Nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện hiv bằng dot blot với các protein gp120 gp41 p24 tái tổ hợp

..

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
…………..o0o…………..

NGUYỄN QUANG ANH

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ SINH PHẨM PHÁT
HIỆN HIV BẰNG DOT BLOT VỚI CÁC PROTEIN
GP120, GP41, P24 TÁI TỔ HỢP

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Hà Nội – 2010
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
…………..o0o…………..

NGUYỄN QUANG ANH

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ SINH PHẨM PHÁT
HIỆN HIV BẰNG DOT BLOT VỚI CÁC PROTEIN
GP120, GP41, P24 TÁI TỔ HỢP

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Hà Nội – 2010
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Luận văn cao họcK12

MỤC LỤC
CHƢƠNG I TỔNG QUAN
Mở đầu-----------------------------------------------------------------------------------1.1 Tình hình nhiễm HIV/AIDS trên thế giới -------------------------------------1.1.1 Lịch sử quá trình phát hiện HIV/AIDS. ---------------------------------------1.1.2 Tình hình nhiễm HIV/AIDS trên thế giới. ------------------------------------1.2 Tình hình nhiễm HIV/AIDS và nghiên cƣ́u HIV ở Việt Nam. ------------1.3 Đặc điểm của HIV----------------------------------------------------------------1.3.1 Giới thiệu chung. -----------------------------------------------------------------1.3.2 Đặc điểm hình thái cấu trúc HIV.----------------------------------------------1.4 Phân loại HIV. --------------------------------------------------------------------1.4.1 HIV-1-------------------------------------------------------------------------------1.4.2 HIV-2-------------------------------------------------------------------------------1.5 Đặc điểm sinh vật học của HIV. -----------------------------------------------1.6 Nguồn truyền nhiễm và đối tƣợng cảm thụ HIV. ----------------------------1.7 Các phƣơng thức lây truyền của HIV------------------------------------------1.8 Sƣ̣ xâm nhập tế bào và nhân lên của HIV. -----------------------------------1.9 Đáp ƣ́ng miễn dị ch của cơ thể khi nhiễm HIV/AIDS. ----------------------1.9.1 Nhƣ̃ng thay đổi miễn dị ch khi nhiễm HIV. ----------------------------------1.9.2 Suy giảm miễn dị ch do nhiễm HIV. -------------------------------------------1.9.3 Diễn biến huyết thanh ngƣời nhiễm HIV/AIDS. -----------------------------1.10 Các kĩ thuật phát hiện HIV trong cơ thể. -------------------------------------1.10.1 Phát hiện trực tiếp sự có mặt của HIV. ---------------------------------------1.10.2 Phát hiện kháng nguyên của HIV. --------------------------------------------1.10.3 Các kỹ thuật sinh học phân tử trong xét nghiệm HIV. --------------------1.10.4 Phát hiện gián tiếp sự có mặt của HIV. -------------------------------------1.10.5 Các bộ sinh phẩm chẩn đoán HIV. -------------------------------------------1.10.6 Nghiên cƣ́u các protein tái tổ hợp để tạo kit chẩn đoán. ------------------1.11 Điều trị HIV/AIDS-----------------------------------------------------------------

3
5
5
7
8
10
10
10
15
15
18
18
19
19
20

23
23
24
26
28
28
29
30
31
34
35
37

40
Đối tƣợng, vật liệu. --------------------------------------------------------------- 40
Đối tƣợng. -------------------------------------------------------------------------- 40
Các sinh phẩm---------------------------------------------------------------------- 40
Hóa chất vật liệu-------------------------------------------------------------------- 40
Dung dị ch và mơi trƣờng---------------------------------------------------------- 40

CHƢƠNG II ĐỚI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U------

2.1
2.1.1
2.1.2
2.1.3
2.1.4

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Nguyễn Quang Anh



1


Luận văn cao họcK12

2.1.5 Thiết bị và máy móc--------------------------------------------------------------2.2 Phƣơng pháp nghiên cƣ́u--------------------------------------------------------2.2.1 Phƣơng pháp điện di trên gel và polyacrylamide. ----------------------------2.2.2 Phƣơng pháp biểu hiện protein tái tổ hợp trong E. coli chủng BL21. -----2.2.3 Tinh chế protein dung hợp bằng cột Probond Nikel Resin. -----------------2.2.4 Phƣơng pháp Western blot-------------------------------------------------------2.2.5 Đị nh lƣợng protein bằng phƣơng pháp Bradford-----------------------------2.2.6 Nuôi cấy biểu hiện và thu nhận protein tái tổ hợp gp120-------------------2.2.7 Nuôi cấy biểu hiện và thu nhận protein tái tổ hợp gp41---------------------2.2.8 Nuôi cấy biểu hiện và thu nhận protein tái tổ hợp p24. ---------------------2.2.9 Phƣơng pháp chế tạo bộ kit dot blot chẩn đoán HIV------------------------CHƢƠNG III KẾT QUẢ ĐẠT ĐƢỢC------------------------------------------------3.1 Biểu hiện protein tái tổ hợp gp120. -------------------------------------------3.2 Tinh chế protein tái tổ hợp. -----------------------------------------------------3.3 Nghiên cƣ́u khả năng phản ƣ́ng gp120 tái tổ hợp với kháng thể kháng
HIV trong huyết thanh bệnh nhân HIV bằng western blot. ------------------------3.4 Kết quả biểu hiện, tinh sạch gp41 của HIV-1 phân type CRF01_AE. ----3.4.1 Tối ƣu hóa điều kiện biểu hiện và xác đị nh trạng thái gp41 tái tổ hợp. ---3.4.2 Tinh sạch gp41 tái tổ hợp--------------------------------------------------------3.5 Kiểm tra khả năng phát hiện khá ng thể kháng HIV trong huyết thanh
bệnh nhân bằng western blot. ----------------------------------------------------------3.6 Biểu hiện và tinh sạch protein p24----------------------------------------------3.7 Phát hiện kháng thể trong huyết thanh bệnh nhân. ---------------------------3.8 Kết quả nghiên cƣ́u chế tạo bộ kit dot blot chẩn đoán HIV. ----------------KẾT LUẬN --------------------------------------.----------------------------------------KIẾN NGHỊ ------------------------------------------------------------------------------PHỤ LỤC ------------------------------------------------------------------------------

44
45
45
46
47
50
50
53
53
54
55
57
57
58

TÀI LIỆU THAM KHẢO----------------------------------------------------------------

87

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Nguyễn Quang Anh

59
61
61
62
65
66
66
66
68
75
77



2


Luận văn cao họcK12

MỞ ĐẦU
Hơn hai thập kỷ qua, nhân loại phải đƣơng đầu với đại dịch HIV/AIDS nguy
hiểm, có tốc đợ lây trùn cao, chƣa có vacxin phịng bệnh và chƣa có thuốc điều trị
đặc hiệu. HIV/AIDS không chỉ là nguyên nhân cƣớp đi hàng triệu sinh mạng trên thế
giới mà cịn là hiểm họa tác đợng nghiêm trọng đến mọi khía cạnh của đời sống xã

hợi làm ảnh hƣởng tới kinh tế, văn hoá, xã hợi, nịi giống của mỗi quốc gia. Theo báo
cáo của Tở chức phịng chống AIDS của Liên Hợp Quốc (UNAIDS) và Tổ chức Y tế
thế giới (WHO), đến năm 2008 trên thế giới có 33,4 triệu ngƣời đang sống chung với
HIV, mỗi năm có 2,7 triệu ngƣời nhiễm mới và 2 triệu ngƣời tử vong do AIDS. Tại
Việt Nam, từ khi ca nhiễm đầu tiên đƣợc thông báo vào năm 1990 ở thành phố Hồ
Chí Minh, số lƣợng ngƣời nhiễm HIV đang ngày càng tăng lên. Tính đên 31/3/2009,
tồn quốc có 144.483 ngƣời nhiễm HIV, 30.996 ngƣời đã chuyển sang giai đoạn
AIDS còn sống, 42.447 ngƣời đã tử vong vì AIDS .
Có hai type HIV gây bệnh ở ngƣời là HIV-1 và HIV-2. Tuy nhiên, HIV-2 chỉ
lƣu hành ở châu Phi, còn HIV-1 thì lƣu hành rộng rãi và gây bệnh chủ yếu ở tất cả các
châu lục. Dựa vào sự biến đổi về gen của HIV-1, ngƣời ta chia HIV-1 ra thành 3
nhóm M, N và O. Các nhóm này có thể đƣợc chia ra thành các phân type, mỗi
phân type lại có phân vùng địa lý khác nhau. Ngồi các phân type, các thể tái tổ hợp
giữa các phân type (CRF) cũng đang xuất hiện ngày càng nhiều và làm cho việc
nghiên cứu về HIV-1 ngày càng trở nên phức tạp và khó khăn [41].
Hiểu đƣợc sự lƣu hành của các phân type HIV cũng nhƣ các thể tái tổ hợp của
chúng ở mỗi vùng địa lý khác nhau không chỉ có ý nghĩa quyết định cho việc nghiên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Nguyễn Quang Anh



3


Luận văn cao họcK12

cứu và triển khai vắc xin phòng chống HIV mà cịn có giá trị trong sản xuất kit chẩn

đoán thích hợp cho từng vùng.
Các cơng trình nghiên cứu về HIV có sự phân biệt ƣu tiên theo địa lý các
nƣớc giàu nghèo. Phân type C xuất hiện chủ yếu tại châu Phi, châu Á và phân type
CRF01_AE lƣu hành chủ yếu tại các nƣớc khu vực Đông Nam Á, tuy nhiên hầu hết
các nghiên cứu về HIV hiện nay đều tập trung vào phân type B, vì phân type này lƣu
hành chủ yếu ở các nƣớc phát triển.
Nghiên cứu để biết rõ hơn về đặc tính di truyền và kháng nguyên của các phân
typ HIV lƣu hành chủ yếu ở Việt Nam từ đó chế tạo các bộ kit chẩn đoán huyết thanh
học có độ nhạy và độ đặc hiệu cao trên cơ sở các kháng nguyên tái tổ hợp GP120,
GP41 và P24 biểu hiện từ các phân typ HIV lƣu hành ở Việt nam là mục tiêu của đề
tài “Nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện HIV bằng dot blot với các protein
GP120, Gp41 và P24 tái tổ hợp”
Đề tài đƣợc đặt ra với các mục tiêu cụ thể sau:
-

Tạo ra đƣợc các kháng nguyên GP120, GP41, P24 có độ tinh sạch, độ đặc hiệu

đảm bảo cho chế tạo kit chẩn đoán.
-

Xây dựng đƣợc quy trình cơng nghệ sản xuất bợ kit chẩn đoán HIV bằng dot

blot,đợ đặc hiệu cao có thể sử dụng cho chẩn đoán HIV.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Nguyễn Quang Anh

4


Luận văn cao họcK12

CHƢƠNG I
TỔNG QUAN
1.1. TÌNH HÌNH NHIỄM HIV/AIDS TRÊN THẾ GIỚI
1.1.1. Lịch sử quá trình phát hiện HIV/AIDS
Quá trình diễn biến HIV/AIDS trên thế giới chia 3 giai đoạn [21].
-

Thời kỳ “yên lặng” 1970-1981.

HIV đã bắt đầu xuất hiện âm thầm từ những năm 70 của thế kỷ XX. Ngƣời ta đã tìm
thấy kháng thể (KT) kháng HIV trong các mẫu máu đƣợc bảo quản ở Zaire (1959) và
ở Mỹ (1970).
-

Thời kỳ phát hiện virus 1981-1985.

Ở thời kỳ này, các nhà khoa học đã phân lập đƣợc virus, xác định đƣợc phƣơng thức
truyền bệnh và phát triển các kỹ thuật phát hiện virus.
+ Năm 1981, Trung tâm kiểm sốt và phịng ngừa bệnh tật Hoa Kỳ (CDC) đã xác
định đƣợc những bệnh nhân mắc hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS) đầu
tiên trên thế giới dựa trên sự phát hiện và mô tả bệnh của bác sỹ Michạel Gottlieb về
5 thanh niên đồng tính luyến ái bị viêm phổi nặng do Pneumocystis carinii ở Los
Angeles và 226 nam thanh niên đồng tính luyến ái mắc ung thƣ da Sarcoma Kaposi.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Nguyễn Quang Anh



5


Luận văn cao họcK12

Điều đặc biệt là ở những bệnh nhân này đều có sự suy giảm nặng nề hệ thống miễn
dịch, về cả số lƣợng và chức năng của tế bào miễn dịch, quan trọng nhất là sự giảm tế
bào TCD4.
+ Năm 1982, nhiều nơi đã công bố căn bệnh tƣơng tự nhƣ trên ở các bệnh nhân phải
truyền máu nhiều lần, ở các đối tƣợng nghiện chích ma tuý, ở những ngƣời mẹ và đứa
con do họ đẻ ra.
Cuối 1982, dựa trên những trƣờng hợp AIDS đầu tiên đƣợc thông báo, CDC đã đƣa ra
tiêu chuẩn đầu tiên về các triệu chứng lâm sàng chẩn đoán bệnh AIDS khi chƣa có
phƣơng pháp xét nghiệm căn nguyên.
+ Năm 1985, Hội nghị danh pháp quốc tế đã thống nhất gọi tên các virus LAV
(Lymphodenopathy Associated Virus), HTLV III (Human T Lymphotropic Virus III),
ARV (AIDS Related Virus) là virus gây suy giảm miễn dịch ở ngƣời (Human
Immunodefiency Virus- HIV).
+ Năm1984-1985, đã xác định kỹ thuật phát hiện KT kháng HTLV III và ch̉n hố
bợ sinh phẩm phát hiện KT kháng HIV bằng kỹ thuật miễn dịch hấp phụ enzym
ELISA để sàng lọc máu và phát hiện lâm sàng
-

Thời kỳ 1985- nay: Đây là thời kỳ toàn thế giới chống AIDS.

+ Năm 1987, thử nghiệm lâm sàng đầu tiên với AZT (Azidothymidine) nhƣ một
thuốc chống Retrovirus.
+ Năm 1989, đƣa ra các hƣớng dẫn điều trị bằng AZT cho những ngƣời nhiễm HIV
và bệnh nhân AIDS trên cơ sở số lƣợng tế bào TCD4 của ngƣời bệnh.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Nguyễn Quang Anh



6


Luận văn cao họcK12

+ Năm 1993, CDC đƣa ra tiêu chuẩn để xác định bệnh AIDS.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Nguyễn Quang Anh



7


Luận văn cao họcK12

1.1.2. Tình hình nhiễm HIV/AIDS trên thế giới
Đại dịch HIV/AIDS tuy xuất hiện chƣa lâu, mới bắt đầu vào những năm 70-80

của thế kỷ XX nhƣng đã nhanh chóng lan tràn trên tồn cầu, tấn cơng mọi đối tƣợng
không phân biệt lứa tuổi, nghề nghiệp, địa vị xã hợi nhƣ phụ nữ, trẻ em, thanh niên,
ngƣời có t̉i, ngƣời đồng tính luyến ái, ngƣời nghiện chích ma tuý. Dịch liên tục
phát triển về cả không gian và thời gian trở thành đại dịch nguy hiểm. Đại dịch này
gồm nhiều vụ dịch xảy ra ở từng nƣớc, từng lục địa, có phƣơng thức lây truyền, biểu
hiện lâm sàng đặc trƣng riêng phụ thuộc vào nguồn gốc virus, đối tƣợng nhiễm, điều
kiện kinh tế xã hội và tập quán từng nƣớc. Ban đầu xuất hiện, dịch chủ yếu xảy ra tại
các nƣớc công nghiệp phát triển ở Bắc Mỹ, Úc, và Tây Âu, tại các thành phố lớn, ở
những ngƣời đồng tính luyến ái và ngƣời nghiện chích ma tuý. Từ đó, dịch lan tràn
khắp các nƣớc, gây tác hại to lớn tại châu Phi, vùng Caribe với số lƣợng ngƣời nhiễm
HIV rất cao. Đến nay, khu vực Nam phi vẫn là vùng có số lƣợng bệnh nhân cao nhất
trên thế giới và riêng tại khu vực Sahara đã có tới 25,8 triệu ngƣời nhiễm HIV, chiếm
64% tổng số ngƣời nhiễm HIV trên thế giới.
Ở Châu Á, dịch HIV/AIDS đến muộn bắt đầu từ cuối những năm 80 của thế kỷ
XX nhƣng phát triển rất nhanh với phƣơng thức lây truyền đa dạng phản ánh tính đa
dạng về xã hội, kinh tế và văn hoá.Theo dự đoán của WHO, đại dịch HIV/AIDS sẽ có
xu thế dịch chuyển về Châu Á mà điểm nóng là Thái lan, Ấn Đợ, Campuchia và
Indonesia.Vì vậy cần phải có các chƣơng trình khống chế và dự phịng HIV/AIDS kịp
thời, mạnh mẽ. Mợt tình trạng đáng báo động khi 70% ngƣời dân Ontania trên đảo
Bomeo, Indonesia kết quả xét nghiệm HIV dƣơng tính.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Nguyễn Quang Anh



8

Luận văn cao họcK12

1.2. TÌNH HÌNH NHIỄM HIV/AIDS VÀ NGHIÊN CỨU HIV Ở VIỆT NAM
Ở Việt Nam, dịch HIV/AIDS đến muộn hơn các quốc gia khác nhƣng đang trở
thành một trong những ngun nhân chính gây tử vong cho cợng đồng.
Kể từ trƣờng hợp nhiễm HIV đầu tiên đƣợc phát hiện tháng 12/1990, đến tháng
12/1992 mới chỉ có thêm 11 trƣờng hợp bị nhiễm HIV nhƣng đến tháng 06/1999, toàn
quốc đã có 13.623 trƣờng hợp nhiễm HIV, 2.532 bệnh nhân AIDS và 1.320 ngƣời đã
tử vong vì AIDS. Theo thống kê của Uỷ ban Quốc gia phịng chống AIDS, tính đến
cuối tháng 7/2007, toàn quốc có 123.775 ngƣời nhiễm HIV, 26.214 bệnh nhân AIDS
và 38.648 ngƣời đã tử vong [1].
Ban đầu, dịch chỉ có ở thành phố Hồ Chí Minh, đến tháng 6/1995 đã có 34/53 tỉnh
thành báo cáo có ngƣời nhiễm HIV/AIDS và hiện nay, tất cả các tỉnh thành trên cả
nƣớc đều có ngƣời nhiễm HIV/AIDS. Dịch liên tục lan rộng ra các xã, phƣờng với
95% số huyện, 49% số xã có ngƣời nhiễm HIV/AIDS và mỗi năm có trên 10.000
trƣờng hợp nhiễm mới [26].
Phƣơng thức lây truyền HIV ở nƣớc ta chủ yếu là qua đƣờng tình dục và tiêm chích
ma tuý. Sự gia tăng của dịch HIV/AIDS ở đối tƣợng nghiện chích ma tuý tại Việt
Nam là điều thực sự đáng quan tâm vì số ngƣời sử dụng ma tuý ngày càng có chiều
hƣớng gia tăng với mức đợ khó kiểm sốt. Theo Cục phịng chống tệ nạn xã hợi, hiện
nay, nƣớc ta có khoảng 185.000 đến 200.000 ngƣời nghiện ma tuý, điều này nhấn
mạnh nguy cơ tăng tỷ lệ nhiễm HIV ở đối tƣợng nghiện chích ma tuý cũng nhƣ nguy
cơ lan truyền từ ngƣời tiêm chích ma t sang các nhóm khác trong cợng đồng. Bên
cạnh đó, hình thức lây nhiễm HIV qua đƣờng tình dục cũng đang có dấu hiệu gia
tăng. Theo thống kê của Bộ Y tế, từ năm 1994-2002, tỷ lệ nhiễm HIV trong nhóm gái
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Nguyễn Quang Anh

9


Luận văn cao họcK12

mại dâm đã tăng gấp 10 lần (từ 0,6% lên đến 6%) [8]. Tình hình lây nhiễm HIV ngày
càng trở nên phức tạp bởi sự lây lan giữa hai nhóm đối tƣợng có nguy cơ cao này.
Các cơng trình nghiên cứu về HIV ở Việt Nam tḥc nhiều lĩnh vực khác nhau,
nhƣng có lẽ tập trung nhiều vào việc thống kê về tình hình nhiễm HIV tại các cơ sở
điều trị và tại các địa phƣơng khác nhau [17], [27], [22]. Ngồi ra các cơng bố về dịch
tễ học, đặc điểm lâm sàng của các bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS đến điều trị tại các
bệnh viện cũng đƣợc đề cập nhiều [25], [10], [16]. Nghiên cứu về sự kháng thuốc của
HIV cũng đƣợc đặc biệt quan tâm trong những năm gần đây [14]. Dịch tễ học phân tử
của HIV lƣu hành ở Việt Nam và các phƣơng pháp sinh học phân tử trong chẩn đoán,
phát hiện, định loại HIV cũng đƣợc quan tâm và đƣa vào ứng dụng tại Việt Nam [1],
[15], [11], [23]. Các kit chẩn đoán HIV hiện nay chủ yếu vẫn là nhập của nƣớc ngồi.
Ở trong nƣớc đã có mợt số cơ sở sản xuất đƣợc kit chẩn đoán và định lƣợng HIV
bằng kỹ thuật PCR nhƣ thuốc thử định lƣợng HIV của Công Ty Nam Khoa [10].
Trong khuôn khổ của đề tài KC.10.08/06-10, Phan Tuấn Nghĩa và cs đã tạo ra đƣợc
bộ kit Multiplex RT-PCR phát hiện đồng thời HBV, HCV and HIV trong các mẫu
máu. Tuy nhiên, tất cả các kit chẩn đoán huyết thanh học phát hiện kháng thể kháng
HIV trên cơ sở các kháng nguyên của HIV, hiện tại chúng ta vẫn phải nhập ngoại. Để
xây dựng đƣợc panel chuẩn cho tất cả các kit nhập ngoại thì khơng phải là điều dễ
dàng. Theo chúng tôi các Hãng trên thế giới không cho biết các kit của họ đƣợc chế
tạo từ phân typ nào, do đó đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu khi phát hiện kháng thể
kháng các chủng HIV lƣu hành trong nƣớc cần phải tiếp tục đƣợc thực hiện để xây
dựng đƣợc panel chuẩn trong chẩn đoán HIV.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Nguyễn Quang Anh



10


Luận văn cao họcK12

1.3. ĐẶC ĐIỂM CỦA HIV
1.3.1 Giới thiệu chung
HIV là virus gây AIDS ở ngƣời, tḥc nhóm Lentivirus họ Retroviridae vì vậy HIV
có những đặc điểm chung của cả retrovirus và lentivirus [21].
Đặc trƣng của một retrovirus:
- Là một RNA virus có enzym sao chép ngƣợc, enzym sao chép ngƣợc này có
bản chất là DNA polymerase phụ dƣ̣a vào khuôn RNA của virus HIV tổng hợp DNA
2 mạch trong tế bào bị retrovirus xâm nhập DNA này gọi là cDNA.
- cDNA mới tạo ra này có những đoạn tự lập lại với kích thƣớc khác nhau
đƣợc gọi là đoạn cuối dài tự lập lại (long terminal repeat), nhờ vậy genom của virus
gắn ổn định trong DNA của tế bào nhiễm virus và trở thành một tiền virus (provirus).
- Provirus này sẽ tồn tại nhƣ một gen của tế bào nhiễm virus, tồn tại thầm lặng
không phát triển và truyền sang cho thế hệ khác khi có phân bào, hoặc đƣợc chuyển
thành mRNA trƣ̣c tiếp tham gia quá trì nh sinh tởng hợp

protein của virus để hình

thành nhƣ̃ng virus hồn chỉnh.
Đặc trƣng của lentivirus: Phát triển chậm, hƣớng đợng tới các tế bào bạch cầu
đơn nhân (monocyte) và đại thực bào (macrophage). Khơng có khả năng làm bất tử

hay biến đổi nhƣng lại làm tiêu huỷ tế bào nhiễm virus. Nucleotide có trình tự
(sequence) giống virus VISNA, là virus tiêu biểu cho hạ tợc lentivirus.
1.3.2 Đặc điểm hình thái cấu trúc của HIV
Dƣới kính hiển vi điện tử, HIV có dạng hình cầu với đƣờng kính khoảng 80-120 nm.
Cấu trúc từ ngồi vào trong gồm 3 lớp [21]:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Nguyễn Quang Anh



11


Luận văn cao họcK12

Hình 1.1: Cấu trúc phân tử của HIV [21].

a.

Lớp vỏ ngồi (vỏ peplon)

Lớp này là mợt màng lipid kép có kháng nguyên (KN) chéo với màng sinh chất tế
bào, đƣợc bao phủ bởi các gai nhú.
Gai nhú có bản chất là glycoprotein (gp) dài 9-10nm, rợng 14 nm, trọng lƣợng
phân tử (TLPT) 160 kDa (kilodalton) ký hiệu là gp 160 với HIV1 và 165 kDa với
HIV2, gồm 2 gp:
+ gp120 với HIV-1 hoặc gp125 với HIV-2: là phần KN bên ngồi dễ biến đởi
nhất, gây khó khăn cho việc tạo KT và việc sản xuất vacxin phòng bệnh.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Nguyễn Quang Anh



12


Luận văn cao họcK12

+ gp41 với HIV-1 hoặc gp36 với HIV-2: là gp xuyên màng gắn với gp120 hoặc
gp125 với HIV-2 giúp cho HIV xâm nhập đƣợc vào tế bào đích.
b. Lớp vỏ trong (vỏ capsid)
Vỏ này gồm 2 lớp [21]:
+ Lớp ngồi hình cầu, cấu tạo bởi protein TLPT 17 kDa (p17 với HIV-1) hoặc 18
kDa (p18 với HIV-2).
+ Lớp trong hình trụ, cấu tạo bởi protein TLPT 24 kDa (p24) bao bọc lấy lõi của
virus, giữa lớp trong và lõi của virus có những khối dầy đặc điện tử gọi là thế bên.
c. Lõi
Nhân hay lõi là thành phần bên trong lớp vỏ capsid có hình trụ hơi lệch tâm
gồm [21]:
* Vật liệu di truyền (genom) của HIV nằm trên hai sợi RNA có gắn enzym sao mã
ngƣợc, mỗi sợi RNA đơn có khoảng 9200 cặp bazơ với 2 nhóm gen :
+ Nhóm gen cấu trúc gồm gen gag, pol và env.
+ Nhóm gen điều hoà sinh trƣởng là tat, nef, vif, vpr, vpu, vpx.
Nhóm gen cấu trúc:
- Gen gag (group specific antigen) là gen mã hoá KN đặc hiệu nhóm cho các
protein p17/p18, p24/p25 ở lớp vỏ capsid của HIV. Ban đầu, nhóm gen gag này sẽ
tởng hợp nên một protein lớn là p55. Khi virus trƣởng thành, protein này sẽ đƣợc cắt

ra tạo nên các protein con là: MA(p17), CA(p24), NC(p9) và p6.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Nguyễn Quang Anh



13


Luận văn cao họcK12

Protein lõi p24 đƣợc mã hoá bởi nhóm gen gag là 1 KN đặc biệt có ý nghĩa
trong chẩn đoán nhiễm HIV vì P24 là protein có vai trị tạo nên lõi hình nón bên trong
của virus và là vị trí mà cycophilin A gắn với nhóm protein gag. Điều này rất quan
trọng trong quá trình nhân lên của virus vì nếu sự kết hợp này bị cản trở thì quá trình
nhân lên của virus cũng bị dừng lại.
P24 đƣợc sản xuất ra trong tế bào nhiễm virus và có thể đƣợc giải phóng ra ngồi
bằng nhiều cách do đó ngƣời ta có thể đo lƣợng p24 nội bào và ngoại bào để đánh
giá số lƣợng HIV trong cơ thể.
+ Gen pol (polymerase) mã hoá cho các enzym:
Reverse transcriptase (RT) p64/p67, p51/p53 là enzym sao chép ngƣợc đảm nhiệm
mã hố bợ gen virus thành DNA bở xung (cDNA). Ngƣời ta đã thí nghiệm dùng các
thuốc nhƣ Zidovudin (ZDV), ddI và Nevirapin để ức chế RT nhằm ngăn chặn sự nhân
lên của virus nhƣng HIV đã phát sinh biến dị làm thay thế các axit amin ở

nơi tác

động của thuốc nên có tác dụng kháng lại thuốc. Enzym này còn đƣợc ứng dụng phát
hiện HIV bằng kỹ thuật RT-PCR.

Protease (p10) của HIV có tác dụng tách các protein đƣợc mã hoá bởi gen gag và pol
thành các phân tử hoạt đợng.
Endonuclease p31/p34 đảm nhiệm sự tích hợp DNA của virus vào nhiễm sắc thể của
tế bào chủ. Protease và endonuclease cịn gọi là enzym tích hợp (integrase).
+ Gen env (envelop) mã hoá cho gp110/120, gp41 ở lớp vỏ peplon của virus.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Nguyễn Quang Anh



14


Ḷn văn cao họcK12

Nhóm gen điều hồ :
+ Gen tat (transactivateur): là gen phát động sự tăng trƣởng các gen khác của
virus. Nơi tác động là đoạn TAR (transactivateur responsive) trong đoạn 5LTR. Tế
bào nhiễm HIV mà provirus có gen tat sẽ kích hoạt các HIV hoạt đợng gấp 1000 lần
các provirus khơng có gen tat. Gen tat kích hoạt các gen mã hoá protein cấu trúc,
protein điều hành (kể cả gen tat).
+ Gen rev ( regulation gene) có chức phận điều chỉnh q trình nhân lên của
virus thơng qua tat và nef . Rev điều hồ mã hố 1 protein rev có hai đầu trong đó
mợt đầu có nhiệm vụ ức chế (CRS) và một đầu giải ức chế (CAR).
+ Gen nef (negative regulator factor) chịu trách nhiệm làm chậm phát triển virus, tăng
cƣờng khả năng lây nhiễm của virus .
+ Gen vif (virion infectivity factor) mã hoá protein vì làm tăng tính thâm nhập của
virus vào tế bào cảm nhiễm.

Hình 1.2: Sơ đồ cấu trúc gen của HIV [95].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Nguyễn Quang Anh



15


Luận văn cao họcK12

1.4. PHÂN LOẠI HIV
HIV là virus có độ biến đổi cao, đột biến dễ dàng. Điều này có nghĩa là trong một cơ
thể của một ngƣời nhiễm bệnh cũng có nhiều chủng HIV. Dựa trên những điểm tƣơng
tự về di truyền, HIV đƣợc chia làm 2 loại là: HIV-1 và HIV-2. Hai loại này cùng gây
nên AIDS trên ngƣời với bệnh cảnh lâm sàng không thể phân biệt đƣợc và đƣờng lây
hoàn toàn giống nhau. Tuy nhiên, HIV-1 là loại gây bệnh chủ yếu và là nguyên nhân
chính gây AIDS ở tất cả các châu lục trên thế giới, khi nói nhiễm HIV mà khơng kèm
theo type HIV tức là nói đến HIV-1. HIV-2 chỉ lƣu hành ở châu Phi, có khả năng gây
bệnh và tiến triển bệnh lâu hơn, khó lây hơn HIV-1 [41].
1.4.1. HIV-1
Dựa vào sự biến đổi về gen của HIV-1, ngƣời ta chia HIV-1 ra thành 3 nhóm là nhóm
M (major), nhóm N (new) và O (outlier). Các nhóm này có thể khác nhau 30-40%
trong trình tự các axit amin nằm ở gp120. Ba nhóm này đại diện cho đợt du nhập
riêng rẽ của SIV gây suy giảm miễn dịch từ khỉ sang ngƣời. Nhóm O hầu nhƣ chỉ
khu trú tại Tây Phi, nhóm N rất hiếm gặp và chỉ mới đƣợc phát hiện tại Cameroon
(1998) còn lại là trên 90% các trƣờng hợp nhiễm HIV-1 đều tḥc nhóm M.
Nhóm M là nhóm lớn nhất và đƣợc chia làm 8 phân type [(A1, A2), (B), (C), (D),

(CRF01_AE), (F1, F2, K) (G, J), (H)]; mỗi phân type có phân vùng địa lý khác
nhau [40].
Ngồi các phân type, các thể tái tổ hợp giữa các phân type (CRF) cũng đang xuất hiện
ngày càng nhiều và làm cho các việc nghiên cứu về HIV-1 ngày càng trở nên phức
tạp và khó khăn. Sự hình thành các thể tái tổ hợp là do 2 virus thuộc 2 phân type khác
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Nguyễn Quang Anh



16


Luận văn cao họcK12

nhau cùng hiện diện trong tế bào ngƣời nhiễm và hịa trợn các chất liệu di trùn để
tạo thành một virus lai mới, mặc dù đa số virus tḥc chủng mới này khơng sống sót
lâu đƣợc, nhƣng nếu chủng nào lây nhiễm tồn tại đƣợc sẽ tạo ra thể tái tổ hợp. Hiện
nay, các nhà khoa học đã phát hiện đƣợc khoảng 30 CRF. CRF A/E đƣợc coi là sự lai
tạo giữa phân type A và một phân type gốc E, cho đến nay ngƣời ta vẫn chƣa tìm thấy
đƣợc phân type E ở dạng riêng rẽ vì vậy CRF A/E có thể đƣợc coi là phân type E
[41].

Hình 1.3: Sơ đồ phân bố các phân type HIV [104].
Kết qủa nghiên cứu phân tích mức đợ lƣu hành của các phân type HIV -1 toàn cầu
năm 2004 cho thấy [41], [39]:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Nguyễn Quang Anh

17


Luận văn cao họcK12

+ Về tỷ lệ %: Phân type C chiếm đa số (47,2%), phân type A 27%, phân type B chiếm
12,3%, phân type D chiếm 5,3%, phân type E chiếm 3,2%, các phân type còn lại (F,
G, H, J,) và các CRF khác chỉ chiếm 5 %.
+ Về phân vùng địa lý: Các phân type HIV-1 và các CRF đƣợc phân bố không đều
trên thế giới, trong đó các phân type B và C phân bố rộng rãi nhất.

Phân type B

xuất hiện chủ yếu tại Bắc Mỹ, châu Âu và châu Úc. Tuy nhiên, hiện nay tại châu Âu
đang dần có sự du nhập của các phân type khác, khoảng 25% những trƣờng hợp
nhiễm HIV tại châu Âu khơng phải do phân type B. Điều này có thể đƣợc giải thích là
do sự lai tạp về dân số vì đã có một số lƣợng lớn dân di cƣ du nhập đến châu Âu kể từ
sau thế chiến thứ 2.
Phân type C là phân type thƣờng gây ra các vụ dịch HIV nặng nề chủ yếu tại châu
Phi, châu Á, Ấn Độ, Nepal và là nguyên nhân của khoảng một nửa các trƣờng hợp
nhiễm HIV hiện nay trên thế giới.
Phân type A xuất hiện nhiều tại Nga và châu Phi, chủ yếu tại Tây Phi và Trung Phi
còn phân type D lại thƣờng khu trú tại Đông Phi.
Phân type F đƣợc tìm thấy tại Trung Phi, Nam Mỹ và Đông Âu nhƣng phân type G và
CRF A/G lại là nguyên nhân gây bệnh chủ yếu tại Tây Phi, Đông Phi và tại Trung
Âu.
Phân type H chỉ tìm thấy tại Trung Phi; phân type J chỉ có tại Trung Mỹ; và phân type

K chỉ có tại Cợng hịa Dân chủ Congo và Cameroon.
Theo các công bố gần đây của các nƣớc khu vực Đông Nam Á thì phân type lƣu hành
chủ yếu ở khu vực này lại là CRF01_AE (nhƣng nguồn gốc từ Trung Phi). Tại Việt
Nam, hiện nay thƣờng xuất hiện HIV-1 phân type CRF01_AE và B phân bố tùy theo
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Nguyễn Quang Anh



18


Luận văn cao họcK12

nhóm đối tƣợng ví dụ nhƣ HIV-1 phân type CRF01_AE lây truyền chủ yếu trong
nhóm đối tƣợng là những ngƣời tiêm chích.
1.4.2. HIV- 2
Các chủng HIV-2 ít gặp hơn HIV-1, thƣờng chỉ gặp ở Tây Phi mà hiếm khi thấy ở
nơi khác. HIV-2 đƣợc chia thành 8 phân typ là A, B, C, D, E, F, G, H.

Hình 1.4: Sơ đồ phân type của HIV [41].
1.5. ĐẶC ĐIỂM SINH VẬT HỌC CỦA HIV
Khi HIV đã xâm nhập vào trong tế bào của cơ thể sẽ tồn tại mãi trong cơ thể nhƣng
khi ở ngoài cơ thể thì HIV cũng giống nhƣ các loại virus có vỏ ngồi là lipid khác, dễ
bị bất hoạt bởi các yếu tố lý, hố và chất khử kh̉n thơng thƣờng. Trong dung dịch,
HIV bị phá huỷ ở 56oC trong 20 phút và ở mơi trƣờng đơng khơ, HIV bị mất hoạt tính
ở 68oC trong 2 giờ. HIV cũng bị bất hoạt bởi các hố chất khử kh̉n, tuy nhiên,
màng lipid có thể bảo vệ cho virus khơng bị mất nƣớc giúp nó có thể sống vài ngày ở
bên ngồi cơ thể trong điều kiện đơng khơ, thậm chí có thể sống vài tuần trong dung

dịch ở nhiệt đợ phịng thí nghiệm, do đó các dụng cụ y tế bị nhiễm các dịch cơ thể có
HIV cần phải đƣợc xử lý bằng các chất sát khuẩn có hiệu lực [18].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Nguyễn Quang Anh



19


Luận văn cao họcK12

1.6. NGUỒN TRUYỀN NHIỄM VÀ ĐỐI TƢỢNG CẢM THỤ
Bệnh nhân AIDS và ngƣời nhiễm HIV là nguồn trùn nhiễm duy nhất cho cợng
đồng, khơng có ở chứa nhiễm trùng tự nhiên ở động vật. Tất cả mọi ngƣời đều có khả
năng cảm nhiễm HIV, khơng phân biệt t̉i tác, nghề nghiệp, giới tính nhƣng dịch lây
lan mạnh ở nhóm ngƣời có nguy cơ cao nhƣ bệnh nhân có bệnh lây trùn qua đƣờng
tình dục (STD), đồng tính luyến ái, nghiện chích ma tuý.
HIV đã đƣợc phân lập từ máu, tinh dịch, dịch tiết âm đạo, nƣớc mắt, sữa mẹ và các
dịch khác của cơ thể, tuy nhiên chỉ có máu, tinh dịch và dịch tiết âm đạo đóng vai trị
chính trong lây trùn HIV [21].
1.7. CÁC PHƢƠNG THỨC LÂY TRUYỀN CỦA HIV
Có 3 phƣơng thức lây truyền đã đƣợc xác định đó là: lây truyền qua đƣờng tình dục,
lây truyền theo đƣờng máu và lây truyền từ mẹ sang con.
Lây truyền HIV có thể xảy ra qua đƣờng tình dục đồng giới (15%) hoặc khác giới
(71%) với ngƣời nhiễm HIV. Những tổn thƣơng ở âm đạo, dƣơng vật, miệng hay hậu
môn sẽ là đƣờng xâm nhập của virus vào máu. HIV có thể gắn và xâm nhập vào tinh
trùng, tồn tại dƣới dạng DNA virus hoặc gây nhiễm tế bào Langerhans trong dịch
nhầy của âm đạo và hậu môn. Nguy cơ lây nhiễm HIV qua một lần giao hợp với một

ngƣời nhiễm HIV là 1%-10% [8], ngƣời nào nhận tinh dịch trong giao hợp thì có
nguy cơ lây nhiễm HIV cao hơn, và càng quan hệ tình dục với nhiều ngƣời thì nguy
cơ lây nhiễm càng cao, đặc biệt là ngƣời có STD thì nguy cơ lây nhiễm HIV có thể
lên gấp 20 lần [18].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Nguyễn Quang Anh



20


Luận văn cao họcK12

HIV có thể lây qua truyền máu, các chế phẩm máu, trong ghép tạng khơng đƣợc kiểm
sốt và sàng lọc HIV hoặc có đƣợc làm xét nghiệm sàng lọc bằng các phƣơng pháp
huyết thanh học nhƣng không phát hiện đƣợc KT kháng HIV (giai đoạn cửa sổ sinh
học). HIV cũng có thể truyền qua việc sử dụng chung bơm kim tiêm bị nhiễm HIV
mà không đƣợc tiệt trùng cẩn thận, đặc biệt ở ngƣời nghiện chích ma tuý.
Phòng tránh lây truyền HIV từ mẹ sang con là mợt mắt xích khơng thể thiếu đƣợc
trong chiến lƣợc tồn cầu nhằm ngăn chặn sự lan tràn của đại dịch HIV/AIDS. Ngƣời
phụ nữ nhiễm HIV nếu sinh con thì con của họ cũng có thể bị nhiễm HIV. Sự lây
truyền HIV từ mẹ sang thai nhi hay sang sơ sinh gọi là lây truyền chu sinh hoặc lây
truyền dọc. Sự lây truyền HIV từ mẹ sang con có thể xảy ra trong thời kỳ mang thai,
lúc sinh con hoặc khi cho con bú [18], [21].
1.8. SỰ XÂM NHẬP TẾ BÀO VÀ NHÂN LÊN CỦA HIV
Quá trình xâm nhập và nhân lên của HIVcó thể đƣợc chia làm 2 thời kì quan trọng là
thời kỳ tạo ra tiền virus và thời kỳ nhân lên [24].

HIV xâm nhập vào cơ thể qua đƣờng da niêm mạc và mạch máu. Virus di chuyển đến
các hạch bạch huyết bằng cách tấn cơng có lựa chọn vào tế vào Lympho TCD4 là tế
bào điều hòa hệ miễn dịch, có thụ thể đặc hiệu phù hợp với gp120. Ngồi ra, HIV cịn
xâm nhập và nhân lên ở nhiều loại tế bào khác nhƣ lympho bào B, đại thực bào, bạch
cầu đơn nhân lớn, tế bào nguồn, tế bào xơ non, tế bào thần kinh, tế bào nội mạc.
Sau khi đã gắn vào receptor của tế bào chủ, phân tử gp41 của HIV cắm sâu vào màng
tế bào giúp cho genome và enzyme sao mã ngƣợc của HIV chui vào bên trong tế bào
chủ, tiến hành quá trình sao mã ngƣợc tạo thành chuỗi cDNA. DNA 2 sợi này sẽ di
chuyển về nhân của tế bào chủ và nhờ enzyme sao chép ngƣợc endonuclease để gắn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Nguyễn Quang Anh



21


Luận văn cao họcK12

đoạn cuối 3‟ DNA virus với đoạn cuối 5‟ DNA của tế bào chủ, nhƣ vậy sợi RNA và
chuỗi cDNA kết hợp thành chuỗi kép DNA để tích hợp vào nhiễm sắc thể của tế bào
chủ, lúc này, HIV trở thành một bộ phận của bộ gen di truyền trong tế bào ngƣời,
tránh đƣợc sự phòng vệ của cơ thể, tác dụng của thuốc và có thể gây bệnh. Tế bào bị
nhiễm HIV không hồi phục.
HIV tồn tại trong tế bào dƣới hai trạng thái, trạng thái tiềm tàng hoặc sinh sản. Ở
trạng thái tiềm tàng, DNA của HIV tồn tại dƣới dạng tiền virus (provirus), không tạo
ra hoặc chỉ tạo ra ít RNA virus. Nhƣng khi tế bào đã nhiễm virus bị hoạt hoá bởi hệ
thống miễn dịch của cơ thể, nhƣ khi bị đồng nhiễm loại nhiễm trùng khác thì provirus
đựơc hoạt hố và chủn sang trạng thái sinh sản, HIV nhân lên.

Sự nhân lên của HIV qua 4 giai đoạn:
-

Sao mã: cDNA provirus sao mã tạo thành RNA genome của HIV và mRNA.

-

Dịch mã: Nhờ mRNA, tế bào vật chủ tổng hợp các protein tạo ra virus mới.

-

Lắp ráp: Từ các thành phần đƣợc tởng hợp sau q trình sao mã và dịch mã,

các hạt HIV mới đƣợc lắp ráp ở bào tƣơng tế bào.
-

Nảy chồi giải phóng virus mới: Các hạt virus mới gần màng sinh chất nảy

chồi (budding) và HIV giải phóng ra ngoài, tạo nên thế hệ virus mới nhờ sự hoạt động
của protease. HIV mới tiếp tục xâm nhiễm vào tế bào mới khác để tiếp tục nhân lên,
còn các tế bào đã giúp HIV nhân lên thì bị phá huỷ.
Mức sinh sản của virus tuỳ thuộc vào từng loại virus, loại tế bào bị nhiễm và
gen điều hoà sự nhân lên của virus.Các gen điều hoà là yếu tố tác động trực tiếp đến
sự sinh trƣởng HIV, nếu gen tat hoạt đợng mạnh, gen nef hoạt đợng yếu thì provirus
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Nguyễn Quang Anh

22


Luận văn cao họcK12

sẽ phát triển nhanh và ngƣợc lại tat hoạt đợng yếu, gen nef hoạt đợng mạnh thì
provirus sẽ ở trạng thái nằm yên. Ngoài sự tồn tại của provirus cịn có các tác đợng
ngồi gen nhƣ: lympho bào bị nhiễm HIV sẽ bị kích hoạt sinh trƣởng HIV do yếu tố
hoại tử của u (TNF), hoặc do nhiễm Cytomegalo virus, Epstein Baar virus… Các tác
nhân này đƣợc gọi chung là đồng yếu tố kích hoạt sự sinh trƣởng của HIV.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Nguyễn Quang Anh



23