Luận văn nghiên cứu tạo chế phẩm Lactobacillus acidophilus - Chương 3

Chương 3: Kết quả và bàn luận

Luận văn tốt nghiệp

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ
VÀ BÀN LUẬN

‐ 42 ‐ 
 


Chương 3: Kết quả và bàn luận

3.1.

Luận văn tốt nghiệp

Đặc điểm hình thái của Lactobacillus acidophilus
3.1.1. Hình dạng khuẩn lạc

Hình 3.1: Hình dạng khuẩn lạc của L.acidophilus
Sau khi phân lập và chọn giống thuần trên môi trường MRS – agar,
L.acidophilus có khuẩn lạc màu trắng đục, tròn, nhô cao, đường kính khuẩn lạc 0,9
– 1,2 mm, rìa khuẩn lạc trơn và bề mặt khuẩn lạc khô.
3.1.2. Hình dạng tế bào

Hình 3.2: Hình dạng tế bào L.acidophilus dưới kính hiển vi điện tử
Tiến hành nhuộm gram rồi quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại 100X.
Kết quả nhuộm gram cho thấy chủng phân lập giữ được phức chất giữa violet

crystal và lugol nên có màu tím. Vì vậy, L.acidophilus là vi khuẩn gram dương,
hình que, đứng riêng lẻ hay tập trung thành sợi ngắn.

‐ 43 ‐ 
 


Chương 3: Kết quả và bàn luận

3.2.

Luận văn tốt nghiệp

Các đặc tính sinh lý và sinh hoá của L.acidophilus
3.2.1. Khả năng sinh acid

Hình 3.3: Khả năng sinh acid làm phân giải CaCO3
Sau 48 giờ nuôi trên môi trường CaCO3 – agar, kết quả cho thấy
L.acidophilus có khả năng làm phân giải CaCO3 và tạo thành vòng tan trong suốt
xung quanh khẩn lạc trên nền trắng đục của CaCO3. Như vậy, trong quá trình sinh
trưởng và phát triển, vi khuẩn L.acidophilus đã sử dụng glucose trong môi trường
carbonate – agar và sinh ra acid lactic.

‐ 44 ‐ 
 


Chương 3: Kết quả và bàn luận

Luận văn tốt nghiệp

3.2.2. Khả năng sinh acid lactic

Hình 3.4: Phản ứng với thuốc thử Uphenmen
Ống nghiệm số 4 chứa dung dịch nuôi vi khuẩn sau 15 giờ làm đổi màu
thuốc thử Uphenmen từ màu xanh tím sang vàng rơm là do trong quá trình sinh
trưởng và phát triển vi khuẩn L.acidophilus sinh acid lactic, phù hợp với ống
nghiệm số 3 chứa acid lactic cũng làm đổi màu thuốc thử Uphenmen. Hai ống
nghiệm số 1 và số 2 chứa nước cất và môi trường huyết thanh sữa, không chứa acid
lactic nên không làm đổi màu thuốc thử Uphenmen. Như vậy, kết quả thí nghiệm
trên cho thấy vi khuẩn L.acidophilus có khả năng sinh acid lactic.

‐ 45 ‐ 
 


Chương 3: Kết quả và bàn luận

Luận văn tốt nghiệp

3.2.3. Khả năng lên men các nguồn carbonhydrate

Hình 3.5: Khả năng lên men các nguồn carbonhydrate của L.acidophilus
ĐC: mẫu đối chứng.
Glu: glucose; Fruc: fructose; Lac: lactose; Sac: saccharose; Mal: maltose;
Man: mannose; Sor: sorbitol; Dex: dextrose; Gly: glycerol.
Kết quả thí nghiệm cho thấy các ống nghiệm chứa glucose, fructose, lactose,
saccharose và maltose làm chất chỉ thị phenol red chuyển từ màu đỏ sang màu
vàng. Điều đó chứng tỏ chủng L.acidophilus đã sử dụng các nguồn đường trong môi
trường nuôi cấy để sinh acid lactic làm môi trường giảm pH dẫn đến sự đổi màu

của chất chỉ thị phenol red. Các ống nghiệm còn lại chứa các loại đường mannose,
sorbitol, dextrose và glycerol không bị đổi màu là do chủng L.acidophilus không sử
dụng được các nguồn đường này nên pH không thay đổi để làm đổi màu chất chỉ
thị pH môi trường là phenol red.
Kết quả thí nghiệm đạt được giống với kết quả nghiên cứu của Adrian
Vamanu và cộng sự (2005) về khả năng sử dụng các nguồn carbonhydrate của
Lactobacillus sp. Như vậy, L.acidophilus có thể sử dụng được các nguồn đường sau:
glucose, fructose, lactose, saccharose vaø maltose.

‐ 46 ‐ 
 


Chương 3: Kết quả và bàn luận

Luận văn tốt nghiệp

3.2.4. Quan hệ với oxy

Hình 3.6: Quan hệ với oxy của L.acidophilus
Sau 48 giờ nuôi cấy, khuẩn lạc của L.acidophilus xuất hiện dọc theo vết cấy
từ đáy ống nghiệm lên trên bề mặt thạch. Như vậy L.acidophilus là vi khuẩn kỵ khí
tuỳ tiện.

‐ 47 ‐ 
 


Chương 3: Kết quả và bàn luận

Luận văn tốt nghiệp

3.2.5. Khả năng tăng trưởng của L.acidophilus trên các pH khác nhau
Hầu hết vi khuẩn có pH tối ưu cho quá trình sinh trưởng và phát triển là ở pH
trung tính. Sự tăng hoặc giảm pH (chính là sự tăng hoặc giảm ion H+) của môi
trường nuôi cấy sẽ ảnh hưởng đến sự sống sót của vi sinh vật nói chung. Khảo sát
sự tăng trưởng của Lactobacillus acidophilus trong môi trường huyết thanh sữa ở
các pH khác nhau từ pH 3,5 đến pH 8,0. Kết quả như sau:

7.2

log(cfu/ml)

7
6.8
6.6
6.4
6.2
6
3.5

4

5

6

7

8

pH

Hình 3.7 : Khả năng tăng trưởng của L.acidophilus ở các giá trị pH
khác nhau của môi trường nuôi cấy
Dựa vào hình 3.7 ta thấy vi khuẩn L.acidophilus có khả năng tăng trưởng tốt
trong khoảng pH môi trường nuôi cấy là từ pH 5,0 đến pH 7,0. Và pH tối thích cho
giống vi khuẩn này trong môi trường huyết thanh sữa là 6,6.

‐ 48 ‐ 
 


Chương 3: Kết quả và bàn luận

Luận văn tốt nghiệp

3.2.6. Khả năng tăng trưởng của L.acidophilus ở các nhiệt độ khác nhau
Tốc độ các phản ứng sinh hoá xảy ra trong tế bào phụ thuộc vào hoạt tính
của các enzyme trong tế bào vi sinh vật. Trong một số trường hợp, nhiệt độ tăng
trưởng tối ưu cho một số vi sinh vật cũng chính là nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính của
các enzyme tham gia vào các phản ứng sinh hoá xảy ra trong tế bào vi sinh vật. Ở
nhiệt độ thấp có thể ức chế hoạt tính của các enzyme này. Ngược lại, ở nhiệt độ
cao các enzyme này có thể bị biến tính không thuận nghịch. Vì vậy nhiệt độ cao
hay thấp cũng ảnh hưởng tới sự phát triển của vi sinh vật. Khảo sát sự tăng trưởng
của L.acidophilus trong môi trường huyết thanh sữa ở các giá trị nhiệt độ khác
nhau, ta được kết quả như sau:

7.4
7.2

log(cfu/ml)

7
6.8
6.6
6.4
6.2
6
20

30

37

40

50

toC

Hình 3.8: Khả năng tăng trưởng của L.acidophilus trên môi trường nuôi cấy
ở các giá trị nhiệt độ khác nhau
Dựa vào hình 4.8 ta thấy khoảng nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của
L.acidophilus là từ 30oC đến 40oC. Và nhiệt độ tối thích cho vi khuẩn này phát triển
trong môi trường huyết thanh sữa là 37oC.

‐ 49 ‐ 
 

Chương 3: Kết quả và bàn luận

3.3.

Luận văn tốt nghiệp

Xây dựng đường cong sinh trưởng của Lactobacillus acidophilus
trong môi trường huyết thanh sữa

Hình 3.9: Đường cong sinh trưởng của L.acidophilus
trong môi trường huyết thanh sữa
Dựa vào kết quả đường cong tăng trưởng của L.acidophilus ở hình 4.1 ta
thấy: trong môi trường huyết thanh sữa, vi khuẩn L.acidophilus có pha lag kéo dài
khoảng 4 – 6 giờ với µ = 0,219, pha log kéo dài khoảng 8 – 10 giờ với µ = 1,03, pha
ổn định bắt đầu từ giờ thứ 14 – 16. Như vậy dựa vào đường cong tăng trưởng ta có
thể thu sinh khối bắt đầu từ giờ thứ 15.

‐ 50 ‐ 
 


Chương 3: Kết quả và bàn luận

Luận văn tốt nghiệp

y = 3.76x + 2.43

log(cfu/ml)

8.25

R2 = 0.986

7.75

7.25

6.75
1.2

1.25

1.3

1.35

1.4

1.45

OD570nm

1.5

1.55

1.6

Hình 3.10: Mối tương quan tuyến tính giữa mật độ tế bào và độ đục

‐ 51 ‐ 
 

1.65


Chương 3: Kết quả và bàn luận

3.4.

Luận văn tốt nghiệp

Tối ưu hoá môi trường nuôi cấy L.acidophilus
3.4.1. Xác định ảnh hưởng của các nhân tố sinh trưởng đến sự phát triển
của Lactobacillus acidophilus

Huyết thanh sữa là một môi trường lý tưởng để nhân giống vi khuẩn lactic. Tuy
nhiên tỷ lệ về hàm lượng các chất dinh dưỡng kém cân đối hơn so với sữa tươi. Đặc
biệt là hàm lượng phosphate trong huyết thanh sữa khá thấp, từ đó tính đệm của
môi trường sẽ bị giảm. Hơn nữa, hàm lượng môt số nguyên tố đa lượng và vi lượng
khác trong huyết thanh sữa thấp hơn so với sữa tươi. Để khắc phục nhược điểm này,
ta bổ sung thêm peptone, yeast extract và K2HPO4 vào huyết thanh sữa. Khảo sát
sự ảnh hưởng của các nhân tố sinh trưởng đến sự phát triển của Lactobacillus
acidophilus với hàm lượng các nhân tố sinh trưởng khác nhau, ta thu được kết quả
như sau:

8.5

log(cfu/ml)

8
7.5
7
6.5
0

0.6

0.8

1

1.2

Hàm lượng peptone (%)

Hình 3.11: Ảnh hưởng của hàm lượng peptone
đến sự tăng trưởng của L.acidophilus

‐ 52 ‐ 
 

1.4


Chương 3: Kết quả và bàn luận

Luận văn tốt nghiệp

9

log(cfu/ml)

8
7
6
5
4
0.1

0.3

0.5

0.7

0.9

1.1

Hàm lượng yeast extract (%)
Hình 3.12: Ảnh hưởng của hàm lượng yeast extract
đến sự tăng trưởng của L.acidophilus

8.5

log(cfu/ml)

8

7.5
7
6.5
6
0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

Hàm lượng K2HPO4 (% )
Hình 3.13: Ảnh hưởng của hàm lượng K2HPO4
đến sự tăng trưởng của L.acidophilus

‐ 53 ‐ 
 

0.35


Chương 3: Kết quả và bàn luận

Luận văn tốt nghiệp

Dựa vào hình 4.11, 4.12, 4.13 ta thấy hàm lượng peptone, yeast extract, K2HPO4
bổ sung vào môi trường huyết thanh sữa khoảng 0,62%, 0,9%, 0,32% so với thể tích

mơi trường là thích hợp để thu sinh khối vi khuẩn.
3.4.2. Tối ưu hoá thành phần môi trường huyết thanh sữa nuôi cấy
L.acidophilus bằng phương pháp thực nghiệm
Xác định điều kiện tối ưu để thu được sinh khối vi khuẩn L.acidophilus cực đại,
ta tiến hành tối ưu hoá môi trường theo phương pháp thực nghiệm, cách tiến hành
như sau:
-

Xét k = 3 nhân tố ảnh hưởng đến sự phát triển của L.acidophilus (hàm lượng

-

peptone, hàm lượng yeast extract, hàm lượng K2HPO4).
Ta tiến hành thí nghiệm ở n = 2 mức giá trị của các nhân tố.

-

Vậy số thí nghiệm cần thực hiện là:
(thí nghiệm)

-

Hàm mục tiêu Y là sinh khối vi khuẩn Lactobacillus acidophilus (cfu/ml).
Bảng 3.1: Mức biến thiên của các nhân tố sinh trưởng
Các mức

Các nhân tố sinh trưởng

Mức cơ sở

0,62

0,90

0,32

Khoảng biến thiên

0,18

0,20

0,04

Mức trên

0,80

1,10

0,36

Mức dưới

0,44

0,70

0,28

Trong đó:
: hàm lượng peptone bổ sung vào môi trường huyết thanh sữa (% so với
môi trường).
: hàm lượng yeast extraxt bổ sung vào môi trường huyết thanh sữa (% so
với môi trường).
: hàm lượng K2HPO4 bổ sung vào môi trường huyết thanh sữa (% so với
môi trường).
‐ 54 ‐ 
 


Chương 3: Kết quả và bàn luận

Luận văn tốt nghiệp

Bảng 3.2: Bố trí và kết quả thí nghiệm
Y1 106 Y2 106 Y3 106

106

STT

Z1

1

0,8

1,10 0,36 12,972

11,246

12,218

12,145

2

0,8

1,10 0,28 78,524

62,806

46,105

62,478

3

0,8

0,70 0,36

5,358

5,012

5,572

5,314

4

0,8

0,70 0,28

6,109

9,183

8,035

7,776

5

0,44 1,10 0,36 34,674

38,019

40,926

37,873

6

0,44 1,10 0,28 324,34

97,724 114,815 178,96

7

0,44 0,70 0,36 19,011

22,803

14,355

18,723

8

0,44 0,70 0,28 31,477

38,905

36,308

35,563

Z2

Z3

Bảng 3.3: Chuyển sang hệ trục toạ độ không thứ nguyên
STT x0 x1 x2 x3

106

1

+

+

+

+

12,145

2

+

+

+

-

62,478

3

+

+

-

+

5,314

4

+

+

-

-

7,776

5

+

-

+

+

37,873

6

+

-

+

-

178,96

7

+

-

-

+

18,723

8

+

-

-

-

35,563

‐ 55 ‐ 
 


Chương 3: Kết quả và bàn luận

Luận văn tốt nghiệp

Bảng 3.4: Hệ số của phương trình hồi quy
b0

b1

b2

b3

44,854 -22,926 28,01 -26,34
-

Ta có phương trình hồi quy tổng quát như sau:

Bảng 3.5: Thí nghiệm tại tâm phương án

STT
1

124,165

2

128,233

3

-

Yo 106

Ytb 106

107,647

1012

(Yo – Ytb)2 1012
17,223
67,536

120,015

118,863

10,902

152,967

Kiểm tra sự có nghóa của phương trình hồi quy theo tiêu chuẩn Student:
STT
0

44,854

11,635

1

-22,926

5,947

2

28,01

3

-26,34

3,855

7,266
6,833

Tra bảng tp(f) với p = 0,05; bậc tự do df = N(k – 1) = 8(3-1) = 16.
Ta có t(0,05;16) = 2,12.
Các hệ số trong phương trình hồi quy có nghóa khí tj > tp(f).
Như vậy, tất cả các hệ số của phương trình hồi quy đều có nghóa.
Ta có phương trình hồi quy như sau:
‐ 56 ‐ 
 

Sth 106


Chương 3: Kết quả và bàn luận

Luận văn tốt nghiệp

‐ 57 ‐ 
 


Chương 3: Kết quả và bàn luận

-

Luận văn tốt nghiệp

Kiểm tra sự tương thích của phương trình so với thực teá:
STT Y 106 Y* 106 (Y – Y*)2 1012
1

12,145

23,598

62,478

76,278

109,642

3

5,314

-32,422

1423,93

4

7,776

20,258

155,95

5

37,873

69,45

997,107

6

178,96

122,13

3229,649

7

18,723

13,43

27,984

8

35,563

66,11

F

131,125

2

106

951,106

1756,623 14,779

Tra bảng F0,95(4,2) = 19,3.
Ta thấy F = 14,779 < F0,95(4,2) = 19,3 nên phương trình hồi quy trên tương thích
với thực tế.
3.4.3. Tối ưu hoá thành phần môi trường huyết thanh sữa nuôi cấy
L.acidophilus theo phương pháp đường dốc nhất
Bảng 3.6: Các giá trị hệ số của phương trình hồi quy và mức biến thiên

STT
1

bj

j

-22,926 0,18 4,127

2

28,01

0,20 5,602

3

-26.34

0,04 1,054

Chọn bước nhaûy

‐ 58 ‐ 
 


Chương 3: Kết quả và bàn luận

Luận văn tốt nghiệp

Xác định các bước nhảy còn lại:

Quá trìn tối ưu hoá được bắt đầu bằng thí nghiệm mà tại đó giá trị các biến số
được ấn định là mức cơ sở, còn các toạ độ tiếp theo được xác định theo công thức:
(với j = 1, 2, 3).
Bảng 3.7: Kết quả thí nghiệm tối ưu hoá môi trường theo phương pháp leo doác
Y1 106

Y2 106

Y3 106

106

STT

Z1

Z2

Z3

1

0,62

0,90

0,32

2

0,745 0,107 0,352 334,195 374,973 762,079 490,416

3

0,87

1,24

0,384 587,789 639,735 554,626

4

0,995

1,41

0,416 309,742 399,025 353,997 354,255

5

1,12

1,58

0,448 283,792 215,278 254,097 251,056

6

1,245

1,75

0,48

103,753

129,42

111,173 114,782

7

1,37

1,92

0,512

51,523

25,942

29,512

35,659

8

1,495

2,09

0,544

15,631

20,323

26,062

20,672

206,538 304,789 317,687 276,338

‐ 59 ‐ 
 

593,95


Chương 3: Kết quả và bàn luận

Luận văn tốt nghiệp

y
600
500
400
300
200
100
0
TN1

TN2

TN3

TN4

TN5

TN6

TN7

TN8

Hình 3.14: Kết quả thí nghiệm tối ưu hoá môi trường theo phương pháp leo dốc
Như vậy, để thu được sinh khối vi khuẩn cực đại ta chọn thành phần môi trường
huyết thanh sữa theo tỷ lệ như sau:
Peptone: 0,87% so với môi trường.
Yeast extract: 1,24% so với môi trường.
K2HPO4: 0,384% so với môi trường.

‐ 60 ‐ 
 


Chương 3: Kết quả và bàn luận

Luận văn tốt nghiệp

4.5. Đánh giá hiệu quả của phương pháp sấy phun
10

log(cfu/ml)

9.6
9.2

Tr ước sấy phun
Sau sấy phun

8.8
8.4
8
Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 4 Mẫu 5 Mẫu 6

Hình 3.15: Mật độ tế bào vi khuẩn trước và sau khi sấy phun
Sau khi tieán hành sấy phun chúng tôi thu được kết quả như sau:
Tỷ lệ tế bào sống sót sau khi sấy phun của các mẫu thí nghiệm với công thức
các chất vi bao khác nhau lần lượt là 10,05%; 13,41%, 34,33%; 40,72%, 63,45%,
54,14%. Như vậy với công thức sấy phun ở mẫu số 5 cho tỷ lệ tế bào L.acidophilus
sống sót là cao nhất. Điều đó chứng tỏ phương pháp tạo probiotic bằng sấy phun
với công thức ở mẫu số 5 là tối ưu. Qua đó chúng tôi nhận thấy rằng, hàm lượng
sữa gầy là 20% thì vi bao tốt hơn so với hàm lượng sữa gầy 15%. Ngoài ra, muối
cũng có tác dụng giúp tế bào chống chịu được với nhiệt độ nên làm tăng tỷ lệ sống
sót. Tuy nhiên nếu lượng muối quá cao sẽ ức chế vi sinh vật làm giảm tỷ lệ sống
sót của tế bào.
Ngoài ra, độ ẩm của mẫu sấy phun cũng có ý nghóa rất quan trọng. Nếu độ ẩm
quá thấp thì tỷ lệ sống sót của vi sinh vật sẽ giảm nhanh. Theo Ananta.E (2004) thì
độ ẩm trong mẫu sấy phun tối thiểu là 7% để đảm bảo ít ảnh hưởng tới tỷ lệ sống
sót của vi khuẩn trong chế phẩm. Như vậy mẫu sấy phun có độ ẩm > 6% là đạt yêu
cầu.

‐ 61 ‐ 
 


Chương 3: Kết quả và bàn luận

Luận văn tốt nghiệp

‐ 62 ‐