Nghiên cứu nuôi cấy tế bào cây nghệ đen curcuma zedoaria roscoe và khảo sát khả năng tích lũy một số hợp chất có hoạt tính sinh học của chúng

..

ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

VÕ CHÂU TUẤN

NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY TẾ BÀO
CÂY NGHỆ ĐEN (CURCUMA ZEDOARIA ROSCOE)
VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TÍCH LŨY MỘT SỐ
HỢP CHẤT CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CHÚNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HUẾ - 2014


ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

VÕ CHÂU TUẤN

NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY TẾ BÀO
CÂY NGHỆ ĐEN (CURCUMA ZEDOARIA ROSCOE)
VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TÍCH LŨY MỘT SỐ
HỢP CHẤT CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CHÚNG

Chuyên ngành: SINH LÝ HỌC THỰC VẬT
Mã số: 62.42.30.05

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học:
1. GS. TS. Nguyễn Hoàng Lộc
2. PGS. TS. Cao Đăng Nguyên

HUẾ - 2014


LỜI CẢM ƠN
Hoàn thành luận án này, trước hết chúng tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc
đến GS. TS. Nguyễn Hoàng Lộc và PGS. TS. Cao Đăng Nguyên đã quan tâm giúp
đỡ và hướng dẫn tận tình.
Xin được bày tỏ lòng biết ơn tới các cán bộ, giảng viên của Phịng thí
nghiệm Các hợp chất thứ cấp, Viện Tài nguyên-Môi trường và Công nghệ sinh học,
Đại học Huế; Bộ mơn Sinh lý-Sinh hóa, Khoa Sinh học, Trường đại học Khoa học,
Đại học Huế đã giúp đỡ chúng tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Xin cám ơn Ban Giám đốc, Ban Đào tạo Sau đại học của Đại học Huế; Ban
Giám hiệu, Phòng Nghiên cứu Khoa học và Hợp tác Quốc tế, Phòng Đào tạo Sau
đại học Trường đại học Khoa học; Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh học, Trường đại học
Khoa học, Đại học Huế; Ban Giám hiệu, Khoa Sinh-Môi trường, Trường Đại học
Sư phạm - Đại học Đà Nẵng đã có nhiều giúp đỡ q báu, tạo mọi điều kiện tốt nhất
để chúng tơi hồn thành luận án.
Xin cám ơn các đồng nghiệp, bạn bè đã nhiệt tình động viên, hỗ trợ chúng tơi
hồn thành luận án.
Cuối cùng, xin được bày tỏ lòng biết ơn đến những người thân trong gia đình
đã đóng góp một phần khơng nhỏ trong việc hồn thành luận án này.
Huế, ngày 15 tháng 02 năm 2014
Tác giả
Võ Châu Tuấn

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tơi. Các số liệu, kết quả
trình bày trong luận án là trung thực, khách quan, nghiêm túc và chưa từng được ai
công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nếu có gì sai sót, tơi xin chịu hoàn toàn
trách nhiệm.
Tác giả
Võ Châu Tuấn


MỤC LỤC
LỜI CÁM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
MỤC LỤC
BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI............................................................... 1
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ........................................................................ 3
3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN ................................................. 3
4. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ............................................................ 4
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 5
1.1. NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT ................................................................... 5
1.1.1. Sơ lƣợc lịch sử nuôi cấy tế bào thực vật ............................................... 5
1.1.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật ..................................................... 6
1.1.2.1. Nuôi cấy callus .................................................................................. 6
1.1.2.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào ................................................................ 7
1.1.2.3. Các thông số đánh giá khả năng sinh trưởng của tế bào ............... 10
1.1.2.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến q trình ni cấy tế bào ................ 12
1.1.2.5. Nuôi cấy tế bào thực vật ở qui mô lớn ............................................ 16

1.2. SỰ TÍCH LŨY CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP TRONG TẾ BÀO THỰC
VẬT NUÔI CẤY IN VITRO................................................................................... 19
1.2.1. Vai trò của các hợp chất thứ cấp ở thực vật ......................................... 19
1.2.2. Các nhóm hợp chất thứ cấp chủ yếu ở thực vật ................................ 19
1.2.2.1. Nhóm terpene .................................................................................. 20
1.2.2.2. Nhóm phenol ................................................................................... 20
1.2.2.3. Các hợp chất chứa nitrogen............................................................ 20


1.2.3. Những nghiên cứu sản xuất các hợp thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực
vật.............................................................................................................................. 21
1.2.3.1. Những nghiên cứu ngoài nước ........................................................ 21
1.2.3.2. Những nghiên cứu trong nước ........................................................ 25
1.3. GIỚI THIỆU VỀ CÂY NGHỆ ĐEN .............................................................. 28
1.3.2. Thành phần hóa học ............................................................................. 28
1.3.3. Cơng dụng ............................................................................................. 30
1.3.3.1. Cơng dụng cổ truyền ....................................................................... 30
1.3.3.2. Các hoạt tính sinh học .................................................................... 30
1.3.4. Tình hình nghiên cứu ni cấy in vitro của cây nghệ đen ................ 35
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 37
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ......................................................................... 37
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ............................................................................ 37
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................... 38
2.3.1. Nuôi cấy callus ...................................................................................... 39
2.3.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào................................................................... 39
2.3.2.1. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong bình tam giác ............................. 39
2.3.2.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong hệ lên men .................................. 40
2.3.3. Xác định khả năng sinh trƣởng của tế bào ........................................ 40
2.3.4. Định lƣợng tinh dầu ............................................................................. 41
2.3.5. Định lƣợng curcumin ........................................................................... 41

2.3.6. Định lƣợng polysaccharide hòa tan trong nƣớc ................................ 42
2.3.7. Xác định sesquiterpene ........................................................................ 42
2.3.8. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu .................................. 43
2.3.9. Xử lý thống kê ....................................................................................... 43
Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................................. 44
3.1. NUÔI CẤY CALLUS NGHỆ ĐEN ................................................................ 44
3.2. NI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO TRONG BÌNH TAM GIÁC .............. 47
3.2.1. Ảnh hƣởng của cỡ mẫu nuôi cấy ......................................................... 47


3.2.2. Ảnh hƣởng của tốc độ lắc .................................................................... 49
3.2.3. Ảnh hƣởng của chất ĐHST ................................................................. 51
3.2.3.1. Ảnh hưởng của BA .......................................................................... 51
3.2.3.2. Ảnh hưởng của 2,4-D ...................................................................... 52
3.2.3.3. Ảnh hưởng của 2,4-D và BA ........................................................... 52
3.2.4. Ảnh hƣởng của nguồn carbon ............................................................. 54
3.2.4.1. Ảnh hưởng của sucrose ................................................................... 54
3.2.4.2. Ảnh hưởng của glucose ................................................................... 56
3.3. NUÔI CẤY TẾ BÀO HUYỀN PHÙ TRONG HỆ LÊN MEN ..................... 59
3.3.1. Khảo sát sinh trƣởng của tế bào ......................................................... 59
3.3.2. Ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy...................................................... 61
3.3.2.1. Cỡ mẫu ............................................................................................ 61
3.3.2.2. Tốc độ khuấy ................................................................................... 62
3.3.2.3. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí ......................................................... 63
3.4. KHẢO SÁT SỰ TÍCH LŨY MỘT SỐ HỢP CHẤT CĨ HOẠT TÍNH
SINH HỌC TRONG TẾ BÀO NGHỆ ĐEN ......................................................... 65
3.4.1. Hàm lƣợng tinh dầu ............................................................................. 65
3.4.2. Hàm lƣợng polysaccharide hòa tan trong nƣớc tổng số ................... 67
3.4.3. Hàm lƣợng curcumin ........................................................................... 68
3.4.4. Xác định sesquiterpene ........................................................................ 73

3.5. HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU TẾ BÀO NGHỆ ĐEN ... 77
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................................... 80
NHỮNG CƠNG TRÌNH ĐÃ ĐƢỢC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
.................................................................................................................................. 82
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 83
PHỤ LỤC


BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT
BAP

:

6-benzylaminopurine

BA

:

6-benzyladenine

CIB

:

centrifugal impeller bioreator

cs

:

cộng sự

DMSO

:

dimethyl sulfoxide

ĐC

:

đối chứng

ĐHST

:

điều hòa sinh trưởng

HPLC

:

high performance liquid chromatography
(sắc ký hiệu năng cao áp)

IAA

:

indoleacetic acid

IBA

:

indolebutyric acid

Kin

:

kinetin

L

:

lít

L-DOPA

:

L-3,4 -dihydrooxyphenylamine

LPS

:

lipopolysaccharide

MS

:

Murashige và Skoog (1962)

NAA

:

naphthaleneacetic acid

Nxb

:

nhà xuất bản

TNF-α

:

tumor necrosis factor-alpha

2,4-D

:

2,4-dichlorophenoxyacetic acid


DANH MỤC CÁC BẢNG
Tên bảng

TT
1
2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

Bảng 3.1.Khả năng tạo callus từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của chất ĐHST lên sinh trưởng và phát
sinh hình thái của callus
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của cỡ mẫu lên sinh trưởng của tế bào
ni cấy huyền phù trong bình tam giác
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên sinh trưởng của tế bào
ni cấy huyền phù trong bình tam giác
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của BA lên sinh trưởng của tế bào ni
cấy huyền phù trong bình tam giác
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của 2,4-D lên sinh trưởng của tế bào ni
cấy huyền phù trong bình tam giác
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của 2,4-D và BA lên sinh trưởng của tế
bào ni cấy huyền phù trong bình tam giác
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của sucrose lên sinh trưởng của tế bào
nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của glucose lên sinh trưởng của tế bào
nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của fructose lên sinh trưởng của tế bào
ni cấy huyền phù trong bình tam giác
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của cỡ mẫu lên sinh trưởng của tế bào
nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy lên sinh trưởng của tế
bào nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí lên sinh trưởng của tế
bào ni cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L

Trang
44
46

48

50

51

52

53

54

56

57

62

63

64


14

15

16

Bảng 3.14. Hàm lượng tinh dầu của tế bào nghệ đen nuôi cấy
trong hệ lên men 10 L
Bảng 3.15. Hàm lượng polysaccharide của tế bào nghệ đen nuôi
cấy trong hệ lên men 10 L
Bảng 3.16. Hàm lượng curcumin của tế bào nghệ đen nuôi cấy
trong hệ lên men 10 L

66

67

69

Bảng 3.17. Chiều cao phổ hấp thụ (mAU) của sesquiterpene
17

trong tế bào nuôi cấy ở hệ lên men 10 L và tế bào củ nghệ tự

74

nhiên
18

Bảng 3.18. Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu tế bào nghệ đen

78

DANH MỤC CÁC HÌNH

TT

Tên hình

Trang

1

Hình 2.1. Cây nghệ đen ni cấy in vitro

37

2

Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm

38

3
4
5

Hình 3.1. Callus hình thành từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro
(A) callus trắng và xốp, (B) callus trắng và mọng nước
Hình 3.2. Callus có màu vàng, rắn, rời rạc sau 14 ngày ni cấy
Hình 3.3. Dịch huyền phù tế bào nghệ đen sau 14 ngày ni cấy
trong bình tam giác trên mơi trường có 3% sucrose

45
47
55

Hình 3.4. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen ni cấy trong bình
6

tam giác trên mơi trường MS có 3% sucrose; 0,5 mg/L BA và

58

1,5 mg/L 2,4-D, lắc 120 vịng/phút
7
8

Hình 3.5. Ni cấy tế bào nghệ đen trong bình tam giác 250 ml
đặt trên máy lắc
Hình 3.6. Ni cấy tế bào nghệ đen trong hệ lên men 10 L

59
60

Hình 3.7. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong hệ lên men
9

nuôi cấy trên môi trường MS có 3% sucrose; 0,5 mg/L BA; 1,5
mg/L 2,4-D ; khuấy 120 vịng/phút; sục khí 2,0 L/phút, cỡ mẫu

60

100 g
10

Hình 3.8. Sinh khối tươi (A) và sinh khối khô (B) của tế bào
nghệ đen sau 14 ngày nuôi cấy trong hệ lên men 10 L

61

Hình 3.9. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong hê lên men
11

nuôi cấy trên môi trường MS có 3% sucrose; 0,5 mg/L BA; 1,5
mg/L 2,4-D ; khuấy 150 vịng/phút; sục khí 2,5 L/phút, cỡ mẫu

65

200 g
12

Hình 3.10. Phổ HPLC của curcumin chuẩn (0,5 mg/ml)

71


13

14

Hình 3.11. Phổ HPLC curcumin của củ nghệ đen 01 năm tuổi

ngồi tự nhiên
Hình 3.12. Phổ HPLC curcumin của tế bào nghệ đen sau 2 đến
18 ngày nuôi cấy trong hệ lên men 10 lít

72

73

Hình 3.13. Phổ HPLC của sesquiterpene. A: Củ nghệ đen tự
15

nhiên; B: tế bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên men 10 L từ 2

76

đến 18 ngày
16

Hình 3.14. Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu nghệ đen

77


1

MỞ ĐẦU
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Trong nhiều thế kỷ qua, loài người đã dựa chủ yếu vào thực vật như là
nguồn cung cấp carbohydrate, protein và chất béo làm thực phẩm. Hơn nữa, thực
vật cũng là nguồn cung cấp phong phú các hợp chất tự nhiên dùng làm dược

phẩm, hóa chất nơng nghiệp, hương liệu, chất màu, thuốc trừ sâu sinh học hoặc
các chất phụ gia thực phẩm có giá trị [132]. Những sản phẩm này được biết như
là các chất trao đổi thứ cấp, được hình thành với một lượng rất nhỏ trong cây
(thường nhỏ hơn 1% khối lượng khô) và chức năng trao đổi chất chưa được biết
đầy đủ. Chúng được xem là sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật với
mơi trường hoặc là sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động vật [177].
Những nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật đã phát triển
từ cuối những năm 50 của thế kỷ XX và đến nay có khoảng hơn 80.000 hợp chất
thứ cấp khác nhau ở thực vật đã đuợc công bố [19], [23].
Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), có đến 80% dân số thế giới sử dụng
thảo dược làm thuốc để chữa bệnh và chăm sóc sức khỏe. Việc khai thác nguồn
dược liệu tự nhiên từ thực vật đang trở thành một vấn đề quan trọng mang tính
tồn cầu và chúng ngày càng được thương mại hóa nhiều hơn. Tuy nhiên, vấn đề
đặt ra hiện nay là nơi sống tự nhiên của các loài cây thuốc đang bị biến mất
nhanh chóng do sự biến đổi của khí hậu tồn cầu cũng như sự khai thác bừa bãi
của con người. Như vậy, sản xuất các hợp chất thứ cấp thực vật bằng con đường
canh tác truyền thống và tổng hợp hóa học sẽ có nhiều hạn chế, khó có thể đáp
ứng đủ nhu cầu dược liệu ngày càng tăng trong tương lai [188]. Điều này buộc
các nhà khoa học cần phải tính đến cơng nghệ ni cấy tế bào thực vật như một
con đường tiềm năng để cung cấp nguyên liệu cho ngành công nghiệp dược
phẩm [106].


2

Nuôi cấy tế bào thực vật đã được quan tâm nghiên cứu từ những năm
1950. Nhiều nghiên cứu cho thấy, ni cấy tế bào thực vật là một phương thức
có hiệu quả trong sản xuất các hợp chất có hoạt chất sinh học hoặc các chất
chuyển hóa của chúng [132]. Ưu điểm của nuôi cấy tế bào thực vật là có thể
cung cấp liên tục nguồn nguyên liệu dồi dào để tách chiết ở quy mô công nghiệp

các hoạt chất mà không phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên [106]; có thể tạo ra các
hợp chất mới và chủ động nâng cao khả năng sản xuất chúng bằng cách thay đổi
các điều kiện nuôi cấy [128]; các hoạt chất thu được không bị nhiễm bẩn bởi
thuốc trừ sâu, diệt cỏ, kháng côn trùng cũng như tránh được sự không đồng nhất
về nguồn nguyên liệu và những biến động hàm lượng của các sản phẩm thực vật
ngoài tự nhiên. Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu cũng cho thấy, hàm lượng các
chất có hoạt tính sinh học tích lũy trong tế bào thực vật nuôi cấy in vitro tương
đương hoặc cao hơn nhiều lần so với cơ quan tích lũy của chúng trong cây ngoài
tự nhiên [140], [167]. Đến nay, người ta đã thành công trong sản xuất rất
nhiều loại hợp chất có giá trị theo phương thức này trên qui mơ lớn
như anthraquinone ở cây Rubia akane, vincristine ở cây dừa cạn (Catharanthus
roseus), berberin ở cây Coscinium fenustratum, diosgenin ở cây Dioscorea
doryophora, taxol ở các loài thuộc chi Taxus, ginsenoside ở các lồi thuộc chi
Panax… [163].
Nghệ đen cịn gọi là nga truật thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) có nguồn
gốc từ Đơng Bắc Ấn Độ, được trồng ở khắp khu vực Nam Á, Đông Nam Á,
Trung Quốc, Đài Loan, và Madagasca [9], [115]. Củ của cây nghệ đen có chứa
các hoạt chất sinh học chủ yếu là curcumin, terpenoid và tinh dầu. Ngoài ra nó
cịn có tinh bột, chất dẻo và một số chất có vị đắng như tannin và flavonoid [82].
Các nghiên cứu cho thấy, curcumin có khả năng chống được sự phát sinh khối u;
một số dạng ung thư ở chuột như ung thư ruột kết, ung thư dạ dày, ung thư vú và
ung thư buồng trứng [55], [66], [152]; curcumin cũng có tác dụng chống đơng
máu và hạ huyết áp; curcuminoid và sesquiterpene là những chất có khả năng ức


3

chế sự hình thành TNF-α của đại thực bào đã được hoạt hóa, do đó có tác dụng
chống viêm nhiễm [152]; curcumin cịn là một chất chống oxy hóa có khả năng
bảo vệ tế bào. Nhiều cơng trình nghiên cứu cũng cho thấy, tinh dầu nghệ đen có

tác dụng kháng khuẩn và kháng đột biến rất cao [176]. Bên cạnh đó,
polysaccharide của nghệ đen ức chế hiệu quả sinh trưởng của các bướu thịt
(sarcoma 180) được cấy dưới da của chuột, ngăn cản đột biến nhiễm sắc thể, có
hoạt tính kích thích đại thực bào [75], [105], [169]. Trong tự nhiên, nghệ đen là
loài nhân giống bằng thân rễ, phải mất một thời gian dài để tạo củ nên hệ số
nhân kém; năng suất thu hoạch thường thấp, đặc biệt là phụ thuộc rất lớn vào
điều kiện đất đai, khí hậu, mùa vụ, chi phí nhân cơng và vật tư sản xuất. Mặt
khác, nghệ đen trong tự nhiên còn dễ mắc các bệnh như thối củ và đốm lá [29].
Vì vậy, rất khó có đủ nguồn nguyên liệu dồi dào và ổn định để sản xuất lượng
lớn các hợp chất có hoạt tính sinh học q của cây nghệ đen sử dụng trong bào
chế dược phẩm.
Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu
nuôi cấy tế bào cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) và khảo sát khả
năng tích lũy một số hợp chất có hoạt tính sinh học của chúng”
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu thiết lập các điều kiện và môi trường nuôi cấy thích hợp để
sản xuất nhanh sinh khối tế bào, đồng thời xác định được khả năng tích lũy và
hoạt tính sinh học một số hợp chất trong tế bào nghệ đen nuôi cấy huyền phù
trong hệ lên men 10 L.
3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN
3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu của luận án sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học mới, có
tính hệ thống về nuôi cấy in vitro tế bào cây nghệ đen và sự tích lũy một số hợp
chất có hoạt tính sinh học của chúng; đồng thời là nguồn tài liệu tham khảo hữu


4

ích trong nghiên cứu, giảng dạy về ni cấy tế bào và sản xuất các hoạt chất sinh
học có giá trị cao từ nuôi cấy tế bào thực vật.

3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của luận án là cơ sở khoa học để phát triển hệ thống nuôi cấy
huyền phù tế bào cây nghệ đen ở qui mô lớn nhằm sản xuất nhanh sinh khối,
cung cấp nguồn nguyên liệu liên tục và ổn định để thu hồi các hợp chất có giá trị
cao dùng làm thuốc, góp phần bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cộng đồng.
4. ĐĨNG GĨP MỚI CỦA LUẬN ÁN
- Đã tạo ra dòng tế bào callus (rắn và rời rạc) từ bẹ lá của cây nghệ đen in
vitro thích hợp để ni cấy huyền phù, đồng thời xác định một cách có hệ thống
các điều kiện và mơi trường ni cấy thích hợp cho sự sinh trưởng nhanh và ổn
định của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong bình tam giác 250 ml và trong hệ lên
men 10 L.
- Đã khảo sát sự tích lũy các chất có hoạt tính sinh học như: tinh dầu,
curcumin, sesquiterpene và polysaccharide trong tế bào nghệ đen nuôi cấy.
Nghiên cứu đã xác định được hàm lượng và thời điểm tích lũy cao nhất của các
hợp chất này theo đường cong sinh trưởng và đồng thời cho thấy có sự chuyển
hóa sinh học các chất như curcumin và sesquiterpene xảy ra trong nuôi cấy
huyền phù tế bào cây nghệ đen.
- Đã khảo sát được khả năng kháng khuẩn của tinh dầu chiết rút từ tế bào
cây nghệ đen nuôi cấy in vitro và nhận thấy, tinh dầu của tế bào có khả năng ức
chế sinh trưởng một số loài vi sinh vật gây bệnh ở mức tương đương hoặc cao
hơn so với tinh dầu chiết rút từ củ nghệ đen 01 năm tuổi ngoài tự nhiên.


5

Chƣơng 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT
1.1.1. Sơ lƣợc lịch sử nuôi cấy tế bào thực vật

Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là nuôi cấy vô trùng các tế bào, mô, cơ
quan và các bộ phận của chúng dưới các điều kiện về vật lý và hóa học in vitro
[93]. Thử nghiệm đầu tiên về ni cấy tế bào bên ngồi một cơ thể thực vật hồn
chỉnh được cơng bố vào năm 1902 bởi Haberlandt - nhà Sinh lý thực vật người
Đức, người được biết đến như nhà sáng lập ra phương pháp nuôi cấy tế bào thực
vật. Trong bài viết nổi tiếng với tiêu đề “Những thử nghiệm nuôi cấy các tế bào
thực vật tách rời”, ông đã mô tả những nổ lực trong thiết lập có hệ thống ni
cấy các tế bào thịt lá, biểu bì và lơng hút. Mặc dù khơng thành công trong nuôi
cấy phân chia tế bào, nhưng ông dự đốn sẽ có khả năng đạt được sự phân chia
tế bào trong nuôi cấy các tế bào riêng rẽ, điều này đã ảnh hưởng mạnh mẽ đến sự
nghiệp của nhiều nhà nhà khoa học sau này. Tiếp sau đó là những nghiên cứu
rộng rãi theo hướng cải thiện các dung dịch dinh dưỡng và khám phá về các chất
ĐHST thực vật nhằm kiểm tra lại những dự đoán của Haberlandt [164]. Trong
những năm 1960, nhiều nổ lực hơn nữa để cải thiện dung dịch dinh dưỡng đã
đưa đến 2 công bố đáng chú ý của Skoog và cs, với hai môi trường nuôi cấy đã
được dùng và mô tả đó là mơi trường Murashige và Skoog [107] và mơi trường
Linsmaier và Skoog [85].
Nuôi cấy các tế bào đơn và các khối nhỏ tế bào thành công đầu tiên trong
nuôi cấy tế bào cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) và cây Tagetes erecta trên máy
lắc. Nuôi cấy tế bào thực vật trên qui mô lớn đầu tiên thành công ở tế bào của
các cây bạch quả, bắt ruồi, cỏ Lolium và hoa hồng trong hệ lên men kiểu ráy
nước dạng đơn giản với dung tích 20 L [164].
Những thử nghiệm đầu tiên trong nuôi cấy tế bào đơn để sản xuất dược


6

phẩm đã được tiến hành trong những năm 1950 tại cơng ty Charles Pfizer [164].
Đến năm 1987, đã có 30 hệ thống nghiên cứu nuôi cấy tế bào thực vật có khả
năng sản xuất các hợp chất thứ cấp cao hơn trong các thực vật tương ứng [177].

Đến nay, một thế kỷ sau những nghiên cứu của Haberlandt, nhiều hợp chất thứ
cấp đã được sản xuất thương mại bằng con đường nuôi cấy tế bào thực vật như
berberine, paclitaxel, ginseng saponin, polysaccharide [177].
1.1.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật
Mỗi tế bào thực vật là một đơn vị độc lập, chứa đầy đủ thông tin di truyền
của một cơ thể. Trong những điều kiện nhất định, mỗi tế bào có thể hình thành
lại được một cơ thể hồn chỉnh. Hồn tồn có thể tách riêng và ni cấy tế bào
độc lập để nghiên cứu mọi quá trình sống xảy ra trong đó [12].
1.1.2.1. Ni cấy callus
Ni cấy tế bào thực vật được khởi đầu bằng việc hình thành các tế bào
khơng phân hóa, được gọi là callus. Ni cấy callus đạt được bằng cách nuôi cấy
các mẫu mô tách từ thực vật trên môi trường dinh dưỡng cơ bản có chất làm rắn
là agar. Mơi trường dinh dưỡng cơ bản này chứa các chất dinh dưỡng khoáng đa
lượng, vi lượng, nguồn carbon và nhiều loại chất ĐHST thực vật. Đánh giá chính
xác các ảnh hưởng của thành phần mơi trường dinh dưỡng hoặc chất ĐHST lên
khả năng sinh trưởng của callus là yêu cầu quan trọng để xác định môi trường tối
ưu cho nuôi cấy. Các thông số phổ biến nhất dùng trong đánh giá sinh trưởng
trong nuôi cấy callus bao gồm khối lượng tươi, khối lượng khô và chỉ số sinh
trưởng [93].
Trong nuôi cấy callus, các tế bào của callus có thể trải qua biến dị dịng
soma trong q trình cấy chuyển. Vì vậy, các dịng tế bào ổn định di truyền nên
được lựa chọn để tránh sự sản xuất thất thường các chất trao đổi thứ cấp trong
nuôi cấy. Thông thường, sau một số lần cấy chuyển, callus có thể được xem là
dịng tế bào đồng nhất khi các thơng số sinh trưởng của dịng tế bào được lặp lại


7

trong q trình cấy chuyển trên cùng một loại mơi trường nuôi cấy [35]. Bouque
và cs (1998) đã nghiên cứu ni cấy 217 dịng callus khác nhau từ các lồi của

chi Psoralea nhận thấy, sau 16 lần cấy chuyển (48 tuần), có khoảng 90% số
dịng callus sinh trưởng ổn định [22]. Fett-Neto và cs (1994) nuôi cấy tế bào cây
Taxus cuspidate và thu được dòng tế bào ổn định sinh trưởng sau 2 năm cấy
chuyển [42].
1.1.2.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào
Nuôi cấy huyền phù tế bào thường được khởi đầu bằng cách chuyển các
khối callus vào nuôi cấy trong môi trường lỏng được khuấy bởi máy lắc, quay
hoặc màng lọc xoay. Mô callus nuôi cấy nên là loại mô dễ vỡ vụn để có thể thiết
lập được dịch huyền phù tế bào với mức độ phân tán cao nhất. Nuôi cấy huyền
phù tế bào trong môi trường lỏng cung cấp một hệ thống duy nhất cho những
nghiên cứu chi tiết về sinh trưởng và sản xuất các chất chuyển hóa. So với ni
cấy callus, ni cấy huyền phù sản xuất ra lượng lớn sinh khối tế bào mà từ đó
các chất chuyển hóa thứ cấp có thể dễ dàng chiết tách [35].
Nuôi cấy dịch huyền phù là sự tiến triển từ thực vật đến mẫu vật, đến
callus và cuối cùng đến dịch huyền phù [7]. Trong q trình ni cấy, các tế
bào sẽ dần dần tách ra khỏi callus do những chuyển động xốy của mơi
trường. Sau một thời gian ngắn nuôi cấy, trong dịch huyền phù là hỗn hợp các
tế bào đơn, các khối tế bào với kích thước khác nhau và các tế bào chết. Tuy
nhiên, cũng có những dịch huyền phù tốt, chứa tỷ lệ cao các tế bào đơn và tỷ
lệ nhỏ các cụm tế bào. Khả năng tách rời của các tế bào trong mơi trường có
thể cải thiện bằng cách thay đổi thành phần môi trường nuôi cấy [104]. Mặc
dù sự kết khối của tế bào có thể được loại bỏ bởi sự thay đổi điều kiện môi
trường nuôi cấy, nhưng thường trong cuối pha lag của q trình ni cấy, các
tế bào trở nên kết dính với nhau như là một qui luật. Để thu được dịch huyền
phù gồm phần lớn các tế bào đơn, người ta thường sử dụng các enzyme phá
hủy thành tế bào hoặc dùng các sàng (rây). Tuy nhiên, các dịch huyền phù


8

đồng nhất đã được thiết lập thường chúng có xu hướng quay trở lại tình trạng
kết khối ban đầu (Fowler và cs 1982) [104].
Cho đến nay, hầu hết các dịch huyền phù tế bào đã được ni cấy có sự
hiện diện của cả những tế bào đơn và các khối tế bào. Nhìn chung, mơi trường
thích hợp cho ni cấy callus thì cũng thích hợp cho ni cấy huyền phù tế bào.
Tuy nhiên, trong một số trường hợp, nồng độ của các auxin và cytokinin địi hỏi
cao hơn. Thơng thường, động học sinh trưởng của các tế bào nuôi cấy huyền phù
là đường hàm mũ; các hợp chất thứ cấp chủ yếu tạo ra trong pha ổn định, liên
quan với trao đổi chất sơ cấp và phân chia tế bào [35].
Nuôi cấy huyền phù tế bào là tiến hành nuôi tế bào trong mơi trường lỏng
có dung tích nhất định để thiết lập hệ huyền phù tế bào. Trong quá trình ni
cấy, bình ni cấy khơng chỉ thường xun có sự tăng lên của các sản phẩm trao
đổi chất mà cịn ln ln diễn ra sự trao đổi khơng khí với bên ngồi. Khi các
chất dinh dưỡng của mơi trường nuôi cấy bị tiêu hao, cùng với sự tạo thêm một
số sản phẩm trao đổi chất có hại, thì sự phân chia và sinh trưởng của tế bào sẽ bị
ức chế. Khi đó, thơng qua cấy chuyển hoặc thay đổi mơi trường ni cấy sẽ kích
thích sự sinh trưởng mạnh mẽ trở lại của huyền phù tế bào [12]. Nhìn chung, có
ba phương thức ni cấy huyền phù tế bào là ni cấy mẻ, ni cấy mẻ có bổ
sung chất dinh dưỡng và nuôi cấy liên tục.
- Nuôi cấy mẻ
Nuôi cấy mẻ là phương thức mà trong suốt thời gian nuôi cấy không thêm
vào chất dinh dưỡng cũng như không loại bỏ sản phẩm cuối cùng của quá trình
trao đổi chất. Do vậy, các điều kiện môi trường luôn thay đổi theo thời gian, mật
độ tế bào tăng lên còn nồng độ cơ chất giảm xuống. Nuôi cấy mẻ được xem là
một hệ thống đóng, quần thể tế bào sinh trưởng và phát triển theo một số pha
nhất định với những điều kiện đặc trưng [7]. Mặc dù tế bào thực vật và tế bào vi
sinh vật có một số điểm khác nhau như kích thước của tế bào thực vật lớn hơn,
chu kỳ sinh trưởng của tế bào thực vật dài hơn, sự trao đổi chất chậm hơn…

9

nhưng nhìn chung sinh trưởng của tế bào thực vật trong nuôi cấy mẻ cũng trải
qua các giai đoạn như tế bào vi sinh vật, gồm có bốn pha. Pha lag (pha tiềm
phát): bắt đầu từ khi callus được đưa vào mơi trường cho đến khi có dấu hiệu
phân chia tế bào đầu tiên; trong pha này không xảy ra sự tăng về khối lượng và
số lượng tế bào. Pha log (pha lũy thừa): ở pha này, sự phân chia và tăng khối
lượng tế bào diễn ra với tốc độ lớn nhất (số lượng tế bào tăng theo hàm mũ); Pha
ổn định: ở pha này, khả năng phân bào giảm mạnh, số lượng và khối lượng tế
bào ổn định. Pha suy vong: sự sinh trưởng của tế bào ra khỏi đỉnh cao, giảm
xuống và dần đến ngừng sinh trưởng nếu khơng được cấy chuyển [12].
- Ni cấy mẻ có bổ sung chất dinh dưỡng
Đây là một hình thức khác của phương thức nuôi cấy mẻ. Sau khi tế bào
nuôi cấy sinh trưởng cực đại, các chất dinh dưỡng sẽ dần cạn kiệt, lúc này người
ta sẽ cung cấp thêm các chất dinh dưỡng mới vào hệ lên men mà không loại bỏ
dịch ni cũ. Trong hệ lên men này, có các bộ phận điều khiển hàm lượng các
chất dinh dưỡng được thêm vào giúp hạn chế hay tăng cường tốc độ sinh trưởng
hoặc sự tích lũy hợp chất thứ cấp. Tuy nhiên, như vậy thể tích hệ lên men sẽ tăng
lên, để hạn chế việc này người ta thường sử dụng dung dịch chất dinh dưỡng
dưới dạng đậm đặc. Phương thức này vẫn được gọi là ni cấy mẻ, vì tồn bộ
thể tích của hệ lên men cuối cùng được thu hồi theo từng mẻ [129].
- Nuôi cấy liên tục
Những hạn chế chính của ni cấy mẻ đó là tốn thời gian nhiều cho quá
trình khử trùng, bổ sung vào và lấy môi trường ra, làm sạch hệ thống lên men
[48]. Nuôi cấy liên tục là phương pháp kinh tế vì có thể kéo dài thời gian ni
cấy hay kéo dài pha log trong một thời gian nhất định. Trong phương thức ni
cấy này, dịng đi vào (mơi trường mới) bằng với dịng đi ra (gồm mơi trường, tế
bào và các chất chuyển hóa) để giữ cho thể tích bình nuôi không thay đổi, và
điều kiện nuôi cấy của hệ thống luôn ổn định [138].

10

Nhìn chung, các phương thức ni cấy có tính truyền thống như ni cấy
mẻ, ni cấy mẻ có bổ sung chất dinh dưỡng và nuôi cấy liên tục trong nuôi cấy
vi sinh vật có thể được dùng trong ni cấy tế bào thực vật. Về cơ bản, thiết lập
một phương thức nuôi cấy tế bào phụ thuộc bởi (1) mối quan hệ giữa sinh trưởng
và tổng hợp các chất trao đổi thứ cấp và (2) khả năng các sản phẩm thứ cấp tiết
ra hoặc không tiết ra môi trường [23].
1.1.2.3. Các thông số đánh giá khả năng sinh trưởng của tế bào
Trong nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật, cần phải theo dõi chặt chẽ sự
sinh trưởng và sức sống của tế bào để tăng hiệu suất nuôi cấy tế bào cũng như
cải thiện điều kiện nuôi cấy [12]. Một số chỉ tiêu dùng để đánh giá động học sinh
trưởng tế bào thực vật trong nuôi cấy, bao gồm thể tích lắng, thể tích đóng gói,
khối lượng tươi và khối lượng khô, mật độ, chỉ số sinh trưởng, thời gian nhân
đôi và một số chỉ tiêu khác của tế bào [135].
- Thể tích lắng và thể tích đóng gói của tế bào
Thể tích lắng của tế bào được xác định bằng cách cho các huyền phù tế
bào trầm tích trong một cái ống có chia vạch và được biểu thị bằng phần trăm thể
tích chung của dịch huyền phù, bao gồm cả sinh khối tế bào. Thể tích đóng gói
của tế bào được xác định bằng cách tương tự sau khi tế bào được nén chặt bởi
quay ly tâm. Hai thông số này cho phép đánh giá nhanh sinh trưởng của tế bào
trong khi vẫn duy trì được điều kiện vô trùng mẫu. Các phương pháp này thuận
lợi để giám sát sự sinh trưởng của tế bào suốt một chu kỳ ni cấy trong các bình
tam giác với điều kiện ni cấy như nhau, bởi vì dịch huyền phù có thể đưa trở
lại các điều kiện ni cấy trước đó. Tuy nhiên, dựa vào thể tích tế bào có lẽ
khơng phải là cách chính xác để kiểm tra sinh trưởng vì nó phụ thuộc vào hình
thái tế bào [93].
- Khối lượng tươi và khối lượng khô của tế bào
Khối lượng tươi và khối lượng khô của tế bào cho phép đánh giá sinh

11

trưởng của tế bào chính xác hơn các chỉ tiêu về thể tích tế bào. Tuy nhiên, yêu
cầu của các thao tác mẫu lại tiến hành trong điều kiện không vô trùng. Việc xác
định khối lượng tươi của tế bào ít tốn thời gian hơn khối lượng khơ, nhưng nó
khơng phản ánh được sự gia tăng sinh khối thực của tế bào, đặc biệt là cuối giai
đoạn nuôi cấy, khi mà hầu hết sự tăng trưởng của tế bào trong nuôi cấy là do sự
hấp thu nước [161].
- Mật độ tế bào nuôi cấy
Để thu được giá trị tin cậy về số lượng tế bào trong nuôi cấy huyền phù,
trước hết các khối tế bào phải được phá vỡ bằng cách ủ dịch huyền phù với dung
dịch chromium trioxide 8% hoặc với các enzyme thủy phân như cellulase và
pectinase. Phương pháp sử dụng chromium trioxide thì nhanh hơn và ít phức tạp
hơn dùng các enzyme thuỷ phân, tuy nhiên nó gây trở ngại trong ước tính các tế
bào sống của cùng một mẫu. Phương pháp dùng enzyme duy trì được các tế bào
sống và đánh giá về số lượng các tế bào sống trong cùng một mẫu bởi nhuộm
màu tế bào có thể thực hiện được [122].
- Chỉ số sinh trưởng
Khối lượng tươi và khô của tế bào chỉ cho phép đánh giá sinh khối thuần
túy của mô tại thời điểm lấy mẫu, chỉ số sinh trưởng tương quan với dữ liệu sinh
khối tại thời điểm lấy mẫu và nuôi cấy ban đầu. Nó được tính tốn bằng tỉ lệ sinh
khối được tích lũy với sinh khối ban đầu ni cấy [93].
- Thời gian tế bào nhân đôi
Thời gian nhân đôi là thời gian để lượng sinh khối của một quần thể tế
bào đạt gấp hai lần so với ban đầu. Một trong những điểm khác biệt lớn nhất
giữa sinh trưởng của tế bào thực vật và tế bào vi sinh vật có liên quan tới tốc độ
sinh trưởng riêng của chúng. Mặc dù kiểu sinh trưởng có thể giống nhau, tế bào
thực vật có thời gian nhân đơi hoặc tốc độ phân chia đo theo ngày, trong khi đó ở

trong nhiều lồi vi sinh vật thì xác định theo phút đến giờ. Thời gian nhân đôi


12

nhanh nhất trong nuôi cấy tế bào thực vật được ghi nhận trong nuôi cấy tế bào
cây thuốc lá là 15 giờ [24].
1.1.2.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến q trình ni cấy tế bào
- Mơi trường ni cấy
Thành phần môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh
trưởng và phát triển của tế bào. Trong giai đoạn đầu của q trình ni cấy, các
chất dinh dưỡng giảm nhanh, sản phẩm trao đổi chất mới bắt đầu được tích tụ và
tăng dần. Ba hợp phần của mơi trường có ảnh hưởng lớn đến q trình ni cấy tế
bào thực vật là carbon, nitrogen và phospho. Tuy nhiên, cũng không thể coi nhẹ
các hợp phần khác của môi trường nuôi cấy, đặc biệt là các nguyên tố vi lượng và
các chất ĐHST. Chúng đóng vai trị quan trọng trong quá trình trao đổi chất mặc
dù nồng độ của chúng có trong mơi trường ở mức độ rất thấp [17].
+ Các chất ĐHST
Nhiều nghiên cứu cho thấy, các chất ĐHST có ảnh hưởng lớn đến tốc độ
sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp các chất của mô thực vật trong ni cấy
in vitro cũng như trong cây hồn chỉnh. Zhao và cs (2001) đã nghiên cứu ảnh
hưởng của 2,4-D và NAA phối hợp với BAP ở các nồng độ khác nhau lên sinh
trưởng và tích lũy jaceosidin của tế bào cây hoa sen tuyết (Saussurea medusa).
Kết quả cho thấy, các mơi trường có sự phối hợp giữa BAP với 2,4-D thì khơng
thích hợp cho sinh trưởng của tế bào; khi nồng độ 2,4-D gia tăng lên, khả năng
sinh trưởng của tế bào giảm đi rõ rệt. Sử dụng các môi trường bổ sung phối hợp
giữa BAP với NAA, lượng jaceosidin tích lũy trong tế bào tăng tỷ lệ thuận với
sự gia tăng nồng độ của NAA [189]. Mô của cây cà trái vàng (Solanum
xanthocarpum) khi nuôi cấy trên mơi trường chứa 2,4-D thì có khả năng sản xuất
được solasodine, nhưng khi ni cấy trên mơi trường có chứa IAA hoặc IBA thì

khơng sản xuất được chất này [111]. Năm 1993, khi nghiên cứu sản xuất
berberine từ nuôi cấy huyền phù tế bào cây Thalictrum minus, Hara và cs nhận


13

thấy, mơi trường ni cấy có bổ sung 2,4-D và NAA khơng có tác dụng kích
thích sản xuất berberine, trong khi đó khả năng sản xuất berberine của tế bào
tăng khi sử dụng BAP [56].
+ Nguồn carbon
Mô và tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro sống chủ yếu dựa theo
phương thức dị dưỡng. Vì vậy, việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy nguồn
carbon hữu cơ là điều bắt buộc. Nguồn carbon trong môi trường nuôi cấy tế bào
thực vật thường được cung cấp dưới dạng carbohydrate. Carbon vừa tham gia
tổng hợp các thành phần của tế bào vừa cung cấp năng lượng cho quá trình sinh
trưởng và tồn tại của tế bào. Ngoài ra, carbohydrate cũng là nguồn cung cấp
carbon cần thiết cho sự hình thành các sản phẩm trung gian thông qua trao đổi
chất [191]
Trong phần lớn các môi trường nuôi cấy, nguồn carbon được bổ sung chủ
yếu là đường sucrose và glucose với nồng độ 20 - 40 g/L. Gautheret (1959) cho
rằng đối với phần lớn các mô và tế bào nuôi cấy, đường sucrose và glucose là
nguồn carbon tốt nhất, trong một số trường hợp khác, có thể dùng fructose,
galactose và maltose (Nguyễn Đức Thành, 2000) [14]. Ảnh hưởng của nồng độ
sucrose trong môi trường nuôi cấy đã được nghiên cứu ở nuôi cấy tế bào tam
thất (Panax notoginseng). Khối lượng khô của tế bào tăng tỷ lệ thuận với sự gia
tăng nồng độ sucrose từ 20 đến 40 g/L, nhưng khi nồng độ sucrose lên đến 60
g/L thì dường như ức chế sự sinh trưởng của tế bào [140]. Theo Gunter và cs
(2003), nuôi cấy tế bào cây Silene vulgaris ở các môi trường có nồng độ đường
sucrose thấp (dưới 30 g/L), khả năng sinh trưởng và tổng hợp polysaccharide của
tế bào không cao. Khi tăng nồng độ sucrose lên dến 30 g/L khả năng tích lũy

sinh khối tế bào cũng gia tăng. Mơi trường có chứa 30 g/L sucrose hoặc phối hợp
giữa đường sucrose (15 g/L) và glucose (15 g/L) là thích hợp nhất cho sinh
trưởng của tế bào [50].