Nghiên cứu chế tạo Multiplex PCR mix phát hiện đồng thời hai tác nhân Chlamydia trachomatis và Neissera gonorrhoeae doc

Nghiên cứu chế tạo Multiplex PCR mix phát hiện đồng thời hai tác nhân
Chlamydia trachomatis và Neissera gonorrhoeae
P. H. Van
(1)
, N. P. N. Ha
(2)
, N. T. M. Thu
(3)
, D. T. T. Thuy
(4)
Tóm tắt
Với hai chủng vi khuẩn N. gonorrhoeae và C. trachomatis trong tay, các tác giả đã nghiên cứu thành
công để chế tạo được multiplex PCR mix phát hiện đồng thời hai tác nhân vi khuẩn trên với độ nhạy phát
hiện từng tác nhân riêng lẻ đạt đến 1 DNA bộ gen vi khuẩn trong thể tích phản ứng, và độ nhạy phát hiện
hai tác nhân vi khuẩn trong cùng một phản ứng được tiên đoán là rất thuận lợi trong thực tế trên bệnh
nhân.
Summary
“Prepare the Multiplex PCR mix detecting Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae
sulmutaneously” With two strains of N. gonorrhoeae and C. trachomatis in hand, the authors have
prepared successfully the multiplex PCR mix detecting these two bacteria sulmutaneously with the
sensitivity in detecting these bacteria separately reaches 1 DNA genome of the target bacteria in the
volume of reaction; and the study also revealed that the sensitivity in detecting Chlamydia trachomatis
and Neisseria gonorrhoeae simultaneously is favored for the detecting of these bacteria from infected
patients.

Đặt vấn đề
C. trachomatis và N. gonorrhoeae là hai tác
nhân vi khuẩn gây nhiễm trùng đường sinh dục rất
thường gặp với các hậu quả cũng khá nặng nề nếu
không phát hiện và chữa trị
(1,2)

. Phương pháp
thông thường nhất hiện nay để phát hiện C.
trachomatic là dùng kỹ thuật miễn dịch huỳnh
quang trực tiếp để phát hiện vi khuẩn trong các
quệt cổ tử cung, tuy nhiên phương pháp này cho
kết quả khá chủ quan vì tuỳ thuộc vào kỹ năng và
kinh nghiệm người đọc kết quả trên kính hiển vi
huỳng quang. Để phát hiện N. gonorrhoeae thì
nuôi cấy là phương pháp thường được dùng nhất,
tuy nhiên có rất nhiều trườ
ng hợp nuôi cấy thất bại
vì bệnh nhân đã dùng kháng sinh trước đó. Chính
vì vậy phương pháp được cho là nhạy cảm và
thích hợp nhất hiện nay để phát hiện hai tác nhân
C. trachomatis và N. gonorrhoeae là kỹ thuật PCR.
Hiện nay đã có kit phát hiện đồng thời N.
gonorrhoeae và C. trachomatis bằng kỹ thuật
PCR-ELISA được sản xuất bởi Roche Diagnostic.
Tuy nhiên kit này ít được sử dụng tại Việt Nam vì
giá thành khá cao, đồng thời cũng khá phức tạp
khi thực hiện xét nghiệm. Trong nước cũng có vài
tác giả cố gắng sản xuất kit PCR phát hiện đồng
thời hai tác nhân này nhưng cũng chưa thành công
vì không có điều kiện thử nghiệm trên chủng vi
khuẩn thật sự, đặc biệt là chủng C. trachomatis,
ngoài ra các nơi dự định sản xuất các kit này cũng
không phải là nơi sản xuất chuyên nghiệp với đầy
đủ kinh nghiệm sản xuất cũng nh
ư hệ thống kiểm
soát chất lượng. Chính vì vậy mặc dù trước đây

chúng tôi đã có kit phát hiện C. trachomatis
nhưng vì hiện vẫn có nhiều khách hàng muốn
được chúng tôi cung cấp thêm kit PCR phát hiện
đồng thời C. trachomatis và N. gonorrhoeae cho
tiện sử dụng, nên đơn vị R&D của chúng tôi cũng
đã đặt ra mục tiêu chế tạo kit PCR phát hiện đồng
thời hai tác nhân này. Mục tiêu của công trình này
là tìm hiểu độ nhạy cảm và độ đặ
c hiệu của kit
PCR này trên các chủng vi khuẩn C. trachomatis
và N. gonorrhoeae thật sự.
Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Mẫu thử trong nghiên cứu là các trích biệt
DNA từ các huyền dịch vi khuẩn N. gonorrhoeae
và C. trachomatis. Vi khuẩn N. gonorrhoeae là
chủng vi khuẩn được phân lập trên bệnh nhân,
được định danh chính xác nhờ hình ảnh song cầu
Gram [-], tính chất oxidase [+], và chỉ lên men
đường glucose trong thử nghiệm lên men đường
nhanh Cummitech 4. Vi khuẩn được phòng R&D
của công ty Nam Khoa bảo quản
ở -70
o
C. Để
chuẩn bị cho thử nghiệm, vi khuẩn được cấy phân
lập lại trên thạch nâu, ủ 37
o
C trong tủ ấm CO
2

trong 48 giờ. Sau đó vi khuẩn được gặt trong nước
muối sinh lý để đạt độ đục tương đương 10
6
vi
khuẩn/ml). Huyền dịch vi khuẩn này được đun
cách thuỷ trong 10 phút kể từ lúc nước sôi, sau đó
ly tâm 13.000RPM/5 phút. Dịch nổi chính là trích
biệt DNA của N. gonorrhoeae. Dịch nổi này được
pha loãng trong đệm TE theo hệ số pha loãng 10
1

(1)
BS., TS., Giảng viên Bộ Môn Vi Sinh, Khoa Y, ĐHYD TP. HCM; Cố vấn chất lượng và trưởng phòng QA Công
Ty Nam Khoa.
(2)
CN., Trưởng phòng Vi Sinh-SHPT Bệnh Viện Phong và Da Liễu Qui Hòa, Qui Nhơn. (3)CN.,
Nghiên cứu viên phòng R&D Công Ty Nam Khoa.
(4)
BS., ThS., Giảng viên Bộ Môn Hoá Sinh, Khoa Y, ĐHYD
TP. HCM; Trưởng phòng R&D công ty Nam Khoa. Công trình được thực hiện tại Công Ty Nam Khoa.
để có các độ pha loãng 1 (không pha loãng), 10
-1
,
10
-2
, 10
-3
, 10
-4
, 10

-5
, và 10
-6
được đặt tên là G
0
, G
1
,
G
2
, G
3
, G
4,
G
5
và G
6
tương đương 10
4
/10µl,
10
3
/10µl, 10
2
/10µl, 10/10µl, 1/10µl và 0.1/10µl.
Vi khuẩn C. trachomatis là hai dòng vi khuẩn 1 và
2 xin từ Khoa Sinh Học, Đại Học Royal Holloway
thuộc Đại Học London, Anh. Hai dòng này được
cung cấp dưới dạng huyền dịch có nồng độ vi

khuẩn đạt 10
7
vi khuẩn/ml. Tại Phòng R&D của
công ty Nam Khoa, hai dòng vi khuẩn được giữ ở
-70
o
C. Trước khi trích biệt DNA, pha loãng hai
huyền dịch vi khuẩn này 1/100 trong đệm TE để
đạt nồng độ vi khuẩn 10
5
/ml. Dùng hai phương
pháp trích biệt DNA cho huyền dịch C.
trachomatis này: Phương pháp đun cách thuỷ
trong 10 phút kể từ lúc nước sôi và sau đó ly tâm
để lấy dịch nổi – như vậy là có 2 mẫu d1 và d2, và
phương pháp trích biệt DNA bằng bộ DNAPREP-
BOOM do công ty Nam Khoa sản xuất theo đúng
qui trình hướng dẫn kèm theo – như vậy là có 2
mẫu b1 và b2. Ngoài ra, chúng tôi còn dùng thêm
mẫu chứng âm là trích biệt DNA từ quệt cổ tử
cung lấy từ người không nhiễm hai tác nhân trên
đã được xác định bằ
ng phương pháp miễn dịch
huỳnh quang trực tiếp phát hiện C. trachomatis
âm tính và cấy cũng như soi trực tiếp âm tính N.
gonorrhoeae. Mẫu chứng âm này được trích biệt
DNA bằng phương pháp dùng phenol-chloroform
với bộ DNAPREP-PHCHL do công ty Nam Khoa
sản xuất và thực hiện theo hướng dẫn đi kèm.
Multiplex PCR mix phát hiện đồng thời C.

trachomatis và N. gonorrhoeae do phòng R&D
của công ty Nam Khoa điều chế gồm các thành
phần chính: Taq polymerase và PCR buffer của
Biorad, dNTP của Roche, dUTP và UNG của
Amersham, mồi
đặc hiệu (đặt Invitrogen tổng
hợp) cho đoạn DNA dài 241bp trên crytic plasmid
của C. trachomatic, mồi đặc hiệu (đặt Invitrogen
tổng hợp) cho đoạn DNA dài 390bp trên crytic
plasmid của N. gonorrhoeae, MgCl
2
của Biorad.
Có hai loại multiplex PCR mix được pha, loại
chứa hàm lượng mồi 50pm/thể tích phản ứng, và
loại chứa hàm lượng mồi 25pm/thể tích phản ứng.
Hai loại PCR mix này được đặt tên là Multiplex
CHL-GNC PCR mix 50pm và Multiplex CHL-
GNC PCR mix 25pm. Thể tích của PCR mix là
40µl, để thể tích của mẫu thử cho vào là 10µl, và
như vậy thể tích phản ứng là 50µl.
Trước hết chúng tôi tìm hiểu phương pháp
trích biệt DNA của huyền dịch C. trachomatis
bằng ph
ương pháp BOOM và bằng phương pháp
đun cách thuỷ, phương pháp nào tốt hơn?. Đồng
thời chúng tôi cũng tìm hiểu hàm lượng mồi 50pm
và 25pm đặc hiệu C. trachomatis và N.
gonorrhoeae, hàm lượng nào cho kết quả khuếch
đại tốt hơn?. Để trả lời hai câu hỏi này chúng tôi
thực hiện thử nghiệm PCR với các mẫu trích biệt

DNA đã chuẩn bị ở trên cho vào 9 tube PCR mix
50pm và 7 tube PCRmix 25pm theo như trình bày
trong bảng 1 sau đây.
Bảng 1: Mẫu trích biệt DNA và thể thích mẫu (µl) được cho vào hai loại PCR mix

CHL-GNC PCR mix 50pm CHL-GNC PCR mix 25pm
1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 12 13 14 15 16 17
d1 (µl)
10 10
d2 (µl)
10 10
b1 (µl)
10 10
b2 (µl)
10 10
G
1
(µl)
10 10
G
2
(µl)
10 10
G
3
(µl)
10 10
G
4
(µl)

10
C (-) 10

Các PCR mix sau khi đã cho các mẫu thử
được cho vào máy PCR, chúng tôi sử dụng máy
iCycler loại Dual-block của Biorad, và chạy PCR
theo chương trình luân nhiệt sau: 40
o
C/10 phút,
95
o
C/5 phút, 40 chu kỳ 94
o
C/45 giây – 55
o
C/45
giây – 72
o
C/1 phút, 72
o
C/7 phút. Sản phẩm
khuếch đại được phát hiện bằng điện di trên thạch
agarose 2% pha trong TBE 0.5X và có trộn thêm
0.01mg ethidium bromide trong 50ml thạch.
Thạch điện di được pha từ bộ thuốc thử điện di
AGE do công ty Nam Khoa sản xuất theo hướng
dẫn đi kèm. Thang DNA được chạy điện di song
song với sản phẩm PCR cũng do công ty Nam
Khoa sản xuất, đây là thang 100-1000bp với
khoảng cách mỗi vạch là 100bp.

Sau khi đã có kết quả xác
định được PCR mix
có hàm lượng mồi nào là thích hợp nhất và trích
biệt nào là tốt nhất đối với huyền dịch C.
trachomatis, chúng tôi tiến hành xác định độ nhạy
cảm của PCR mix này trong phát hiện C.
trachomatis và N. gonorrhoeae riêng lẻ cũng như

2
trong phát hiện đồng thời. Phương pháp xác định
độ nhạy cảm trong phát hiện hai tác nhân riêng lẻ
được tiến hành như sau: (1) Trước hết pha loãng
trích biệt DNA (cho kết quả tốt nhất) trong TE
theo hệ số pha loãng 10 để có các độ pha loãng 1
(không pha loãng), 10
-1
, 10
-2
, 10
-3

được đặt tên là
C
0
, C
1
, C
2
, và C
3

, tương đương 10
3
/10µl, 10
2
/10µl,
10/10µl, và 1/10µl. (2) Cho các độ pha loãng của
trích biệt DNA của C. trachomatis vừa chuẩn bị
và các độ pha loãng của trích biệt DNA của N.
gonorrhoeae đã chuẩn bị trước đó (các mẫu G
0
,
G
1
, G
2
, G
3
, G
4,
G
5
và G
6
) vào các PCR mix, lượng
mẫu cho vào là 10µl. (3) Chạy PCR theo chương
trình luân nhiệt sau: 40
o
C/10 phút, 95
o
C/5 phút, 40

chu kỳ 94
o
C/45 giây – 55
o
C/45 giây – 72
o
C/1 phút,
72
o
C/7 phút. (4) Sản phẩm khuếch đại được phát
hiện bằng điện di trên thạch agarose 2% pha trong
TBE 0.5X như trên, đọc kết quả xác định độ nhạy
cảm là hàm lượng thấp nhất của DNA bộ gen của
hai vi khuẩn C. trachomatis và N. gonorrhoeae
còn cho được kết quả sản phẩm khuếch đại. Để
xác định độ nhạy cảm trong phát hiện hai tác nhân
C. trachomatis và N. gonorrhoeae đồng thời,
chúng tôi thực hiện thử nghi
ệm PCR với các độ
pha loãng của các trích biệt DNA của C.
trachomatis và N. gonorrhoeae các cho vào 16
PCR mix sao cho các nồng độ DNA của C.
trachomatis đều gặp được các nồng độ DNA của
N. gonorrhoeae. Sau đó chạy PCR và phát hiện và
đánh giá các kết quả sản phẩm khuếch đại điện di
trong thạch agarose 2% như phương pháp đã trình
bày ở trên. Bảng 2 dưới đây trình bày cách cho
các pha loãng mẫu trích biệt DNA của C.
trachomatis và N. gonorrhoeae vào các PCR mix
để đạt đượ

c yêu cầu này.
Bảng 2: Các pha loãng mẫu trích biệt DNA và thể tích mẫu (µl) được cho vào PCR mix

PCR mix
1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 12 13 14 15 16 17
C
0
(µl)
5 5 5 5
C
1
(µl)
5 5 5 5
C
2
(µl)
5 5 5 5
C
3
(µl)
5 5 5 5
G
3
(µl)
5 5 5 5
G
4
(µl)
5 5 5 5
G

5
(µl)
5 5 5 5
G
6
(µl)
5 5 5 5

Kết quả
Kết quả điện di trong hình 1 cho thấy phương
pháp trích biệt DNA của C. trachomatis bằng
phương pháp đun tỏ ra có hiệu quả hơn phương
pháp Boom vì trong cả hai mẩu C. trachomatis 1
và C. trachomatis 2, vạch khuếch đại sản phẩm
PCR với DNA trích biệt bằng phương pháp đun
cách thuỷ (giếng 2, 4, 11 và 13) cho kết quả sáng
đậm hơn và rõ nét hơn phương pháp Boom (giếng
1, 3, 10 và 12). Ngoài ra kết quả trên hình 1 cũng
cho th
ấy PCR mix 50pm có vẻ tốt hơn PCR mix
25pm vì với mẫu trích biệt DNA của C.
trachomatis bằng phương pháp Boom, kết quả
PCR cho thấy mẫu b1 không cho sản phẩm khuếch
đại với PCR mix 25pm, nhưng vẫn cho sản phẩm
khuếch đại với PCR mix 50pm. Từ kết quả này,
chúng tôi chọn phương pháp trích biệt DNA cho
huyền dịch vi khuẩn C. trachomatis là phương
pháp đun cách thuỷ, đồng thời chúng tôi chọn PCR
mix có hàm lượng mồi 50pm cho các thí nghiệm
xác

định độ nhạy cảm của Multiplex CHL-GNC
PCR mix.
Kết quả điện di trong hình 2 cho thấy
Multiplex CHL-GNC PCR mix 50pm có độ nhạy
cảm phát hiện N. gonorrhoeae và C. trachomatis
riêng lẻ đạt đến 1 bộ gen vi khuẩn trong một thể
tích mẫu cho vào tube phản ứng. Tuy nhiên, kết
quả điện di trong hình 3 thì cho thấy trong phát
hiện hai tác nhân vi khuẩn này cùng một lúc thì
với các mẫu thử có hàm lượng DNA bộ gen C.
trachomatis cao thì sẽ ức chế khả năng phát hiệ
n N.
gonorrhoeae. Trong khi các mẫu có hàm lượng
DNA bộ gen của N. gonorrhoeae dù rất cao (đến
10
4
bộ gen DNA trong thể tích phản ứng) vẫn
không ảnh hưởng đến khả năng phát hiện C.
trachomatis. Kết quả này rất thuận lợi trong thực
tế phát hiện bệnh vì thông thường nếu một người
nhiễm C. trachomatis thì số lượng vi khuẩn trong
mẫu thử sẽ rất thấp, trong khi đó nếu nhiễm N.
gonorrhoeae thì số lượng vi khuẩn trong mẫu thử
sẽ cao hơn.

3

4

C

0
C
1
C
2
C
3
mk mk G
2
G
3
G
4
G
5
G
6

Hình 2: Kết quả xác định độ nhạy cảm của
Multiplex CHL-GNC PCR mix 50
trong phát hiện từng tác nhân C.
trachomatis (gel bên trái) và N.
gonorrhoeae (gel bên phải). Kết quả
cho thấy PCR mix có khả năng phát
hiện N. gonorrhoeae đến nồng độ G
5
,
tương đương 1 bộ gen vi khuẩn trong
thể tích 10µl mẫu trích biệt DNA cho
vào tube phản ứng; khả năng phát hiện

C. trachomatis đến nồng độ C
3
, tương
đương 1 bộ gen vi khuẩn trong thể tích
10µl mẫu trích biệt DNA cho vào tube
phản ứng.
1 2 mk 3 4 5 6 7 8 9 mk
PCR mix 50pm
10 11 12 13 14 15 16 mk
PCR mix 25pm
Hình 1: K ết quả điện di sản phẩm PCR, gel bên trái là PCR mix 50, gel bên phải là PCR mix
25. Giếng 1,3, 10, 12: trích biệt DNA của C. trachomatis bằng phương pháp Boom;
giếng 2, 4, 11, 13 là trích biệt DNA của C. trachomatis bằng phương pháp đun cách
thuỷ; Giếng 5 đến 16 là trích biệt DNA của N. gonorrhoeae bằng phương pháp đun
cách thuỷ với giếng 5, 14 là G1; giếng 6, 15 là G2; giếng 7, 16 là G3; giếng 8 là G4.
G
3
G
4
G
5
G
6
G
3
G
4
G
5
G

6
G
3
G
4
G
5
G
6
G
3
G
4
G
5
G
6

C
0
C
0
C
0
C
0
C
1
C
1

C
1
C
1
C
2
C
2
C
2
C
2
C
3
C
3
C
3
C
3

Hình 3: Kết quả xác định độ nhạy cảm của Multiplex CHL-GNC PCR mix 50 trong
phát hiện cùng một lúc hai tác nhân C. trachomatis (vạch khuếch đại 241bp) và
N. gonorrhoeae (vạch khuếch đại 390bp).
Bàn luận
Chlamydia trachomatis là một trong các tác
nhân nhiễm trùng lây truyền bằng đường tình dục
phổ biến nhất tại các nước đang phát triển
(1)
. Bởi

vì hầu hết các trường hợp nhiễm bệnh đều không
có triệu chứng do vậy mà các trường hợp phát
hiện được bệnh chỉ là một phần nổi của một tảng
băng chìm
(1)
. Người ta phỏng đoán ở Hoa Kỳ mỗi
năm có 3-4 triệu trường hợp nhiễm bệnh và trên
toàn thế giới có đến 90 triệu trường hợp nhiễm
bệnh
(3)
. Tỷ lệ phụ nữ dưới 25 tuổi nhiễm C.
trachomatis có thể rất cao (đến 30%), trong đó
nguy cơ cao nhất là ở phụ nữ có hoạt động tình
dục nhiều
(3-5)
. Nếu nhiễm bệnh mà không điều trị
thì có thể đưa đến viêm vùng chậu và dẫn đến các
di chứng nghiêm trọng như thai ngoài tử cung hay
vô sinh
(1,2)
. Tuy nhiên nhiễm trùng C. trachomatis
là một nhiễm trùng rất dễ dàng để điều trị bằng
kháng sinh do vậy việc phát hiện và điều trị được
các trường hợp riêng lẻ là một trong các chìa khoá
trong chương trình kiểm soát nhiễm trùng. Chính
vì thế có nhiều nơi, người ta đã khuyến cáo là các
thanh niên nam nữ trưởng thành dưới 25 tuổi nên
được sàng lọc phát hiện nhiễm C. trachomatis mỗi
năm một hay thậm chí hai lần
(4-7)

. Cũng như vậy,
nhiễm N. gonorrhoeae mạn tính hay không triệu
chúng là một trong các yếu tố gây lây lan lậu trong
cộng đồng
(8)
. Lậu không triệu chứng hay mạn tính
có ở cả đàn ông và phụ nữ
(9,10)
. Một trong các tiếp
cận tốt nhất để kiểm soát và loại trừ được bệnh lậu
chính là việc phải phát hiện và điều trị cho được
các trường hợp mang mầm bệnh này vì đây chính
là các nhân tố nguy cơ cao.
Độ nhạy của các phương pháp truyền thống
như nuôi cấy hay phát hiện kháng nguyên để phát
hiện C. trachomatis hiện nay đã bị các phương
pháp khuếch đại nucleic acid qua mặt. Cũng như

vậy, phương pháp nuôi cấy vi sinh truyền thống đã
bị chứng minh là không đủ nhạy cảm để phát hiện
được N. gonorrheae trong các đối tượng nhiễm
lậu không triệu chứng hay mạn tính, do vậy các
phương pháp khuếch đại nucleic acid hiện đang
rất được quan tâm để áp dụng. Có nhiều phương
pháp khuếch đại nucleic acid đã được đưa ra
thương mại như các phương pháp dựa vào kỹ
thuật LCR (Abbott), PCR (Roche)
(11)
, TMA
(Bayer), hay SDA (BD). Trong các phương pháp

này, dễ tiếp cận nhất là phương pháp PCR vì đây
là phương pháp mà các nhà nghiên cứu dễ dàng
thiết kế nhất và không cần phải bị phụ thuộc vào
một hệ thống kín nào. Mục tiêu chính của công
trình này là thiết kế được multiplex PCR mix phát
hiện được đồng thời cả hai tác nhân C.
trachomatis và N. gonorrhoeae, và cả hai tác nhân
này đều có thể hiện diện cùng một lúc trong bệnh
phẩm chứ không phải là có tác nhân này thì không
có tác nhân kia. Chính vì vậy khi thiế
t kế
Multiplex PCR này, phải dự đoán được sự cạnh
tranh của cả hai loại DNA đích của cả hai tác nhân
khi cùng tham gia vào phản ứng khuếch đại.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, để phát hiện
từng tác nhân riêng lẻ, Multiplex PCR mix do
chúng tôi chế tạo có khả năng phát hiện rất cao, có
thể nói là lý tưởng: đạt mức phát hiện tối thiểu chỉ
cần 1 DNA bộ gen của vi khuẩn đích có mặt trong
phả
n ứng là hoàn toàn có thể phát hiện được. Đây
chỉ là sự tính toán lý thuyết vì với phương pháp
trích biệt DNA mà chúng tôi sử dụng trong công
trình này chỉ là phương pháp đun cách thuỷ do vậy
lượng DNA bộ gen trích ra ngoài dung dịch chắc
sẽ thấp hơn lượng DNA bộ gen thật sự có trong
huyền dịch vi khuẩn.
Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy đối với
huyền dịch C. trachomatis, phương pháp BOOM
để trích biệt DNA bộ gen t

ỏ ra không hiệu quả.
Điều này hoàn toàn có thể giải thích được nếu
chúng ta hiểu được nguyên tắc trích biệt DNA của
phương pháp BOOM, đó là dùng triton X100 để
phá huỷ tế bào giải phóng DNA, dùng Guanidine
thiocyanate để bất hoạt các men nuclease. Các
DNA tự do sẽ bám vào các hạt silica nhờ vậy mà
trích biệt được DNA. Tuy nhiên vì trong dịch cấy
C. trachomatis là dịch cấy tế bào, do vậy bên cạnh
DNA của C. trachomatis, vẫn có nhiều DNA của
tế bào và chính các DNA này đã cạnh tranh vớ
i
DNA của C. trachomatis khi bám vào các hạt
silica do vậy khả năng DNA của C. trachomatis
được trích biệt sẽ thấp đi nhiều. Do vậy, dù chúng
tôi là những người đầu tiên mang về Việt Nam kỹ
thuật BOOM để trích biệt DNA nhưng không áp
dụng BOOM một cách máy móc vào tất cả các
bệnh phẩm mà phải xác định các bệnh phẩm nào
không lẫn nhiều DNA tạp nhiễm mới dùng
BOOM.
Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy là trong
phát hi
ện đồng thời cả hai tác nhân N.
gonorrhoeae và C. trachomatis; nếu C.
trachomatis trong mẫu thử có lượng DNA bộ gen
là 10
3
thì ngưỡng phát hiện N. gonorrhoeae là 10
DNA bộ gen trong mẫu thử, nếu C. trachomatis

có lượng DNA bộ gen là 10
2
thì ngưỡng phát hiện
N. gonorrhoeae là 1, nếu C. trachomatis có lượng
DNA bộ gen là 10 và 1 thì ngưỡng phát hiện N.
gonorrhoeae là 0.1 bộ gen trong mẫu thử. Ngược
lại lượng DNA bộ gen của N. gonorrhoeae không
có ảnh huởng nhiều đến ngưỡng phát hiện C.
trachomatis. Như vậy có nghĩa là lượng vi khuẩn
C. trachomatis trong mẫu cao thì sẽ ức chế khả
năng phát hiện N. gonorrhoeae. Trên thực tế thì
thông thường với một người nhiễ
m C. trachomatis

5
thì ít khi lượng vi khuẩn trong mẫu cao đến mức
10
3
vi khuẩn trong 10µl mẫu thử tức là đến 10
5
/ml
mẫu thử vì nếu với những người đã từng quan sát
phát hiện C. trachomatis trong các quệt cổ tử cung
bằng thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang trực tiếp
thì không bao giờ có thể thấy được vi khuẩn này
nhiều trên quang trường quan sát. Do vậy hiệu
ứng này chắc chắn sẽ không ảnh hưởng đến việc
phát hiện cả hai tác nhân này cùng một lúc trên
thực tế mẫu bệnh phẩm lấ
y từ bệnh nhân.

Kết luận
Nghiên cứu đã thành công trong việc chế tạo
được multiplex phát hiện đồng thời cả hai tác nhân
C. trachomatis và N. gonorrhoeae trong mẫu thử,
ngoài ra còn xác định được độ nhạy cảm trong
phát hiện hai tác nhân vi khuẩn này một cách
riêng lẻ hay đồng thời. Thành công này là chìa
khóa để có thể tiến tới chế được bộ thử nghiệm
PCR phát hiện C. trachomatis và N. gonorrhoeae
trong các bệnh phẩm lấy từ đường ti
ết niệu và sinh
dục bệnh nhân.
Tài liệu tham khảo
1. Centers for Disease Control and Prevention. 2001.
Sexually transmitted disease surveillance 2000
supplement: Chlamydia Prevalence Monitoring Project.
U.S. Department of Health and Human Services, CDC,
Atlanta, Ga.
2. Centers for Disease Control and Prevention. 2002.
Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2002.
Morb. Mortal. Wkly. Rep. 51:1–78.
3. Burstein, G., C. A. Gaydos, M. Diener-West, M. R.
Howell, J. Zenilman, and T. C. Quinn. 1998. Incident
Chlamydia trachomatis infections among inner city
adolescent females: implications for frequency of
chlamydial screening. JAMA 280:521–526.
4. Burstein, G., G. Waterfield, A. Joffe, J. M. Zenilman, T.
C. Quinn, and C. A. Gaydos. 1998. Screening for
gonorrhea and chlamydia by DNA amplification in
adolescents attending middle school health centers:

opportunity for early intervention. Sex. Transm. Dis.
25:395–402.
5. Burstein, G. R., J. M. Zenilman, C. A. Gaydos, M.
Diener-West, M. R. Howell, W. Brathwaite, and T. C.
Quinn. 2001. Predictors of repeat Chlamydia trachomatis
infections diagnosed by DNA amplification testing
among inner city females. Sex. Transmit. Infect. 77:26–
32.
6. Centers for Disease Control and Prevention. 2002.
Screening tests to detect Chlamydia trachomatis and
Neisseria gonorrhoeae infections, 2002. Morb. Mortal.
Wkly. Rep. 51:1–38.
7. U.S. Preventive Services Task Force. 2001. Screening for
chlamydial infection, recommendations and rationale. Am.
J. Prev. Med. 20:90–94.
8. Handsfield, H. H. 1990. Neisseria gonorrhoeae, p. 1613–
1631. In G. L. Mandell, R. G. Jr. Douglas, and J. E.
Bennett (ed.), Principles and practice of infectious
diseases, 3rd ed. Churchill Livingstone, New York, N.Y.
9. Biro, F. M., S. L. Rosenthal, and M. Kiniyalocts. 1995.
Gonococcal and chlamydial genitourinary infections in
symptomatic and asymptomatic adolescent women. Clin.
Pediatr. 34:419–423.
10. Dalabetta, G., and E. W. Hook III. 1987. Gonococcal
infections. Infect. Dis. Clin. N. Am. 1:25–24.
11. Roche Diagnostic Systems Inc. 1996. AMPLICOR™
Chlamydia trachomatis/Neisseria gonorrhoeae (CT/NG)
test package insert. Roche Diagnostic Systems,Inc.,
Branchburg, N.J.

6