xây dựng quy trình sản xuất bộ mẫu có kháng nguyên ns1 của virus dengue sử dụng trong kiểm tra chất lượng phòng xét nghiệm về test nhanh ns1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

HUỲNH PHƯƠNG THẢO

XÂY DỰNG QUY TRÌNH SẢN XUẤT BỘ MẪU
CĨ KHÁNG NGUN NS1 CỦA VIRUS DENGUE
SỬ DỤNG TRONG KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG
PHÒNG XÉT NGHIỆM VỀ TEST NHANH NS1

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2020


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

HUỲNH PHƯƠNG THẢO

XÂY DỰNG QUY TRÌNH SẢN XUẤT BỘ MẪU
CĨ KHÁNG NGUN NS1 CỦA VIRUS DENGUE
SỬ DỤNG TRONG KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG
PHÒNG XÉT NGHIỆM VỀ TEST NHANH NS1

Chuyên ngành: Kiểm nghiệm Thuốc – Độc chất
Mã số: 8720210

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Hướng dẫn khoa học:
PGS.TS. NGUYỄN ĐỨC TUẤN
TS. NGUYỄN VŨ THƯỢNG

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2020


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả
trong luận văn này là trung thực và chưa từng được ai cơng bố trong bất kỳ cơng trình
nào khác.
Tác giả

Huỳnh Phương Thảo


Luận văn Thạc sĩ – Khóa: 2018 – 2020
Chuyên ngành: Kiểm nghiệm Thuốc & Độc chất – Mã số: 8720210
XÂY DỰNG QUY TRÌNH SẢN XUẤT BỘ MẪU CĨ KHÁNG NGUN NS1
CỦA VIRUS DENGUE SỬ DỤNG TRONG KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG
PHÒNG XÉT NGHIỆM VỀ TEST NHANH NS1
Huỳnh Phương Thảo
Thầy hướng dẫn: PGS.TS. Nguyễn Đức Tuấn, TS. Nguyễn Vũ Thượng
Từ khóa: Bộ mẫu NS1, ngoại kiểm, test nhanh NS1, virus Dengue.
Mở đầu: Kết quả test nhanh phát hiện kháng nguyên NS1 của virus Dengue được sử

dụng rộng rãi trong chẩn đoán cũng như cơng tác phịng chống dịch sốt xuất huyết
Dengue. Tuy nhiên, hiện nay chưa có đơn vị trong nước cung cấp bộ mẫu chuẩn NS1
để đánh giá chất lượng các phòng xét nghiệm về test nhanh NS1. Từ nhu cầu thực tế
trên, đề tài này được thực hiện với mục tiêu xây dựng quy trình sản xuất bộ mẫu có
kháng nguyên NS1 của virus Dengue sử dụng trong kiểm tra chất lượng phòng xét
nghiệm về test nhanh NS1.
Đối tượng và Phương pháp nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: Huyết tương bệnh nhân sốt xuất huyết Dengue của 20 tỉnh/thành
phố khu vực phía Nam được thu thập từ mẫu giám sát của Chương trình Phịng chống
Sốt xuất huyết Quốc gia và mẫu NS1 âm tính được thu thập từ viện Truyền máu và
huyết học TP.HCM. Phương pháp nghiên cứu: Sau khi sàng lọc với các tác nhân HIV,
viêm gan B, viêm gan C, sởi, Rubella, Leptospira, Zika, Chikungunya, mẫu NS1 dương
tính được phối trộn cho đủ thể tích và mẫu âm tính được sử dụng để sản xuất 3 lô và
được xác định các đặc tính bằng realtime RT-PCR Dengue, ELISA phát hiện NS1 của
công ty SD và test nhanh NS1 của một số công ty sản xuất khác nhau. Bộ mẫu được
bảo quản ở dạng đông lạnh và đông khô. Độ đồng nhất của bộ mẫu được thực hiện trên
5 mẫu ngẫu nhiên với 2 lần lặp lại và độ ổn định được xác định ở 2 điều kiện bảo quản
là 2-8 oC và -20 oC trong 3 tháng bằng test nhanh SD.
Kết quả: Đã sản xuất được bộ mẫu ngoại kiểm bao gồm 3 mẫu dương tính và 2 mẫu
âm tính ở dạng đơng lạnh và đơng khơ đạt u cầu về độ đồng nhất và độ ổn định trong
3 tháng ở -20 oC. Bộ mẫu đông khô của lô đầu tiên đã được sử dụng để triển khai ngoại
kiểm, được gửi dưới dạng bưu phẩm tới 23 phòng xét nghiệm đánh giá chất lượng xét
nghiệm NS1 và đều cho kết quả tương đồng với Viện Pasteur TP.HCM.
Kết luận: Bộ mẫu ngoại kiểm cho test nhanh NS1 Dengue dạng đông khô và đông lạnh
đã được sản xuất thành công, đảm bảo độ đồng nhất và độ ổn định ở -20 oC trong 3
tháng, đáp ứng tiêu chí của mẫu dùng trong chương trình kiểm tra chất lượng các phịng
xét nghiệm.


Master’s Thesis – Academic course: 2018 – 2020

Specialty: Drug Quality Control & Toxicology – Code: 8720210
DEVELOPMENT OF PRODUCTION PROCESS OF DENGUE NS1 ANTIGEN
PANEL FOR EXTERNAL QUALITY ASSESSMENT
OF DENGUE NS1 RAPID TEST
Huynh Phuong Thao
Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Nguyen Duc Tuan, Dr. Nguyen Vu Thuong
Keywords: NS1 panel, external quality assessment, NS1 rapid test, Dengue virus.
Introduction: Dengue NS1 antigen testing is a popular method to diagnose Dengue
fever in the early stages of the disease. It uses the Dengue NS1 test result not only in
diagnosis but also in Dengue prevention and control program. So far, there have been
no local Dengue NS1 standard panel for external quality assessment of Dengue NS1
rapid test in Vietnam. For that reason, this study was conducted to develop production
process of Dengue NS1 antigen panel for external quality assessment of Dengue NS1
rapid test.
Methods: Object of study: Dengue patient plasma were collected from 20 southern
Vietnam provinces in the National Dengue Control Program and the NS1 negative
samples were collected from Hematology and Blood Transfusion hospital at Ho Chi
Minh city. Methods: After screening for HIV, hepatitis B, hepatitis C, measles, Rubella,
Leptospira, Zika, Chikungunya, the NS1 pooled positive samples and the negative
samples were used to produce three batches and characterized by Dengue virus realtime RT-PCR, SD Dengue NS1 Ag ELISA and some different brands of NS1 rapid
tests. The panels were stored in freeze-drying condition, and freezing at -20 oC. By
using SD rapid tests, the frozen and freeze-dried panels were evaluated homogeneity
by performing on 5 random samples with two replicates, and stability at two storage
conditions at 2-8 °C and -20 °C for three months.
Results: The sample panels including three positive samples and two negative samples
in frozen and lyophilized form were produced and conformed homogeneity and
stability for three months at -20 oC. The lyophilized samples of the first batch were
shipped to 23 laboratories for external quality assessment of Dengue NS1 test and the
results of testing showed similarity with the result from Pasteur Institute HCMC.
Conclusion: The freeze-dried and frozen Dengue NS1 panels have been successfully

produced, ensuring uniformity and stability at -20 °C for three months, and can be used
for external quality assessment scheme.


MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................ i
DANH MỤC CÁC BẢNG ......................................................................................... iii
DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ ........................................................... iv
MỞ ĐẦU .......................................................................................................................1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................3
1.1. Sốt Dengue và sốt xuất huyết Dengue ....................................................................3
1.2. Các phương pháp chẩn đoán sốt xuất huyết Dengue ..............................................8
1.3. Kiểm tra chất lượng xét nghiệm ............................................................................13
1.4. Bộ mẫu NS1 và các yếu tố ảnh hưởng tới chất lượng mẫu chuẩn ........................16
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .........................20
2.1. Đối tượng nghiên cứu..........................................................................................20
2.2. Thiết kế nghiên cứu.............................................................................................20
2.3. Dân số mục tiêu ...................................................................................................20
2.4. Dụng cụ - Trang thiết bị - Sinh phẩm – Hóa chất ............................................21
2.5. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................23
2.5.1. Thu thập mẫu từ mẫu giám sát ...........................................................................23
2.5.2. Xác định đặc tính mẫu thu thập .........................................................................24
2.5.3. Sản xuất mẫu ngoại kiểm kháng nguyên NS1 của virus Dengue ......................34
2.5.5. Triển khai thí điểm ngoại kiểm kháng nguyên NS1 của virus Dengue tại các tỉnh
phía Nam .............................................................................................................35
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ....................................................................37
3.1. Thu thập mẫu từ mẫu chương trình giám sát SXH quốc gia .........................37
3.2. Xác định đặc tính mẫu thu thập ........................................................................38
3.2.1. Kết quả xét nghiệm sàng lọc HIV Ab, VGB Ag, VGC Ab, sởi, Rubella,

Leptospira, Zika, chikungunya. ...........................................................................38
3.2.2. Kết quả sàng lọc kháng nguyên NS1 trong mẫu huyết tương. ..........................41
3.3. Sản xuất mẫu ngoại kiểm kháng nguyên NS1 của virus Dengue ...................43
3.3.1. Phối trộn mẫu huyết tương .................................................................................43


3.3.2. Bất hoạt mẫu ......................................................................................................43
3.3.3. Xác định đặc tính mẫu .......................................................................................45
3.3.4. Sản xuất mẫu ngoại kiểm ...................................................................................51
3.4. Kết quả đánh giá chất lượng mẫu ngoại kiểm .................................................53
3.4.1. Đánh giá độ đồng nhất .......................................................................................53
3.4.2. Đánh giá độ ổn định mẫu ...................................................................................54
3.5. Quy trình sản xuất mẫu ngoại kiểm kháng nguyên NS1 của virus Dengue ..56
3.6. Kết quả triển khai ngoại kiểm kháng nguyên NS1 của virus Dengue tại các
tỉnh phía Nam .............................................................................................................57
3.6.1. Độ ổn đinh của bộ mẫu ngoại kiểm ...................................................................58
3.6.2. Kết quả triển khai của các đơn vị tham gia ........................................................59
Chương 4: BÀN LUẬN..............................................................................................63
4.1. Mẫu thu thập .........................................................................................................63
4.2. Quy trình sản xuất mẫu ngoại kiểm kháng nguyên NS1 của virus Dengue .........65
4.3. Chất lượng mẫu ngoại kiểm kháng nguyên NS1 của virus Dengue .....................66
4.4. Kết quả triển khai mẫu ngoại kiểm tại các tỉnh phía Nam ....................................67
Chương 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................69
KẾT LUẬN ..................................................................................................................69
KIẾN NGHỊ .................................................................................................................69
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


i

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu, chữ

Nghĩa tiếng Việt

Từ nguyên

viết tắt
CHIKV

Virus Chikungunya

CRM

Certified refence material

DENV

Virus Dengue

ELISA

Mẫu chuẩn được chứng nhận

Enzyme linked immunosorbent Phản ứng hấp phụ miễn dịch
assay

gắn men

ER

Endoplasmic reticulum

Mạng lưới nội chất

EQA

External Quality Assessment
The

ENIVD

European

Network

Đánh giá chất lượng bên
ngoài
for Mạng lưới PXN Châu Âu về

Diagnostics of Imported Viral bệnh do virus du nhập
Diseases

HCSD

Hội chứng sốc Dengue

HRPO

Horseradish Peroxidase

HTg

Huyết tương

ICT

Immunochoromatography test

INF

Interferon

IQC

Internal quality control
IgM

MAC-ELISA

Antibody

captured

Thử nghiệm bằng sắc ký miễn
dịch

Nội kiểm tra
– Phản ứng hấp phụ miễn dịch

Enzyme Linked Immunosorbent

gắn enzym thu bắt kháng thể

assay

IgM

KVPN

Khu vực phía Nam

NS1

Nonstructural protein 1

Protein khơng cấu trúc 1

OD

Optical density

Mật độ quang

PCR

Polymerase chain reaction

Phản ứng khuếch đại gen

PXN

Phòng xét nghiệm


ii

PT
RCPA

Proficiency testing

Thử nghiệm thành thạo

Royal College of Pathologists of Hội nghiên cứu bệnh học
Australasia

Hoàng gia Úc

RM

Reference material

Mẫu chuẩn

RNA

Ribonucleic acid

RT-PCR

Reverse transcriptase

Phản ứng khuếch đại chuỗi

Polymerase chain reaction

gen sau khi sao chép ngược

SCF

Soluble complement-fixing

SD

Sốt Dengue

SXHD

Bệnh sốt xuất huyết Dengue

TLR

Toll-like receptor

TMB

3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine

TTYT

Trung tâm y tế

WHO

World Health Organization

ZIKV

Virus Zika

Kháng nguyên cố định bổ thể
hòa tan

Thụ thể giống Toll

Tổ chức Y tế thế giới


iii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1. Biểu mẫu dùng chọn mẫu sản xuất bộ mẫu ngoại kiểm .............................24
Bảng 3.1. Số lượng mẫu thu thập từ chương trình giám sát SXH năm 2019 ..............37
Bảng 3.2. Phân bố mẫu huyết tương theo thời gian thu thập ......................................37
Bảng 3.3. Kết quả sàng lọc HBsAg của 20 mẫu G10 của 4 nhóm G200 .......................39
Bảng 3.4. Kết quả sàng lọc HIV Ab, VGC Ab, sởi, Rubella, Leptospira ...................40
Bảng 3.5. Kết quả sàng lọc mẫu bằng realtime RT-PCR ............................................41

Bảng 3.6. Kết quả xét nghiệm ELISA .........................................................................42
Bảng 3.7. Kết quả xác định đặc tính mẫu bằng realtime RT-PCR ..............................46
Bảng 3.8. Kết quả xác định đặc tính mẫu bằng kỹ thuật ELISA phát hiện NS1 .........47
Bảng 3.9. Kết quả xác định đặc tính mẫu bằng test nhanh NS1 .................................50
Bảng 3.10. Kết quả đánh giá độ đồng nhất của mẫu huyết tương đông lạnh ..............53
Bảng 3.11. Kết quả đánh giá độ đồng nhất của mẫu huyết tương đông khô ..............54
Bảng 3.12. Kết quả đánh giá độ ổn định bộ mẫu ngoại kiểm ở điều kiện vận chuyển
của bộ mẫu đông lạnh ..................................................................................................54
Bảng 3.13. Kết quả đánh giá độ ổn định bộ mẫu ngoại kiểm ở điều kiện bảo quản ...55
Bảng 3.14. Kết quả đánh giá độ ổn định của bộ mẫu huyết tương đông khô gửi đến các
đơn vị tham gia.............................................................................................................58
Bảng 3.15. Các test nhanh được sử dụng ở các đơn vị tham gia ngoại kiểm ..............61


iv

DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ
Trang
Hình 1.1. Cấu trúc bộ gen của DENV ..........................................................................6
Hình 1.2. Các phương pháp chẩn đoán nhiễm sốt xuất huyết ......................................9
Hình 1.3. Các dấu ấn trong chẩn đoán .........................................................................9
Hình 2.1: Sơ đồ thực hiện quá trình sản xuất bộ mẫu ngoại kiểm NS1 .....................23
Hình 3.1. Sơ đồ phối hợp mẫu từ hai trăm mẫu riêng rẽ. ............................................38
Hình 3.2. Kết quả sàng lọc HBsAg của 4 mẫu G200. ...................................................39
Hình 3.3. Biểu đồ khuếch đại của phản ứng realtime RT-PCR phát hiện virus
Chikungunya, Zika và Dengue .....................................................................................40
Hình 3.4. Chai mẫu khuấy từ qua đêm và khuấy đều 1 giờ sau khi bổ sung chất bảo
quản (dung dịch Proclin 300 0,05%) ở nhiệt độ 2-8 oC ...............................................44
Hình 3.5. Tế bào C6/36 dưới kính hiển vị huỳnh quang (vật kính x 40) sau khi nhuộm
DFA mẫu PI-1 của lơ 1 (hình A) và chứng dương Dengue-2 (hình B) .......................44

Hình 3.6. Biểu đồ khuếch đại của phản ứng realtime RT-PCR phát hiện DENV-1,
DENV-2, DENV-3 và DENV-4 của 5 mẫu ngoại kiểm lơ 1 .......................................45
Hình 3.7. Biểu đồ xác định đặc tính bộ mẫu bằng kỹ thuật ELISA phát hiện NS1 của
mẫu PI-1 .......................................................................................................................48
Hình 3.8. Biểu đồ xác định đặc tính bộ mẫu bằng kỹ thuật ELISA phát hiện NS1 của
mẫu PI-3 .......................................................................................................................48
Hình 3.9. Biểu đồ xác định đặc tính bộ mẫu bằng kỹ thuật ELISA phát hiện NS1 của
mẫu PI-4 .......................................................................................................................49
Hình 3.10. Xác định đặc tính bộ mẫu bằng kỹ thuật ELISA phát hiện NS1...............49
Hình 3.11. Kết quả xác định đặc tính bằng test nhanh NS1 ở lơ 1, mẫu 1 .................51
Hình 3.12. Mẫu đơng khơ trên máy Modulyo D-230 và ống mẫu sau đơng khơ .......52
Hình 3.13. Nhãn dán bộ mẫu ngoại kiểm ....................................................................57
Hình 3.14. Bộ mẫu ngoại kiểm được đóng gói và gửi cho các đơn vị ........................57


v

Hình 3.15. Thời gian bộ mẫu vận chuyển tại nhiệt độ thường đến các đơn vị và quay
trở lại Viện Pasteur TP.HCM .......................................................................................58
Hình 3.16. Tỷ lệ phần trăm các đơn vị tham gia chương trình ...................................59
Hình 3.17. Thời gian các đơn vị gửi kết quả bộ mẫu chuẩn .......................................60
Hình 3.18. Các test nhanh NS1 được các đơn vị sử dụng xét nghiệm bộ mẫu ngoại
kiểm ..............................................................................................................................60


1

MỞ ĐẦU
Chẩn đoán phòng xét nghiệm (PXN) là một thành phần quan trọng của giám sát và
kiểm soát sốt xuất huyết Dengue (SXHD). Trong giai đoạn nhiễm trùng cấp tính, việc

phát hiện dựa vào RNA và/hoặc protein không cấu trúc NS1, trong khi kháng thể kháng
IgM và/hoặc IgG là mục tiêu nhắm đến trong giai đoạn hồi phục. Một số xét nghiệm
chẩn đoán thương mại cho bệnh sốt xuất huyết hiện được sử dụng để phát hiện RNA
hoặc định danh serotype của virus như phản ứng RT-PCR, hoặc phát hiện kháng thể
NS1, hoặc IgG và IgM kháng lại virus. Một hình thức phổ biến được sử dụng bởi các
PXN để duy trì độ chính xác và chất lượng chẩn đoán là đánh giá chất lượng bên ngoài
(EQA) hoặc thử nghiệm thành thạo. Theo đó, một cơ quan bên ngoài phân phối các
mẫu mù cho phịng thí nghiệm để phân tích và sau đó xác nhận và báo cáo kết quả.
EQA có thể được sử dụng để so sánh hiệu suất phòng xét nghiệm, phát hiện các vấn đề
tiềm ẩn liên quan đến sinh phẩm chẩn đoán hoặc quy trình, chỉ ra các khu vực trong
phòng xét nghiệm cần cải thiện và xác định nhu cầu đào tạo. Ngoài việc đảm bảo chẩn
đoán chính xác bệnh sốt xuất huyết, chương trình EQA còn liên kết các PXN tham gia
với các PXN tham chiếu quốc tế có thể hỗ trợ chẩn đoán chuyên sâu hơn hoặc các chức
năng phân tích theo yêu cầu [13].
Trong khn khổ của Chương trình mục tiêu quốc qua phòng chống SXHD, các
phòng xét nghiệm chẩn đoán DENV ở bốn viện (Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương,
Viện Pasteur Nha Trang, Viện Vệ sinh Dịch tễ Tây Nguyên và Viện Pasteur TP. HCM)
phụ trách công tác giám sát virus – huyết thanh học bệnh SD/SXHD ở từng khu vực
trên những quy trình kỹ thuật chẩn đoán DENV khác nhau. Các PXN trong các bệnh
viện, trung tâm y tế dự phòng và trung tâm chẩn đoán tư nhân cũng đã và đang sử dụng
những bộ sinh phẩm chẩn đoán thương mại từ nhiều nguồn khác nhau để chẩn đoán
sinh học bệnh SD/SXHD. Do xét nghiệm NS1 có thể sử dụng để chẩn đoán xác định ở
giai đoạn sớm của bệnh và có thể thực hiện ở tuyến y tế cơ sở, cho kết quả nhanh (sau
2-4 giờ) nên xét nghiệm NS1 tại tuyến quận/huyện trở nên phổ biến. Từ đó, rất khó đối
chiếu hoặc thu thập các kết quả đạt được bởi các viện khác nhau cũng như đánh giá
chất lượng thật sự của các xét nghiệm.


2

Theo quyết định 3711/QĐ-BYT ban hành ngày 19/09/2014 về “Hướng dẫn giám
sát và phòng chống bệnh sốt xuất huyết Dengue”, kết quả NS1 được đề cập trong định
nghĩa ca bệnh xác định để đưa vào hệ thống giám sát, báo cáo và xử lý ổ dịch. Số lượng
ổ dịch phát hiện bằng NS1 tăng dần qua các năm. Năm 2015, số lượng ổ dịch NS1(+)
chiếm 25,5% với số ổ dịch được phát hiện là 2.614. Số lượng ổ dịch NS1(+) năm 2016
chiếm 30,6% tổng số ổ dịch phát hiện (3.036 ổ dịch NS1(+)/9.924 ổ dịch). Năm 2018,
ghi nhận sự gia tăng mạnh số ổ dịch có kết quả NS1(+) so với các năm trước. Số lượng
ổ dịch NS1(+) chiếm 46,6% tổng số ổ dịch phát hiện (6.497 ổ dịch NS1(+)/13.932 ổ
dịch). Tỷ lệ ổ dịch NS1(+) tăng 10% so với năm 2017 (đạt tỷ lệ 37%) [7],[8],[9]. Nhờ
xét nghiệm NS1 này, các ổ dịch được phát hiện và xử lý kịp thời góp phần cho cơng
tác phịng chống dịch hiệu quả. Tuy nhiên, hiện nay chưa có đơn vị trong nước cung
cấp bộ mẫu chuẩn NS1 để đánh giá chất lượng các phòng xét nghiệm. Xuất phát từ
thực tiển trên, đề tài “Xây dựng quy trình sản xuất bộ mẫu có kháng nguyên NS1 của
virus Dengue sử dụng trong kiểm tra chất lượng phòng xét nghiệm về test nhanh
NS1” được thực hiện nhằm đáp ứng nhu cầu nâng cao chất lượng xét nghiệm NS1
Dengue tại 20 tỉnh phía Nam. Mục tiêu của đề tài là:
-

Xây dựng ngân hàng mẫu xác định kháng nguyên NS1 của DENV.

-

Đánh giá chất lượng mẫu sau khi sản xuất.

-

Triển khai thí điểm ngoại kiểm kháng nguyên NS1 của DENV tại các tỉnh khu
vực phía Nam.

3

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sốt Dengue và sốt xuất huyết Dengue
Bệnh sốt Dengue (SD) và bệnh sốt xuất huyết Dengue (SXHD) là bệnh do virus
truyền qua muỗi Aedes aegypti đã lan nhanh ở tất cả các khu vực của WHO trong những
năm gần đây. Muỗi Aedes aegypti cũng truyền bệnh Chikungunya và Zika. Sốt xuất
huyết lan rộng khắp vùng nhiệt đới và bị ảnh hưởng bởi lượng mưa, nhiệt độ và q
trình đơ thị hóa [36].
1.1.1. Tình hình bệnh sốt Dengue và sốt xuất huyết Dengue trên thế giới và Việt
Nam
1.1.1.1. Tình hình bệnh sốt Dengue và sốt xuất huyết Dengue trên thế giới
Trước năm 1970, chỉ có 9 quốc gia trải qua dịch bệnh sốt xuất huyết nặng. Bệnh
hiện đang lưu hành ở hơn 100 quốc gia thuộc khu vực WHO ở Châu Phi, Châu Mỹ,
Đông Địa Trung Hải, Đơng Nam Á và Tây Thái Bình Dương. Các khu vực Mỹ, Đơng
Nam Á và Tây Thái Bình Dương bị ảnh hưởng nghiêm trọng nhất [36].
Các ca bệnh xảy ra trên khắp Châu Mỹ, Đông Nam Á và Tây Thái Bình Dương
vượt quá 1,2 triệu trong năm 2008 và hơn 3,34 triệu vào năm 2016 (dựa trên dữ liệu
chính thức do các quốc gia thành viên đệ trình). Gần đây số lượng các trường hợp báo
cáo đã tiếp tục tăng. Trong năm 2015; 2,35 triệu trường hợp mắc sốt xuất huyết đã được
báo cáo chỉ riêng ở Châu Mỹ, trong đó 10.200 trường hợp được chẩn đoán là sốt xuất
huyết nặng khiến 1181 người tử vong [36].
Không chỉ số lượng ca bệnh gia tăng khi bệnh lây sang các khu vực mới, mà còn
bùng phát thành dịch. Mối đe dọa của dịch sốt xuất huyết có thể xảy ra ở Châu Âu khi
lần đầu tiên ở Pháp và Croatia xảy ra đợt dịch ở địa phương vào năm 2010 và các
trường hợp du nhập đã được phát hiện ở 3 quốc gia Châu Âu khác. Năm 2012, dịch sốt
xuất huyết trên quần đảo Madeira của Bồ Đào Nha đã gây ra hơn 2.000 trường hợp và
các trường hợp du nhập đã được phát hiện ở lục địa Bồ Đào Nha và 10 quốc gia khác
ở Châu Âu. Trong số các du khách trở về từ các quốc gia thu nhập thấp và trung bình,
sốt xuất huyết là nguyên nhân được chẩn đoán sốt thứ hai sau sốt rét [36].

Năm 2015, tại Delhi, Ấn Độ, đã ghi nhận đợt bùng phát tồi tệ nhất kể từ năm 2006
với hơn 15.000 trường hợp. Đảo Hawaii, Hoa Kỳ, đã bị ảnh hưởng bởi một vụ dịch với


4

181 trường hợp được báo cáo vào năm 2015 và lây truyền đang diễn ra vào năm 2016.
Các quốc đảo Thái Bình Dương của Fiji, Tonga và Polynesia thuộc Pháp đã tiếp tục
ghi nhận các trường hợp bệnh [36].
Năm 2016 được đặc trưng bởi sự bùng phát sốt xuất huyết lớn trên toàn thế giới.
Khu vực Châu Mỹ đã báo cáo hơn 2,38 triệu trường hợp trong năm 2016, trong đó
riêng Brazil đã đóng góp ít nhất 1,5 triệu trường hợp, cao gấp khoảng 3 lần so với năm
2014 và 1.032 trường hợp tử vong do sốt xuất huyết cũng được báo cáo trong khu vực.
Khu vực Tây Thái Bình Dương đã báo cáo hơn 375.000 trường hợp nghi mắc sốt xuất
huyết trong năm 2016, trong đó Philippine báo cáo 176.411 và Malaysia 100.028
trường hợp, thể hiện gánh nặng tương tự năm trước đối với cả hai nước. Quần đảo
Solomon tuyên bố có một ổ dịch với hơn 7000 trường hợp nghi ngờ. Tại khu vực Châu
Phi, Burkina Faso đã báo cáo một đợt bùng phát sốt xuất huyết cục bộ với 1.061 trường
hợp có thể xảy ra [36].
Trong năm 2017, số lượng ca mắc sốt xuất huyết đã giảm đáng kể ở mức 73% ở
châu Mỹ - từ 2.177.171 trường hợp trong năm 2016 xuống còn 584.263 trường hợp
trong năm 2017. Panama, Peru và Aruba là những quốc gia duy nhất tăng số ca mắc
bệnh trong năm 2017. Thời kỳ bùng phát Zika (sau năm 2016) đã chứng kiến sự suy
giảm của các ca sốt xuất huyết và các yếu tố chính xác dẫn đến sự sụt giảm này vẫn
chưa được biết. Khu vực Tây Thái Bình Dương của WHO đã báo cáo dịch sốt xuất
huyết ở một số quốc gia ở Thái Bình Dương cũng như sự lưu hành của các type huyết
thanh DENV-1 và DENV-2 [36].
Sau khi giảm số lượng các trường hợp trong năm 2017-2018, các trường hợp tăng
mạnh đang được quan sát vào năm 2019. Ở khu vực Tây Thái Bình Dương, sự gia tăng
các trường hợp đã được ghi nhận ở Úc, Campuchia, Trung Quốc, Lào, Malaysia,

Philippines, Singapore và Việt Nam trong khi Dengue-2 được báo cáo ở New
Caledonia và Dengue-1 ở Polynesia thuộc Pháp. Dịch sốt xuất huyết cũng đã được báo
cáo ở Congo, Côte d’Ivoire, Tanzania ở khu vực châu Phi. Một số quốc gia trong khu
vực Mỹ cũng đã chứng kiến sự gia tăng số ca mắc bệnh. Ước tính 500.000 người mắc
sốt xuất huyết nặng phải nhập viện mỗi năm và tỷ lệ tử vong ước tính 2,5% mỗi năm.
Tuy nhiên, nhiều quốc gia đã giảm tỷ lệ tử vong xuống dưới 1% và trên toàn cầu, tỷ lệ


5

tử vong giảm 28% đã được ghi nhận từ năm 2010 đến 2016 với sự cải thiện đáng kể
thông qua chương trình nâng cao năng lực ở cấp quốc gia [36].
1.1.1.2. Tình hình bệnh sốt Dengue và sốt xuất huyết Dengue ở Việt Nam
Tại Việt Nam, bệnh SD/SXHD lưu hành quanh năm. Sốt Dengue được phát hiện ở
miền Bắc lần đầu vào năm 1958. Đến 1969, dịch sốt xuất huyết Dengue lớn đầu tiên
đã xảy ra ở 19 tỉnh miền Bắc. Chỉ tính tại Hà Nội từ tháng 7 đến tháng 10 năm 1969 số
bệnh nhân nhập viện chiếm 0,74% dân số thành phố với tỷ lệ tử vong là 0,77% [2].
Ở miền Nam, sốt xuất huyết Dengue được mô tả đàu tiên vào năm 1960 với 60 em
tử vong, đến tháng 8 năm 1963 dịch sốt xuất huyết Dengue đã xảy ra ở Cái Bè, Châu
Đốc, Hồng Ngự, Tân Châu và Cao Lãnh và đã có 331 em nhập viện và tử vong 116 em

[2]. Trong năm 2018, số mắc/100.000 dân của toàn khu vực là 248 ca, tăng so với năm
2017 (tăng 31%) và trung bình từ 2011 đến 2015 (tăng 81%). Nhóm tỉnh có số
mắc/100.000 dân cao thuộc khu vực TP. HCM, Bình Phước, Bà Rịa - Vũng Tàu, Đồng
Nai [2].
1.1.2. Virus Dengue
1.1.2.1. Phân loại
Virus Dengue (DENV) thuộc nhóm Flavivirus, họ Flaviviridae. Họ Flaviviridae
có khoảng 70 lồi virus gây nhiều bệnh khác nhau ở người và động vật như DENV gây
bệnh sốt Dengue/Sốt xuất huyết Dengue, virus viêm não Nhật Bản, virus viêm não St.

Louis và virus West Nile gây ra bệnh viêm não-viêm màng não ở người

[2],[4],[18],[26].
Dựa vào hình thái học của virion, tổ chức của bộ gen virus và quy trình nhân lên
của RNA, họ Flaviviridae bao gồm ba giống khác nhau, đó là Flavivirus, Pestivirus và
Hepacivirus. Cả ba giống này có các tính chất sinh học khác nhau và khơng có phản
ứng huyết thanh chéo. DENV gồm 4 type huyết thanh (từ DENV-1 đến DENV-4),
thuộc giống Flavivirus. Bốn type huyết thanh này khác nhau về tính chất kháng nguyên,
gây bệnh SXHD và nặng hơn là hội chứng sốc Dengue (HCSD) với tỷ lệ tử vong cao,
nhất là ở trẻ em. Virus này truyền bệnh thông qua trung gian là muỗi Aedes aegypti [4].
1.1.2.2. Cấu trúc phân tử


6

DENV có hình cầu, đường kính khoảng 40 đến 60 nm, chứa một lõi nucleotid đồng
kích thước (đường kính khoảng 30 nm) bao quanh bởi một lớp lipid kép. Bộ gen
DENVgồm một RNA cực dương, sợi đơn, dài khoảng 11 kb (Hình 1.1), mã hóa cho
cho 3 protein cấu trúc: protein lõi (C), protein tiền màng/màng (prM/M), protein vỏ
(E), 7 protein không cấu trúc NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5 và hai vùng
khơng mã hóa ở cả 2 đầu 5’ và 3’ [2],[31].

Hình 1.1. Cấu trúc bộ gen của DENV [31]
Protein lõi C là một protein nhỏ (9-12 kDa), tích điện dương mạnh vì chứa nhiều
lysin và arginin [2]. Vai trị chính của protein này trong tế bào chất là đóng gói virus
thơng qua tương tác với bộ gen virus và mạng lưới nội chất. Vai trò của protein lõi
trong nhân chưa được hiểu rõ, nhưng nó có tương tác với một số protein trong nhân
(như histon, helicase, importin-/) và nó có thể gây ra sự chết theo chương trình của
tế bào [18].
Protein màng M có 2 dạng: protein tiền màng prM (19-20 kDa) mới được tổng hợp,

có ở bề mặt virus chưa trưởng thành và protein màng M (7-8 kDa) có trong virus trưởng
thành, có khả năng lây nhiễm. Chức năng chính của protein là tạo mũ chụp lên vòng
lặp của protein E, ngăn virus mới được tổng hợp quay trở lại tế bào khi di chuyển qua
hệ thống Golgi [18].
Phần lõi được bao quanh bởi protein E (51-60 kDa) là thành phần chính của bề mặt
virus. Có nhiều nghiên cứu cũng đã chứng minh rằng protein E đóng rất nhiều vai trị
trong gắn kết vào thụ thể, ngưng kết hồng cầu, sản sinh các kháng thể trung hòa chủ


7

yếu trong đáp ứng miễn dịch bảo vệ, trung gian cho sự hòa màng đặc hiệu của virus
trong các hạt nội bào pH acid và lắp ráp các thành phần của virus [2],[4],[18].
Trong 7 protein không cấu trúc NS1, NS2 (NS2a, NS2b), NS3, NS4 (NS4a, NS4b)
và NS5, protein NS1 là một glycoprotein (42-50 kDa), có vai trị quan trọng trong sự
hình thành và phóng thích virus ra ngồi tế bào động vật có vú. Đặc biệt có nhiều nghiên
cứu cho rằng NS1 liên quan trong quá trình nhân đơi RNA. Các protein NS2A, NS2B
là protein tương đối nhỏ, kết hợp với màng. NS2A có vai trị trong đóng gói và sao
chép của virus. NS2A cịn có thể ức chế tín hiệu INF. NS3 là protein đa chức năng, có
hoạt tính enzym protease, helicase và RNA triphosphatase. NS4A, NS4B có thể là
những protein kết hợp với màng, có vai trị trong việc sao chép của virus thông qua
tương tác với protein NS3, hai protein này khóa tín hiệu IFN1. NS5 có hoạt tính tổng
hợp RNA từ mạch RNA (RdRp – RNA dependent RNA polymerase), protein này có
vai trị trong biến đổi vùng 5’ và khởi đầu tổng hợp RNA [2],[18].
1.1.2.3. Protein NS1 của DENV

Trong số các protein không cấu trúc, NS1 được bảo tồn cao, có trọng lượng khoảng
47 kDa, được tạo ra trong quá trình sao chép của virus và đã được xem là một kháng
nguyên quan trọng trong nhiễm trùng Dengue. NS1 tồn tại dưới dạng monomer, dimer
(protein gắn màng, mNS1) và hexamer (protein được tiết ra, sNS1). NS1 được biết là

kích hoạt TLR và ức chế hệ thống bổ thể. NS1 nội bào đóng vai trị then chốt trong sự
nhân lên của virus, trong khi NS1 bài tiết và gắn màng liên quan đến phản ứng miễn
dịch [26],[27].
Protein NS1 được sản xuất bởi tất cả các Flavivirus và được tiết ra từ các tế bào bị
nhiễm bệnh trong giai đoạn đầu của nhiễm trùng. Protein được tìm thấy trong vòng một
ngày sau khi xuất hiện các triệu chứng ở cả nhiễm sốt xuất huyết nguyên phát và thứ
phát, trong khi kháng thể xuất hiện khoảng một tuần sau các triệu chứng đầu tiên của
nhiễm trùng tiên phát. Sự hiện diện của kháng nguyên NS1 ở nồng độ cao trong huyết
thanh bệnh nhân làm cho nó trở thành một dấu ấn sinh học của nhiễm DENV. Nhiều
loại xét nghiệm miễn dịch sử dụng kháng thể đơn dòng hoặc đa dòng đã được phát triển
để phát hiện NS1 và một số xét nghiệm miễn dịch này có sẵn trên thị trường dưới dạng
bộ xét nghiệm ELISA hoặc xét nghiệm nhanh [27].


8

Ban đầu, NS1 được thể hiện dưới dạng monomer trong các tế bào bị nhiễm bệnh.
Sau khi sửa đổi sau dịch mã trong ống thơng ER, nó tạo thành các chất đồng nhất liên
kết với màng sinh chất và màng tế bào. Mặc dù thiếu vùng xuyên màng, NS1 neo vào
màng tế bào thơng qua một số con đường. Ngồi ra, NS1 là protein duy nhất được tiết
ra liên tục ở dạng hexamer bởi các tế bào chủ bị nhiễm bệnh, có thành phần tương tự
như một lipoprotein mật độ cao. Cấu trúc giàu lipid này có thể giúp NS1 tiết ra gắn vào
màng tế bào bằng cách liên kết với glycosamino glycan (GAG). Do sự giống nhau giữa
NS1 và lipoprotein ở mật độ cao, NS1 tiết ra làm phá vỡ tầng đông máu bằng cách can
thiệp vào sự tương tác của các hạt lipoprotein nội sinh. NS1 tích lũy được tiết ra trong
huyết thanh bệnh nhân SXHD/HCSD đã được quan sát trong giai đoạn cấp [2],[12].
Nồng độ NS1 trong huyết thanh ở bệnh nhân SXHD/HCSD có thể đạt tới 50 μg/ml
và nồng độ này có tương quan với mức độ nghiêm trọng của bệnh. Trong giai đoạn
phục hồi, NS1 bị mất đi bởi hiệu ứng qua trung gian kháng thể. Do NS1 được tiết ra có
thể tương tác với protein bổ thể, nên lần đầu tiên nó được mơ tả là một kháng nguyên

cố định bổ thể hòa tan (SCF) có thể thúc đẩy sự thoái hóa C4 và do đó có thể bảo vệ
DENV khỏi sự kháng nguyên cố định bổ thể hòa tan ly giải phụ thuộc bổ thể. Gần đây,
vai trò gây bệnh do NS1 bài tiết trong SXHD/HCSD đã được chứng minh do có liên
quan đến hệ thống miễn dịch và kích hoạt tế bào nội mơ [12].
1.2.

Các phương pháp chẩn đốn sốt xuất huyết Dengue
Các công cụ chẩn đoán sốt xuất huyết dựa vào đặc điểm, sự nhân lên của virus và

đáp ứng miễn dịch ở thể dịch đối với các protein sốt xuất huyết. Chẩn đoán rất quan
trọng đối với lâm sàng, hỗ trợ giám sát, nghiên cứu bệnh, phát triển vaccin, thuốc và
thử nghiệm lâm sàng [18],[24]. Các phương pháp trực tiếp (phân lập virus, phát hiện
RNA và kháng nguyên) và gián tiếp (điều tra huyết thanh học) tạo thành các công cụ
chẩn đoán bệnh sốt xuất huyết (Hình 1.2). Phương pháp trực tiếp cho độ tin cậy cao
nhất trong khi phương pháp gián tiếp thể hiện khả năng phát hiện cao nhất, được áp
dụng rộng rãi trong xét nghiệm thường quy [2],[18],[24].
Các dấu ấn chẩn đoán được nghiên cứu trong trường hợp nhiễm sốt xuất huyết phụ
thuộc vào thời gian nhiễm trùng, đáp ứng miễn dịch và các kỹ thuật sử dụng. Trong
giai đoạn sớm của bệnh, phân lập virus, kháng nguyên và phát hiện acid nucleic có thể


9

được sử dụng để chẩn đoán. Huyết thanh học là phương pháp được lựa chọn để chẩn
đoán vào cuối giai đoạn cấp tính của bệnh. Khi bệnh nhân bị muỗi đốt, thời gian ủ bệnh
từ 4-10 ngày. Giai đoạn virus huyết được quan sát 2-3 ngày trước khi khởi sốt đến 5-6
ngày sau. Trong thời kỳ này, virus có thể được phát hiện bằng phân lập và tìm RNA và
NS1. Một người có thể mắc tối đa bốn lần với bốn loại type huyết thanh sốt xuất huyết

[17],[18],[20],[24].

Hình 1.2. Các phương pháp chẩn đoán nhiễm sốt xuất huyết [24]

Kháng thể IgM chống sốt xuất
huyết được phát hiện trong hầu hết các
trường hợp 5-6 ngày sau khi bị sốt và
thường trong 60-90 ngày, nhưng đôi
khi lên đến 6 tháng. Ở lần nhiễm trùng
đầu tiên, kháng thể IgG bắt đầu xuất
hiện vài ngày sau kháng thể IgM,
thường là vào những ngày 7-9 của sốt.
Hiệu giá kháng thể tiếp tục tăng chậm
trong một vài tuần và có thể được phát
hiện trong suốt cuộc đời. Trong nhiễm
trùng thứ hai, kháng thể IgG tăng
nhanh gần như ngay lập tức sau khi
khởi phát sốt, với mức độ cao ở hầu hết
bệnh nhân (Hình 1.3) [18],[24].

Hình 1.3. Các dấu ấn trong chẩn đoán [24]


10

1.2.1. Phân lập virus
Phân lập virus là phương pháp chẩn đoán truyền thống để phát hiện nhiễm DENV.
Mặc dù việc phát hiện DENV bằng cách phân lập virus được xem là tiêu chuẩn vàng,
nhưng nó khơng thực tế, vì thời gian phân lập có thể mất vài ngày đến vài tuần

[11],[22]. Trong chẩn đoán lâm sàng, nó đã dần được thay thế bằng phản ứng chuỗi

polymerase phiên mã ngược (RT-PCR) và gần đây hơn là bằng các xét nghiệm hấp thụ
miễn dịch liên kết với kháng nguyên NS1 (ELISA) để chẩn đoán nhanh hơn. Tuy nhiên,
phân lập virus vẫn quan trọng trong việc phân lập chủng, giữ chủng và không thể thay
thế bằng PCR hay ELISA. Để phân lập virus, các mẫu lâm sàng lấy từ bệnh nhân được
nuôi cấy trong nhiều dòng tế bào của muỗi (AP-61, Tra-284, AP64, C6/36 và CLA-1)
hoặc động vật có vú (LLCMK2, Vero và BHK -21). Mẫu máu của bệnh nhân khởi sốt
đến 5 ngày cho kết quả cao.
1.2.2. PCR
Hiện tại, một số xét nghiệm PCR được sử dụng để phát hiện bộ gen virus trong
huyết thanh. Kỹ thuật Real time RT-PCR cũng dần thay thế các kỹ thuật RT-PCR
truyền thống mặc dù giá thành vẫn cịn đắt. Các xét nghiệm hiện tại có độ nhạy từ 8090% và độ đặc hiệu hơn 95%. Kết quả PCR dương tính là bằng chứng khẳng định bệnh
nhân đang bị nhiễm trùng. Tuy nhiên, kết quả âm tính được hiểu là khơng xác định.
Bệnh nhân có kết quả âm tính trước 5 ngày của bệnh thường được yêu cầu gửi mẫu
huyết thanh thứ hai để xác nhận huyết thanh học sau ngày thứ 5 của bệnh [35].
1.2.3. MAC-ELISA
Phương pháp Elisa bắt kháng thể IgM kháng DENV (MAC-ELISA) được sử dụng
phổ biến nhất trong các phịng thí nghiệm chẩn đoán. Một trong những hạn chế của thử
nghiệm này là khả năng phản ứng chéo giữa các Flavivirus lưu hành khác. Do đó, phát
hiện IgM khơng dùng trong việc xác định kiểu huyết thanh sốt xuất huyết. IgM ban đầu
có thể được phát hiện trong khoảng từ 3 đến 5 ngày sau khi phát sốt ở khoảng 50%
bệnh nhân nhập viện và có độ nhạy và độ đặc hiệu tương ứng là 90% và 98% khi các
xét nghiệm được thực hiện từ 5 ngày trở lên sau khi khởi sốt. Gần như tất cả các bệnh
nhân có thể phát hiện IgM từ 6 đến 10 ngày (93%) sau khi khởi sốt và 99% bệnh nhân
có phát hiện IgM được xét nghiệm từ 10 đến 20 ngày sau khi khởi sốt [24].


11

1.2.4. ELISA-IgG
Xét nghiệm ELISA-IgG thông thường nhằm phát hiện bệnh nhân đã từng mắc SD/

SXHD trong quá khứ hoặc hiện tại. Xét nghiệm được tiến hành trên mẫu máu cặp (máu
giai đoạn cấp và giai đoạn hồi phục) từ đó tính được sự gia tăng của kháng thể trong
suốt quá trình nhiễm bệnh. Xét nghiệm này tương đương với xét nghiệm ngăn ngưng
kết hồng cầu. Nhìn chung, xét nghiệm ELISA-IgG thiếu độ đặc hiệu trong nhóm huyết
thanh bệnh nhân mắc Flavivirus. Mặc dù việc phát hiện kháng thể IgG kháng DENV
đã bị loại bỏ trong chẩn đoán bệnh SD và SXHD cấp tính nhưng xét nghiệm này vẫn
là xét nghiệm được sử dụng cho các nghiên cứu dịch tễ học huyết thanh bệnh SD và
SXHD. Ngoài ra, các xét nghiệm ELISA ái lực kháng thể IgG kháng DENV có thể giúp
xác định tình trạng sơ nhiễm hoặc tái nhiễm bệnh SD và SXHD và cho thấy có ích hơn
xét nghiệm ngăn ngưng kết hồng cầu [24].
1.2.5. Các xét nghiệm xác định kháng nguyên NS1
Một phương pháp chẩn đoán đơn giản trong giai đoạn cấp tính của nhiễm sốt xuất
huyết so với phân lập virus hoặc phát hiện acid nucleic là phát hiện các kháng nguyên
virus trong máu; tuy nhiên, việc phát hiện kháng nguyên trong giai đoạn cấp tính của
nhiễm trùng thứ cấp có thể bị ảnh hưởng do virus miễn dịch IgG trước đó [18].
Những phát triển mới trong xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzym (ELISA)
và xét nghiệm miễn dịch nhanh nhắm vào protein không cấu trúc 1 (NS1) đã chỉ ra rằng
nồng độ kháng nguyên NS1 cao có thể được phát hiện ở những bệnh nhân bị nhiễm sốt
xuất huyết nguyên phát và thứ phát đến 9 ngày sau khởi phát bệnh. NS1 được tổng hợp
bởi tất cả các Flavivirus và được tiết ra từ các tế bào động vật có vú bị nhiễm bệnh.
Kháng nguyên NS1 được tìm thấy trong máu, nước tiểu và nước bọt [10]. Tuy nhiên,
sự hiện diện của NS1 dạng tiết trong máu liên quan trực tiếp đến virus có trong máu.
Do biểu hiện lâm sàng khơng điển hình trong giai đoạn đầu của bệnh nên việc phân
biệt bệnh nhân sốt xuất huyết với các trường hợp sốt cấp tính khác là một thách thức
lớn đối với các bác sĩ lâm sàng vì có thể đưa đến chẩn đoán sai lầm nếu chỉ dựa trên
chẩn đoán lâm sàng. Các xét nghiệm dựa trên NS1 có vai trị quan trọng trong việc
chẩn đoán SXH ở giai đoạn cấp tính của nhiễm trùng sốt xuất huyết và hỗ trợ cho công
tác điều tra, giám sát dịch bệnh hiệu quả. Nồng độ và thời gian tồn tại của NS1 trong

12

mẫu bệnh phẩm làm cho nó trở thành mục tiêu để phát triển xét nghiệm chẩn đoán. Xét
nghiệm dựa trên kháng nguyên NS1 được sử dụng cùng với dấu hiệu chẩn đoán huyết
thanh học (ví dụ: IgM kháng DENV) có thể tăng độ nhạy và độ đặc hiệu của chẩn đoán
sốt xuất huyết qua tất cả các giai đoạn của bệnh. Hơn nữa, việc định lượng NS1 có thể
giúp dự đoán nguy cơ nhiễm DENV, vì nồng độ NS1 cao được tìm thấy có liên quan
đến sốt xuất huyết [23],[30].
Năm 2000, ELISA đầu tiên có khả năng phát hiện DENV NS1 đã được phát triển.
ELISA là kỹ thuật xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với men. Nếu mẫu thử có
kháng nguyên Dengue NS1, sẽ kết hợp với kháng thể kháng NS1 được phủ trên bề mặt
phiến nhựa. Để phát hiện kháng nguyên được gắn, cộng hợp IgG gắn HRPO được
thêm vào ở bước tiếp theo sẽ xúc tác các phản ứng màu. Sự xuất hiện màu giúp xác
định có kháng nguyên Dengue NS1 có trong mẫu thử. Giá trị mật độ quang (OD) của
phản ứng màu tỷ lệ thuận với lượng kháng thể kháng DENV hiện diện trong mẫu thử
[17],[23].
Các xét nghiệm nhanh phát hiện kháng nguyên NS1 dựa trên nguyên lý sắc ký miễn
dịch (ICT), phát hiện kháng nguyên NS1 hiện diện trong máu toàn phần, huyết tương
và huyết thanh. Kháng thể đặc hiệu với Dengue tạo phức với cộng hợp vàng được đặt
ở vùng cộng hợp và kháng thể kháng NS1 được cố định trên màng. Khi mẫu dương
tính với kháng nguyên NS1 được đưa vào vị trí tiêm mẫu, kháng nguyên này bị bắt giữ
bởi kháng thể kháng NS1, tạo phản ứng với phức hợp kháng thể đặc hiệu Dengue và
keo vàng cho một vạch nhìn thấy ở vị trí T. Một số xét nghiệm nhanh kết hợp cả kháng
nguyên và kháng thể IgM hoặc/và IgG trong cùng một bộ xét nghiệm nhằm mục đích
phát hiện nhiễm sốt xuất huyết ở cả giai đoạn cấp (khi virus đang lưu hành) và giai
đoạn hồi phục (khi xuất hiện kháng thể).
Các xét nghiệm nhanh rất dễ sử dụng, cung cấp kết quả trong vòng chưa đầy một
giờ. Nó khơng u cầu cơ sở hạ tầng phịng xét nghiệm cao và do đó được ứng dụng
rộng rãi tại hầu hết các phòng xét nghiệm, bệnh viện huyện, bệnh viện tỉnh, các trung
tâm y tế dự phòng tại 20 tỉnh/ thành phố khu vực phía Nam và có tầm quan trọng trong

việc xác định dịch sốt xuất huyết. Nhiều xét nghiệm nhanh sốt xuất huyết hiện đang
lưu hành trên thị trường Việt Nam nhưng lại có ít bằng chứng về tính hiệu quả [24].


13

Một đánh giá về hiệu quả của xét nghiệm phát hiện NS1 dựa trên ELISA cho thấy
độ nhạy dao động từ 23% đến 90%, độ đặc hiệu từ 89% đến 100%. Độ nhạy của xét
nghiệm nhanh NS1 dự kiến sẽ thấp hơn các con số trên vì xét nghiệm nhanh thường có
độ nhạy thấp hơn xét nghiệm ELISA được thiết kế cho cùng một mục tiêu [23],[34].
1.3.

Kiểm tra chất lượng xét nghiệm
Nội kiểm tra (Internal quality control – IQC) và ngoại kiểm tra xét nghiệm

(External Quality Assessment - EQA) là hai hoạt động quan trọng trong kiểm tra chất
lượng giúp phát hiện ra các lỗi chính trong q trình thực hiện xét nghiệm, khắc phục
và đưa ra kết quả đạt độ tin cậy cho khách hàng. Nội kiểm là các quy trình được chính
nhân viên PXN thực hiện để giám sát liên tục và nhanh quy trình xét nghiệm. IQC thực
hiện phân tích trên mẫu chứng đã được biết trước giá trị. IQC được thực hiện hàng ngày
trong PXN, giúp phát hiện lỗi trong khi thực hiện xét nghiệm thường quy. Ngoại kiểm
tra xét nghiệm (đánh giá chất lượng từ bên ngồi) được sử dụng để mơ tả một phương
pháp cho phép so sánh kết quả xét nghiệm của một phòng xét nghiệm đối với các phòng
xét nghiệm khác, đánh giá chất lượng từ bên ngoài thuộc phạm trù ngoại kiểm tra nhưng
trọng tâm chủ yếu là đánh giá về kết quả xét nghiệm của PXN này so với các PXN
khác, xét nghiệm cùng một mẫu xét nghiệm với cùng kỹ thuật xét nghiệm. Chương
trình ngoại kiểm tra thơng thường được tổ chức bởi một PXN chuẩn, đơn vị này phân
phối mẫu xét nghiệm cho các phòng xét nghiệm thành viên cùng tham gia vào chương
trình ngoại kiểm tra để làm xét nghiệm, sau đó thu thập các kết quả xét nghiệm để so
sánh và đánh giá kết quả của các phòng xét nghiệm thành viên. Kết quả sai ở các PXN

sẽ được nhà quản lý điều tra tìm hiểu các điểm không phù hợp và hỗ trợ khắc phục để
nâng cao chất lượng. Bên cạnh đó cũng khuyến cáo các cơ sở sử dụng sinh phẩm phù
hợp với các yêu cầu về chất lượng, điều kiện ....[32].
Ở Việt Nam, ngày nay do yêu cầu ngày càng cao về chất lượng, công tác nội kiểm
xét nghiệm và ngoại kiểm xét nghiệm là hai yếu tố chất lượng cốt lõi nằm trong hệ
thống chất lượng mà mọi khoa phòng xét nghiệm cần có. Nó đã và đang trở thành một
hoạt động thiết yếu và là nhu cầu thực tế và cần thiết của các phòng xét nghiệm y học
để bảo đảm kết quả xét nghiệm chính xác, kịp thời, chuẩn hóa, làm cơ sở cho việc liên
thông, công nhận kết quả xét nghiệm giữa các cơ sở khám bệnh, chữa bệnh, cơ sở y tế