Nghiên cứu tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán HIV có độ nhạy và đặc hiệu cao

Viện Công nghệ sinh học








Nghiên cứu tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán HIV
có độ nhạy và đặc hiệu cao

Chủ nhiệm đề tài: Đinh Huy Kháng











8411

Hà nội - 2010


1
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

__________________
CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Hà nội, ngày 10 tháng 11 năm 2010



BÁO CÁO THỐNG KÊ
KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI/DỰ ÁN SXTN

I. THÔNG TIN CHUNG
1. Tên đề tài/dự án: Nghiên cứu tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán HIV có độ
nhạy và đặc hiệu cao
Mã số đề tài: KC.04.20/06-10
Thuộc:
- Chương trình (tên, mã số chương trình): Nghiên cứu, ứng
dụng và phát triển công nghệ sinh học, KC.04./06-10
- Dự án khoa học và công nghệ (tên dự án):
- Độc lập (tên lĩnh vực KHCN):
2. Chủ nhiệm đề tài/dự án:
Họ và tên: Đinh Duy Kháng
Ngày, tháng, năm sinh: 29 tháng 03 năm 1952 Nam/ Nữ: Nam
Học hàm, học vị: Phó giáo sư, Tiến sỹ
Chức danh khoa học: NCVC Chức vụ: Phó giám đốc phòng thí
nghiệm trọng điểm công nghệ gen, Trưởng phòng vi sinh phân tử
Điện thoại: Tổ chức: 04.37563386 Nhà riêng: 04.39870812 Mobile:
0913087536
Fax: 04.37914815 E-mail:

Tên tổ chức đang công tác: Viện Công nghệ sinh học, Viện
KH&CNVN
Địa chỉ tổ chức: 18, Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội
Địa chỉ nhà riêng: Số 106, Tổ 9A, Phường Thanh Lương, Quận Hai Bà
Trưng, Hà Nội
3. Tổ chức chủ trì đề tài/dự án:
Tên tổ chức chủ trì đề tài: Viện Công nghệ sinh học, Viện KH&CNVN

2
Điện thoại: 04.38362599 Fax: 04.38363144
E-mail:

Website: www.ibt.ac.vn

Địa chỉ: 18, Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội
Họ và tên thủ trưởng tổ chức: Trương Nam Hải
Số tài khoản: 931. 01. 064
Ngân hàng: Kho bạc Nhà nước Ba Đình, Hà Nội
Tên cơ quan chủ quản đề tài: Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

II. TÌNH HÌNH THỰC HIỆN
1. Thời gian thực hiện đề tài/dự án:
- Theo Hợp đồng đã ký kết: từ 01 tháng 01/năm 2009 đến 30 tháng 10/ năm
2010
- Thực tế thực hiện: từ tháng 01/năm 2009 đến tháng 10/năm 2010
- Được gia hạn (nếu có): không
- Lần 1 từ tháng…. năm…. đến tháng…. năm….
- Lần 2 ….
2. Kinh phí và sử dụng kinh phí:
a) Tổng số kinh phí thực hiện: 1800 tr.đ, trong đó:

+ Kính phí hỗ trợ từ SNKH: 1800 tr.đ.
+ Kinh phí từ các nguồn khác: 0 tr.đ
.
+ Tỷ lệ và kinh phí thu hồi đối với dự án (nếu có): ………….
b) Tình hình cấp và sử dụng kinh phí từ nguồn SNKH:
Theo kế hoạch Thực tế đạt được
Số
TT
Thời gian
(Tháng, năm)
Kinh phí
(Tr.đ)
Thời gian
(Tháng, năm)
Kinh phí
(Tr.đ)
Ghi chú
(Số đề nghị
quyết toán)
1 3/2009 1050 3/2009
12/2009
735
315
376,977
2 3/2010 750 3/2010
6/2010
525
225
677,930
3 11/2010 745,093

3
c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi:
Đơn vị tính: Triệu đồng
Theo kế hoạch Thực tế đạt được
Số
TT
Nội dung
các khoản chi
Tổng SNKH Nguồn
khác
Tổng SNKH Nguồn
khác
1 Trả công lao động
(khoa học, phổ
thông)
675 675

675 675

2 Nguyên, vật liệu,
năng lượng
955 955

980,95 980,95

3 Thiết bị, máy móc

4 Xây dựng, sửa
chữa nhỏ

5 Chi khác
170 170

144,05 144,05


Tổng cộng 1800
- Lý do thay đổi (nếu có):

3. Các văn bản hành chính trong quá trình thực hiện đề tài/dự án:
(Liệt kê các quyết định, văn bản của cơ quan quản lý từ công đoạn xác định nhiệm vụ, xét chọn,
phê duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực hiện nếu có); văn
bản của tổ chức chủ trì đề tài, dự án (đơn, kiến nghị điều chỉnh nếu có)
Số
TT
Số, thời gian ban
hành văn bản
Tên văn bản Ghi chú
1 1202/QĐ-
BKHCN ngày
18/6/2008
Thành lập hội đồng khoa học và công
nghệ cấp nhà nước tư vấn tuyển chọn tổ
chức và cá nhân chủ trì thực hiện đề tài
để thực hiện trong kế hoạch năm 2009
thuộc chương trình “Nghiên cứu, ứng
dụng và phát triển công nghệ sinh học”

2 148/QĐ-

BKHCN, ngày
16/7/2008
Phê duyệt các tổ chức, cá nhân trúng
tuyển chủ trì thực hiện các đề tài khoa
học và công nghệ thực hiện năm 2009
thuộc Chương trình “Nghiên cứu, phát
triển và ứng dụng công nghệ sinh học”

3 2025/QĐ-
BKHCN, ngày
16/9/2008
Phê duyệt kinh phí 06 đề tài, 01 dự án
sản xuất thử nghiệm bắt đầu thực hiện
thuộc Chương trình KH&CN trọng điểm
cấp Nhà nước giai đoạn 2006-2010
“Nghiên cứu, phát triển và ứng dụng


4
công nghệ sinh học”
4 308/QĐ-
BKHCN, ngày
9/3/2009
Phê duyệt kế hoạch đấu thầu mua sắm
vật tư, hóa chất của đề tài KC.04.20
thuộc chương trình “Nghiên cứu, phát
triển và ứng dụng công nghệ sinh học”

5 134/QĐ-CNSH,
ngày 13/4/2009

Thành lập hội đồng đấu thầu mua sắm
vật tư hóa chất năm 2009

6 146/QĐ-CNSH,
ngày 23/4/2009
Phê duyệt Nhà thầu trúng tuyển 02 gói
thầu: Gói thầu 1-“Hóa chất phục vụ
nghiên cứu”; Gói thầu 2-“Chế phẩm
sinh học phục vụ nghiên cứu” của năm
2009

7 35/CNSH, ngày
28/01/2010
Kế hoạch mua hóa chất và vật tư tiêu
hao

8 169/QĐ-
BKHCN, ngày
9/2/2010
Phê duyệt kế hoạch đấu thầu mua sắm
vật tư hóa chất

9 395/QĐ-
BKHCN, ngày
24/3/2010
Cử đoàn đi công tác nước ngoài của đề
tài

10 167/QĐ-CNSH,
ngày 15/4/2010

Thành lập hội đồng đấu thầu mua vật tư,
hóa chất năm 2010

11 179/QĐ-CNSH,
ngày 26/4/2010
Phê duyệt kết quả đấu thầu gói thầu:”
Mua sắm hóa chất phục vụ nghiên cứu”
năm 2010

12 24/TB-VPCTTĐ,
ngày 5/4/2010
Xét duyệt quyết toán ngân sách năm
2009

13 195/CNSH, ngày
07/5/2010
Giải trình điều chỉnh kinh phí điện nước
cho nội dung mua sắm hóa chất và vật tư
tiêu hao

14 279/VPCTTĐ-
THKH, ngày
01/6/2010
Điều chỉnh nội dung và kinh phí đề tài
15 279/VPCTTĐ-
THKH, ngày
01/06/2010
Điều chỉnh nội dung và kinh phí của đề
tài

16 491/QĐ-CNSH,
ngày 9/11/2010
Thành lập hội đồng nghiệm thu cấp cơ
sở Qui trình công nghệ





5
4. Tổ chức phối hợp thực hiện đề tài, dự án:
Số
TT
Tên tổ chức
đăng ký theo
Thuyết minh
Tên tổ chức đã
tham gia thực
hiện
Nội dung
tham gia
chủ yếu
Sản phẩm
chủ yếu
đạt được
Ghi
chú*
1
Viện Vệ sinh
dịch tễ TƯ

Viện Vệ sinh dịch
tễ TƯ

Lấy mẫu máu
từ bệnh nhân
HIV cho
nghiên cứu bao
gồm: 6 điểm ở
miền Bắc (Hà
Nội, Hải
Phòng, Quảng
Ninh, Lào Cai,
Sơn La, Nghệ
An)

Đã lấy được
120 mẫu máu
từ bệnh nhân
HIV/AIDS
cho nghiên
cứu bao
gồm: 6 điểm
ở miền Bắc
(Hà Nội, Hải
Phòng,
Quảng Ninh,
Lào Cai, Sơn
La, Nghệ
An)

2
Viện Vệ sinh
phòng dịch
quân đội

Viện Vệ sinh
phòng dịch quân
đội

Lấy mẫu máu
từ bệnh nhân
HIV cho
nghiên cứu bao
gồm: 2 ở miền
Trung (Huế,
Đà Nẵng); 2
điểm ở miền
Nam (TP Hồ
Chí Minh, Cần
Thơ)

Đã lấy được
40 mẫu máu
từ bệnh nhân
HIV cho
nghiên cứu
bao gồm: 2 ở
miền Trung

(Huế, Đà
Nẵng); 2
điểm ở miền
Nam (TP Hồ
Chí Minh,
Cần Thơ),
Đã kiểm tra
độ nhạy và
độ đặc hiệu
của các bộ
kit



6
3
Viện Huyết học
và Truyền máu

Viện Vệ sinh dịch
tễ tây nguyên

Lấy mẫu máu
từ bệnh nhân
HIV cho
nghiên cứu bao
gồm: 4 tỉnh ở
Tây Nguyên
(Đak Lac, Đắc
Nông, Gia Lai,

Kon Tum

Lấy được 40
mẫu máu từ
bệnh nhân
HIV cho
nghiên cứu
bao gồm: 4
tỉnh ở Tây
Nguyên (Đak
Lac, Đắc
Nông, Gia
Lai, Kon
Tum


4
Bệnh viện Bạch
Mai

Bệnh viện Việt
Tiệp Hải Phòng
Kiểm tra độ
nhạy và độ đặc
hiệu của các bộ
kit

Đã kiểm tra
độ nhạy và
độ đặc hiệu

của các bộ
kit


5
Viện Vi sinh vật
và CNSH

Viện Vi sinh vật
và CNSH

Biểu hiện gen
p24 của HIV
phân typ B có
nguồn gốc từ
nước ngoài

Đã biểu hiện
gen p24 của
HIV phân
typ B có
nguồn gốc từ
nước ngoài


- Lý do thay đổi (nếu có):

5. Cá nhân tham gia thực hiện đề tài, dự án:
(Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không quá 10
người kể cả chủ nhiệm)

Số
TT
Tên cá nhân
đăng ký theo
Thuyết minh
Tên cá nhân
đã tham gia
thực hiện
Nội dung
tham gia
chính
Sản phẩm
chủ yếu đạt
được
Ghi
chú*
1 Đinh Duy Kháng Đinh Duy
Kháng
Chủ nhiệm đề
tài

2 Bạch Thị Như
Quỳnh
Bạch Thị Như
Quỳnh
Thư ký đề tài

3
Đồng Văn
Quyền

Đồng Văn
Quyền
Thiết kế vector
biểu hiện gen,
tinh chế protein,
nghiên cứu tạo
bộ kit chẩn
đoán
Thiết kế được
các vector
biểu hiện gen
p24, gp120 và
gp41

4 Lê Thị Tâm Lê Văn Tuấn
Tìm hiểu phân
týp và đặc điểm
di truyền học
phân tử của các
Xác định
được các phân
týp và đặc
điểm di truyền


7
chủng HIV ở
Tây Nguyên

học phân tử

của 40 mẫu
HIV ở Tây
Nguyên

5 Phạm Minh
Tuấn
Nguyễn Thị Hoa Khuếch đại,
nhân dòng và
giải trình tự gen
p24, gp120,
gp41
Nhân dòng,
giải trình tự
gen p24,
gp120, gp41
và đăng ký
trong ngân
hàng
GenBank

6 Dương Văn Hợp Dương Văn Hợp Thiết kế vector
biểu hiện gen
p24 phân typ B
có nguồn gốc từ
Ấn Độ
Thiết kế được
vector biểu
hiện gen p24
phân typ B có
nguồn gốc từ

Ấn Độ

7
Nguyễn Trần
Hiển
Nguyễn Trần
Hiển
Chỉ đạo lấy mẫu
máu, tách huyết
thanh kiểm tra
kit
Lấy được đầy
đủ 120 mẫu
máu từ 6 tỉnh,
thành phía
Bắc, tách
huyết thanh
phục vụ
nghiên cứu

8
Nguyễn Trung
Chiến
Nguyễn Trung
Chiến
Chỉ đạo lấy mẫu
máu, tách huyết
thanh kiểm tra
kit
Lấy được đầy

đủ 80 mẫu
máu từ 4 tỉnh
thành phía
Nam, tách
huyết thanh
phục vụ
nghiên cứu

9
Bạch Khánh Hòa Chu Thị Nga
Kiểm tra độ đặc
hiệu và độ nhạy
của bộ kit
Đã kiểm tra
độ đặc hiệu và
độ nhạy của
các bộ kit Dot
blot, ngưng
kết hạt latex
và ELISA do
Viện CNSH
tạo ra

10
Nguyễn Xuân
Quang
Lê Phương
Hằng
Thiết kế vector
biểu hiện gen

p24, GP41,
Thiết kế được
các vector
biểu hiện gen


8
Gp120 phân typ
AE lưu hành ở
Việt Nam
p24, GP41,
Gp120 phân
typ AE lưu
hành ở Việt
Nam và chế
tạo được các
kit chẩn đoán
- Lý do thay đổi ( nếu có):

6. Tình hình hợp tác quốc tế:
Số
TT
Theo kế hoạch
(Nội dung, thời gian, kinh phí, địa
điểm, tên tổ chức hợp tác, số
đoàn, số lượng người tham gia )
Thực tế đạt được
(Nội dung, thời gian, kinh phí, địa
điểm, tên tổ chức hợp tác, số
đoàn, số lượng người tham gia )

Ghi
chú*

1
CDC Hoa Kỳ Thăm quan trao
đổi kinh nghiệm về giám sát HIV
tại Việt Nam, học hỏi kinh
nghiệm trong chẩn đoán phát hiện
HIV

Báo cáo “Giám sát dịch tễ học ở
mức độ phân tử của HIV ở một số
tỉnh thành của Việt Nam” tại Hội
nghị quốc tế về virus và các bệnh
truyền nhiễm. Busan, Hàn Quốc,
31/7-3/8/2010.

2

- Lý do thay đổi (nếu có):

7. Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị:
Số
TT
Theo kế hoạch
(Nội dung, thời gian, kinh phí, địa
điểm )
Thực tế đạt được
(Nội dung, thời gian, kinh
phí, địa điểm )

Ghi chú*
1
2

- Lý do thay đổi (nếu có):








9
8. Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:
(Nêu tại mục 15 của thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát
trong nước và nước ngoài)
Thời gian
(Bắt đầu, kết thúc
- tháng … năm)
Số
TT
Các nội dung, công việc
chủ yếu
(Các mốc đánh giá chủ yếu)
Theo kế
hoạch
Thực tế đạt
được
Người,

cơ quan
thực hiện
1
Nội dung 1:
Đánh giá về sự lưu hành của
các phân typ HIV ở 10 điểm
“nóng” trên lãnh thổ Việt
Nam:


Đánh giá về
sự lưu hành
của các phân
typ HIV ở 10
điểm “nóng”
trên lãnh thổ
Việt Nam.


Đánh giá về
sự lưu hành
của các phân
typ HIV ở 14
điểm “nóng”
trên lãnh thổ
Việt Nam.

Nguyễn Trần
Hiển, Viện
VSDTTW,

Nguyễn Trung
Chiến, Viện
VSPD Quân
Độ
i, Lê Văn
Tuấn, Viện
VSDT Tây
nguyên,

2
Nội dung 2:
Khuếch đại, nhân dòng và xác
định trình tự các gen gp120,
gp41, p24

Khuếch đại,
nhân dòng và
xác định trình
tự các gen
gp120, gp41,
p24 của các
phân typ HIV
lưu hành ở
Việt Nam

Khuếch đại,
nhân dòng và
xác định trình
tự các gen
gp120, gp41,

p24 của các
phân typ
CRF01_AE và
phân typ B lưu
hành ở Việt
Nam

Bạch Như
Quỳnh, Đinh
Duy Kháng,
Phạm Minh
Tuấn, Lê
Phương Hằng,
Nguyễn Thị
Hoa, Viện
Công nghệ
sinh học
3
Nội dung 3: Nghiên cứu thiết
kế vector biểu hiện các
protein GP120, GP41 và P24,
biến nạp tế bào E. coli để tạo
ra các chủng E. coli tái tổ hợp
sản xuất kháng nguyên.
Thiết kế các
vector biểu
hiện các
protein GP120,
GP41 và P24,
biến nạp tế bào

E. coli để tạo
ra các chủng E.
coli tái tổ hợp
sản xuất kháng
nguyên.

Đã thiết kế
thành công các
vector biểu
hiện các
protein GP120,
GP41 và P24,
biến nạp tế bào
E. coli để tạo
ra các chủng E.
coli tái tổ hợp
sản xuất kháng
nguyên.

Bạch Như
Quỳnh, Đinh
Duy Kháng,
Đồng Văn
Quyền, Lê
Phương Hằng,
Nguyễn Thị
Hoa, Viện
Công nghệ
sinh học,
Dương Văn

Hợp viện Vi
sinh vật và
CNSH
4
Nội dung 4: Nghiên cứu tìm
điều kiện tối ưu cho việc biểu
hiện, thu nhận và tinh chế các
Tìm được điều
kiện tối ưu cho
việc biểu hiện,
Đã tìm được
điều kiện tối
ưu cho việc
Bạch Như
Quỳnh, Đinh
Duy Kháng,

10
protein tái tổ hợp GP120,
GP41, P24
thu nhận và
tinh chế các
protein tái tổ
hợp GP120,
GP41, P24

biểu hiện, thu
nhận và tinh
chế các protein
tái tổ hợp

GP120, GP41,
P24. Đạt hiệu
quả 30 mg/lit
đối với P24, 30
mg/lit đối với
GP120 và 20
mg/lit đối với
GP41

Đồng Văn
Quyền, Lê
Phương Hằng,
Nguyễn Thị
Hoa, Viện
Công nghệ
sinh học
5
Nội dung 5: Nghiên cứu ứng
dụng các protein tái tổ hợp để
chế tạo các bộ sinh phẩm
chẩn đoán HIV bằng Western
blot (Dot blot), ngưng kết hạ
latex và ELISA
Ứng dụng các
protein tái tổ
hợp để chế tạo
được các bộ
sinh phẩm
chẩn đoán HIV
bằng Western

blot (Dot blot),
ngưng kết hạt
latex và
ELISA

Đã chế tạo
được các bộ
sinh phẩm
chẩn đoán HIV
bằng Dot blot,
ngưng kết hạt
latex và
ELISA

Bạch Như
Quỳnh, Đinh
Duy Kháng,
Đồng Văn
Quyền, Lê
Phương Hằng,
Nguyễn Thị
Hoa, Viện
Công nghệ
sinh học
6
Nội dung 6: Kiểm tra độ
nhạy, độ đặc hiệu của các kit
đã tạo ra trên cơ sơ các huyết
thanh bệnh nhân HIV có so
sánh với các kit nhập ngoại

Kiểm tra độ
nhạy, độ đặc
hiệu của các
kit đã tạo ra
trên cơ sơ các
huyết thanh
bệnh nhân HIV
có so sánh với
các kit nhập
ngoại
Đã kiểm tra độ
nhạy, độ đặc
hiệu của các
kit Dot blot,
ngưng kết hạt
latex và
ELISA tạo ra
với 60 mẫu
huyết thanh
dương tính và
âm tính với
HIV đã được
kiểm tra tại
Trung Tâm
HIV/AIDS bộ
Quốc phòng và
Bệnh viện Việt
Tiệp Hải
phòng
Nguyễn Trung

Chiến, Viện
VSPD Quân
Đội, Chu Thị
Nga, Bv Việt
Tiệp, Hải
Phòng

- Lý do thay đổi (nếu có):




11
III. SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI, DỰ ÁN
1. Sản phẩm KH&CN đã tạo ra:
a) Sản phẩm Dạng I:
Số
TT
Tên sản phẩm và
chỉ tiêu chất lượng
chủ yếu
Đơn
vị đo
Số
lượng
Theo kế hoạch
Thực tế
đạt được
1
Các chủng vi sinh vật

tái tổ hợp sản xuất ổn
định kháng nguyên
GP120
chủng
2
2 chủng Sản xuất
ổn định 20 mg
KN/lit
3 chủng Sản
xuất ổn định 30
mg KN/lit
2
Các chủng vi sinh vật
tái tổ hợp sản xuất ổn
định kháng nguyên
GP41
chủng
2
2 chủng Sản xuất
ổn định 20 mg
KN/lit
3 chủng Sản
xuất ổn định 20
mg KN/lit
3
Các chủng vi sinh vật
tái tổ hợp sản xuất ổn
định kháng nguyên
P24
chủng

2
2 chủng Sản xuất
ổn định 20 mg
KN/lit
3 chủng Sản
xuất ổn định 30
mg KN/lit
4
Các kháng nguyên tái
tổ hợp GP120, GP41,
P24 có độ tinh sạch đủ
tiêu chuẩn tạo các bộ
sinh phẩm chẩn đoán
mg 10
10 mg mỗi loại Đủ
độ tinh sạch và độ
đặc hiệu cho SX kit
chẩn đoán HIV
20 mg kháng
nguyên gp120;
10 mg kháng
nguyên gp41;
30 mg kháng
nguyên p24 Đủ
độ tinh sạch và
độ đặc hiệu cho
SX kit chẩn
đoán HIV
5
Bộ sinh phẩm Western

Blot (Dot blot)
Bộ 50
50 bộ 20 test/bộ Độ
nhạy 100%, độ đặc
hiệu 100%
50 bộ 20 test/bộ
Độ nhạy 99%,
độ đặc hiệu
96%
6
Bộ sinh phẩm ngưng
kết hạt Latex
Bộ
50
50 bộ 20 test/bộ Độ
nhạy 95%, độ đặc
hiệu 95%
50 bộ 20 test/bộ
Độ nhạy 97%,
độ đặc hiệu
89%
7
Bộ sinh phẩm ELISA
Bộ
30
30 bộ 30 test/bộ Độ
nhạy 100%, độ đặc
hiệu 95%
30 bộ 30 test/bộ
Độ nhạy 97%,

độ đặc hiệu
93%
- Lý do thay đổi (nếu có):


12
b) Sản phẩm Dạng II:
Yêu cầu khoa học
cần đạt

Số
TT
Tên sản phẩm

Theo kế hoạch Thực tế
đạt được
Ghi
chú

1
Quy trình công nghệ tạo
chủng vi sinh vật tái tổ hợp
sản xuất kháng nguyên
GP120
1 qui trình công
nghệ đảm bảo tạo ra
được chủng vi sinh
vật tái tổ hợp sản
xuất ổn định kháng
nguyên GP120

1 qui trình công
nghệ đảm bảo tạo
ra được chủng vi
sinh vật tái tổ hợp
sản xuất ổn định
kháng nguyên
GP120

2
Quy trình công nghệ tạo
chủng vi sinh vật tái tổ hợp
sản xuất kháng nguyên GP41
1 qui trình công
nghệ đảm bảo tạo ra
được chủng vi sinh
vật tái tổ hợp sản
xuất ổn định kháng
nguyên GP41
1 qui trình công
nghệ đảm bảo tạo
ra được chủng vi
sinh vật tái tổ hợp
sản xuất ổn định
kháng nguyên
GP41

3
Quy trình công nghệ tạo
chủng vi sinh vật tái tổ hợp
sản xuất kháng nguyên P24

1 qui trình công
nghệ đảm bảo tạo ra
được chủng vi sinh
vật tái tổ hợp sản
xuất ổn định kháng
nguyên P24
1 qui trình công
nghệ đảm bảo tạo
ra được chủng vi
sinh vật tái tổ hợp
sản xuất ổn định
kháng nguyên P24

4
Quy trình công nghệ sản
xuất bộ kit chẩn đoán HIV
bằng Western blot (Dot blot)
1 qui trình công
nghệ đảm bảo tạo ra
được bộ kit chẩn
đoán HIV bằng Dot
blot blot, có độ
nhạy, độ đặc hiệu
cao sử dụng cho
chẩn đoán HIV
1 qui trình công
nghệ đảm bảo tạo
ra được bộ kit chẩn
đoán HIV bằng Dot
blot blot, có độ

nhạy, độ đặc hiệu
cao sử dụng cho
chẩn đ
oán HIV

5
Quy trình công nghệ sản
xuất bộ kit chẩn đoán HIV
bằng ngưng kết hạt latex
1 qui trình công
nghệ đảm bảo tạo ra
được bộ kit chẩn
đoán HIV bằng
ngưng kết hạt latex,
có độ nhạy, độ đặc
hiệu cao sử dụng
cho chẩn đoán HIV
1 qui trình công
nghệ đảm bảo tạo
ra được bộ kit chẩn
đoán HIV bằng
ngưng kết hạt latex,
có độ
nhạy, độ đặc
hiệu cao sử dụng
cho chẩn đoán HIV


6
Quy trình công nghệ sản

xuất bộ kit chẩn đoán HIV
1 qui trình công
nghệ đảm bảo tạo ra
1 qui trình công
nghệ đảm bảo tạo


13
bằng ELISA được bộ kit chẩn
đoán HIV bằng
ELISA, có độ nhạy,
độ đặc hiệu cao sử
dụng cho chẩn đoán
HIV


ra được bộ kit chẩn
đoán HIV bằng
ELISA, có độ nhạy,
độ đặc hiệu cao sử
dụng cho chẩn đoán
HIV


- Lý do thay đổi (nếu có): Qui trình công nghệ sản xuất bộ kit Western blot
được thay bằng Dot blot, vì các kháng nguyên tái tổ hợp sử dụng được sản
xuất riêng rẽ từng loại (GP120, GP41 và P24) và tinh chế vì vậy không nhất
thiết phải điện di và chuyển sang màng giống như kháng nguyên tự nhiên
(Western blot) tốn công sức, nguyên vật liệu và làm cho giá thành bộ kit đắt
hơn mà chỉ cầm chấm thẳng kháng nguyên lên màng (Dot blot).

c) Sản phẩm Dạng III:
Yêu cầu khoa học
cần
đạt

Số
TT
Tên sản phẩm

Theo
kế hoạch
Thực tế
đạt được
Số lượng,
nơi công bố
(Tạp chí, nhà
xuất bản)
1 Công bố 4 bài báo 6 bài
Hội nghị SHPT
Y-Dược toàn
quốc; Tạp chí Y
học Việt Nam;
Tạp chí Công
nghệ Sinh học;
Tạp chí Y học
thực hành; Hội
nghị Quốc tế về
Virus và bệnh
truyền nhiễm,

Busan, Hàn
Quốc 31/7-3/8,
2010

2
Sách chuyên khảo 1 cuốn Vì thời gian quá
ngắn sau khi
thực hiện đề tài
chưa kịp thành
lập hội đồng xét
duyệt đề cương
sách chuyên
khảo.



- Lý do thay đổi (nếu có):

14
d) Kết quả đào tạo:
Số lượng
Số
TT
Cấp đào tạo, Chuyên
ngành đào tạo
Theo kế
hoạch
Thực tế đạt
được
Ghi chú

(Thời gian kết
thúc)
1 Thạc sỹ 02 8
04 đã hoàn
thành, 03 sẽ
hoàn thành
vào tháng
11-12 năm
2010, 01 sẽ
hoàn thành
vào năm
2011
2 Tiến sỹ 01 01 Năm 2011
- Lý do thay đổi (nếu có):

đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp, quyền đối với giống
cây trồng:
Kết quả
Số
TT
Tên sản phẩm
đăng ký
Theo
kế hoạch
Thực tế
đạt được
Ghi chú
(Thời gian kết
thúc)
1

Quy trình công nghệ sản
xuất bộ kit chẩn đoán HIV
đặc hiệu phân typ
CRF01_AE lưu hành ở Việt
Nam.
Đăng ký 01 giải
pháp
Đã gửi đơn

2

- Lý do thay đổi (nếu có):

e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN đã được ứng dụng vào thực tế
Số
TT
Tên kết quả
đã được ứng dụng
Thời gian
Địa điểm
(Ghi rõ tên, địa
chỉ nơi ứng dụng)
Kết quả
sơ bộ
1
2

2. Đánh giá về hiệu quả do đề tài, dự án mang lại:
a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:

15
(Nêu rõ danh mục công nghệ và mức độ nắm vững, làm chủ, so sánh với trình độ công
nghệ so với khu vực và thế giới…)
- Lần đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu biểu hiện thành công các gen mã hóa
các kháng nguyên quan trọng nhất của HIV phân typ CRF01_AE, bao gồm
GP120, GP41, P24 thu nhận protein tái tổ hợp dạng tinh chế.
- Nghiên cứu chế tạo thành công các kit chẩn đoán HIV với các protein tái tổ
hợp GP120, GP41, P24 biểu hiện từ phân typ HIV lưu hành trong nước.
b) Hiệu quả về kinh tế xã hội:
(Nêu rõ hiệu quả làm lợi tính bằng tiền dự kiến do đề tài, dự án tạo ra so với các sản phẩm
cùng loại trên thị trường…)
- Các kit chẩn đoán HIV với các protein tái tổ hợp GP120, GP41, P24 biểu
hiện từ phân typ HIV lưu hành trong nước được sản xuất bằng các chủng E.
coli tái tổ hợp do đề tài tạo ra có tính đặc hiệu cao và giá thành hạ sẽ mang lại
hiệu quả lớn về kinh tế và xã hội.
3. Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của đề tài, dự án:
Số
TT
Nội dung
Thời gian
thực hiện
Ghi chú
(Tóm tắt kết quả, kết luận chính,
người chủ trì…)
I Báo cáo định kỳ Tháng 7/2009 Đã hoàn thành đúng các nội
dung theo đúng tiến độ đăng kí
Lần 1
II Kiểm tra định kỳ Tháng 1/2010 Đã hoàn thành đúng các nội
dung theo đúng tiến độ đăng kí
Lần 2

III Kiểm tra định kỳ Tháng 7/2010 Đã hoàn thành đúng các nội
dung theo đúng tiến độ đăng kí.
Kết quả của đề tài có triển
vọng để triển khai pha II(sản
xuất thử nghiệm)
Lần 3
IV Nghiệm thu cơ sở Tháng 11/2010


Chủ nhiệm đề tài




PGS.TS. Đinh Duy Kháng
Thủ trưởng tổ chức chủ trì
ĐỀ TÀI KC04.20/06-10 BÁO CÁO TỔNG HỢP

1

MỤC LỤC
Trang

Danh mục các chữ viết tắt 6
Danh mục các hình 8
Mở đầu 10
Chương I. Tổng quan tài liệu
12
1.1. Tình hình nhiễm HIV/AIDS trên thế giới 12
1.1.1. Lịch sử quá trình phát hiện HIV/AIDS 12

1.1.2. Tình hình nhiễm HIV/AIDS trên thế giới 13
1.2. Tình hình nhiễm HIV/AIDS và nghiên cứu HIV ở Việt Nam 14
1.3. Đặc điểm của HIV 16
1.3.1. Giới thiệu chung 16
1.3.2. Đặc điểm hình thái cấu trúc của HIV 17
1.4. Phân loại HIV 20
1.4.1. HIV-1 20
1.4.2. HIV- 2 23
1.5. Đặc điểm sinh vật học củ
a HIV 23
1.6. Nguồn truyền nhiễm và đối tượng cảm thụ 23
1.7. Các phương thức lây truyền của HIV 24
1.8. Sự xâm nhập tế bào và nhân lên của virus 25
1.9. Đáp ứng miễn dịch của cơ thể khi nhiễm HIV/AIDS 27
1.9.1. Những thay đổi miễn dịch khi nhiễm HIV 27
1.9.2. Suy giảm miễn dịch do HIV 28
1.9.3. Diễn biến huyết thanh người nhiễm HIV/AIDS 29
1.10. Các kỹ thuật phát hiện HIV trong cơ thể 31
1.10.1. Phát hiện trực tiếp sự có mặ
t của HIV 31
ĐỀ TÀI KC04.20/06-10 BÁO CÁO TỔNG HỢP

2

1.10.2. Phát hiện KN của HIV 32
1.10.3. Các kỹ thuật sinh học phân tử trong xét nghiệm HIV 33
1.10.4. Phát hiện gián tiếp sự có mặt của HIV 34
1.10.5. Các bộ sinh phẩm (Kit) chẩn đoán HIV 36
1.10.6. Nghiên cứu các protein tái tổ hợp để tạo kit chẩn đoán 38
1.11. Điều trị HIV/AIDS 39

Chương II. Đối tượng, vật liệu và phương pháp nghiên cứu
41
2.1. Đối tượng, vật liệu 41
2.1.1. Đối tượng 41
2.1.2. Các sinh phẩm 41
2.1.3. Hoá chất 41
2.1.4. Dung dịch và môi trường 42
2.1.5. Thiế
t bị và máy móc 46
2.2. Phương pháp nghiên cứu 47
2.2.1. Tách chiết DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm 47
2.2.2. Phương pháp thiết kế các cặp mồi xác định phân typ B
và CRF01_AE
47
2.2.3. Phương pháp tạo dòng sản phẩm PCR 50
2.2.4. Phương pháp biến nạp plasmid vào tế bào E. coli khả
biến bằng sốc nhiệt
51
2.2.5. Phương pháp tách chiết plasmid từ E. coli 52
2.2.6. Phương pháp cắt DNA bằng enzyme giới hạn 53
2.2.7. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose 53
2.2.8. Phươ
ng pháp xác định trình tự axit nucleic 54
ĐỀ TÀI KC04.20/06-10 BÁO CÁO TỔNG HỢP

3

2.2.9. Phương pháp chiết DNA từ gel agarose 55
2.2.10. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide 56
2.2.11. Phương pháp biểu hiện protein tái tổ hợp trong E. coli

chủng BL21
57
2.2.12. Tinh chế protein dung hợp bằng cột Probond Nikel
Resin
58
2.2.13. Phương pháp Western blot 60
2.2.14. Định lượng proein bằng phương pháp Bradford 61
2.2.15. Phương pháp khuếch đại gen mã hoá kháng nguyên
gp120 của phân typ CRF01_AE
62
2.2.16. Phương pháp thiết kế vector biểu hiện gen mã hoá
kháng nguyên gp120
64
2.2.17. Phương pháp khuếch đại gen mã hoá kháng nguyên
GP41 của phân typ CRF01_AE
65
2.2.18. Phương pháp thiết kế vector biểu hiện gen mã hoá
kháng nguyên GP41 c
ủa phân typ CRF01_AE
67
2.2.19. Phương pháp thiết kế vector biểu hiện gen mã hoá
kháng nguyên P24
68
2.2.20. Phương pháp chế tạo bộ kit Dot blot chẩn đoán HIV 70
2.2.21. Phương pháp chế tạo bộ kit ngưng kết hạt latex chẩn
đoán HIV
71
2.2.22. Phương pháp chế tạo bộ kit LISA chẩn đoán HIV 73
2.2.23. Độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ kit 74
Chương III. Kết quả đạt được

75
3.1. Kết quả xác định phân type của HIV 75
3.2. Kết qu
ả khuếch đại, nhân dòng và xác định trình tự gen
gp120 của HIV-1 phân typ CRF01_AE
80
ĐỀ TÀI KC04.20/06-10 BÁO CÁO TỔNG HỢP

4

3.2.1. Khuếch đại gen mã hoá protein gp120 của virus HIV
bằng phương pháp Nested PCR
80
3.2.2. Tạo dòng plasmit tái tổ hợp mang gen mã hóa protein
gp120
81
3.3. Kết quả khuếch đại, nhân dòng và xác định trình tự gen gp41
của HIV-1 phân typ CRF01_AE
84
3.3.1. Khuếch đại gen mã hoá protein gp41 của virus HIV
bằng phương pháp Nested PCR
84
3.3.2. Tạo dòng plasmid tái tổ hợp mang gen mã hóa protein
gp41
85
3.4. Kết quả thiết kế vector biểu hiện gen gp120 của HIV-1 phân
typ CRF01_AE
87
3.4.1. Thiết kế vector biểu hiện repET-gp120 87
3.4.2. Biểu hiện protein tái tổ hợp GP120 89

3.4.3. Tinh ch
ế protein tái tổ hợp GP120 90
3.4.4. Nghiên cứu khả năng phản ứng của GP120 tái tổ hợp
với kháng thể kháng HIV trong huyết thanh bệnh nhân HIV
bằng Western blot
91
3.5. Kết quả thiết kế vector biểu hiện gen gp41 của HIV-1 phân
typ CRF01_AE
92
3.5.1. Thiết kế vectơ biểu hiện mang gen mã hoá protein gp41 92
3.5.2. Tối ưu hóa điều kiện biểu hiện và xác định trạng thái
GP41 tái tổ hợp
93
3.5.3. Tinh sạch GP41 tái tổ hợp 95
3.5.4. Kiểm tra kh
ả năng phát hiện kháng thể kháng HIV
trong huyết thanh bệnh nhân bằng Western blot
96
3.6. Kết quả thiết kế vector biểu hiện gen p24 của HIV-1 phân 97
ĐỀ TÀI KC04.20/06-10 BÁO CÁO TỔNG HỢP

5

typCRF01_AE
3.6.1. Biểu hiện và tinh sạch protein p24 97
3.6.2. Phát hiện kháng thể trong huyết thanh bệnh nhân 99
3.7. Kết quả nghiên cứu chế tạo bộ kit Dot Blot chẩn đoán HIV 100
3.8. Kết quả nghiên cứu chế tạo bộ kit ngưng kết hạt Latex chẩn
đoán HIV
104

3.9. Kết quả nghiên cứu chế tạo bộ kit Elisa chẩn đoán HIV 106
Kết luận và kiến nghị
108
Tài liệu tham khảo
110
Phụ lục
123
ĐỀ TÀI KC04.20/06-10 BÁO CÁO TỔNG HỢP

6

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AIDS Acquired ImmunoDeficiency Syndrome
Amp Ampicillin
APS Amonium persulphate
DNA Deoxyribonucleic Acid
RNA Ribonucleic Acid
Bp Base pair (cặp base)
BSA Bovine Serum Albumin
CBB Comassie Brillant Blue
CDC Centers for Disease Control and Prevention
CD4 Cluster of Differentiation 4
cDNA Complementary DNA
CRF Circulating Recombinant Form
dNTP Deoxynucleotide
E.coli Escherichia coli
EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
env
Gen mã hóa kháng nguyên vỏ (envelope)

EtBr Ethidium Bromite
gag Gen mã hóa kháng nguyên đặc hiệu nhóm (group specific
antigen)
gp glycoprotein
HAART Highly active antiretroviral therapy
HIV Human Immunodeficiency Virus
HRP Horse Raddish Peroxidase
IFA Immunofluorescence Assay
IPTG
Isopropylthio-β-D-Galactosite
ĐỀ TÀI KC04.20/06-10 BÁO CÁO TỔNG HỢP

7

Kb Kilo base
KDa, Da Kilo Dalton, Dalton
KN Kháng nguyên
KT Kháng thể
LB Môi trường Lauria Betani
nef
negative regulator factor
PBS Phosphate Buffered Saline
PCR Polymerase Chain Reaction
pol
Gen mã hóa polymerase
PVDF Polyvinylidene difluoride
SDS Sodium dodecyl sulphat
rev
regulation gene
SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphat-Polyacrylamid gel

electrophoresis
STD Sex Transmitted Disease
TAR transactivateur responsive
tat
transactivateur
TBS Tris Buffered Saline
TEMED Tetramethylenediamine
TTBS Tween- Tris Buffered Saline
UNAIDS Joint United Nations Programme on HIV and AIDS
vif
virion infectivity factor
WB Western Blot
WHO World Health Organization
X-gal
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D galactopyranosite

ĐỀ TÀI KC04.20/06-10 BÁO CÁO TỔNG HỢP

8

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1 Cấu trúc phân tử của HIV 17
Hình 1.2 Sơ đồ cấu trúc gen của HIV 20
Hình 1.3 Bản đồ phân bố các phân type HIV 21
Hình 1.4 Sơ đồ phân type của HIV 23
Hình 1.5 Vòng đời của HIV 27
Hình 1.6 Sự biến động của các thông số sinh học trên bệnh nhân
nhiễm HIV.
31

Hình 3.1 Các tỉnh thành nơi thu nhận mẫu máu từ bệnh nhân
HIV/AIDS phục vụ nghiên cứu.
76
Hình 3.2 Sự phân bố củ các phân typ HIV trên thế giới. 77
Hình 3.3 Sản phẩm Nested PCR với cặp mồi của phân type B và
phân type CRF01_AE
78
Hình 3.4 Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại gen gp120
trên gel agarose 1%
82
Hình 3.5 Kết quả tạo dòng gen mã hóa protein GP120 83
Hình 3.6 Kết quả sản phẩm PCR vòng 1 85
Hình 3.7 Kết quả sản phẩm PCR vòng 2 86
Hình 3.8 Kết quả kiểm tra các dòng DNA plasmid sau khi xử lí
bằng EcoR I
87
Hình 3.9 Chọn lọc các dòng plasmid tái tổ hợp pET32a(+) mang
gen gp120 bằng điện di trên gel agarose 1%
89
Hình 3.10 Hình ảnh điện di kiểm tra protein tổng số chủng tái tổ
hợp E. coli BL21 Star™ (DE3) sau khi cảm ứng với
IPTG
90
Hình 3.11 Kiểm tra độ tinh sạch của GP120 tái tổ hợp sau tinh chế 91
ĐỀ TÀI KC04.20/06-10 BÁO CÁO TỔNG HỢP

9

bằng điện di trên gel SDS-PAGE
Hình 3.12 Phát hiện kháng thể kháng HIV tự nhiên trong huyết

thanh bệnh nhân bằng Western blot
92
Hình 3.13 Chọn lọc các dòng plasmid tái tổ hợp pET32a (+) mang
gen gp41 bằng điện di trên gel agarose 1%
94
Hình 3.14 Kết quả điện di trên gel SDS-PAGE 95
Hình 3.15 Kiểm tra độ tinh sạch của GP41 tái tổ hợp sau tinh chế
bằng điện di trên gel SDS-PAGE
96
Hình 3.16 Kết quả kiểm tra phản ứng giữa GP41 tái tổ hợp với
kháng thể kháng HIV từ các mẫu huyết thanh bệnh
nhân
98
Hình 3.17 Kết quả biểu hiện protein tái tổ hợp p24 được kiểm tra
bằng điện di trên gel polyacrylamide
99
Hình 3.18 Tinh chế protein tái tổ hợp p24 bằng cột Ni-Resin 99
Hình 3.19 Phản ứng của protein p24 tái tổ hợp với kháng thể trong
huyết thanh bệnh nhân bằng kỹ thuật western blot
100
Hình 3.20 Dot blot với các kháng nguyên tái tổ hợp 101
Hình 3.21 Bộ kit Dot blot chẩn đoán HIV của viện Công nghệ
sinh học
105
Hình 3.22 Ảnh chụp dưới kính hiển vi sự ngưng kết của phức hợp
hạt latex-kháng nguyên-kháng thể sau khi trộn huyết
thanh bệnh nhân HIV với huyền dịch hạt latex gắn KN
HIV
106
Hình 3.23 Bộ kit ngưng kết hạt latex chẩn đoán HIV của Viện

Công nghệ sinh học
107
Hình 3.24 Bộ kit ELISA chẩn đoán HIV của Viện Công nghệ sinh
học
108