KHẢO SÁT CƠ CHẾ CHỐNG NGƯNG TẬP TIỂU CẦU VỚI CHẤT KÍCH TẬP ADP CỦA PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT CÂY DONG RIỀNG ĐỎ Canna warszewiczii A. Dietr

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

LƯƠNG PHÚ HƯNG

KHẢO SÁT CƠ CHẾ
CHỐNG NGƯNG TẬP TIỂU CẦU VỚI CHẤT
KÍCH TẬP ADP CỦA PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT
CÂY DONG RIỀNG ĐỎ
Canna warszewiczii A. Dietr

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội – 2020


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

Người thực hiện: LƯƠNG PHÚ HƯNG

KHẢO SÁT CƠ CHẾ
CHỐNG NGƯNG TẬP TIỂU CẦU VỚI CHẤT
KÍCH TẬP ADP CỦA PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT
CÂY DONG RIỀNG ĐỎ
Canna warszewiczii A. Dietr

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Khóa: QH.2015.Y
Người hướng dẫn:

1. TS. Vũ Thị Thơm
2. TS. Nguyễn Thị Vân Anh

Hà Nội – 2020


LỜI CẢM ƠN
Khi nhận được đề tài khóa luận này, tôi cảm thấy bản thân rất may mắn khi
được học tập và nghiên cứu về lĩnh vực mà tôi yêu thích. Tơi khơng chỉ học hỏi
thêm được nhiều kiến thức mà còn nhận được sự quan tâm, giúp đỡ của các thầy
cơ, nhà trường, bệnh viện, gia đình và bạn bè.
Đầu tiên, tơi xin gửi cảm ơn đến tồn thể Ban chủ nhiệm Khoa Y dược, Đại
học Quốc gia Hà Nội và Bộ môn Y dược học cơ sở cùng các thầy cô giáo trong
khoa đã tạo điều kiện cho tơi được làm khóa luận tốt nghiệp và giúp đỡ tơi hồn
thành chương trình học tập trong suốt 5 năm qua.
Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến TS. Vũ Thị Thơm và
TS. Nguyễn Thị Vân Anh. Các cô là những người thầy đã tận tình hướng dẫn, tạo
điều kiện giúp đỡ tơi trong q trình học tập và hồn thành khóa luận. Khơng chỉ
truyền đạt kiến thức khoa học cùng những kinh nghiệm quý báu của mình, các cơ
cịn truyền cho tơi lịng u nghề, nhiệt huyết và tận tâm với công việc.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Lê Hồng Luyến và nhóm sinh viên đến từ
Đại học Khoa học và Công nghệ Hà Nội đã quan tâm, giúp đỡ tôi trong quá trình
thực hiện nghiên cứu tại phịng thí nghiệm. Tơi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các
bác sĩ và nhân viên Khoa Huyết học, Bệnh viện Bạch Mai đã giúp đỡ, tạo điều
kiện cho tôi thực hiện đề tài một cách thuận lợi nhất.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn và tình yêu thương sâu sắc tới gia đình,
người thân và bạn bè, những người đã luôn quan tâm, khuyến khích, động viên và
tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và thực hiện đề tài khóa luận.
Hà Nội, ngày 10 tháng 06 năm 2020
Sinh viên

Lương Phú Hưng


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
A
AC
ADP
APTT
Arg-Gly-Asp
ATP
AUC
Ca++
CalDAG-GEFI
cAMP
COX-1
CW
DCM
DEA
DMSO
EA
FPA
GDP
GP
GTP
G-actin
IP3
K+
LTA
Mg++

Phần trên mặt đất (Aerial)
Adenylyl cyclase
Adenosine diphosphate
Thời gian thromboplastin một phần hoạt hóa (Activated
partial thromboplastin time)
Arginylglycylaspartic acid
Adenosine triphosphate
Mức độ ngưng tập tiểu cầu (Area Under the aggregation
Curve)
Ion Canxi
Yếu tố trao đổi guanine điều hòa bởi canxi và DAG – 1
Cyclic adenosine monophosphate
Cyclooxygenase 1
Canna warszewiczii A. Dietr
Dichloromethane
Mức độ phân rã ngưng tập (Deaggregation)
Dimethyl sulfoxide
Ethyl acetate
Phần trăm ngưng tập tiểu cầu điểm cuối (Final Platelet
Aggregation)
Guanine diphosphate
Glycoprotein
Guanine triphosphate
Monomer actin
Inositol (1,4,5) trisphosphate
Ion Kali
Phương pháp đo độ ngưng tập tiểu cầu thông qua độ dẫn
truyền ánh sáng (Light Transmission Aggregometry)
Ion Magie

PC
PE
PIP2
PI 3-K
PKB/Akt

Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa (Maximal Platelet
Aggregation)
n-Hexan
Ngưng tập tiểu cầu
Thụ thể hoạt hóa bởi protease (Protease – activated
receptor)
Phosphatidylcholine
Phosphatidylethanolamine
Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate
Phosphoinositide 3-kinase
Serine-threonine protein kinase B/Akt

PLC

Phospholipase C

PLCγ
PPADS
PPP
PRP
PS
PT

R
Slope
TXA2
t-SNARE
UDP
UTP
vWF
v-SNARE

Phospholipase Cγ
Pyridoxalphosphate-6-azophenyl-2′,4′-disulfonic acid
Huyết tương nghèo tiểu cầu (Platelet-poor plasma)
Huyết tương giàu tiểu cầu (Platelet-rich plasma)
Phosphatidylserine
Thời gian prothrombin (Prothrombin time)
Phần thân rễ (Rhizome)
Tốc độ ngưng tập tiểu cầu
Thromboxane A2
Protein liên kết màng bào tương
Uridine diphosphate
Uridine triphosphate
Yếu tố von Willebrand
Protein liên kết màng hạt tiểu cầu

MPA
nH
NTTC
PAR

DANH MỤC CÁC BẢNG
STT

Tên Bảng

Trang

Bảng 1.1 Đặc điểm của một số GP chính

4

Bảng 1.2 Thành phần của hạt α

6

Bảng 2.1 Các nhóm tiến hành đo ngưng tập tiểu cầu

26

Bảng 3.1 Tốc độ ngưng tập tiểu cầu (Slope)

29

Bảng 3.2 Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa (MPA)

30

Bảng 3.3 Mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC)

32

Bảng 3.4 Giá trị P của sai khác giữa AUC của các nhóm

32

Bảng 3.5 Mức độ phân rã ngưng tập (DEA)

33

Bảng 3.6 Đánh giá sự phối hợp của PPADS và phân đoạn dịch chiết

39


DANH MỤC CÁC HÌNH
STT

Tên Hình

Trang

Hình 1.1 Cấu trúc tiểu cầu khi cắt theo mặt phẳng xích đạo

3

Hình 1.2 Giai đoạn bám dính

8

Hình 1.3 Giai đoạn ngưng tập tiểu cầu

9

Hình 1.4 Hiện tượng thay đổi hình dạng

13

Hình 1.5 Cơ chế hoạt hóa GPIIb/IIIa

14

Hình 1.6 Cơ chế hịa màng và giải phóng chất từ hạt tiểu cầu

16

Hình 1.7 Các con đường hoạt hóa tiểu cầu và đích tác dụng của các
thuốc kháng tiểu cầu

17

Hình 2.1 Mẫu cây Dong riềng đỏ C. warszewiczii A. Dietr

22

Hình 2.2 Sơ đồ tách chiết các phân đoạn dịch chiết C. warszewiczii
A. Dietr

23

Hình 2.3 Quá trình ngưng tập tiểu cầu gây ra bởi ADP 5 M

25

Hình 3.1 So sánh sự khác biệt giữa giá trị trung bình Slope của các
nhóm

30

Hình 3.2 So sánh sự khác biệt giữa giá trị trung bình MPA của các
nhóm

31

Hình 3.3 Đồ thị ngưng tập tiểu cầu của các nhóm

34


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ................................................................................ 3
1.1. Sinh lý học tiểu cầu ..................................................................................... 3
1.1.1. Cấu trúc tiểu cầu ..................................................................................... 3
1.1.2. Chức năng tiểu cầu ................................................................................. 7
1.1.2.1. Vai trị của tiểu cầu trong q trình cầm máu ban đầu .................... 7
1.1.2.2. Vai trò của tiểu cầu trong q trình đơng máu huyết tương .......... 10
1.2. Ngưng tập tiểu cầu in vitro hoạt hóa bởi ADP ....................................... 10
1.2.1. Thụ thể purinergic ................................................................................ 10
1.2.2. Quá trình ngưng tập tiểu cầu in vitro gây ra bởi ADP ......................... 12
1.2.2.1. Pha ngưng tập nguyên phát ............................................................ 12

1.2.2.2. Pha ngưng tập thứ phát .................................................................. 15
1.3. Các thuốc kháng ngưng tập tiểu cầu ...................................................... 16
1.3.1. Nhóm ức chế Cyclooxygenase 1 (COX-1) .......................................... 17
1.3.2. Nhóm ức chế thụ thể P2Y12 .................................................................. 18
1.3.3. Nhóm ức chế thụ thể của thrombin ...................................................... 18
1.3.4. Nhóm ức chế phức hợp GPIIb/IIIa ....................................................... 19
1.3.5. Nhóm ức chế phosphodiesterase .......................................................... 19
1.4. Tổng quan về cây Dong riềng đỏ Canna warszewiczii A. Dietr ............ 19
1.4.1. Đặc điểm thực vật, thực trạng phân bố và công dụng .......................... 19
1.4.2. Các nghiên cứu trước đây về Canna warszewiczii A. Dietr ................ 20
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 22
2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................... 22


2.1.1. Đối tượng .............................................................................................. 22
2.1.2. Thu thập mẫu máu ................................................................................ 23
2.1.3. Dụng cụ nghiên cứu.............................................................................. 23
2.2. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................... 24
2.2.1. Phương pháp pha các phân đoạn dịch chiết và hóa chất ...................... 24
2.2.2. Phương pháp thu thập và xử lý mẫu bệnh phẩm .................................. 24
2.2.3. Phương pháp phân tích ngưng tập tiểu cầu .......................................... 24
2.2.4. Phân tích và xử lý số liệu ..................................................................... 27
2.2.5. Đạo đức nghiên cứu.............................................................................. 28
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ....................................................... 29
3.1. Kết quả ....................................................................................................... 29
3.1.1. Tốc độ ngưng tập tiểu cầu (Slope) ....................................................... 29
3.1.2. Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa (MPA)......................................... 30
3.1.3. Mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) ....................................................... 31
3.1.4. Mức độ phân rã ngưng tập (Deaggregation – DEA) ............................ 33
3.1.5. Đồ thị ngưng tập tiểu cầu ..................................................................... 33

3.2. Bàn luận ..................................................................................................... 35
3.2.1. Thiết kế nghiên cứu .............................................................................. 35
3.2.2. Kết quả nghiên cứu............................................................................... 35
3.2.3. Hạn chế của nghiên cứu ....................................................................... 40
KẾT LUẬN ......................................................................................................... 41
KIẾN NGHỊ ........................................................................................................ 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 43


ĐẶT VẤN ĐỀ
Các bệnh lý về tim mạch hiện đang là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu
trên thế giới. Phần lớn trong số đó có liên quan đến các cơn đau tim và đột quỵ.
Đây là những triệu chứng cấp tính gây ra bởi sự tắc nghẽn lưu thơng máu đến tim
hoặc não bộ mà tác nhân chính là sự xuất hiện của huyết khối [32, 48]. Những
nghiên cứu về sinh lý học đã chứng minh vai trò quan trọng của tiểu cầu trong
hình thành cục máu đơng. Nằm trong chuỗi các biến đổi xảy ra kể từ khi tiểu cầu
được hoạt hóa, ngưng tập tiểu cầu, sự kết tập của các tiểu cầu tạo thành đám tiểu
cầu, được xem là tiền đề để hình thành huyết khối.
Để ngăn ngừa và điều trị các bệnh lý có liên quan đến huyết khối, nhiều
thuốc kháng tiểu cầu đã được nghiên cứu và ra đời. Bên cạnh những lợi ích mang
lại trong điều trị, các thuốc kháng tiểu cầu cũng gây ra nhiều tác dụng không mong
muốn như làm tăng nguy cơ chảy máu hay loét dạ dày. Do đó, xu hướng nghiên
cứu các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên đang ngày càng được quan tâm với mong
muốn phát triển các thuốc kháng tiểu cầu có tác dụng tốt hơn và quan trọng là gây
ít tác dụng khơng mong muốn hơn đối với người sử dụng.
Việt Nam là một nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa với thảm thực vật vô
cùng phong phú. Hơn nữa, kinh nghiệm sử dụng cây cỏ làm thuốc chữa bệnh của
người dân cũng rất dồi dào. Điều này giúp cho Việt Nam có một nguồn tài nguyên
cây thuốc quý giá. Theo kinh nghiệm dân gian của một số địa phương, cây Dong
riềng đỏ Canna warszewiczii A. Dietr đã được sử dụng để điều trị một số triệu

chứng trong bệnh lý tim mạch như đau thắt ngực, cơn đau tim [6, 35]. Theo đó,
một vài nghiên cứu đã được tiến hành để đánh giá tác dụng chống ngưng tập tiểu
cầu, chống đông máu của các phân đoạn dịch chiết của Canna warszewiczii A.
Dietr. Tổng hợp kết quả các nghiên cứu cho thấy các phân đoạn dịch chiết ethyl
acetate, dichloromethane, n-hexan đều có tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu gây
ra bởi các chất kích tập ADP, collagen, ristocetin [13, 31]. Do đó, đề tài “Khảo
sát cơ chế chống ngưng tập tiểu cầu với chất kích tập ADP của phân đoạn
dịch chiết cây Dong riềng đỏ Canna warszewiczii A. Dietr” được thực hiện với
mục tiêu:
1


Khảo sát cơ chế chống ngưng tập tiểu cầu của phân đoạn dịch chiết cây
Dong riềng đỏ Canna warszewiczii A. Dietr với chất kích tập ADP và chất ức chế
nhóm thụ thể P2 là PPADS.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1.

Sinh lý học tiểu cầu
Tiểu cầu là tế bào máu nhỏ nhất, hình đĩa, khơng có nhân, đường kính trung

bình 2 đến 5 m, dày 0,5 m [2, 20]. Số lượng tiểu cầu trong máu ngoại vi ở người
khỏe mạnh khoảng 150 – 400 x 109/L [5, 47]. Trong quá trình tạo máu, tiểu cầu
được tách ra từ mẫu tiểu cầu trong tủy xương, mỗi mẫu tiểu cầu có thể tạo ra 3000
tiểu cầu [5, 7]. Đời sống của tiểu cầu ngắn, trung bình khoảng 10 ngày, bị tiêu hủy
bởi đại thực bào ở gan và lách [2, 47].

1.1.1. Cấu trúc tiểu cầu
Cấu trúc tiểu cầu được chia thành 4 khu vực: khu ngoại vi, khu sol-gel, khu
bào quan và khu màng.

Hình 1.1. Cấu trúc tiểu cầu khi cắt theo mặt phẳng xích đạo [51]
 Khu ngoại vi

3


Khu ngoại vi gồm lớp áo ngoài glycocalyx, màng bào tương và vùng dưới
màng. Glycocalyx được cấu thành từ rất nhiều loại glycoprotein (GP). Các GP này
hoạt động như các receptor bề mặt, có vai trị vơ cùng quan trọng trong sự bám
dính, hoạt hóa và ngưng tập tiểu cầu [20, 51].
Bảng 1.1. Đặc điểm của một số GP chính [51]
Glycoprotein

Cấu trúc

Chất liên kết

GPIIb/IIIa

Integrin αIIbβ3

Fibrinogen, vWF,
fibronectin, vitronectin
và thrombospondin

GPIa/IIa

Integrin α2β1

Collagen

GPIb/IX/V

GPVI

Thụ thể nhiều đoạn acid vWF
amin giàu leucine lặp lại
Thụ thể thuộc siêu họ Collagen
globulin miễn dịch

Màng bào tương là màng lipid kép với thành phần chính là các phospholipid
như
phosphatidylethanolamine
(PE),
phosphatidylcholine
(PC),
phosphatidylserine (PS) cùng với một lượng đáng kể sphingolipid, sphingomyelin
và cholesterol. Các phospholipid này phân bố khơng đều. PC cấu trúc nên lớp
ngồi; ngược lại, PE và PS cấu trúc nên lớp trong của màng. Sự phân bố này được
kiểm soát bởi các enzyme phụ thuộc ATP là flipase và flopase [47].
Nằm ngay dưới màng bào tương, vùng dưới màng là nơi vùng nội bào của
các thụ thể xuyên màng tương tác với các protein phụ trách quá trình truyền tin
trong tiểu cầu. Vùng dưới màng cịn có một cấu trúc đặc biệt dính vào màng bào
tương giúp ổn định hình dạng bình thường của tiểu cầu, gọi là hệ khung màng
spectrin. Hệ thống này là một chuỗi polymer xoắn được tạo ra bởi từ các tiểu đơn
vị α và  của spectrin. Cấu trúc này tồn tại những vị trí gắn với các protein giúp

liên kết hệ thống màng spectrin với hệ thống các vi sợi, tạo nên một mạng lưới
liên tục [47].
4


 Khu sol – gel
Thành phần chính của khu sol – gel là hệ thống vi ống và hệ thống vi sợi.
Hai hệ thống này cùng với hệ thống màng spectrin cấu thành hệ khung nâng đỡ
tiểu cầu. Hệ thống vi ống nằm ngay dưới hệ thống màng spectrin, là tập hợp của
3 – 24 vi ống, bao quanh chu vi tiểu cầu, nằm trên mặt phẳng xích đạo của tiểu
cầu. Mỗi vi ống được tạo nên từ các chuỗi polymer của heterodimer tubulin, hình
thành những ống rỗng, cứng, đường kính mỗi ống khoảng 25 nm. Chức năng của
hệ thống vi ống là duy trì kích thước, hình dạng bình thường của tiểu cầu và tham
gia vào hiện tượng co rút khi tiểu cầu bị kích thích [5, 47].
Các vi sợi là các chuỗi polymer được hình thành từ các monomer actin (Gactin). Đây là những sợi mỏng, dẻo, có ái lực với ATP khác nhau ở mỗi đầu. 98%
đầu có ái lực cao với ATP gắn với các protein CapZ và adducin, trong khi phần
lớn đầu có ái lực thấp với ATP gắn với phức hợp Arp2/3. Trong khi CapZ ức chế
phản ứng trùng ngưng, Arp2/3 có thể kéo dài sợi acin và bảo vệ sợi khỏi sự khử
trùng ngưng (depolymerization). Hệ thống vi sợi được hình thành chủ yếu nhờ
filamin và α-actinin. Filamin là protein có hình dạng giống chữ V, đầu chụm vào
tương tác với phần nội bào của GPIb và các -integrin, hai đầu còn lại gắn với hai
sợi actin. α-actinin giữ các vi sợi gần nhau hơn [47]. Hệ thống vi sợi trong tế bào
chất, giữ các bào quan cách xa nhau và tham gia tạo chân giả của tiểu cầu [5, 20].
Khi bị kích thích, hệ thống vi sợi trong tế bào chất làm co hệ thống vi ống lại, đẩy
các hạt α và các hạt đặc vào trung tâm tiểu cầu. Các hạt này giải phóng các chất ra
bên ngồi qua hệ thống các kênh mở. Ngồi ra, khu sol – gel cịn bao gồm một
lượng lớn glycogen và một vài túi trơn hoặc được bọc clathrin [20].
 Khu bào quan
Khu bào quan chứa hệ thống các hạt đặc hiệu và các thành phần tế bào như
lysosome, ty thể, bộ máy Golgi… Các bào quan này thực hiện các q trình chuyển

hóa của tiểu cầu, dự trữ enzyme và một lượng lớn cơ chất cần thiết cho hoạt động
của tiểu cầu [51].

5


Hệ thống hạt đặc hiệu được chia thành 3 nhóm: hạt α, hạt đặc và túi
lysosome [7]. Có mặt ít nhất trong tiểu cầu là túi lysosome (< 3 hạt/tiểu cầu).
Thành phần trong túi lysosome là các enzyme phân giải protein (cathepsins,
elastase, collagenase, carboxypeptidase); enzyme phân giải carbohydrate
(glucosidase, galactosidase, mannosidase) và enzyme cắt cầu ester (acid
phosphatase).
Mỗi tiểu cầu có thể chứa 3 đến 8 hạt đặc với kích thước khoảng 150 nm.
Hạt đặc chứa một lượng lớn các nucleotide (ADP, ATP, UTP, GTP); cation (Ca++,
Mg++, K+); các amin (serotonin, histamine) và pyrophosphate. Các chất này tham
gia vào quá trình cầm máu và quá trình đáp ứng viêm.
Trong các loại hạt, hạt α có số lượng nhiều nhất với 50 đến 80 hạt/tiểu cầu,
kích thước lớn nhất từ 200 đến 500 nm và cũng đa dạng nhất về thành phần chứa
trong hạt. Thành phần của hạt α được trình bày ở Bảng 1.2.
Bảng 1.2. Thành phần của hạt α [20]
Nhóm chất

Thành phần

Protein kết hợp màng

αIIbβ3, GPIb/IX/V, GPVI, P-selectin

Chất tham gia quá trình
đơng máu

Yếu tố V, IX, XIII, antithrombin, protein
S, plasminogen, α2-macroglobulin

Protein dính

Fibrinogen, vWF, thrombospondin

Hóa chất

CXCL1, CXCL4, CXCL5, CXCL8, CCL2

Yếu tố tăng trưởng

Yếu tố tăng trưởng biểu bì, yếu tố tăng
trưởng tế bào gan

Chất ức chế

Angiostatin, endostatin

Chất điều hòa miễn dịch Complement C4 precursor, IgG
Protein vi sinh

Thymosin-β4, thrombocidins1 và 2

 Khu màng
6

Khu màng chứa hệ thống các ống dày đặc và hệ thống các kênh mở. Hệ
thống các ống dày đặc là khối vật chất khơng định hình, dày đặc điện tử, là nơi dự
trữ Ca++, tổng hợp prostaglandin và chứa nhiều enzyme cyclooxygenase tham gia
vào con đường chuyển hóa prostaglandin [5, 51]. Hệ thống các kênh mở là các
ống mở vào trong tiểu cầu như các không bào làm tăng diện tích bề mặt tiểu cầu.
Các hạt tiểu cầu giải phóng các chất cũng như các chất ngoại bào có thể thâm nhập
vào tổ chức bên trong tiểu cầu qua hệ thống kênh này (như sự hấp thu fibrinogen
vào hạt α) [5, 43, 47].
1.1.2. Chức năng tiểu cầu
Ở điều kiện sinh lý bình thường, tiểu cầu lưu hành trong máu ở trạng thái
nghỉ. Khi xuất hiện tổn thương ở thành mạch, tiểu cầu lập tức bị thu hút và trải
qua một loạt các sự kiện diễn biến liên tục. Nhìn chung, quá trình này gồm các
bước quan trọng là bám dính, hoạt hóa, chế tiết và ngưng tập.
1.1.2.1. Vai trị của tiểu cầu trong quá trình cầm máu ban đầu
 Giai đoạn bám dính ban đầu
Khi thành mạch bị tổn thương, lớp tế bào nội mô bị phã vỡ, một số protein
ở tổ chức dưới nội mô được bộc lộ và tương tác với tiểu cầu, bao gồm: yếu tố von
Willebrand (vWF), collagen, fibronectin, laminin và thrombospodin-1 [7, 40].
Trong đó, collagen và vWF có vai trị quan trọng nhất. vWF bám vào collagen,
dãn thẳng và bộc lộ nhiều vị trí liên kết (vùng A1) với phức hợp glycoprotein (GP)
Ib/IX/V trên màng tiểu cầu. Dưới tốc độ dòng máu cao, sự bám dính của tiểu cầu
phụ thuộc chủ yếu vào liên kết giữa GPIb và vWF. Liên kết này được hình thành
nhanh và chịu áp lực đẩy của dòng máu nhưng tồn tại khơng lâu. Tuy nhiên, nó lại
quan trọng do giúp tiểu cầu “lăn” gần về bề mặt bám dính, tạo điều kiện để
collagen liên kết với GPVI và tương tác này lại hoạt hóa GPIa/IIa gắn với collagen
[1, 32, 40].

7

Hình 1.2. Giai đoạn bám dính [40]
Sự phối hợp giữa những tín hiệu sinh ra bởi các tương tác vWF – GPIb,
collagen – GPVI, collagen – GPIa/IIa thúc đẩy một chuỗi các biến đổi phức tạp
bên trong tiểu cầu dẫn đến hoạt hóa phospholipase Cγ (PLCγ) và tạo ra inositol
(1,4,5) trisphosphate (IP3) từ sự thủy phân màng phospholipid. IP3 gắn với thụ thể
của nó trên hệ thống các ống dày đặc để huy động Ca++ từ kho dự trữ này. Nồng
độ Ca++ nội bào tăng kích hoạt một loạt các biến đổi quan trọng của tiểu cầu có ý
nghĩa trong giai đoạn ngưng tập sau đó như thay đổi hình dạng từ hình đĩa thành
hình cầu gai, hoạt hóa GPIIb/IIIa, giải phóng chất từ các hạt và tổng hợp TXA2.

8


GPIIb/IIIa được hoạt hóa, liên kết với vùng C1 của vWF đảm bảo tiểu cầu bám
dính chặt vào vị trí tổn thương của thành mạch [40].
 Giai đoạn ngưng tập tiểu cầu

Hình 1.3. Giai đoạn ngưng tập tiểu cầu [40]
Ngưng tập tiểu cầu (NTTC) là hiện tượng các tiểu cầu liên kết với nhau để
tạo thành nút tiểu cầu và là giai đoạn tiếp theo của quá trình cầm máu ban đầu.
Nồng độ Ca++ nội bào tăng cao, kích hoạt tiểu cầu biến đổi từ hình đĩa thành hình
cầu gai. Đây được cho tín hiệu đầu tiên của sự NTTC [44]. GPIIb/IIIa bộc lộ trên
bề mặt tiểu cầu và được hoạt hóa từ trạng thái có ái lực thấp thành trạng thái có ái
lực cao, liên kết được với các protein hòa tan trong huyết tương như vWF,
fibronectin, fibrinogen [32]. Đồng thời, sự giải phóng chất từ hệ thống các hạt đặc
hiệu thông qua hệ thống các kênh mở cũng diễn ra. Các chất chủ vận được giải
phóng hay hình thành trong q trình bám dính như ADP, thrombin, TXA 2 gắn
với thụ thể của chúng trên màng tiểu cầu, hoạt hóa tiểu cầu theo những cơ chế
9

khác nhau. Các tiểu cầu này cũng trải qua một loạt biến đổi như thay đổi hình
dạng, giải phóng chất từ các hạt và ngưng tập với nhau thông qua liên kết
GPIIb/IIIa – fibrinogen – GPIIb/IIIa, GPIIb/IIIa – vWF, GPIb – vWF. Cứ như vậy,
q trình hoạt hóa và ngưng tập diễn ra làm bền nút tiểu cầu và chuẩn bị cho giai
đoạn tạo cục máu đơng [40].
1.1.2.2. Vai trị của tiểu cầu trong q trình đơng máu huyết tương
Q trình đơng máu là một chuỗi phản ứng hoạt hóa các yếu tố đơng máu
hay cịn gọi là dịng thác đơng máu và kết quả cuối cùng là hình thành cục máu
đơng từ mạng lưới fibrin. Trong đó, có hai con đường khởi động q trình đơng
máu. Con đường đơng máu ngoại sinh xảy ra khi máu tiếp xúc với mô tổn thương,
trong khi con đường đông máu nội sinh xảy ra khi máu tiếp xúc với bề mặt lạ [2].
Tiểu cầu có vai trị quan trọng trong cả hai con đường này.
Màng tiểu cầu có chứa các phospholipid tích điện âm, phosphatidylserine
(PS) và phosphatidylethanolamin (PE). Các aminophospholipid này chỉ được bộ
lộ ra khi hoạt hóa tiểu cầu. Nhờ đó, các yếu tố đơng máu gắn có hồi phục với màng
tiểu cầu. Phức hợp TF-VIIa có thể hoạt hóa yếu tố IX và X một cách hiệu quả.
Yếu tố XII tự động hoạt hóa trên bề mặt tích điện âm, khởi động con đường đông
máu nội sinh theo nguyên lý khuếch tán diễn tiến cùng với prekallikrein và
kinninogen trọng lượng phân tử cao [7, 45]. Tiểu cầu hoạt hóa cịn giải phóng hàng
loạt chất tham gia q trình đơng máu như yếu tố V, IX, XIII, fibrinogen.
1.2.

Ngưng tập tiểu cầu in vitro hoạt hóa bởi ADP

ADP là phân tử trọng lượng thấp gây NTTC được biết đến đầu tiên. Tuy là
một chất chủ vận yếu, ADP đóng vai trị quan trọng trong chức năng tiểu cầu bởi
vì khi được tiết ra từ hạt đặc, nó khuếch đại đáp ứng của tiểu cầu với các chất chủ
vận khác [34]. Trong huyết tương giàu tiểu cầu đã chống đông bằng citrate, ADP
gây NTTC thông qua tương tác các thụ thể purinergic của nó.

1.2.1. Thụ thể purinergic

10


Khái niệm về thụ thể purinergic lần đầu được mô tả bởi Burnstock vào năm
1972 để chỉ những thụ thể của các nucleotide trên màng tế bào. Ban đầu, các thụ
thể purinergic được phân loại dựa trên ái lực của các chất chủ vận. Tuy nhiên, hệ
thống sắp xếp đã được thay đổi dựa trên không chỉ những thông tin dược lý mà
cịn cả những thơng tin hóa sinh [38]. Theo đó, các thụ thể được phân loại thành
hai nhóm lớn: P1, các thụ thể được hoạt hóa bởi adenosine và P2, các thụ thể được
hoạt hóa bởi purine và pyrimidine nucleotide (ATP, ADP, UTP và UDP) [41].
Nhóm P1 là các thụ thể bắt cặp protein G, bao gồm bốn thụ thể A1, A2A, A2B
và A3. Các thụ thể A1 và A3 bắt cặp với protein Gi/o, ức chế adenylyl cyclase (AC),
trong khi thụ thể A2A và A2B bắt cặp với protein Gs, hoạt hóa AC, dẫn đến sự tổng
hợp cAMP. Ngoài ra, thụ thể A2B cũng bắt cặp với protein Gq, chịu trách nhiệm
cho sự hoạt hóa phospholipase C và huy động Ca++ [29, 33].
Dựa vào cấu trúc phân tử, nhóm thụ thể P2 tiếp tục được chia thành hai phân
nhóm: P2X, các kênh ion hoạt hóa bởi phối tử và P2Y, các thụ thể bắt cặp với
protein G. Hầu hết các thụ thể P2Y đều có cơ chế truyền tín hiệu chung là hoạt
hóa phospholipase C (PLC) và/hoặc kiểm soát hoạt động của AC. Các thụ thể P2X
là các kênh ion điều hòa sự vận chuyển Na+, K+ và Ca++ dẫn đến sự khử cực tế bào
và hoạt hóa các enzyme nội bào [9].
Bốn thụ thể purinergic xuất hiện trên màng tiểu cầu là P2X1, P2Y1, P2Y12
và A2A. P2X1 được hoạt hóa bởi ATP, trong khi P2Y1 và P2Y12 là hai thụ thể của
ADP [33]. P2Y1 là thụ thể được tìm ra trước và mỗi tiểu cầu chỉ có khoảng 150
thụ thể này. P2Y1 là thụ thể bắt cặp với protein Gq. Hoạt hóa thụ thể này bởi ADP
dẫn đến kết quả là nồng độ Ca++ nội bào tăng cao. Do đó, P2Y1 điều khiển q
trình thay đổi hình dạng của tiểu cầu và khởi động quá trình ngưng tập [9, 17, 27].
P2Y12 là thụ thể có vai trò trung tâm trong ngưng tập tiểu cầu do ADP và là đích

tác dụng của nhiều thuốc kháng tiểu cầu. P2Y12 bắt cặp với protein Gi, khuếch đại
và ổn định ngưng tập thông qua tác dụng ức chế AC và tham gia q trình giải
phóng chất từ hạt. Sự phối hợp của hai thụ thể này là cần thiết để quá trình NTTC
do ADP diễn ra trọn vẹn [9, 27, 42].

11


 Chất ức chế thụ thể purinergic
Nhiều chất ức chế hay đối vận các thụ thể purinergic đã được phát hiện hoặc
tổng hợp trong quá trình nghiên cứu cơ chế của các thụ thể này cũng như quá trình
phát triển thuốc mới. Nhóm thụ thể của adenosine P1 bị ức chế không chọn lọc
bởi caffeine, trong khi các dẫn xuất của xanthine được tổng hợp và tối ưu để ức
chế đặc hiệu các thụ thể P1. Phần lớn các chất đối vận nhóm thụ thể P2X đều gắn
vào vị trí dị lập thể, khơng cạnh tranh vào vị trí gắn của ATP. Tác dụng của những
chất đối vận này đã và đang được đánh giá lâm sàng. Các chất ức chế thụ thể P2Y
đa dạng về cấu trúc, một số cạnh tranh vị trí gắn của các chất chủ vận, một số gắn
vào vị trí dị lập thể của thụ thể. Trong đó, thụ thể P2Y12 là đích tác dụng của nhiều
thuốc kháng tiểu cầu [33].
Một trong những chất ức chế nhóm thụ thể P2Y được sử dụng nhiều trong
nghiên cứu là pyridoxalphosphate-6-azophenyl-2′,4′-disulfonic acid (PPADS).
Ban đầu được mô tả là chất ức chế chọn lọc thụ thể P2X1, tuy nhiên PPADS đã
được chứng minh có tác dụng khơng đặc hiệu nhóm thụ thể P2. Nồng độ ức chế
tối đa 50% (IC50) của PPADS với thụ thể P2Y12 là 100 M. Ái lực của PPADS với
P2Y1 là KB = 4 – 12 M [30].
1.2.2. Quá trình ngưng tập tiểu cầu in vitro gây ra bởi ADP
Born là người đầu tiên chỉ ra ADP gây ngưng tập tiểu cầu in vitro vào năm
1962 [8]. Quá trình ngưng tập tiểu cầu gây ra bởi ADP gồm hai pha. Pha ngưng
tập nguyên phát, có hồi phục, nghĩa là tiểu cầu ngưng tập rồi sau đó giải ngưng
tập và pha ngưng tập thứ phát, khơng hồi phục, liên quan chặt chẽ đến phản ứng

giải phóng chất từ các hạt tiểu cầu [19].
1.2.2.1. Pha ngưng tập nguyên phát
P2Y1 chịu trách nhiệm chính cho sự xuất hiện của pha ngưng tập nguyên
phát do đáp ứng làm tăng nồng độ Ca++ nội bào của nó, dẫn đến sự thay đổi hình
dạng của tiểu cầu. Lý do tại sao tiểu cầu phải thay đổi hình dạng trước khi ngưng
tập có thể là do hình dạng mới làm giảm lực đẩy tĩnh điện giữa hai tiểu cầu. Nhìn

12


chung, quá trình thay đổi hình dạng của tiểu cầu được chia thành hai bước. Đầu
tiên, tiểu cầu từ hình đĩa trở thành hình cầu do các sợi actin bị phân mảnh, kéo
theo là sự phá hủy của hệ khung màng spectrin. Sau đó, màng tiểu cầu lồi lên, hình
thành các chân giả và phần mở rộng (lamellipodia) do sự tổng hợp của các sợi
actin mới. Mỗi bước của quá trình thay đổi hình dạng đều có sự tham gia của rất
nhiều protein gắn với actin [44].

Hình 1.4. Hiện tượng thay đổi hình dạng [47]
ADP gắn vào thụ thể P2Y1, phát ra tín hiệu hoạt hóa phospholipase C
(PLC), kéo theo sự tổng hợp phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) và
inositol (1,4,5) trisphosphate (IP3). IP3 gắn với thụ thể của nó trên hệ thống các
ống dày đặc và huy động Ca++ từ đây. Nồng độ Ca++ nội bào tăng cao hoạt hóa
gelsolin, cho phép protein này cắt và gắn luôn vào đầu các sợi actin vừa cắt. Cofilin
cũng được kích hoạt để giải phóng các G-actin đơn lẻ ra khỏi chuỗi polymer.
Những G-actin sau đó này gắn với β-thymosin hoặc profilin. Sự xuất hiện của PIP2
cắt đứt liên kết giữa hệ khung màng spectrin với màng bào tương. Đồng thời, hệ
thống vi ống bị mất cân bằng, các vi ống xoắn lại và chuyển động rộng. Điều này
làm cho tiểu cầu phồng lên thành hình cầu. Khi nồng độ Ca++ giảm xuống, các
13

protein gelsolin, CapZ, cofilin gắn với PIP2, cùng với hoạt động của Arp2/3 và
Formin đã tạo điều kiện để các sợi actin tiếp tục phản ứng trùng ngưng kéo dài
chuỗi. Chính sự tổng hợp này đã tạo ra lực đẩy để hình thành chân giả và phần mở
rộng. Các vi ống lúc này co lại vào trung tâm tiểu cầu, bị phân mảng và phân bố
rải rác. Cuối cùng, các protein gắn trở lại đầu các sợi actin và hình thành hình dạng
cuối cùng của tiểu cầu sau khi được hoạt hóa: hình cầu gai với những chân giả dài
vài micromet [44, 47].
Song song với quá trình thay đổi hình dạng, nồng độ Ca++ cao cũng hoạt
hóa phospholipase A2, khởi đầu một chuỗi phản ứng để cuối cùng hình thành
thromboxane A2 (TXA2), một chất kích tập, giúp khuếch đại và củng cố ngưng tập
gây ra bởi ADP. Sự phối hợp giữa P2Y1 và P2Y12 là cần thiết để giải phóng TXA2
[25]. Ca++ cũng hoạt hóa yếu tố trao đổi guanine điều hòa bởi canxi và DAG – 1
(CalDAG-GEFI) xúc tác chuyển Rap1-GDP thành Rap1-GTP. Quá trình biến đổi
ngược lại được xúc tác bởi RASA3 đã bị ức chế do phosphoinositide 3-kinase (PI
3-K) được hoạt hóa bởi tương tác P2Y12 – ADP. Điều này cho thấy sự phối hợp
giữa thụ thể P2Y1 và P2Y12 là rất quan trọng để ổn định sự ngưng tập giữa các tiểu
cầu [9].

Hình 1.5. Cơ chế hoạt hóa GPIIb/IIIa [9]

14


RAP1-GTP kích thích talin và kindlin 3 gắn vào miền nội bào của
GPIIb/IIIa, hoạt hóa thụ thể này từ trạng thái có ái lực thấp thành trạng thái có ái
lực cao và liên kết được với fibrinogen hòa tan trong huyết tương. Nhờ đó, tiểu
cầu ngưng tập với nhau thơng qua cầu fibrinogen, hình thành sự ngưng tập nguyên
phát. Tuy nhiên, sự ngưng tập nguyên phát có thể hồi phục nếu phản ứng giải
phóng chất từ các hạt khơng diễn ra do liên kết giữa các tiểu cầu không được củng

cố.
1.2.2.2. Pha ngưng tập thứ phát
Ngưng tập thứ phát xảy ra khi có phản ứng giải phóng các chất từ hạt. Phản
ứng này giúp bài tiết các thành phần chứa trong hạt α và hạt đặc giúp khuếch đại
quá trình ngưng tập và tạo điều kiện cho quá trình hình thành cục máu đơng. P2Y12
được chứng minh có vai trị trung tâm trong ngưng tập thứ phát. Điều này được
chứng minh ở sự vắng mặt của sóng ngưng tập thứ phát ở những bệnh nhân mắc
bệnh thiếu hụt P2Y12 [10, 22]. Một trong những tác động của thụ thể P2Y12 giúp
ổn định sự ngưng tập một cách gián tiếp là ức chế adenylyl cyclase (AC), dẫn đến
ngăn cản sự thoái hóa của ATP thành cAMP. cAMP làm giảm NTTC bằng cách
hoạt hóa protein kinase A (PKA), dẫn đến phosphoryl hóa và ức chế thụ thể của
IP3, do đó làm giảm huy động Ca++ nội bào [29]. Sự hoạt hóa PI 3-K ngồi tham
gia vào cơ chế hoạt hóa GPIIb/IIIa như đã trình bày ở trên, cịn dẫn đến sự
phosphoryl hóa serine-threonine protein kinase B/Akt (PKB/Akt). Con đường tín
hiệu này đóng vai trị quan trọng trong phản ứng giải phóng chất từ các hạt. Tuy
nhiên, cơ chế hoạt hóa các protein tham gia phản ứng giải phóng chưa được làm
rõ [9, 14].
Hịa màng là cơ chế chính của phản ứng giải phóng chất từ các hạt. Trong
q trình thay đổi hình dạng, các hạt được kéo vào trung tâm tiểu cầu do chuyển
động của hệ thống vi sợi. Các hạt này có thể hịa màng với nhau để tạo thành hạt
lớn hơn. Sau đó, các hạt này hịa màng với hệ thống các kênh mở hoặc màng bào
tương, giải phóng các chất ra môi trường ngoại bào. Các protein liên kết màng hạt
(v-SNARE) và màng bào tương (t-SNARE) có vai trị quan trọng trong quá trình

15


hòa màng và được điều hòa chặt chẽ bởi các protein Sec1/Munc, Rab [20]. Nhìn
chung, q trình giải phóng chất từ các hạt diễn ra theo ba bước chính: gắn màng
(docking), chuẩn bị (priming) và hòa màng. Rab27 trên màng hạt đặc (hoặc Rab4

trên màng hạt α) cùng với protein giống syntaptotagmin (SLPs) và Munc13-4 là
cần thiết cho sự gắn với màng bào tương. Sự hoạt hóa tiểu cầu dẫn đến sự thay đổi
hình dạng của syntaxin, vốn bị cơ lập bởi Munc18b ở trạng thái nghỉ. Sau đó, một
phức hợp liên kết các SNARE được hình thành trong đó có một v-SNARE
(VAMP) và hai t-SNARE (syntaxin và SNAP-23). Sự kết hợp chặt chẽ của các
SNARE cung cấp năng lượng cần thiết cho q trình hịa màng [16, 39].

Hình 1.6. Cơ chế hịa màng và giải phóng chất từ hạt tiểu cầu [16]
Hạt đặc giải phóng một lượng lớn ADP, ATP, serotonin và các cation. ATP
hoạt hóa kênh ion P2X1, làm tăng nồng độ Ca++, khuếch đại tín hiệu của thụ thể
P2Y1, đóng góp vào sự giải phóng TXA2 và bắt đầu quá trình ngưng tập gây ra bởi
TXA2 [23]. Serotonin làm tăng trương lực mạch máu trong khi Ca++ và
polyphosphate giúp hình thành cục máu đơng. Hạt α giải phóng fibrinogen và
vWF, thúc đẩy hình thành liên kết giữa các tiểu cầu [16, 20]. Nhờ đó, pha ngưng
tập thứ phát là khơng hồi phục và q trình NTTC in vitro do ADP diễn ra trọn
vẹn.
1.3.

Các thuốc kháng ngưng tập tiểu cầu
16