Nghiên cứu đặc điểm thực vật học và đoạn gen matk its ở cây ô đầu aconitum carmichaelii debx

..

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN THỊ LOAN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC
VÀ ĐOẠN GEN MATK/ITS Ở CÂY Ô ĐẦU
(Aconitum carmichaelii Debx.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN THỊ LOAN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC
VÀ ĐOẠN GEN MATK/ITS Ở CÂY Ô ĐẦU
(Aconitum carmichaelii Debx.)
Ngành: SINH HỌC THỰC NGHIỆM
Mã ngành: 8.42.01.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN THỊ NGỌC LAN

THÁI NGUYÊN - 2018


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết quả
nghiên cứu là trung thực và chưa được công bố ở bất cứ cơng trình nào khác.
Thái Ngun, tháng 4 năm 2018
Tác giả

Nguyễn Thị Loan

i


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện luận văn này, em
đã được tạo điều kiện và nhận được sự giúp đỡ quý báu từ thầy cơ, cơ quan,
bạn bè đồng nghiệp và gia đình.
Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị Ngọc
Lan, người hướng dẫn khoa học đã tận tâm chỉ bảo hướng dẫn em suốt quá
trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn cảm ơn sâu sắc tới Quý thầy cô khoa Sinh
học, Trường Đại học Sư Phạm - ĐH Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn,
truyền dạy kiến thức cho em trong suốt khóa học.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy giáo, cô giáo trong Ban
giám hiệu trường Đại học Sư phạm - ĐH Thái Nguyên, Hội đồng Khoa học của
trường và Quý thầy, cơ các phịng ban chức năng đã tạo điều kiện và giúp đỡ
em trong suốt thời gian học tập tại trường.
Tôi cũng xin được chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Phổ thông
Dân tộc nội trú tỉnh Quảng Ninh đã tạo điều kiện giúp đỡ cả về vật chất và tinh

thần cho tơi trong q trình học tập.
Và cuối cùng, xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới các đồng nghiệp,
bạn bè và gia đình đã ln quan tâm, động viên, ủng hộ và giúp đỡ tôi.
Dù đã rất cố gắng, tuy nhiên không tránh khỏi những thiếu sót trong luận
văn, rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của Q thầy/cơ để luận văn
thêm hồn thiện.
Thái Nguyên, tháng 4 năm 2018
Tác giả

Nguyễn Thị Loan

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................ii
MỤC LỤC ................................................................................................................... iii
DANH MỤC NHỮNG TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT ....................................................... iv
DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................................ v
DANH MỤC CÁC HÌNH............................................................................................. vi
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ....................................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................................. 2
3. Nội dung nghiên cứu.................................................................................................. 2
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU......................................................................... 3
1.1. Giới thiệu chung về cây Ô đầu ............................................................................... 3
1.1.1. Phân loại cây Ô đầu ............................................................................................. 3
1.1.2. Nguồn gốc và phân bố của cây Ô đầu tại Việt Nam............................................ 3
1.1.3. Vai trò của cây Ô đầu .......................................................................................... 4

1.2. Phương pháp phân loại học phân tử ....................................................................... 5
1.2.1. Giới thiệu về mã vạch DNA ................................................................................ 5
1.2.2. Phân loại thực vật học bằng mã vạch DNA ......................................................... 6
1.3. Nghiên cứu sử dụng phân loại học phân tử ............................................................ 7
1.3.1. Nghiên cứu sử dụng phân loại học phân tử trên thế giới ..................................... 7
1.3.2. Nghiên cứu sử dụng phân loại học phân tử ở Việt Nam ..................................... 8
1.4. Sơ lược về gen matK và ITS ................................................................................ 10
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 13
2.1. Vật liệu, hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu .............................................. 13
2.1.1. Vật liệu ............................................................................................................... 13
2.1.2. Hóa chất và thiết bị ............................................................................................ 13
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu .......................................................................................... 13
2.2. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................... 13

iii


2.2.1. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái .................................................... 13
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu cấu tạo giải phẫu rễ, thân, lá ..................................... 14
2.2.3. Phương pháp phân tử ......................................................................................... 15
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN..................................... 18
3.1. Đặc điểm hình thái và cấu tạo giải phẫu của cây Ô đầu ....................................... 18
3.1.1. Đặc điểm hình thái ............................................................................................. 18
3.1.2. Cấu tạo giải phẫu của cây Ô đầu ....................................................................... 20
3.2. Kết quả phân lập đoạn gen matK và trình tự ITS .................................................. 27
3.2.1. Nhận diện mẫu Ô đầu bằng mã vạch matK ....................................................... 27
3.2.2. Nhận diện mẫu Ô đầu bằng mã vạch ITS .......................................................... 31
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ........................................................................................ 34
1. Kết luận .................................................................................................................... 34
2. Đề nghị ..................................................................................................................... 34

DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN
CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN VĂN .................................................................... 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 36
PHỤ LỤC

iv


DANH MỤC NHỮNG TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT

BOLD

:

The Barcode of Life Data System

BLAST

:

The Basic Local Alignment Search Tool

CIA

:

Chloroform : Isoamyl Alcohol Solution

CTAB

:

Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

DNA

:

Deoxyribonucleic acid

DNA barcoding

:

Mã vạch DNA

EDTA

:

Ethylene diamine tetraacetic acid

Genbank

:

Ngân hàng gen

ITS

:

Internal Transcribed Spacer

Kb

:

Kilobase

matK

:

MaturaseK

NCBI

:

The

National

Center

for

Information

PCR

:

Polymerase Chain Reaction

iv

Biotechnology


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Trình tự nucleotide của cặp mồi ITS-F/ITS-R và cặp mồi matKF/matK-R ........................................................................................... 16
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR ............................................................... 16
Bảng 3.1. Hệ số tương đồng và hệ số phân ly dựa trên trình tự gen matK ....... 30
Bảng 3.2. Bảng hệ số tương đồng và hệ số phân ly dựa trên trình tự vùng ITS2 ........ 33

v


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc gen matK ............................................................................. 10
Hình 1.2. Cấu trúc vùng gen ITS ....................................................................... 11
Hình 3.1. Cây Ơ đầu (Aconitum carmichaelii Debx) ........................................ 18
Hình 3.2. Cơ quan sinh sản của cây Ơ đầu ........................................................ 19
Hình 3.3. Lớp biểu bì dưới của lá cây Ơ đầu .................................................... 21
Hình 3.4. Lớp biểu bì trên của lá cây Ơ đầu ...................................................... 22
Hình 3.5. Cấu tạo sơ cấp cuống lá ..................................................................... 22
Hình 3.6. Cấu tạo rễ cây Ơ đầu.......................................................................... 23

Hình 3.7. Cấu tạo sơ cấp thân cây Ô đầu .......................................................... 25
Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen matK của mẫu
cây Ơ đầu ............................................................................................. 27
Hình 3.9. Kết quả phân tích bằng BLAST đoạn gen matK phân lập từ mẫu
Ơ đầu ................................................................................................... 28
Hình 3.10. Trình tự nucleotide đoạn gen matK của mẫu Ô đầu Hà Giang và
của cây Ô đầu mang mã số KY407560 trên GenBanK....................... 29
Hình 3.11. Sơ đồ hình cây mơ tả mối quan hệ di truyền giữa các lồi Ơ đầu
thuộc chi Aconitum dựa trên trình tự nucleotide của đoạn gen matK. .... 30
Hình 3.12. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân bản vùng ITS từ
hệ gen cây Ô đầu ................................................................................. 31
Hình 3.13. Kết quả phân tích bằng BLAST đoạn DNA phân lập từ mẫu Ô
đầu Quản Bạ, Hà Giang....................................................................... 32
Hình 3.14. Trình tự nucleotide vùng ITS của mẫu Ơ đầu Quản Bạ, Hà
Giang và của cây Ô đầu mang mã số KU041716 trên GenBanK ....... 32
Hình 3.15. Sơ đồ hình cây mơ tả mối quan hệ di truyền giữa các lồi Ơ đầu
trong chi Aconitum dựa trên trình tự nucleotide của vùng ITS ........... 33

vi


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Việt Nam là một nước có nguồn tài nguyên thực vật đa dạng và phong
phú, đặc biệt là nguồn cây dược liệu. Trong đó, nhiều cây có giá trị làm thuốc
nhưng cũng có độc tính, được xếp trong Danh mục dược liệu độc làm thuốc
như Thầu dầu, Cà độc dược, Ơ đầu ... Vì vậy, khi sử dụng những loại dược liệu
này làm thuốc cần phải đặc biệt chú ý đến cách sử dụng, liều dùng, đối tượng
dùng và phải được chế biến theo quy trình nghiêm ngặt, đúng kỹ thuật để đảm
bảo an tồn cho người sử dụng.

Ơ đầu, Phụ tử chứa những thành phần có độc tính cao nhưng vẫn được
cho là những vị thuốc quý, đã được dùng khá phổ biến trong y dược học cổ
truyền. Ô đầu là củ mẹ và Phụ tử là củ con của một số loài thực vật thuộc chi
Aconitum. Hiện nay, chi Aconitum được nghiên cứu nhằm phát triển các sản
phẩm theo hướng hiện đại, cũng như nâng cao hiệu quả sử dụng các loài thuộc
chi này trong phịng và điều trị bệnh. Do đó, việc nghiên cứu đặc điểm thực vật
học sẽ giúp tiêu chuẩn hóa dược liệu, minh chứng cho cách sử dụng Ô đầu và
Phụ tử, đồng thời góp phần phát triển các dạng thuốc mới sử dụng trong điều trị
và chăm sóc sức khỏe.
Theo phương pháp truyền thống, việc giám định loài thực vật và động
vật chủ yếu dựa trên chỉ thị về hình thái. Phương pháp phân loại này trong
nhiều trường hợp cịn gặp nhiều khó khăn và hạn chế như: nhiều lồi có hình
thái rất giống nhau nhưng thực tế lại rất khác nhau trong hệ thống phân loại (hệ
gen rất khác nhau); ngược lại nhiều lồi có hình thái rất khác nhau nhưng lại rất
gần nhau trong hệ thống phân loại (hệ gen rất giống nhau). Mặt khác, phương
pháp phân loại truyền thống dựa trên các đặc điểm hình thái rất khó phân biệt
được sự khác biệt giữa các biến dị dưới loài.
Gần đây nhờ vào sự phát triển của khoa học cơng nghệ nói chung và các
kỹ thuật sinh học phân tử nói riêng đã giúp cho việc xác định nhanh chóng

1


được sự khác biệt về vật chất di truyền giữa các lồi sinh vật, thậm chí giữa các
cá thể sinh vật trong cùng lồi. Từ đó có thể định danh được loài và xác định
được mối quan hệ di truyền giữa các cá thể, quần thể hay xuất xứ. Vì vậy, các
kỹ thuật sinh học phân tử được xem là cơng cụ hỗ trợ có hiệu quả cho việc
phân tích di truyền ở các lồi sinh vật. Trong đó, mã vạch DNA được xem như
là một công cụ để giám định sinh vật và xác định mối quan hệ di truyền giữa
các loài.

Việc xây dựng cơ sở dữ liệu mã vạch DNA là rất cần thiết và có ý nghĩa
trong việc giám định, bảo tồn và quản lý nguồn tài nguyên sinh vật. Hiện nay, ở
Việt Nam, các nhà khoa học cũng đã bắt đầu tiếp cận và quan tâm đến hướng
nghiên cứu này, nhằm hướng tới xây dựng một ngân hàng dữ liệu mã vạch
DNA quốc gia cho các lồi sinh vật, góp phần phân loại, bảo tồn và phát triển
nguồn tài nguyên sinh vật ở Việt Nam.
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
"Nghiên cứu đặc điểm thực vật học và đoạn gen matK/ITS ở cây Ô đầu
(Aconitum carmichaelii Debx.)”
2. Mục tiêu nghiên cứu
Xác định được đặc điểm thực vật học và đoạn gen matK/ITS từ cây Ô
đầu làm cơ sở cho việc bảo tồn và phát triển nguồn gen cây Ô đầu (Aconitum
carmichaelii Debx.) tại Việt Nam.
3. Nội dung nghiên cứu
- Phân tích đặc điểm hình thái, cấu tạo giải phẫu rễ, thân, lá của cây Ô đầu
- Nghiên cứu đặc điểm trình tự đoạn gen matK/ITS từ cây Ơ đầu ở
Việt Nam.

2


Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về cây Ô đầu
1.1.1. Phân loại cây Ô đầu
Aconitum carmichaelii Debx. có tên thường gọi là cây Ơ đầu. Ngồi ra,
Ơ đầu còn được gọi bằng các tên khác là Củ gấu tàu, Ấu tàu, Thảo ô, Xuyên ô.
Theo thống kê trong Danh mục dược liệu độc làm thuốc, cây Ô đầu ở Việt Nam
bao gồm có hai lồi là: Aconitum fortunei Hemsl. và Aconitum carmichaelii
Debx. [16], [25]. Cây Ô đầu là một loại thực vật thân cỏ, có độ cao chừng

khoảng 0,6 – 1m, thân mọc thẳng đứng. Lá có hình mắt chim, xẻ 3 thùy, mép lá
hình răng cưa. Hoa có màu xanh tím và thành từng chùm. Quả chia thành 5 đại
và hạt có vẩy ở trên mặt [12].
Về phân loại, cây Ô đầu thuộc chi Ô đầu (Aconitum), họ Mao lương
(Ranunculaceae), bộ Mao lương (Ranunculales), phân lớp Mao lương
(Ranunculidae),

lớp

Mộc

lan

(Magnoliopsida),

ngành

Mộc

lan

(Magnoliophyta) [12].
1.1.2. Nguồn gốc và phân bố của cây Ô đầu tại Việt Nam
Ở Việt Nam, cây Ô đầu được trồng hiện nay có nguồn gốc từ Trung Quốc
di thực vào Việt Nam vào những năm 70 của thế kỷ trước. Gần đây diện tích cây
Ơ đầu tăng nhanh góp phần đa dạng hóa loại cây trồng rừng và cây đặc sản ở vùng
núi phía Bắc, hứa hẹn nhiều triển vọng lớn cho ngành y học nói riêng và nền kinh
tế nói chung. Cây Ơ đầu mọc trên cạn và là cây thích nghi tốt với điều kiện khí
hậu lạnh, mát. Vì vậy, hiện nay cây Ơ đầu được trồng nhiều ở những vùng núi cao
thuộc các tỉnh như: Hà Giang, Lào Cai, Lai Châu, Cao Bằng [17].

Cây Ô đầu trồng ở Việt Nam đã được xác định bởi 2 tên là: A. fortunei
Hemsl và A. carmichaelii Debx. Theo một số nghiên cứu, tên khoa học của cây
Ô đầu trồng ở Sa Pa - Lào Cai là Aconitum carmichaelii Debx. Việc xác định
tên khoa học của cây Ô đầu trồng ở các địa phương khác cũng chưa được thực

3


hiện. Do đó, cần có nghiên cứu định danh tên khoa học chính xác của cây Ơ
đầu [3], [5].
1.1.3. Vai trị của cây Ơ đầu
Trong cây Ơ đầu có 3 thành phần hóa học chủ yếu là: alcaloid,
polysaccharid, flavonoid, trong đó alcaloid là thành phần chính. Trong các bộ
phận của cây như: thân cây, rễ củ, lá cây, hoa, quả và hạt đều có các hợp chất
alcaloid, acid hữu cơ, đường tự do, acid amin. Aconitin là một loại alkaloid
chính có trong củ Ơ đầu. Ngồi ra, trong củ Ơ đầu cịn có tinh bột, đường,
manit, chất nhựa, các acid hữu cơ chất béo và sterol. Ở thân, lá và hoa cây Ơ
đầu có chất carotenoid, sterol và flavonoid, ở hạt có thêm chất béo [30].
Cây Ơ đầu là loại dược liệu có tính độc cao [12], [21], [33]. Cây Ô đầu
chứa chất gây độc ở hầu hết các bộ phận, nhiều nhất là ở củ [34]. Trong dược
thư Việt Nam, củ của cây Ô đầu được chia thành hai loại là củ lớn và củ nhỏ.
Củ nhỏ được gọi là phụ tử, củ lớn được gọi là Ô đầu. Phụ tử có độc tính kém
hơn Ơ đầu. Ơ đầu có tác dụng giảm đau, tăng cường miễn dịch, chống oxy hóa,
gây hạ đường huyết, chống tăng sinh tế bào, chống ung thư, tác dụng trên tim
mạch, chống viêm, chống tiêu chảy, kháng nấm và kháng virus [14], [29].
Theo y học dân tộc, Ơ đầu có vị cay tê, tính nóng, rất độc, có tác dụng
trợ dương bổ hoả, trừ phong hàn, táo thấp. Trong đơng y, Ơ đầu được dùng để
chữa các chứng phong tê, chân tay nhức mỏi, tê bại... Thường chỉ dùng làm
thuốc uống khi đã qua chế biến cẩn thận và được dùng với liều nhỏ, có sự chỉ
định và theo dõi thận trọng của thầy thuốc. Tây y dùng làm thuốc ho và chữa

chứng ra mồ hôi nhiều [35], [36].
Hiện nay, trên thị trường đã có một số sản phẩm làm từ cây Ơ đầu như:
Bát vị quế phụ, cồn xoa bóp Jamda của cơng ty Cổ phần Traphaco dùng để trị
đau nhức xương khớp [39]. Các sản phẩm khác có chiết xuất từ các loài cây
thuộc chi Aconitum với tác dụng tăng cường miễn dịch, chống viêm, giảm đau,
tim mạch như: Aconite 30C, Boiron, Hylands [37].

4


Hiện nay, ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về cây Ơ đầu. Trong đó,
Phùng Hồ Bình và cộng sự (2003) [3] quan tâm nghiên cứu về tác dụng sinh
học và phương pháp chế biến Ô đầu, phụ tử nhằm tìm ra các biện pháp sử dụng
Ơ đầu một cách an toàn và hiệu quả. Vũ Đức Lợi và cộng sự quan tâm nghiên
cứu xác định thành phần hóa học của cây Ơ đầu, đặc biệt là các alkaloid với
nhiều tác dụng như giảm đau, chống oxy hóa, chống viêm …. [10], [11].
1.2. Phương pháp phân loại học phân tử
1.2.1. Giới thiệu về mã vạch DNA
Hiện nay, để phân loại và xác định loài thực vật người ta có thể sử
dụng nhiều phương pháp nghiên cứu khác nhau. Nhưng các phương pháp
đều có chung nguyên tắc là dựa vào các thơng tin như: có chung một nguồn
gốc, có nhiều tính chất giống nhau về các đặc điểm hình thái, giải phẫu, sinh
lý, sinh hoá….
Việc phân loại và xác định loài đối với thực vật dựa trên các đặc điểm về
hình thái thơng qua nhận biết cơ quan, bộ phận của cây như lá, hoa, quả hoặc
chu kỳ sống, cách thức phân cành, … Với phương pháp truyền thống này có ưu
điểm là dễ quan sát trực tiếp bằng mắt thường nhưng chỉ dựa vào sựu thống kê
phân tích một hoặc một số tính trạng được thể hiện ra bên ngồi thì hiệu quả
khơng cao. Hơn nữa, khi sử dụng phương pháp này sẽ gặp nhiều khó khăn khi
các mẫu cần giám định khơng cịn ngun vẹn đặc điểm hình thái bên ngồi.

Bởi vậy, sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại sẽ hỗ trợ việc định
danh lồi chính xác hơn, đặc biệt trong trường hợp mẫu thực vật đã bị tác động
thay đổi hình thái (các bộ phận của cây đã bị cắt thái, sấy khô…).
Hiện nay, trên thế giới phương pháp phân loại học phân tử để xác định
loài là hướng nghiên cứu đang phát triển mạnh, được xây dựng dựa trên việc
nhận biết thành phần và cấu trúc của các gen đặc hữu ở sinh vật. Trong đó, kỹ
thuật dựa trên phân tích DNA là phương pháp đạt hiệu quả cao trong việc định
loại và giám định loài [32].

5


Năm 2003, Hebert P.D., nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph ở Ontario,
Canada, đã đề xuất mã vạch DNA (DNA Barcode, chỉ thị DNA) giống như một
cách để xác định loài. Mã vạch DNA được sử dụng là một đoạn DNA ngắn từ
một phần của hệ gen và được dùng giống như cách một máy quét nhận diện
được các loài [20].
Một mã vạch DNA điển hình đảm bảo được các yêu cầu:
(1) Hiệu suất nhân bản cao và trình tự có tính đặc hiệu.
(2) Có tính phổ biến.
(3) Có khả năng phân biệt được nhiều loài một cách đồng thời.
Việc kết hợp giữa chỉ thị phân tử DNA và chỉ thị hình thái sẽ nhanh
chóng xác định được sự khác biệt giữ sinh vật này với sinh vật khác một cách
chính xác [20], [28].
Mã vạch DNA là một đoạn gen ngắn, chuẩn của các loài sinh vật đã
được xác định nằm trong Ngân hàng gen, nó được sử dụng để định danh các
loài sinh vật chưa biết bằng phương pháp so sánh với trình tự DNA của Ngân
hàng gen (Genbank) [15], [19].
1.2.2. Phân loại thực vật học bằng mã vạch DNA
Việt Nam là một nước có nguồn tài nguyên thực vật đa dạng và phong

phú, đặc biệt là nguồn cây dược liệu. Hệ thực vật rất đa dạng, gồm thực vật có
hạt (hạt trần và hạt kín) cùng với rêu, dương xỉ và các lồi có quan hệ gần với
dương xỉ. Tổng số các loài khác nhau rất nhiều, một tính tốn gần đây thấy
rằng hiện nay có khoảng 380.000 lồi thực vật sống trên cạn, có khoảng
352.000 lồi thực vật hạt kín, 1.300 lồi thực vật hạt trần và 13.000 loài rêu với
dương xỉ [2]. Như vậy, với một số lượng lồi rất lớn thì việc phân loại và định
danh sẽ rất khó khăn.
Hệ gen lục lạp ở thực vật bao gồm như: matK, rcbL, atpβ, ndnF, 16S có
nhiều đặc điểm thích hợp với chỉ thị DNA và hệ gen nhân vùng DNA như: 18S,
5,6S, 26S, 5S spacer và vùng ITS (Internal Transcribed Spacer) thường được sử

6


dụng làm chỉ thị DNA trong nhiều nghiên cứu [1], [8], [13], [24]. Trong đó,
gen matK, ITS là gen có giá trị lớn trong nghiên cứu hệ thống và tiến hố thực
vật ở các độ tiến hóa khác nhau [7], [18], [26], [31], [38].
Hiện nay, có rất nhiều vùng gen được đề xuất làm chỉ thị cho mã vạch
DNA ở thực vật. Tuy nhiên chưa có chỉ thị DNA nào được đa phần các nhà
phân loại học thực vật hoàn tồn chấp nhận [28]. Vì vậy, các nhà nghiên cứu
cũng đã đi tới một quan điểm thống nhất là sẽ sử dụng không chỉ một mà kết
hợp nhiều vùng mã vạch DNA cho việc định danh loài đối với thực vật [22].
Đặc điểm quan trọng nhất của mã vạch DNA là phải phổ biến và đặc
hiệu trong các biến dị và dễ dàng sử dụng. Có nghĩa là các đoạn gen được sử
dụng như một barcode nên thích hợp cho nhiều đơn vị phân loại, có sự biến đổi
giữa các loài nhưng ổn định và bảo thủ cao bên trong lồi hoặc biến đổi khơng
đáng kể. Do đó, mã vạch DNA lý tưởng là một đoạn DNA có trình tự
nucleotide ngắn, bắt cặp được với cặp mồi được thiết kế đặc hiệu để dễ dàng
khuếch đại bằng PCR [20].
1.3. Nghiên cứu sử dụng phân loại học phân tử

1.3.1. Nghiên cứu sử dụng phân loại học phân tử trên thế giới
Hiện nay trên thế giới đã ứng dụng nhiều phương pháp hiện đại như
phương pháp phân tích DNA trong việc phân loại và giám định mẫu vật. Phân
tích DNA cụ thể là kỹ thuật mã vạch DNA đã xác định chính xác tên lồi và
đánh giá có hiệu quả trong việc giám định lồi [28], [32].
Cho đến nay, đã có nhiều nghiên cứu về mã vạch DNA ở thực vật để xác
định một mã vạch DNA tiêu chuẩn đối với thực vật. Dựa trên các kết quả
nghiên cứu giám định loài thực vật mà đã thực hiện trên nhiều mẫu thực vật
khác nhau, có các đại diện cho thực vật hạt kín, thực vật hạt trần, các vùng gen
được lựa chọn như: gen atpF-atpH, gen matK, gen rbcL, gen rpoB, gen rpoC1,
psbK-psbI và gen trnH-psbA. Dựa trên những đánh giá có khả năng thu được,

7


chất lượng và mức độ phân biệt giữa các loài, nhiều nghiên cứu đã đưa ra kết
luận gen có mức độ phân biệt lồi cao đó là gen rbcL và matK [23].
Hiện nay, việc điều trị các bệnh khác nhau thì thuốc thảo dược được sử
dụng rộng rãi ngày càng nhiều, ngành công nghiệp dược liệu cũng phát triển.
Với nhiều lý do mà hiện nay các loại dược liệu có thể bị pha trộn làm giảm đi
hiệu quả của thuốc. Dược liệu bị thay thế bởi các thành phần chứa độc tính nên
một số trường hợp có thể thể gây nguy hiểm đến tính mạng. Các loại thuốc thảo
dược được sử dụng ngày càng tăng vì vậy xác định chính xác nguồn gốc của
các loại dược liệu là điều cần thiết. Li M. và cộng sự (2011) đã tiến hành
nghiên cứu xác định nguyên liệu thảo dược bằng mã vạch DNA [24]. He J và
cộng sự (2010) cũng sử dụng mã vạch DNA để nghiên cứu xác định một số
mẫu cây dược liệu trong chi Aconitum [19]. DNA là một đại phân tử ổn định và
được tìm thấy trong tất cả các mơ. Do đó, sự phát triển của các dấu hiệu nhận
biết dựa trên DNA là rất quan trọng để xác định cây thuốc [27].
1.3.2. Nghiên cứu sử dụng phân loại học phân tử ở Việt Nam

Ở Việt Nam, việc phân loại học phân tử các loài sinh vật nói chung và
thực vật nói riêng đã được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu trong thời
gian gần đây [1], [8], [15]. Khi nghiên cứu tính đa dạng sinh học cây họ Gừng
ở vùng Núi Cấm hướng đến ứng dụng trong việc điều chế các thuốc chữa
bệnh, các nhà nghiên cứu thu thập hơn 20 mẫu cây họ Gừng có tên bắt đầu
bằng chữ "ngải" tại vùng Núi Cấm, An Giang. Các mẫu có đặc điểm là hình
thái của chúng tương đối giống nhau. Vì vậy, trình tự ITS và matK đã được sử
dụng để định danh các mẫu này chính xác hơn [7].
Vũ Đình Duy (2013) tiến hành nghiên cứu mối quan hệ di truyền của
một số loài Thông (Coniferales) ở Việt Nam trên cơ sở xác định trình tự
nucleotide vùng gen rbcL (Rubilose-1,5 Bisphophate Carboxylase). Tổng số
18 mẫu lá hoặc vỏ cây từ 17 loài thuộc 5 họ của bộ cây lá kim sử dụng trong
nghiên cứu này được thu thập vào năm 2009. Nghiên cứu vùng gen rbcL

8


khoảng 861bp đã được xác định cho 17 lồi thơng nghiên cứu. Trong đó có
180 vị trí biến đổi, giá trị mang thơng tin tiến hóa chiếm 148 vị trí. Số cặp
nucleotide tương đồng trung bình 681. Số cặp tương đồng cao nhất là 285
xuất hiện ở vị trí codon thứ 1 và thấp nhất là 237 ở vị trí codon thứ 2. Từ đó
đã xây dựng được cây tiến hóa cho thấy các lồi nghiên cứu tách thành 3
nhánh: Nhánh thứ nhất gồm các loài thuộc họ Kim giao (Podocarpaceae),
nhánh thứ hai gồm các lồi thuộc họ Thơng (Pinaceae), nhánh thứ ba gồm các
lồi của 3 họ Thơng đỏ (Taxaceae), họ Hoàng đàn (Cupressaceae) và họ Bụt
mọc (Taxodiaceae). Ba cặp lồi có quan hệ rất gần nhau gồm: Thơng đỏ bắc
(Taxus chinensis) và Thông đỏ nam (T. wallichiana), Bách xanh núi đá
(Calocedrus macrolepis) và bách xanh núi đất (Ca. rupestris) và 2 mẫu
Hồng đàn tía (Cupressus tonkinensis) và Hồng đàn rủ (C. tonkinensis). Với
kết quả trên, nhóm nghiên cứu đã nhập lồi thơng đỏ nam và lồi thơng đỏ bắc

vào cùng tên T. chinensis, loài Bách xanh núi đất và loài Bách xanh núi đá
vào chung một tên là Bách xanh (C. macrolepis), Hồng đàn tía và lồi Hồng
đàn rủ được xác định vào cùng một loài C. Tonkinensis [6].
Để góp phần xác định mã vạch có thể phân biệt được các loài thuộc chi
Codonopsis bằng cách kết hợp giữa phương pháp phân loại hình thái truyền
thống với phương pháp phân tích trình tự DNA của một gen mã vạch như ITS,
matK, trnK. Nguyễn Thị Thanh Nga (2012) đã khuếch đại thành công hai vùng
gen ITS và matK. Kết quả phân tích sự đa hình trên mỗi vùng gen cho thấy
vùng gen ITS kích thước từ 638-650 bp xuất hiện 113 điểm đa hình, chiếm
17,4% trên tồn bộ trình tự vùng gen, có độ đa hình cao hơn so với gen matK
kích thước 871 bp với 61 điểm đa hình xuất hiện, chiếm 7% trên tồn bộ trình
tự và cây phát sinh chủng loại được xây dựng. Kết quả phân tích trình tự DNA
và cây phát sinh chủng loại thu được, có thể kết luận vùng gen matK có khả
năng phân biệt tốt hơn vùng gen ITS, vùng gen matK có thể được sử dụng để
phân biệt các dưới loài của chi Codonopsis [13], [40].

9


Bùi Thanh Tùng và cộng sự (2017) đã sử dụng phương pháp giải trình tự
DNA để xác định tên khoa học của cây Ô đầu của Việt Nam. Kết quả đã giải
được trình tự gen của cây Ơ đầu và khi so sánh với trình tự gen của lồi A.
carmichaelii Debx. thấy có sự tương đồng đến 99%. Đây là căn cứ khoa học để
xác định tên khoa học của cây Ô đầu trồng ở tỉnh Hà Giang là: A. carmichaelii
Debx. họ Ranunculaceae [17].
Như vậy, việc sử dụng mã vạch DNA trong phân loại học đã và đang
được ứng dụng rộng rãi. Phương pháp này cịn góp phần rút ngắn thời gian
trong phân loại và định danh loài mới của sinh vật. Hiện nay, mã vạch DNA
cịn giúp các lồi có cùng nguồn gốc bằng phân tích sự đa hình di truyền.
1.4. Sơ lược về gen matK và ITS

Gen maturase K (MatK) là gen mã hóa enzyme maturase, một protein kết
nối các intron. Gen matK là một trong số các gen trong lục lạp có mặt ở hầu hết
thực vật. Hiện nay, matK cũng đang được xem là một gen có những đóng góp
lớn cho việc phát triển hệ thống phân loại phân tử và cho tiến hóa. Vì vậy,
gen matK được coi như một chỉ thị phân tử để giám định loài cũng như nghiên
cứu mối quan hệ giữa các lồi thực vật.

trnK ex1

matK

trnK ex2

trnK intron

Hình 1.1. Cấu trúc gen matK
Về kích thước, chiều dài của gen matK của lục lạp khoảng 1500 bp, nằm
trong intron của gen trnK (Hình 1.1). Trong thực tế, hai exon của gen trnK bên
cạnh gen matK đã bị mất, để lại gen matK cịn ngun bản để tham gia vào q
trình gắn nối các đoạn intron. Gen matK có kích thước lý tưởng, tỷ lệ thay thế
cao, tỷ lệ thay đổi lớn ở mức axit nucleic tại vị trí codon thứ nhất và thứ hai, tỷ

10


lệ chuyển tiếp/chuyển đổi thấp và có sự hiện diện của các vùng được bảo tồn.
Những đặc điểm này của gen matK đã tạo ra nhưng ưu thế lớn để xác định các
mối quan hệ cấp độ loài và họ [20], [28], [32].
Khác với gen lục lạp matK, trình tự internal transcribed spacer (ITS)
nằm trong nhân tế bào. ITS cũng được sử dụng rộng rãi như một công cụ hiệu

quả để nhận dạng loài và xác định quan hệ di truyền giữa các loài thực vật.
Vùng ITS ở thực vật được hiểu là đơn vị chứa gen mã hóa 18S; 5,8S; 28S và
hai đoạn đệm sao chép nội bộ ITS1 và ITS 2 có mặt ở hai bên của vùng 5,8S
(Hình 1.2). Vùng này có thể dễ dàng khuếch đại bằng phản ứng PCR với các
mồi đặc hiệu. Về cấu trúc, vùng ITS gồm các trình tự khơng mã hóa ITS1, ITS2
sắp xếp xen kẽ giữa với những trình tự mã hóa ribosome. Vùng mã hóa được
bảo tồn cao hơn vùng khơng mã hóa. [28], [31], [32].

18S rRNA

ITS1

5,8S rRNA

ITS2

28S rRNA

Hình 1.2. Cấu trúc vùng gen ITS
Hiện nay, ITS được coi là một trong những chỉ thị phân tử để xác định
phát sinh lồi hữu ích nhất cho cả thực vật và động vật, bởi vì tính chất phổ
biến của ITS, sự thừa kế lưỡng cực và những thay đổi tiến hóa tương đối cao
hơn do các ràng buộc chức năng ít hơn. Một ưu điểm nữa là vùng ITS1 và ITS2
có thể được khuếch đại bằng phản ứng PCR một cách riêng biệt với các mồi đặ
hiệu cho từng vùng. Điều này tạo điều kiện dễ dàng khuếch đại ITS từ mẫu
DNA có chất lượng kém hoặc bị suy thối. Ngồi ra các mồi khác có thể
khuếch đại cả hai vùng ITS1 và ITS2. Với các ưu thế như sự sẵn có của mồi, sự
hiện diện của nhiều bản sao trong tế bào, tính phổ quát cao và khả năng phân
biệt loài tốt, vùng ITS đã được xem như là một chỉ thị phân tử tiềm năng cho
mã vạch trong thực vật [20], [28], [32]. Vì vậy, vùng ITS được sử dụng để giám

11


định chính xác và hiệu quả các lồi thực vật trong cùng họ với các đặc điểm
sống và nguồn gốc tiến hóa khác nhau. Trong đó, việc sử dụng vùng ITS2 để
xác định cây thuốc và họ hàng gần của cây đã càng chứng tỏ về tiềm năng của
gen này như một DNA mã vạch hữu ích cho thực vật [18], [19], [23].

12


Chương 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu, hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu
Vật liệu nghiên cứu của đề tài là mẫu cây Ô đầu thu tại Quản Bạ, Hà
Giang được trồng tại vườn Thực nghiệm, khoa Sinh học, Trường Đại học Sư
phạm Thái Nguyên.
2.1.2. Hóa chất và thiết bị
Thang DNA 1kb (GeneShun Biotech), Kit Gel QIAquick , các hóa chất
như: cồn, agarose, EDTA, enzyme, isopropanol, isoamylalcohol, nước khử ion,
Chlorofrorm… của các hãng Merck, Sigma, Invitrogen, Fermentas.
Các thiết bị sử dụng trong đề tài gồm: Kính hiển vi kết nối máy tính, máy
quang phổ UV - Visible Spectrometer (Cintra 40) của Australia; máy li tâm lạnh
Heraeus của Đức; máy PCR - Veriti (Applied Biosystems) của Mĩ; tủ ấm (Hàn
Quốc); máy điện di và bộ nguồn Power Pae 300 (Bio Rad) của Mĩ; pipet các loại
(Gilson, Pháp); tủ sấy của Anh; cân điện tử của Thụy Sỹ; tủ lạnh âm 3000C
(Sanyo, Nhật Bản); nồi khử trùng (Tomy, Nhật Bản); máy voltex (Đức)…
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu

Các thí nghiệm được thực hiện tại các phịng thí nghiệm khoa Sinh học,
Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên và Viện Khoa học sự sống Trường Đại học Nơng lâm - Đại học Thái Ngun.
Trình tự nucleotide của đoạn gen ITS và gen matK được xác định tại
công ty 1st BASE tại Singapore.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái
- Quan sát, mơ tả, chụp ảnh về hình thái chung của cây Ơ đầu
- Sử dụng phương pháp hình thái so sánh: căn cứ vào đặc điểm hình thái
đối chiếu mô tả trong tài liệu chuyên khảo để xác định tên loài.

13


2.2.2. Phương pháp nghiên cứu cấu tạo giải phẫu rễ, thân, lá
* Sử dụng phương pháp cắt lát, phương pháp nhuộm kép để nghiên cứu
cấu tạo giải phẫu rễ, thân, lá của cây Ô đầu.
+ Phương pháp cắt lát: Dùng dao lam cắt lát thật mỏng theo những
phương hướng nhất định trong không gian (theo mặt phẳng ngang, mặt phẳng
dọc hay tiếp tuyến). Chú ý cắt lát thật mỏng thẳng góc với trục của vật mẫu,
khơng nhay lại lát cắt, lát cắt phải đảm bảo vng góc với trục thẳng của vật cắt.
+ Nhuộm lát cắt theo phương pháp nhuộm kép: tiến hành nhuộm kép với
thuốc nhuộm màu xanh metylen và cacmin. Các bước thực hiện như sau:
Bước 1: Lát cắt được ngâm vào dung dịch nước javen trong 10 - 15 phút
để tẩy sạch nội chất của tế bào.
Bước 2: Rửa sạch javen bằng nước cất (2 - 3 lần).
Bước 3: Ngâm mẫu bằng axit axetic để sạch nước javen cịn dính lại (nếu
khơng javen sẽ làm mất màu thuốc nhuộm).
Bước 4: Rửa sạch axit axetic bằng nước cất (rửa 2 lần)
Bước 5: Nhuộm đỏ mẫu bằng dung dịch cacmin trong khoảng 30 phút.
Bước 6: Rửa qua mẫu bằng nước cất (2-3 lần).

Bước 7: Nhuộm mẫu bằng dung dịch xanh metylen trong khoảng 30 giây.
Bước 8: Rửa mẫu bằng nước cất (2-3).
Bước 9: Lên kính, quan sát và chụp ảnh tiêu bản.
* Phương pháp chụp ảnh hiển vi và phân tích giải phẫu
Ảnh được chụp trên kính hiển vi kết nối máy tính sử dụng phần mềm
Microscope manger tại phịng thí nghiệm Thực vật học khoa Sinh học với các
độ phóng đại khác nhau và kết hợp với chụp ảnh bằng máy ảnh kỹ thuật số.
Sử dụng thuật ngữ để mơ tả hình thái và cấu tạo giải phẫu theo các tài
liệu của các tác giả: Nguyễn Bá, 2010 (Hình thái học thực vật) [2]; Trần Cơng
Khánh, 1981 (Thực tập hình thái và giải phẫu thực vật) [9]; Đỗ Tất Lợi, 2004
(Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam) [12].

14


2.2.3. Phương pháp phân tử
* Phương pháp tách chiết DNA tổng số
DNA tổng số của cây Ô đầu được tách chiết theo quy trình thực hiện
gồm các bước cụ thể như sau [22]:
- Ủ đệm chiết ở 650C trước khi tách 30 phút.
- Cân 0.5 g mẫu lá, vệ sinh mẫu bằng cồn 70%.
- Nghiền cẩn thận trong 0,5 ml đệm chiết thành dạng bột mịn, chuyển
ngay vào ống eppendorf 2 ml.
- Bổ sung 1 ml đệm tách chiết đảo nhẹ thành hỗn hợp đồng nhất. Ủ 650C
trong 1 giờ 30 phút (10 phút đảo đều 1 lần ).
- Bổ sung 0,5 ml chloroform: isoamylalcohol (24:1), đảo đều. Ly tâm 10000
v/p ở 4oC trong 15 phút. Hút dịch nổi cho vào ống eppendorf 1,5 ml mới.
- Bổ sung isopropanol lạnh tỉ lệ thể tích 1 : 1 với dịch thu được, đảo nhẹ,
để ở tủ -20oC trong 2 giờ.
- Ly tâm 7000 v/p trong 15 phút ở 4oC, loại bỏ dịch nổi thu tủa.

- Bổ sung 1 ml cồn 70%. Ly tâm 7000 v/p trong 10 phút ở 4 oC, loại cồn
thu tủa.
- Làm khơ DNA ở nhiệt độ phịng.
- Hịa tan DNA trong 100 µl nước khử ion. Bổ sung 0,5 µl RNase (100
mg/ml) ủ ở 37oC trong 2 giờ.
- Bảo quản DNA tổng số ở -20oC.
* Phương pháp PCR
Khuếch đại vùng ITS và gen matK bằng PCR với các cặp mồi là: ITS-F/
ITS-R và matK-F/ matK-R. Trình tự nucleotide của các cặp mồi này được thể
hiện ở bảng 2.1.

15


Bảng 2.1. Trình tự nucleotide của cặp mồi ITS-F/ITS-R
và cặp mồi matK-F/matK-R
Kích thước
Trình tự nucleotide 5’  3’

Cặp mồi

đoạn DNA
(bp) dự kiến

ITS-F

ACGAATTCATGGTCCGGTGAAGTGTTCG

ITS-R

TAGAATTCCCCGGTTCGCTCGCCGTTACT

matK-F

CGATCTATTCATTCAATATTTC

matK-R

TCTAGCACACGAAAGTCGAAGT

0,28 kb

0,9 kb

Thành phần phản ứng PCR được trình bày trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR
Hóa chất

STT

Thể tích (µl)

1

H2O

14,7

2

Buffer 10X

3

dNTP 10mM

0,4

4

Primer

0,8

5

Taq polymerase ( 1 UI/µl)

0,1

6

DNA khn

2

2

Tổng thể tích

20

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR nhân bản vùng ITS là: 94 oC trong 4
phút, lặp lại 40 chu kỳ và trong mỗi chu kỳ, biến tính ở 94 oC trong 30 giây,
tiếp hợp mồi ở 58 oC trong 60 giây, tổng hợp ở 72 oC trong 60 giây và bước kết
thúc ở 72 oC trong 5 phút, lưu giữ ở 4oC .
Gen matK được khuếch đại với chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR là 94 oC
trong 1 phút, phản ứng được lặp lại 35 chu kỳ và trong mỗi chu kỳ, biến tính ở
94oC trong 30 giây, tiếp hợp mồi ở 53oC trong 40 giây, tổng hợp ở 72oC cho 40
giây và bước kết thúc ở 72°C trong 5 phút.

16