Xác định trình tự gen e6 và l1 của hpv và gen ebna 1 của ebv để ứng dụng trong chuẩn đoán ung thư cổ tử cung và vòm mũi họng

..

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
-------------------------

HOÀNG VĂN MẠNH

XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN E6 VÀ L1 CỦA HPV VÀ GEN
EBNA-1 CỦA EBV ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG CHUẨN ĐOÁN UNG
THƯ CỔ TỬ CUNG VÀ VỊM MŨI HỌNG

Chun ngành: Cơng nghệ sinh học
Mã số: 60.42.80

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS.TS. Lê Thanh Hoà

Thái Nguyên - 2011

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ala

Alanine

bp

Base pair

BL

Burkitt’s Lymphoma

CTC

Cổ tử cung

E

Early region

EBV

Epstein-Barr Virus

Gly

Glycine

gs-PCR

Group-specific PCR

HPV

Human papilloma virus

HP6

Hải Phòng 6 (ký hiệu mẫu)

L

Late region

LCL

Lymphoblastoid

LCR

Long control region

LMP

Latent membrane protein

MHC

Major Histocompatibility Complex

MT7

Miền trung 7 (ký hiệu mẫu)

NPC

Nasopharyngeal carcinoma

p53

Protein 53

PV

Papilloma virus

RB

Retinoblast

TR

Terminal repeat

ts-PCR

Type- specific PCR

UICC

Universal Integrated Circuit Card

UTBM

Carcinoma

VCA

Viral capsid antigen

VMH

Vòm mũi họng

WHO

World Health Organization

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

Tên bảng trong luận văn

Trang

Bảng 1.1

Tình hình ung thư CTC trên thế giới (khơng tính Châu

Phi)

5

Bảng 2.1

Thành phần và số lượng từng thành phần tham gia phản
ứng multiplex-PCR HPV-16/HPV-18

38

Bảng 2.2

Chu trình nhiệt độ trong phản ứng multiplex-PCR
HPV16/HPV18

39

Bảng 2.3

Thành phần và số lượng từng thành phần tham gia phản
ứng PCR gen E6 cua HPV-16

39

Bảng 2.4

Chu trình nhiệt độ trong phản ứng PCR của gen EBNA-1

40

Bảng 2.5

Thành phần phản ứng nối sản phẩm PCR vào vector tách
dòng (pCR2.1TOPO)

43

Bảng 2.6

Thành phần của phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp bằng
enzym EcoRI

47

Bảng 2.7

Thành phần phản ứng tạo DNA sợi đơn

49

Bảng 2.8

Chu trì nh nhiệt của phản ứng giải trì nh tự

49

Bảng 3.1

Kết quả truy cập Ngân hàng gen sử dụng chuỗi gen E6

của mẫu PK12

56

Bảng 3.2

Kết quả truy cập Ngân hàng gen sử dụng chuỗi gen L1
của mẫu PS16

57

Bảng 3.3

Kết quả truy cập Ngân hàng gen sử dụng chuỗi
nucleotide gen EBNA-1 của EB17, EB18, EB19 và EB20

64

Bảng 3.4

Kết quả xác định phân týp của các chủng EBV qua phân
tích acid amin tại vị trí 487 của EBNA-1

66

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình

Tên hình trong luận văn

Trang

Hình 1.1

Bản đồ phân bố dịch tễ theo độ tuổi của người có khả
năng nhiễm ung thư cổ tử cung của các châu lục

4

Hình 1.2

Cơ chế nhiễm HPV (Human papilloma virus) trong ung thư
cổ tử cung

9

Hình 1.3

Mối quan hệ phả hệ và nguồn gốc của 101 Papillomavirus
dựa trên so sánh chuỗi nucleotid của gene capsid L1

11

Hình 1.4

Human Papillomavirus chụp dưới kính hiển vi điện tử

12

Hình 1.5

Cấu trúc phân tử của hệ gene HPV -16.

13

Hình 1.6

Quá trình nhân lên của HPV

15

Hình 1.7

Sơ đồ minh họa quá trình tiến triển của EBV trong cơ thể bị
nhiễm

27

Hình 1.8

Cấu trúc hệ gene EBV dạng khép lại thành mạch vịng (a)
và dạng mạch thẳng (b)

29

Hình 2.1

Sơ đồ quy trình nghiên cứu phân tích gene EBNA-1 của
virus EBV và E6 của virus HPV16 và L1 của HPV18

34

Hình 2.2

Cấu trúc vector pCR2.1-TOPO® (Invitrogen)

43

Hình 3.1

Kết quả kiểm tra DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm

51

Hình 3.2

Kiểm tra sản phẩm multiplex-PCR sử dụng cùng lúc 2 cặp
mồi (E6F-E6R và HP18F-HP18R) với khuôn DNA tổng
số của các mẫu PS16, PK12, PK11, PK10.

52

Hình 3.3

Kiểm tra sản phẩm tách dòng đoạn gen E6 của mẫu PK12

(bản A) và đoạn gen L1 của mẫu PS16 (bản B).

53

Hình 3.4

Hình ảnh giản đồ (chromatogram) một phần trình tự gen
E6 của mẫu PK12 (HPV-16).

54

Hình 3.5

Hình ảnh giản đồ (chromatogram) một phần trình tự gen
L1 của mẫu PS16 (HPV18).

54

Hình 3.6

Trình bày chuỗi gen E6 của typ HPV-16.

55

Hình 3.7

Trình bày chuỗi gen L1 của typ HPV-18

55

Hình 3.8

Kết quả bước đầu phát hiện HPV16/HPV18 bằng phương
pháp đa mồi multiplex-PCR.

59

Hình 3.9

Kết quả kiểm tra DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm EBV

61

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Hình 3.10 Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di gen EBNA-1

61

Hình 3.11

Hình ảnh giản đồ (chromatogram) một phần trình tự gen
EBNA-1

63

Hình 3.12

Kết quả chuỗi gen EBNA-1 của EB17 được thu nhận sau giải
trình tự

63

Hình 3.13

So sánh một phần trình tự acid amin EBNA-1 của 13 chủng
nghiên cứu

65

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Mục lục
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
ĐẶT VẤN ĐỀ..........................................................................................................1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU....................................................................4

1.1. UNG THƢ CỔ TỬ CUNG VÀ HUMAN PAPILLOMA VIRUS (HPV).... 4
1.1.1 Dịch tễ học ung thư cổ tử cung.............................................................4
1.1.1.1. Trên thế giới..............................................................................
4
1.1.1.2. Tình hình ung thư cổ tử cung ở Việt Nam................................
6
1.1.1.3. Các yếu tố có nguy cơ đối với ung thư CTC............................
6
1.1.1.4. Human papilloma virus và bệnh ung thư cổ tử cung................
6
1.1.2. Phân loại và đặc tính sinh học của Papilloma virus...............................
9
1.1.2.1. Phân loại Papilloma virus.........................................................
9
1.1.2.2. Đặc tính sinh học của Human Papillomavirus.........................
12
1.1.2.3. Quá trình nhân lên của HPV.....................................................
14
1.1.2.4. Cơ chế gây ung thư cổ tử cung của HPV..................................
16
1.1.3. Chẩn đoán ung thư CTC........................................................................
17
1.1.3.1. Chẩn đoán tế bào học................................................................
17
1.1.3.2. Chẩn đoán dựa trên phân tích mRNA.......................................
19
1.1.3.3. Định týp HPV bằng sinh học phân tử.......................................
19

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1.1.4. Tầm quan trọng của việc nghiên cứu sinh học phân tử và xây dựng
phương pháp PCR chẩn đoán nhanh HPV gây ung thư cổ tử cung ở Việt Nam........
21
1.2. UNG THƢ VÒM MŨI HỌNG VÀ EPSTEIN-BARR VIRUS (EBV)....... 22
1.2.1. Dịch tễ học ung thư vịm mũi họng........................................................
22
1.2.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới............................................
22
1.2.1.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam...........................................
23
1.2.2. Đặc tính sinh học của Epstein-Bar virus (EBV).....................................
24
1.2.2.1. Phát hiện virus Epstein - Barr và ung thư VMH......................
24
1.2.2.2. Đặc điểm phân loại và cấu trúc EBV........................................
25
1.2.2.3. Sự nhân lên, tàng nhiễm và khả năng gây ung thư của
EBV….................................................................................... 26
1.2.2.4. Sinh học phân tử và sắp xếp hệ gene của EBV.........................
28
1.2.2.5. Gene và sản phẩm của gene EBNA-1.......................................
29
1.2.3. Tầm quan trọng của việc nghiên cứu sinh học phân tử và xây dựng
phương pháp PCR chẩn đoán sớm EBV ung thư vòm mũi họng ở Việt Nam...........
30
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................

33
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu.........................................................................................
33
2.2. Dụng cụ, trang thiết bị nghiên cứu và hoá chất nghiên cứu ..........................
33
2.2.1. Dụng cụ, trang thiết bị..........................................................................33
2.2.2. Hoá chất................................................................................................33
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu...................................................................................
34
2.4. Quy trình nghiên cứu..........................................................................................
35
2.4.1. Lấy mẫu và bảo quản.............................................................................
35
2.4.2. Kỹ thuật tách chiết DNA tổng số............................................................
35
2.4.3. Quy trình phản ứng PCR và kiểm tra sản phẩm PCR.............................
37

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




2.4.3.1. Thiết kế mồi………………………………………………. 37
2.4.3.2. Quy trình phản ứng PCR..........................................................
38
2.4.3.3. Kỹ thuật phát hiện sản phẩm PCR............................................
40
2.4.3.4. Tinh sạch sản phẩm PCR..........................................................
41

2.4.4. Phương pháp tạo dòng sản phẩm PCR....................................................
42
2.4.4.1. Tạo vectơ tái tổ hợp..................................................................
42
2.4.4.2. Chuyển nạp……………………………………..……………
43
2.4.4.3. Chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp.....................................................
44
2.4.4.4. Tách DNA plasmid tái tổ hợp...................................................
45
2.4.4.5. Kiểm tra DNA tái tổ hợp..........................................................
47
2.4.5. Giải trình trình tự và xử lý số liệu...........................................................
48
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..........................................................
51
3.1. Kết quả thu nhận, giải trình trình tự và xác định gen E6 của HPV-16
và L1 của HPV-18....................................................................................................
51
3.1.1. Kết quả kiểm tra DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm............................. 51
3.1.2. Kết quả thực hiện phản ứng Multiplex-PCR phát hiện HPV-16 và
HPV-18.....................................................................................................
52
3.1.3. Kết quả tách dịng và giải trình tự các sản phẩm HPV-16 và
HPV-18 từ các mẫu kiểm tra..................................................................53
3.1.4. Kết quả giải trình tự và thu nhận chuỗi gen E6 của HPV-16 và
chuỗi gen L1 của HPV-18................................................................. 54
3.1.5. Kết quả truy cập Ngân hàng gen xác định chuỗi gen E6 của
HPV16 và L1 của HPV18......................................................................56
3.1.6. Kết quả bước đầu phát hiện HPV-16 và HPV-18 bằng phương

pháp đa mồi multiplex-PCR.....................................................................
59

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




3.2. Kết quả thu nhận, giải trình trình tự và xác định gen EBNA – 1 của
EBV......................................................................................................................... 60
3.2.1. Kết quả kiểm tra DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm.................................
60
3.2.2. Kết quả thực hiện phản ứng PCR............................................................
61
3.2.3. Kết quả giải trình tự và thu nhận chuỗi gen EBNA-1 của EBV............
62
3.2.4. Kết quả truy cập Ngân hàng gen xác định chuỗi gen EBNA-1
của EBV.................................................................................................
63
3.2.5. Kết quả xác định phân týp EBV qua phân tích vị trí acid amin
số 487 của EBNA-1 thu nhận với chuỗi gen tương ứng của các chủng Việt
Nam và thế giới....................................................................................................... 64
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..........................................................
69
4.1. KẾT LUẬN..........................................................................................................
69
4.2. KIẾN NGHỊ..........................................................................................................
70
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, trên thế giới cũng như ở Việt Nam, ung thư (cancer) là một
trong những nguyên nhân gây tỷ lệ tử vong cao nhất ở người, chiếm khoảng
12% trong tổng số trường hợp tử vong hàng năm trên thế giới, đứng thứ 2 sau tỷ
lệ tử vong của các bệnh lí về tim - mạch và ngày càng có xu hướng gia tăng.
Bệnh ung thư nếu khơng được phát hiện sớm và điều trị kịp thời sẽ dẫn
đến nguyên nhân gây tử vong, do chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu. Bệnh
có thể xảy ra ở mọi lứa tuổi, ở cả hai giới (nam và nữ) và ở tất cả các mô, các cơ
quan trong cơ thể. Đặc biệt, ung thư cổ tử cung (CTC) và ung thư vòm mũi
họng (VMH) là hai trong số 5 loại ung thư có tỷ lệ tử vong cao nhất ở Việt Nam
và các quốc gia đang phát triển trong khu vực. Trong đó, ung thư CTC đứng thứ
2 trong số các ung thư và là nguyên nhân gây tử vong cao nhất cho phụ nữ ở
Việt Nam [1], [9]. Bên cạnh đó, ung thư VMH cũng là một trong 5 loại ung thư
phổ biến nhất ở người và là loại hay gặp nhất trong ung thư vùng tai mũi họng ở
các nước vùng Đơng nam Á và phía nam Trung Quốc [23], [56].
Nguyên nhân gây ra ung thư rất phức tạp, liên quan đến thể địa, tập quán,
thói quen và mơi trường sống. Trong đó, một số yếu tố đã được coi là liên quan
chặt chẽ với việc gây ra ung thư như: yếu tố vật lí (phóng xạ), hóa chất độc, các
gốc tự do và đặc biệt ngày nay đã phát hiện ra vai trò của các virus trong tiến
triển ung thư. Các cơng trình nghiên cứu gần đây đã chứng minh virus là nguyên
nhân gây ra hai loại ung thư này ở người. Nhiều nghiên cứu đã phát hiện sự hiện
diện của HPV (Human papilloma virus) trong hơn 95% các trường hợp ung thư
cổ tử cung [62], do đó HPV được coi là nguyên nhân gây bệnh ung thư CTC [9].
Các nghiên cứu về mối liên quan giữa Epstein-Barr Virus (EBV) và ung thư

VMH cũng đã cho thấy sự biểu hiện của kháng nguyên virus trong các giai đoạn
của bệnh, vai trò quan trọng của EBV trong bệnh học cũng như trong q trình
sàng lọc chẩn đốn điều trị, theo dõi và tiên lượng bệnh [24].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1




Papilloma virus (PV) thuộc họ Papillomaviridae, lưu hành phổ biến
trong tự nhiên, gây bệnh chủ yếu cho các loài động vật có xương sống bậc cao
như: người, ngựa, bị, chó, thỏ và một số lồi chim. Đặc biệt, PV có đặc tính gây
bệnh đặc hiệu lồi, HPV chỉ gây bệnh ở người mà khơng gây bệnh ở lồi khác
[36]. Đối với người, HPV thích ứng gây khối u ở da, miệng, thực quản, hầu,
họng và đường hậu môn - sinh dục. Cấu trúc hệ gen HPV là phân tử DNA sợi
đơi (double strand DNA - dsDNA) hình vịng trịn khép kín, có độ dài khoảng
7900 cặp nucleotid, được bao bọc bởi phân tử protein histon, các vùng gen HPV
được định vị trên một sợi DNA. Trong đó, L1 là gen mã hố cho protein vỏ
ngồi và cũng chính là thành phần kháng nguyên bề mặt của virus. Gen E6
thuộc phân vùng gen thứ 2 (vùng sao chép sớm) của hệ gen HPV, tổng hợp
protein E6 và các protein tương ứng, có vai trị quan trọng giúp cho sự nhân lên
DNA của virus, tham gia cơ chế hình thành ung thư CTC. Protein E6 của HPV
xâm nhập hệ gen của tế bào, phong toả và kìm hãm p53 bằng cách bám vào p53,
kích thích phân giải p53 nhờ enzym ubiquitin ligase [57]. Hậu quả, tế bào vẫn
tiếp tục phân chia, không có sự kiểm sốt và phát triển thành khối u.
EBV là loại virus nhiễm phổ biến trong cộng đồng còn gọi là Herpes
virus type 4, thuộc họ Herpesviridae [26]. EBV gây bệnh trên người và lây
truyền qua đường tiêu hoá, có đặc tính thích ứng tế bào Lympho B và là nguyên

nhân gây bệnh tăng bạch cầu đơn nhân nhiễm khuẩn (IM), liên quan đến cơ
chế tiến triển của một số loại ung thư như: tăng sinh lympho B, ung thư biểu
mô như ung thư VMH và ung thư dạ dày... Tuy nhiên, EBV có khả năng gây
sơ nhiễm và tồn tại lâu dài trong cơ thể mà không gây bệnh. Cấu trúc hệ gen
của EBV là DNA sợi đôi xoắn kép, mạch hở, kích thước khoảng 172 kb, nếu
tính cả phần cấu trúc lặp ở hai đầu là 184 kb, mã hố cho 9 protein virus. Trong
đó, gen EBNA-1 là một đoạn DNA nằm trong tổ hợp gen EBNA protein kháng
ngun, có vai trị thiết yếu trong q trình xâm nhập và nhân lên cũng như duy
trì sự tái tạo hệ gen của virus, bên cạnh đó protein EBNA-1 cịn ngăn cản q
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2




trình phân giải và trình diện kháng nguyên của virus ở tế bào nhiễm. Gen EBNA-1
và sản phẩm protein EBNA-1 có mặt trong tất cả các khối u có liên quan đến
EBV. Như vậy, với sự hiểu biết về các đặc tính sinh học phân tử của HPV và
EBV, cùng với sự phát triển của các kĩ thuật ứng dụng sinh học phân tử, hồn
tồn có thể giúp cho việc phát hiện sớm và chính xác HPV và EBV trên bệnh
nhân, phục vụ chẩn đoán và áp dụng các biện pháp điều trị sớm nhằm ngăn chặn
sự tiến triển của bệnh, giảm tỷ lệ tử vong do các ung thư mà chúng gây ra. Hiện
nay, ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu tìm hiểu đặc tính, định loại và xác định
týp một cách chính xác, có hệ thống về HPV và EBV. Việc nghiên cứu ứng
dụng PCR trong chẩn đoán phát hiện HPV và EBV cũng đã được thực hiện gần
đây, nhưng cịn nhiều hạn chế như: quy trình thực hiện phức tạp, thời gian trả lời
kết quả kéo dài và giá thành xét nghiệm.
Xuất phát trên cơ sở phân tích những cơng trình nghiên cứu có liên quan,
những kết quả mới nhất trong lĩnh vực nghiên cứu về Human papilloma virus

(HPV) và Epstein-Barr Virus (EBV), chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
“ Xác định trình tự gen E6 và L1 của HPV và gen EBNA-1 của EBV để ứng
dụng trong chuẩn đoán ung thư cổ tử cung và vòm mũi họng” với mục tiêu
nghiên cứu:
1. Thu nhận chuỗi gen E6 của HPV-16 và chuỗi gen L1 của HPV-18, ở một
số chủng Human papilloma virus (HPV) bằng cặp mồi thử nghiệm để
nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử và so sánh với các chủng của Việt
Nam và thế giới.
2. Thu nhận chuỗi gen EBNA-1 của một số chủng Epstein-Barr Virus
(EBV) bằng cặp mồi thử nghiệm để nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử
và so sánh với các chủng của Việt Nam và thế giới.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

3




Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. UNG THƢ CỔ TỬ CUNG VÀ HUMAN PAPILLOMA VIRUS (HPV)
1.1.1. Dịch tễ học ung thƣ cổ tử cung
Ung thư cổ tử cung là bệnh ác tính thường gặp thứ hai ở phụ nữ trên tồn
thế giới và là một trong số các nguyên nhân tử vong hàng đầu liên quan đến
bệnh ung thư cho phụ nữ ở các nước đang phát triển với khoảng 500.000 ca mới
và 250.000 ca chết mỗi năm. Khoảng 80% số ca ung thư cổ tử cung xảy ra ở các
nước có mức sống thấp [27].
1.1.1.1. Trên thế giới
Trên tồn thế giới tỷ lệ mắc ung thư cổ tử cung trên 100.000 phụ nữ (tất

cả các lứa tuổi). Theo Hiệp hội chống ung thư thế giới (UICC), tỷ lệ ung thư
CTC chiếm 12% trong số các bệnh ung thư ở phụ nữ (Hình 1.1).

Hình 1.1. Bản đồ phân bố dịch tễ theo độ tuổi của người có khả
năng nhiễm ung thư của các châu lục [64].

Ở Pháp, cứ 100.000 phụ nữ ở tuổi 45 có 13 trường hợp mắc ung thư CTC
và con số này tăng lên khi ở tuổi 60 cứ 100.000 người có 46 người mắc. Tần
suất mới mắc hàng năm từ 20 đến 85 trường hợp trong tổng số 100.000 phụ nữ.
Tỷ lệ tử vong do ung thư CTC ở các nước cũng rất khác nhau, ở Mexico là cao nhất

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

4




(15,9/100.000 dân), thấp nhất ở Hy lạp (1,3/100.000 dân) [50].
Theo Hội Ung Thư Mỹ, trong năm 2009, có khoảng 11.270 trường hợp
mới mắc ung thư cổ tử cung và ước tính có tới 4.070 phụ nữ sẽ chết vì ung thư
cổ tử cung, chiếm 1,3% của tất cả các ca tử vong do ung thư và 6,5% các ca tử
vong từ bệnh ung thư phụ khoa.
Các nghiên cứu điều tra gần đây cho thấy, tỷ lệ mới mắc và tỷ lệ tử vong
do ung thư CTC ở các nước phát triển đang có xu hướng giảm dần, do áp dụng
rộng rãi phương pháp chẩn đoán sàng lọc Pap smear, nên đã phát hiện sớm ung
thư CTC. Ở Anh tỷ lệ chết giảm từ 88/100.000 dân năm 1972 xuống còn
63/100.000 dân trong năm 1992. Ở Mỹ tỷ lệ mới mắc là 44/100.000 dân năm 1947,
đến năm 1996 tỷ lệ mới mắc hàng năm đã giảm xuống 7,5/100.000 dân [49].
Các nước có tỷ lệ ước tính mắc ung thư cổ tử cung cao nhất xảy ra ở châu

Phi, Trung Mỹ, Nam Mỹ và Châu Á.
Bảng 1.1. Tình hình ung thư CTC trên thế giới (khơng tính châu Phi) [11].
Vùng/Châu

Số trƣờng hợp

Tỷ lệ %

Châu Á

208.500

59,4

Trung Âu

35.700

18,6

Tây Âu

25.700

7,3

Nam Mỹ

14.800

4,2

Úc

1.000

1,3

Tổng cộng

350.000

100

Hiện nay, có khoảng 500.000 trường hợp ung thư cổ tử cung được chẩn
đoán xác định mỗi năm, hơn 80% trong số đó ở phụ nữ các nước đang phát
triển, nơi không được kiểm tra thường xuyên, do ý thức của người dân cũng như
điều kiện sử dụng thử nghiệm Pap smear không phải là có sẵn [9].
Ở châu Á bao gồm Malaysia khoảng 266.000 trường hợp mới phát
hiện và 143.000 ca tử vong mỗi năm [63].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

5




Ở khu vực Đông Nam châu Á, tỷ lệ ung thư CTC ở Thái lan, Myanma,
Lào, Campuchia chiếm cao nhất [8].

Tóm lại, tỷ lệ mắc bệnh ung thư CTC khác nhau tùy thuộc các quốc gia,
dân tộc, chủng tộc trong cùng một nước, phụ nữ da đen mắc bệnh gấp 2 lần phụ
nữ da trắng, phụ nữ ở thành thị mắc bệnh cao hơn phụ nữ ở nông thôn [8], [50].
1.1.1.2. Tình hình ung thƣ cổ tử cung ở Việt Nam
Hiện nay, ở Việt Nam chưa có thống kê cụ thể hàng năm về tỷ lệ mới
mắc và tử vong do bệnh ung thư CTC. Tuy nhiên, năm 1994, theo điều tra của
bệnh viện K - Hà Nội, tỷ lệ ung thư CTC là 7,7/100.000 phụ nữ, chiếm 6% trong
các loại ung thư. Ở thành phố Hồ Chí Minh tỷ lệ này là 35/100.000 phụ nữ và
chiếm hơn 20% trong các loại ung thư nói chung. Ung thư CTC đứng thứ 2 trong
số các ung thư ở phụ nữ Việt Nam, nhưng gây tử vong cao nhất cho phụ nữ [9].
1.1.1.3. Các yếu tố có nguy cơ đối với ung thƣ CTC
Nhiều nghiên cứu và giả thuyết cho thấy ung thư CTC hay gặp ở những
phụ nữ có hoạt động tình dục sớm (dưới 20 tuổi), có nhiều bạn tình, những
người có thai sớm, đẻ nhiều, mắc bệnh lây truyền qua đường tình dục, có thói
quen hút thuốc lá, tình trạng kinh tế thấp, có tiền sử viêm nhiễm CTC, nhất là
loạn sản CTC không được điều trị triệt để, nhiễm nhiều loại virus cơ hội như
Herpes simplex virus týp 2 [3], [6] và [11].
Hiện nay, nguyên nhân gây ung thư CTC đã được biết một cách cụ thể,
đó là do loại virus sinh u nhú ở người Human papillomavirus (HPV), thuộc họ
Papillomaviridae gây ra. HPV được phát hiện có mặt trong, trên 95% các
trường hợp ung thư CTC, do vậy được coi là nguyên nhân gây bệnh ung thư
CTC [62], [71].
1.1.1.4. Human papilloma virus và bệnh ung thƣ cổ tử cung
Các nghiên cứu dịch tễ học tại Hoa Kỳ cho thấy rằng 75% dân số tuổi 15
- 50 bị nhiễm HPV sinh dục và kéo dài trong suốt cuộc đời của họ. Trong số đó,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

6

60% bị nhiễm trùng thoáng qua, 10% bị nhiễm trùng dai dẳng (có sự hiện diện
của HPV DNA trong các mẫu mơ bộ phận sinh dục), 4% có dấu hiệu nhẹ tế bào
học và 1% với tổn thương lâm sàng.
Ở Việt Nam, tần suất lưu hành của HPV là rất cao ở nhóm tuổi có sinh
hoạt tình dục ở cả nam và nữ. Nhóm tuổi 20 - 29 bị nhiễm HPV cao nhất. Một
nghiên cứu theo dõi bằng Pap smear ở phụ nữ trẻ tuổi trong 2 năm, đã nhận thấy
tỷ lệ nhiễm HPV trong năm đầu là 3%, trong năm sau là 7% [11]. Tỷ lệ mới mắc
HPV hàng năm là 7%.
Có rất nhiều týp HPV là nguyên nhân gây ung thư CTC, nhưng tần suất
xuất hiện có khác nhau [25]. HPV týp 16 (HPV-16) là týp nổi trội chiếm 46 63% các trường hợp ung thư CTC, tiếp theo là HPV-18 (10-14%), HPV-31 (27%), HPV-33 (3-5%) và HPV-45 (2-8%) ở nhiều nơi trên thế giới trừ châu Á.
Bên cạnh các týp trên, ở châu Á còn phát hiện các týp khác là HPV-58 (6%) và
HPV-52 (4%). Ngoài HPV-16 và HPV-18, các týp HPV có khả năng gây ung
thư CTC bao gồm: HPV-31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -56, -58, -59, -68, -73
và -82, và có thể cả các týp HPV-26, -53 và -66 [47], [54].
Ở người, nhiễm virus papilloma thường biểu hiện những trạng thái tăng
sinh nội mơ biểu bì thuộc nhiều dạng khác nhau như: sùi niêm mạc, viêm, xơ
cứng biểu mô, khối u papilloma vùng sinh dục, vùng hầu họng, dạng tăng sinh
tế bào keratin [71]. Hầu như, mọi týp HPV đều có biểu hiện đặc trưng liên quan
đến khối u papilloma vùng sinh dục, như condyloma, u xơ và u mềm CTC,
chúng có tính chất lây truyền qua đường tình dục [42]. Biểu hiện khối u điển
hình do HPV gây ra chủ yếu là u biểu mô vùng hậu môn - sinh dục như: âm hộ, âm
đạo, trực tràng, vùng hậu môn, dương vật và khối u ở vòm họng, hầu- họng [17].
Những nghiên cứu về Human papillomavirus (HPV) cho thấy HPV tác
động chủ yếu vào các tế bào biểu mô lát tầng không sừng hóa của cổ tử cung, tại
nơi tiếp giáp giữa cổ trong và cổ ngoài (nơi tiếp giáp 2 loại mô khác nhau: biểu
mô tế bào trụ tuyến và biểu mơ lát tầng khơng sừng hóa). Biểu mơ lát tầng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

7




khơng sừng hóa vốn được tổ chức với chức năng che chở, bảo vệ và được quy
định sẽ phát triển dần lên hướng bề mặt và sau đó sẽ được bong ra ngồi. HPV
tấn cơng vào lớp tế bào đáy của biểu mơ vốn có khả năng sinh sản cao và gây ra
hiện tượng phát triển mạnh hơn bình thường của 1 rồi nhiều lớp tế bào sau đó.
Khi tế bào bất thường chiếm toàn bộ các lớp của tế bào biểu mơ lát (dị sản nặng
tại chỗ), sẽ có khả năng phát triển lan rộng khỏi màng đáy vào các lớp sâu hơn
biểu mơ lát và hình thành ung thư cổ tử cung giai đoạn xâm lấn. Tuy nhiên,
những tổn thương ban đầu chỉ xảy ra tại biểu mô lát vốn khơng có tiếp xúc mạch
máu, HPV hầu như chỉ hiện diện tại chỗ và không đi vào máu, do đó khơng gây
ra tình trạng viêm, khơng hoạt hóa hệ miễn dịch và hầu như không gây miễn
nhiễm sau khi đã nhiễm tự nhiên HPV (Hình 1.2).
Những nghiên cứu ở giai đoạn xâm lấn và giai đoạn trước xâm lấn là cần
thiết để dự đoán tác động tương lai của loại vắc-xin HPV-16/HPV-18 và xét
nghiệm HPV. Phân tích xác định các chủng HPV trong ung thư cổ tử cung giai
đoạn xâm lấn (ICC) cho thấy HPV-16 là phổ biến nhất và HPV-18 loại thứ hai
phổ biến, trong tất cả các châu lục. Kết hợp giữa các trường hợp nhiễm HPV16/HPV-18, ICC ở Châu Âu, Bắc Mỹ và Australia (74 - 77%) cao hơn so với ở
Châu Phi, Châu Á và Nam/Trung Mỹ (65 - 70%). Các loại HPV phổ biến nhất là
HPV 31, 33, 35, 45, 52 và 58, mặc dù sự phân bố tương đối của chúng khác
nhau tùy theo vùng địa lý. Tổn thương mơ biểu bì mức độ cao (tổn thương có
vảy cao cấp intraepithelial HSIL (high-grade squamous intra-epithelial lesion),
trong nhiễm HPV thường biểu hiện rõ ràng trong vòng vài tháng, khoảng 90%
biểu hiện rõ ràng trong vòng hai tháng. Trong số các trường hợp HSIL,
HPV16/18 có tỷ lệ nhiễm là 52% [52].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

8




Hình 1.2. Cơ chế nhiễm HPV (Human papilloma virus) trong ung thư cổ tử cung [6].
Ngày nay, nhiều bằng chứng cho thấy dường như cũng có các đáp ứng
miễn dịch trong bệnh nhân nhiễm HPV mặc dù yếu ớt: những người có suy
giảm miễn dịch dễ bị nhiễm HPV và khi đã nhiễm thì tiến triển sẽ nhanh và
nặng nề. Bên cạnh đó, có sự gia tăng nồng độ kháng thể kháng HPV sau khi bị
nhiễm tự nhiên, tuy nhiên nồng độ kháng thể này không đủ để gây đáp ứng miễn
dịch bảo hộ cơ thể nhiễm. Tổn thương dị sản hay ung thư cổ tử cung có một thời
gian dài phát triển tại biểu mô và tại cổ tử cung. Trung bình, khoảng 10- 20 năm
cho sự tiến triển từ dị sản đến ung thư cổ tử cung. Đây chính là điều kiện thuận
lợi cho việc kiểm sốt ung thư cổ tử cung, giúp phát hiện sớm và điều trị những
tổn thương dị sản cũng như ung thư giai đoạn sớm.
1.1.2. Phân loại và đặc tính sinh học của Papilloma virus
1.1.2.1. Phân loại Papilloma virus
Những nghiên cứu về sinh học chức năng và sinh học phân tử đã cho
phép phân loại Papilloma virus (PV) một cách hoàn chỉnh và tách hẳn nhóm
papilloma virus ra khỏi nhóm Polyoma virus. Như vậy, tất cả PV chỉ là một

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

9

nhóm duy nhất, thuộc họ Papillomaviridae. PV phân bố tương đối rộng rãi trong
thiên nhiên, gây bệnh cho các loài động vật có xương sống bậc cao chủ yếu là
người, ngựa, bị, chó, thỏ và một số lồi chim. Virus Papilloma gây bệnh cho
người (HPV) chỉ là một loại duy nhất [36]. Tính đặc hiệu lồi gây bệnh của PV
rất cao, khó có thể tìm thấy loại PV của lồi này lại gây bệnh lồi khác, PV chỉ
thích ứng biểu mô sừng và niêm mạc, gây tăng sinh tế bào biểu mơ ở đường
sinh dục và hậu mơn, vùng vịm họng, hầu - họng [32]. Đối với người, HPV gây
khối u ở da, miệng, thực quản, hầu, họng và đường hậu môn - sinh dục.
Về phân loại, PV được chia làm 5 siêu nhóm chính (super- groups) đánh
dấu từ A - E (Hình 1.3). Trong mỗi siêu nhóm, PV được chia thành các nhóm
khác nhau, mỗi một nhóm lại bao gồm các virus thuộc các týp khác nhau [22].
Ví dụ: siêu nhóm A, chủ yếu là HPV bao gồm 12 nhóm phụ là A1 - 12, trong đó các
týp HPV thuộc nhóm A9 là các loại virus có khả năng gây ung thư CTC rất cao.
Hầu hết, PV gây bệnh và biểu hiện lâm sàng đều thuộc siêu nhóm A (PV
thích ứng đường sinh dục và niêm mạc), hoặc siêu nhóm B (PV gây u xơ cứng
biểu mơ sùi). Siêu nhóm C và D gồm các PV gây khối u xơ papilloma và khối u
đích thực do Papillomavirus gây ra. Siêu nhóm E chưa được phân loại chính xác
đó là hỗn hợp của PV thích ứng và gây khối u ở da.
PV được phân chia tiếp tục thành các týp. Đối với HPV được coi là cùng
týp, nếu chuỗi gen L1 trong hệ gen không khác nhau trên 10%. Tuy nhiên cũng
có nhiều trường hợp, phân týp HPV khơng hồn toàn dựa vào chênh lệch %
nucleotid trong chuỗi gen L1, mà cịn phải xem xét đặc tính gây bệnh của các
týp đó [21], [22].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

10

Hình 1.3. Mối quan hệ phả hệ và nguồn gốc của 101 Papillomavirus dựa trên so
sánh chuỗi nucleotid của gen capsid L1. Các chuỗi gen được thu nhận từ Ngân
hàng Gen, xử lý bằng chương trình BioEdit, ClustalX 1.8.1 và phân tích phả hệ
bằng chương trình MEGA2.1. Nhóm A5, A7 và A9 gồm các týp HPV có nguy
cơ gây ung thư cao ở người [35].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

11




1.1.2.2. Đặc tính sinh học của Human Papillomavirus
Năm 1974 - 1976, bắt đầu có sự nghiên cứu về HPV và chứng minh HPV
là nguyên nhân gây ung thư CTC. Nhưng đến những năm 1980, sự phát triển
ứng dụng các kỹ thuật đã xác định DNA - HPV trong mô bệnh phẩm ung thư
CTC [18], [19], [72]. Những týp đầu tiên được phân lập là HPV-16 và HPV-18,
và hệ gen của chúng chính là nguồn gen quan trọng trong nghiên cứu về HPV.
Virus Papilloma của người có kích thước nhỏ, khoảng 55nanomet (nm), khơng
có vỏ bọc ngồi cùng. Dưới kính hiển vi điện tử, HPV trơng giống như quả bóng
gơn, nằm cạnh nhau theo một tập hợp (Hình 1.4) [51], [70].
Hạt virus có cấu trúc hình khối, gồm 72 capsomer, tạo nên protein cấu
trúc capsid có 2 lớp: Lớp 1 (L1) và lớp 2 (L2). L1 (layer 1) là lớp protein bề
mặt, cịn gọi là lớp vỏ lớn, có cấu trúc khối từ các đơn vị 5 góc cạnh. Kề cận L1
là protein cấu trúc của L2 (layer 2), còn gọi là lớp vỏ bé, gồm nhiều đơn vị xếp
lớp theo nhau (12 đơn vị /virus). .

Hình 1.4. Human Papillomavirus mơ hình và ảnh chụp dưới kính hiển vi
điện tử [51].
Hệ gen của HPV là phân tử DNA sợi đôi (double strands DNA - dsDNA)
khép kín thành vịng trịn, kích thước khoảng 7900bp, được bao bọc bởi nhiều phân
tử histon. Các gen thành phần hệ gen của HPV được định vị trong một sợi DNA.
Về chức năng, hệ gen HPV chia làm 3 phân vùng quan trọng:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

12




- Phân vùng thứ nhất: Là vùng khơng mã hóa L, có độ dài 400 - 1000 bp,
có chức năng điều hoà sao chép, gọi là vùng điều hoà lớn (LCR = long control
region), gồm chuỗi p97 (TATA Singnal 1,2) là tiểu phần khởi động (p97 core
promoter), các tiểu phần kích hoạt và một số chuỗi gen câm [16]. Vùng này có hệ
số biến đổi nucleotid cao hơn rất nhiều so với các vùng khác của hệ gen HPV.
- Phân vùng thứ hai: Là vùng sao chép sớm, ký hiệu là E (early region),
gồm các gen: E1, E2, E4, E5, E6 và E7, giúp cho sự nhân lên DNA của virus,
tham gia cơ chế hình thành khối u CTC.
- Phân vùng thứ ba: gồm các gen tổng hợp protein L1 và L2, là những
protein cấu trúc capsid của virus, được sản xuất muộn hơn. Do vậy, được gọi là
vùng sao chép muộn, ký hiệu là L (late region) (Hình 1.5).

Hình 1.5. Cấu trúc phân tử của hệ gen HPV -16.
Ghi chú: E1,2,4,5,6,7: các gen sớm; L1,2: các gen muộn; TATA Singnal 1,2: promotor
khởi động sao chép của hệ gen; Long Control Region: vùng điều khiển của hệ gen [16].

Hiện nay, HPV có khoảng 100 týp khác nhau đã được xác định, mỗi týp

có hàng chục phân týp (subtype); mỗi một phân týp lại có hàng chục biến thể
(variant) khác nhau, còn gọi là chủng virus, các chủng virus được đặt tên theo

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

13




địa danh, hoặc nhân danh, do đó nếu phân tích về mặt di truyền, nhiều chủng tuy
tên khác nhau nhưng rất có thể cùng thuộc về một biến thể. Do sự biến động và
đa dạng này, việc định týp và định chủng của HPV là rất phức tạp, đòi hỏi kỹ
thuật cao và chính xác. Việc định týp và chủng (biến thể) của HPV dựa vào kết
quả phân tích và xác định mức độ đồng nhất về thành phần nucleotid, cũng như
mức độ tương đồng về thành phần acid amin của các chuỗi gen E6, E7 và L1.
Một mẫu virus HPV mới phân lập, được gọi là cùng týp với một týp HPV
đã xác định trước đó, nếu thành phần nucleotid của các chuỗi E6, E7 và L1 có
mức độ đồng nhất trên 90% [59]. Những mẫu virus khác nhau trong cùng một
týp lại được phân chia thành các phân týp (hay biến thể hoặc chủng) trên cơ sở
phân tích sự biến đổi nucleotid và acid amin của các gen sớm (E) và gen muộn
(L). Về nguyên tắc, một virus HPV mới phân lập được coi là đồng phân týp
(đồng chủng) nằm trong một týp HPV nào đó, nếu như hệ gen của chúng có
mức độ đồng nhất về nucleotid và về acid amin tương đồng 90 - 98%. Một biến
thể độc lập của virus HPV phải có sai khác ít nhất là 2% so với biến thể khác khi
so sánh; nếu dưới 2%, chúng được coi là cùng biến thể. Tuy sai khác ít về hệ
gen, nhưng có một số biến thể HPV trong tự nhiên lại có các đặc tính sinh học
và hóa sinh học khác nhau, đặc biệt là khả năng gây ung thư và cơ chế hình
thành khối u CTC.
1.1.2.3. Quá trình nhân lên của HPV

HPV thường bắt đầu nhân lên ngay sau khi xâm nhập vào tế bào biểu mô,
qua những chấn thương rất nhỏ của biểu mơ như sinh hoạt tình dục. Do chỉ
những tế bào màng đáy của biểu mô vẩy mới mẫn cảm với virus [11].
Một số hoạt chất (Integrin- 6) rất cần thiết cho thụ thể của tế bào hoạt
động đối với HPV-6, nhưng không bắt buộc đối với HPV-11, -33. Giống như
nhiều loại virus khác, HPV-16, -33 khi tiếp xúc với tế bào chủ, thơng qua thụ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

14




Hình 1.6. Quá trình nhân lên của HPV [11].
thể bề mặt có cấu trúc từ heparan. Một số HPV cịn sử dụng thụ thể thứ cấp,
hoặc đảm bảo sự xâm nhập chắc chắn qua màng tế bào bằng cách sử dụng
proteoglycan.
Khi virus xâm nhập và nằm trong tế bào, thì DNA của virus ngay lập tức
được giải phóng và thực hiện q trình nhân lên của nó. Q trình tạo ra HPV
mới được thực hiện thông qua 2 cơ chế:
- Virus xâm nhập vào tế bào biểu mô hạ tầng thì sự nhân lên của virus
thuộc loại hình khơng tăng về số lượng và tồn tại với một số lượng thấp, DNA
của tế bào thực hiện quá trình tổng hợp nên DNA của chính virus, với tỷ lệ: 1
phân tử hệ gen /1 tế bào.
- Đối với tế bào keratin đã được biệt hố thích ứng với virus thì virus thực
hiện q trình nhân lên và tự nó điều khiển quá trình nhân lên DNA của mình
với một số lượng rất lớn, đồng thời tổng hợp nên protein cấu trúc capsid, để thực
hiện q trình lắp ghép, tạo virus hồn chỉnh.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

15




1.1.2.4. Cơ chế gây ung thƣ cổ tử cung của HPV
Khái niệm về cơ chế gây ung thư cổ tử cung của HPV
Cơ chế HPV gây ung thư CTC đã được Massimi và Banks (1997) giải
thích như sau: ở người và động vật, có hai protein điều chỉnh sự phân chia và
mức độ phát triển tế bào là RB (retinoblast) và p53 (protein điều hoà khối u).
Khi hai gen E6 và E7 của HPV tổng hợp protein, làm cho tự nó tiếp xúc với RB
và p53 sẽ gây cản trở quá trình điều chỉnh sự phân chia tế bào, kết quả tế bào bị
nhiễm HPV sinh sản tự phát, không có sự kiểm sốt, thay đổi cấu trúc và gen
khơng thể sửa chữa được và phát triển thành ung thư. Trong giai đoạn sớm,
những tế bào CTC bị nhiễm có thể chỉ thay đổi nhỏ về hình dáng và kích thước,
dần dần bị biến dạng, rối loạn trật tự cấu trúc, phá huỷ biểu mô bề mặt CTC.
Những thay đổi này sẽ gây nghịch sản hoặc tạo thành khối tân tạo hoặc là ung
thư trong biểu mô ở CTC [2], [11].
Do hệ gen của HPV chỉ mã hoá được 8 đến 10 loại protein, cho nên trong
quá trình nhân lên, HPV sử dụng các yếu tố trợ giúp của tế bào chủ trong việc
tương tác vùng điều hoà lớn (LCR) của hệ gen, để sao chép gen E6, E7. Protein
E6, E7 kìm hãm sự sinh trưởng của tế bào nhiễm bằng cách bám vào và vơ hoạt
protein điều hồ khối u của tế bào, hoạt chất cyclin (chất kích thích chu kỳ nhân
lên của tế bào) và các enzym kinase [55].
Trong quá trình gây nhiễm của HPV, gen E6 và E7 đã tạo nên mơi trường
khơng thích hợp, làm biến đổi hoạt động sống của tế bào, buộc tế bào phục vụ
riêng cho virus. Dẫn đến tế bào bị biến đổi nghiêm trọng về hình thái, cấu trúc
cũng như chức năng, nhưng tế bào khơng chết mà chỉ biệt hố và sinh trưởng

theo hướng khác.
Cơ chế gây ung thư cổ tử cung do tương tác của protein E6 và p53
Không giống như các loại ung thư khác, p53 trong ung thư CTC vẫn tồn
tại dưới dạng nguyên thuỷ và không bị đột biến. Protein E6 của HPV phong toả

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

16