O7BJ_2007
..........
O7HEBTJ_2007
..........
10-NgAn
..........
VR2332_1993
..........
RespPRRS/Repro_1999 ..........
RespPRRSMLV_2005
..........
GGCTTTCATC
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
C.G.......
..........
..........
CGATTGCGGG
.........C
.........C
.........C
.........C
.........C
.........C
.........C
.........C
.........C
.........C
.........C
.........C
.........C
AAATGATAAC
..........
..G.......
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
ACCACGTCGA
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
.......T..
.......T..
.......T..
.......T..
*
CACGCATTTG
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
TCCCGGCTCC
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
......T...
..........
..........
..........
ACTACGGTCA
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..C..A....
..........
..........
..........
ACGGCACATT
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
GGTGCCCGGG
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
...A......
..........
..........
..........
450
450
450
450
450
450
450
450
450
450
450
450
450
450
10-QuNi
10_HuY
10-TiGi
10-BaLi
JXA1_2006
07QN_2007
O7NM_2007
O7HEN_2007
O7BJ_2007
O7HEBTJ_2007
10-NgAn
VR2332_1993
RespPRRS/Repro_1999
RespPRRSMLV_2005
*
10-QuNi
10_HuY
10-TiGi
10-BaLi
JXA1_2006
07QN_2007
O7NM_2007
O7HEN_2007
O7BJ_2007
O7HEBTJ_2007
10-NgAn
VR2332_1993
RespPRRS/Repro_1999
RespPRRSMLV_2005
CTGAAAAGCC
T.........
T.........
T.........
T.........
T.........
T.........
T.........
T.........
T.........
T.........
T.A.......
T.A.......
T.A.......
TCGTGTTGGG
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
TGGCAGAAAA
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
GCTGTTAAGC
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
........A.
........A.
........A.
........A.
AGGGAGTGGT
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
.A........
..........
..........
..........
500
500
500
500
500
500
500
500
500
500
500
500
500
500
AAACCTTGTT
..........
..........
.........C
..........
..........
..........
..........
..........
..........
.........C
.........C
.........C
.........C
*
AAATATGCCA
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
AATAA
.....
.....
.....
.....
.....
.....
.....
.....
.....
.....
.....
.....
.....
Hình 3.6. (Tiếp theo)
10-QuNi
10_HuY
10-TiGi
10-BaLi
JXA1_2006
07QN_2007
O7NM_2007
O7HEN_2007
O7BJ_2007
O7HEBTJ_2007
10-NgAn
VR2332_1993
RespPRRS/Repro_1999
RespPRRSMLV_2005
10-QuNi
10_HuY
10-TiGi
10-BaLi
JXA1_2006
07QN_2007
O7NM_2007
O7HEN_2007
O7BJ_2007
O7HEBTJ_2007
10-NgAn
VR2332_1993
RespPRRS/Repro_1999
RespPRRSMLV_2005
Số hóa bởi trung tâm học lieäu
400
400
400
400
400
400
400
400
400
400
400
400
400
400
525
525
525
525
525
525
525
525
525
525
525
525
525
525
/>
14
Hình 3.6. So sánh trình tự DNA gen M của 4 mẫu nghiên cứu 10-QuNi, 10-HuY, 10-TiGi, 10-BaLi với các chủng
HP-PRRSV có độc tính cao trong nhóm phụ 1 và trình tự của mẫu 10-NgAn với các các chủng gốc Nam Mỹ VR2332, và các chủng vắc xin RespPRRS Repro, RespPRRS MLV. Trong đó: *) đánh dấu các điểm đột biến đặc
trưng để phân biệt giữa 2 nhóm phụ trong nhóm PRRSV Bắc Mỹ
Kết quả cho thấy:
- Gen M của 5 chủng nghiên cứu có độ dài 525 bp , tương đồng với các chủng so sánh và cùng thuộc
type 2 ( Bắc Mỹ)
- Gen M của chủng 10-QuNi có 5 sai khác nucleotide ở vị trí 192 (T↔C), ở vị trí 289 (C↔T), 380
(G↔C) , 451 (C↔ T) khi so sánh với trình tự tương ứng với các chủng 10-HuY, 10-TiGi, 10-BaLi, JXA1,
07QN, 07NM, 07HEN, 07BJ, 07HEBTJ, 10-NgAn, ở vị trí 243 (T↔ C) so với các chủng 10-HuY, 10-NgAn.
Khi so sánh với các chủng VR-2332, RespPRRS Repro, RespPRRS MLV thuộc dịng Bắc Mỹ chủng 10-QuNi
có đến 29 nucleotide sai khác ở các vị trí : 12, 13, 18, 27, 28, 39, 48, 69, 99, 108, 150, 165, 183, 188, 192, 196,
201, 209, 234, 243, 252, 289, 348, 360, 380, 451, 453, 489, 510 .
- Gen M của chủng 10-HuY có 3 sai khác nucleotide ở vị trí 242 (T↔C), 401 (T↔C) và 234 (A↔G)
khi so sánh với trình tự tương ứng với các chủng JXA1, 07QN, 07NM, 07HEN, 07BJ, 07HEBTJ. Có 20 sai khác
ở các vị trí : 12, 13, 18, 27, 28, 39, 48, 69, 99, 108, 150, 165, 183, 188, 234, 252, 348, 453, 489, 510 khi so sánh
với trình tự tương ứng với các chủng VR-2332, RespPRRS Repro, RespPRRS MLV
- Gen M của chủng 10-TiGi khi so sánh với trình tự tương ứng với các chủng JXA1, 07QN, 07NM,
07HEN, 07BJ, 07HEBTJ chỉ có 3 sai khác nucleotide ở các vị trí 220, 234 và 383 (A↔G). Khi so sánh với các
chủng VR-2332, RespPRRS Repro, RespPRRS MLV chủng 10-TiGi có 24 nucleotide sai khác ở các vị trí : 12,
13, 18, 27, 28, 39, 48, 69, 99, 108, 150, 165, 183, 188, 196, 201, 209, 243, 252, 348, 360, 453, 489, 510.
- Chủng 10-BaLi có 4 sai khác nucleotide ở vị trí 13 (C↔T), 86 (G↔A), 132 và 510 (T↔C). Có 23 sai
khác nucleotide ở các vị trí : 12, 18, 27, 28, 39, 48, 69, 99, 108, 150, 165, 183, 188, 196, 201, 209, 243, 252,
348, 360, 453, 489, 510.
- Chủng 10-NgAn có tới 41 sai khác ở các vị trí 9, 13, 18, 27, , 28, 33 , 42, 39, 47, 51, 75 ,77, 99 ,105,
108 ,112, 114 , 121 ,124 , 126, 138, 150, 183, 196, 207, 209, 243, 252, 307, 320, 321, 347, 351, 360, 417, 423,
426, 444, 489, 492, 510 khi so sánh với trình tự tương ứng với các chủng JXA1, 07QN, 07NM, 07HEN, 07BJ,
07HEBTJ. Đối với các chủng VR-2332, RespPRRS Repro, RespPRRS MLV cũng có tới 28 vị trí sai khác 9, 12,
33, 42, 51, 69, 75, 77, 105, 112, 114, 121, 124, 126, 138, 165, 173, 178, 207,307, 320, 321, 351, 417, 423, 426,
492.
Như vậy chủng 10-QuNi có mức độ đồng nhất với các chủng 10-HuY, 10-TiGi, 10-BaLi rất cao, và các
chủng này gần gũi với các chủng độc lực cao JXA1, 07QN, 07NM, 07HEN, 07BJ, 07HEBTJ. Tuy nhiên khi so
sánh với các chủng VR-2332, RespPRRS Repro, RespPRRS MLV là nhũng đại diện đặc trưng của vùng Bắc Mỹ
thì có mức tương đồng thấp hơn. Đối với chủng 10-NgAn có sự sai khác rõ rệt với các chủng so sánh, cần có
thêm những nghiên cứu về chủng này để có nhứng kết luận chính xác về chủng này.
3.4.2. Dựa trên trình tự amino acid
Số hóa bởi trung tâm học liệu
/>
15
10-QuNi
10_HuY
10-TiGi
10-BaLi
JXA1_2006
07QN_2007
O7NM_2007
O7HEN_2007
MGSSLDDFCN
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
DSTAPQKVLL
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
AFSITYTPVM
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
IYALKVSRGR
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
40
40
40
40
40
40
40
40
..........
..........
.........H
.........H
.........H
.........H
*
10-QuNi
LLGLLHLLIF
10_HuY
..........
10-TiGi
..........
10-BaLi
..........
JXA1_2006
..........
07QN_2007
..........
O7NM_2007
..........
O7HEN_2007
..........
O7BJ_2007
..........
O7HEBTJ_2007
..........
10-NgAn
..........
VR2332_1993
..........
RespPRRS/Repro_1999 ..........
RespPRRSMLV_2005
..........
..........
..........
..........
..........
.....E....
.....E....
..........
..........
........I.
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
40
40
40
40
40
40
LNCAFTFGYM
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
VALTMGAVVA
..........
...A......
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
80
80
80
80
80
80
80
80
80
80
80
80
80
80
10-QuNi
10_HuY
10-TiGi
10-BaLi
JXA1_2006
07QN_2007
O7NM_2007
O7HEN_2007
O7BJ_2007
O7HEBTJ_2007
10-NgAn
VR2332_1993
RespPRRS/Repro_1999
RespPRRSMLV_2005
LLWGVYSAIE
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
TWKFITPRCR
......S...
......S...
......S...
......S...
......S...
......S...
......S...
......S...
......S...
......S...
......S...
......S...
......S...
TFVHFESTNR
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
.....Q...K
..A..Q...K
..A..Q...K
..A..Q...K
*
*
LCLLGRKYIL
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
......R...
..........
..........
..........
APAHHVESAA
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
120
120
120
120
120
120
120
120
120
120
120
120
120
120
10-QuNi
10_HuY
10-TiGi
10-BaLi
JXA1_2006
07QN_2007
O7NM_2007
O7HEN_2007
O7BJ_2007
O7HEBTJ_2007
10-NgAn
VR2332_1993
RespPRRS/Repro_1999
RespPRRSMLV_2005
GFHPIAGNDN
......A...
......AS..
......A...
......A...
......A...
......A...
......A...
......A...
......A...
......A...
R.....A...
......A...
......A...
HAFVVRRPGS
...A......
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
TTVNGTLVPG
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
LKSLVLGGRK
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
160
160
160
160
160
160
160
160
160
160
160
160
160
160
10-QuNi
10_HuY
10-TiGi
10-BaLi
JXA1_2006
07QN_2007
O7NM_2007
O7HEN_2007
O7BJ_2007
O7HEBTJ_2007
10-NgAn
VR2332_1993
RespPRRS/Repro_1999
RespPRRSMLV_2005
AVKQGVVNLV
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
KYAK
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
Hình 3.7. (Tiếp theo)
O7BJ_2007
O7HEBTJ_2007
10-NgAn
VR2332_1993
RespPRRS/Repro_1999
RespPRRSMLV_2005
174
174
174
174
174
174
174
174
174
174
174
174
174
174
Hình 3.7.So sánh trình tự amino acid gen M của 4 mẫu nghiên cứu 10-QuNi, 10-HuY, 10-TiGi, 10-BaLi với các
chủng HP-PRRSV có độc tính cao JXA1, 07QN, 07NM, 07HEN, 07BJ, 07HEBTJ trong Sgza 1 và trình tự của
Số hóa bởi trung tâm học liệu
/>
16
mẫu 10-NgAn với các các chủng gốc Nam Mỹ VR-2332, và các chủng vaccine RespPRRS Repro, RespPRRS
MLV
Trong đó:*) đánh dấu các điểm đột biến đặc trưng để phân biệt giữa 2 nhóm phụ trong nhóm PRRSV Bắc Mỹ
Từ kết quả so sánh thành phần nucleotide, chúng tôi tiến hành so sánh thành phần amino acid tương ứng
do đoạn gen này quy định mã hóa. Kết quả so sánh trình tự amino acid được trình bày ở hình 3.8 cho thấy:
- Chuỗi gen M của 5 chủng nghiên cứu có độ dài là 174 amino acid giống như độ dài trình tự
polypeptide của các chủng so sánh.
- Chủng 10-QiNi có 3 sự khác biệt so với chuỗi polypeptide M tương ứng của các chủng có độc lực cao
JXA1, 07QN, 07NM, 07HEN, 07BJ, 07HEBTJ ở các vị trí: 97 (S↔P), 127 (A↔G), 134 (A↔V). Đối với các
chủng VR-2332, RespPRRS Repro, RespPRRS MLV có 6 sự khác biệt ở các vị trí: 10 (N↔H); 63 (V↔A); 66
(E↔Q); 70 (R↔K); 97 (S↔P); 127 (A↔G).
- Chủng 10-HuY và 10-BaLi, 10-TiGi có 4 sự khác biệt so với chuỗi polypeptide M tương ứng của
chủng gốc Bắc Mỹ (VR-2332, RespPRRS Repro, RespPRRS MLV) ở các vị trí : 10 (N↔H); 63 (V↔A); 66
(E↔Q); 70 (R↔K); Riêng chủng 10-HuY có thêm sự khác biệt ở vị trí 134 (V↔A) và chủng 10-TiGi có thêm
sự khác biệt ở 2 vị trí 74 (T↔A); 128 (N↔S). Trong khi đó khơng có sự khác biệt nào về trình tự amino acid so
với các chủng có độc lực cao JXA1, 07QN, 07NM, 07HEN, 07BJ, 07HEBTJ.
- Chủng 10-NgAn có 5 sự khác biệt so với chuỗi polypeptide M tương ứng của các chủng có độc lực
cao JXA1, 07QN, 07NM, 07HEN, 07BJ, 07HEBTJ ở các vị trí: 10 (N↔H); 29(V↔I); 66 (E↔Q); 70 (R↔K);
107 (K↔R). Khi so sánh với các chủng VR-2332, RespPRRS Repro, RespPRRS MLV thì chủng 10-NgAn cũng
có sự khác biệt so với chuỗi polypeptide tương ứng ở các vị trí: 63 (A↔V); 117 (K↔R).
Như vậy, về thành phần amino acid, chuỗi polypeptide của gen M của các chủng 10-HuY ,10-BaLi, 10TiGi có sự tương đồng cao với trình tự chuỗi tương ứng với các chủng độc lực cao cao JXA1, 07QN, 07NM,
07HEN, 07BJ, 07HEBTJ, ít hơn so với chủng gốc Bắc Mỹ. Riêng chủng 10-NgAn có sự tương đồng về trinh tự
amino acid cao so với các chủng gốc Bắc Mỹ.
- Như vậy có 17 điểm đột biến đặc trưng trên trình tự DNA của gen M giữa các chủng PRRSV gốc
(Prototype) và các chủng có tính độc dược cao (HP-PRRSV)
- Có 3 điểm đột biến đặc trưng trên trình tự Amino acid cuả gen M giữa các chủng PRRSV gốc
(Prototype) và các chủng có tính độc dược cao (HP-PRRSV)
- Từ những kết quả trên ta thấy rằng giữa chủng 10-NgAn có khác biệt với 4 chủng 10-QuNi, 10-HuY,
10-TiGi, 10-BaLi ở 17 điểm đột biến đặc trưng trên trình tự DNA của chúng và 3 điểm đột biến đặc trưng trên
trình tự amino acid của chúng.
Như ta đã biết, đột biến trong các ectodormain có thể thay đổi vai trị xâm nhập, mục tiêu đáp ứng miễn
dịch, và vaccine của virus. Trong nghiên cứu này, đột biến tại 2 ectodormains trên trình tự của gen M có lẽ phản
ánh quan hệ chủng loại giữa các chủng PRRSV có độc tính cao (đại diện là chủng 07QN và JXA1) với các
chủng PRRSV gốc với đại diện là chủng VR2332. Các vị trí đột biến N10H và Q16L ở ectodormain G2-L19 và
Số hóa bởi trung tâm học liệu
/>
17
V63A, E66Q và R70K ở ectodormain A63-K70 có thể phản ánh độc tính cao của các chủng năm 2006-2007 so
với với các chủng gốc. Tuy nhiên, nghiên cứu cụ thể về các đột biến trên cần được nghiên cứu thêm.
- Từ 2009, một số chủng PRRSV mới lại xuất hiện với độc tính cao hơn so với các chủng năm 20062007, đặc biệt ở Trung Quốc [14] và có thể ở Việt Nam [9]. Tuy nhiên, M gen là gen bảo thủ, ít biến đổi nên
chủng loại quả 5 chủng PRRSV trong nghiên cứu này chỉ thấy thuộc 2 nhóm, 4 chủng thuộc nhóm PRRSV
2006-2007 và 1 chủng gần với nhóm gốc. Cần phải phân tích, so sánh các gen có mức đột biến cao như GP3,
GP5 hoặc N để tìm hiểu sâu hơn về chủng loại của 5 chủng trong nghiên cứu này.
Sự biến đổi của 5 chủng virus PRRS phân lập trong nghiên cứu này có thể giải thích rằng như sau: Các
chủng 10-Bali, 10-QuNi, 10-HuY, 10-TiGi (trong nhóm 1) có thể được phát triển chủng VR2332 với sự 3 đột
biến thay thế amino acid của gen M, chủng 10-NgAn chỉ có 1 sự thay thế giữa các trình tự axit amin trong tổng
số 174 aa của gen M. Một chủng mới của virus PRRS (07QN) được phân lập tại Việt Nam đã được tìm thấy vào
năm 2007 và phân tích phát sinh lồi với một số chủng mới và có độc lực cao của Trung Quốc trong năm 2007
[30]. Các chủng 10-Bali, 10-QuNi, 10-HuY, 10-TiGi trong nghiên cứu này cùng nhóm với những chủng tìm
thấy ở Việt Nam và Trung Quốc trong năm 2007 có thể cũng là điển hình virus PRRS chủng có độc lực cao. Các
chủng này có thể là một trong những tác nhân gây dịch bệnh tai xanh tại 21 tỉnh của Việt Nam trong năm 2010,
bao gồm 4 tỉnh, nơi cô lập 10-Bali đã được thu thập trong năm 2010 và xác định trong nghiên cứu này. Ngồi sự
biến đổi nhanh chóng của virus PRRS, sự phát sinh những biến thể độc lực cao của các chủng trong nghiên cứu
này có thể cũng là do q trình chăn ni lợn ở Việt Nam, trong đó bao gồm sự vận chuyển lợn sống trong nước
hay giữa các quốc gia và giết mổ lợn tại Việt Nam [23]. Do đó, các chủng virus PRRS khác nhau có thể được
vận chuyển đến Việt Nam từ các nước láng giềng và các chủng khác nhau đã được lưu hành từ tỉnh này sang tỉnh
khác trong nước.
Soá hóa bởi trung tâm học liệu
/>
18
Chƣơng 4 : KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Từ kết quả thu được trong q trình nghiên cứu chúng tơi có một số kết luận sau:
1. Đã phân lập và giải trình tự thành cơng gen M của 5 chủng virus PRRS trong nghiên cứu phân lập từ
5 địa phương khác nhau Quảng Ninh, Hưng Yên, Nghệ An, Bạc Liêu, Tiền Giang ký hiệu theo thứ tự là 10QiNi, 10-HuY, 10-NgAn, 10-BaLi, 10-TiGi.
2. Dựa vào phân tích trình tự nucleotide và amino acid do gen M mã hóa, 2 subgroup của virus PRRS
được xác định từ 5 dòng virus PRRS phân lập ở 5 tỉnh của Việt Nam với mức sai khác di truyền tin cậy giữa các
dòng là từ 91-99% . Kết quả nghiên cứu lần đầu tiên được cơng bố, làm cơ sở để phân tích các biến chủng của
virus PRRS cũng như sản xuất vaccine phòng chống dịch bệnh ở Việt Nam hiện nay.
KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục nghiên cứu virus PRRS mới những năm gần đây, lưu giữ nguồn gen M của các chủng phân
lập ở các địa phương khác nhau ở Việt Nam trong các năm tiếp theo và giải mã để so sánh phân tích với các
chủng khác.
2. Phân tích số lượng cỡ mẫu nhiều hơn về tính ổn định của các dịng gen nhằm chọn lọc đúng nguồn
gen thích hợp làm nguyên liệu cho kiến tạo chế phẩm mới đặc biệt vaccine ở Việt Nam.
3. Giải mã gen M và toàn bộ hệ gen của một số chủng mới để phân tích so sánh với các chủng khác để
có cơ sở dữ liệu đánh giá biến đổi di truyền của virus PRRS hiện nay và định hướng tương quan miễn dịch và
vaccine phịng bệnh.
Số hóa bởi trung tâm học liệu
/>
