SEMINAR xác định vitamin c sử dụng HPLC cùng với phát hiện điện hóa (dược PHÂN TÍCH SLIDE)

Xác định Vitamin C sử dụng HPLC cùng với phát hiện điện
hóa


NỘI DUNG

I.

GIỚI THIỆU

II.

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
IV.

KẾT LUẬN


I. Giới thiệu
1.1 Chức năng sinh học vitamin C (acid ascorbic) :



Chống oxy hóa



Tổng hợp collagen



Miễn dịch



Thần kinh



Thải độc



Khử Fe



Tim mạch

3+

 thành Fe

2+

 ở dạ dày,dễ hấp thụ ở ruột


 1.2 Hàm lượng vitamin C có trong thực phẩm





Nguồn thực vật: trái cây và rau quả: rau ngót, cam quýt, dâu tây, ớt, cà chua...
Nguồn động vật: gan và thận có hàm lượng cao nhất
Nhu cầu bình qn trong một ngày từ 100- 120 mg

 1.3 Một số phương pháp xác định vitamin C




Nhiều kỹ thuật phân tích: cảm biến và cảm biến sinh học
Phát hiện bằng đầu dò điện hóa: amperometric hoặc coulometric kết hợp với sắc ký lỏng hiệu năng cao
Mục đích sử dụng hai máy dị điện hóa (amperometric - Coulochem III và coulometric - CoulArray) kết
hợp phân tích phun dịng chảy để phát hiện acid ascorbic.


II. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.1 Hóa chất, nguyên liệu và cách đo pH





Loại HPCL acetonitrile từ Merck (Darmstadt, Đức)
Các hóa chất khác được sử dụng từ Sigma-Aldrich (St. Louis, Mỹ)
Dung dịch AA chuẩn (100mM) được lưu trữ tránh ánh sáng ở

-20 ° C




Dithiothreitol (DTT) để tránh quá trình oxy hóa khử và q trình axit hóa
Giá trị pH được đo bằng WTW inoLab (Weilheim, Đức), điều khiển bởi phần mềm Multilab Pilot.


2.2 Hệ thống HPLC kết hợp với đầu dò điện hóa CoulArray hoặc CoulochemIII

 CoulArray: bao gồm hai máy bơm dung môi hoạt động trong tốc độ 0,001-9,999 mL/ phút(Model

ESA

Inc., Chelmsford, MA, USA), một cuộn dây phản ứng 1 m, cột đảo ngược và một đầu dị điện hóa
CoulArray (Model 5600A, ESA, USA).

 Coulochem: bao gồm một máy bơm cung cấp dung môi hoạt động trong tốc độ 0,001-9,999 mL/
phút(Model 583 ESA Inc, Chelmsford, MA, USA), một tế bào (quang điện ) bảo vệ , một cuộn dây phản
ứng 1 m và đầu dị điện hóa (Model 5040, ESA, USA).



2.3 Chuẩn bị mẫu thực:

 Chuẩn bị dược phẩm (viên) - Celaskon → nghiền (5 mẫu)
 Cam và táo được bán tại các cửa hàng Tesco → bỏ vỏ → nghiền bằng cối (5 mẫu)
 Chuyển vào bình định mức và pha loãng với nước ACS. Các phép đo của các mẫu được thực hiện ngay
lập tức sau khi chuẩn bị.



Các mẫu huyết thanh máu người thu được từ Sở lâm sàng Hóa sinh, (n = 10),huyết thanh người đã được
đơng lạnh ở -20 ° C ngay sau khi thu thập



Các mẫu được pha loãng 100 lần với nước ACS và lọc qua màng lọc Teflon 0,45 m trước khi đo


2.4 Độ đúng, độ chính xác và độ thu hồi:

 Tính đúng

AA được đánh giá với dung dịch đồng chất, trước khi đánh giá AA chuẩn (100 ml) và nước (100
ml) đã được thêm vào dung dịch đồng chất của mẫu thật



Độ đúng được đánh giá bằng cách so sánh với nồng độ lí thuyết

2.5 Xử lí số liệu:

 Dữ liệu được xử lý bằng Microsoft Excel .
 Các giới hạn phát hiện được tính tốn theo Long và Winefordner (Long, G.L.; Winefordner, J.D. Limit of
Detection. Anal. Chem. 1983, 55, A712-A724)


III. Kết quả và thảo luận

 3.1 Phân tích sự phun dịng chảy kết hợp với đầu dị điện hóa CoulArray để xác định
acid ascorbic


FIA coupled with CoulArray electrochemical detector




Thông số thực nghiệm: 100mV, 25°C, pha động 0.09% TFA: ACN : 3:97 (v/v), tốc độ dòng chảy: 0.13
mL/phút

 Đường cong tiêu chuẩn y= 0.3788x- 0.1461;  R2 = 0.9985
 Giới hạn dị tìm :100fmol/5 µM dung dịch tiêm vào
 Đối với xác định AA trong huyết thanh người: Đường cong
dị tìm 20pmol/5µL

2
y = 0.2897x + 0.6118; R  = 0.9942; giới hạn


3.2 Phân tích sự phun dịng chảy kết hợp với đầu dị điện hóa Coulochem III để
xác định acid ascorbic


 Coulochem chứa một thiết bị gọi là ‘tế bào bảo vệ’, mà có thể oxy hóa các tạp chất trong giai đoạn động.
 Coulochem III có phần khơng hiệu quả bởi vì chỉ có một phần chất được phân tích (thường là 5-10%)
 Coularray nhạy cảm hơn Coulochem III 10-20 lần
 Các tiếp tuyến của đường chuẩn là 0,3788 với phương pháp Coulochem và 0,0136 cho Coularray. Các
tiếp tuyến của đường chuẩn đo bởi máy dò Coularray cao hơn gần 30 lần các tiếp tuyến đo bằng máy dò

Coulochem


3.3 HPLC với đầu dị Coularray phát hiện AA:

 Thơng số của máy như sau: cột sắc kí - MetaChem Polaris C18A (150 × 2.0 mm, kích thước hạt 3 µm)
pha động - acetonitrile và 0,09% axit trifluoroacetic trong tỷ lệ 3:97; nhiệt độ đầu dò : 25 ° C; tốc độ
dòng chảy của pha động : 0,13 ml/phút ; điện thế phù hợp :150 mV; 5 mẫu µl được tiêm

 Thời gian lưu của AA là 5,4 phút. (Hình 5A).
 Phương trình của đường chuẩn đo trong khoảng 0,5-20 mM của AA là y = 24.921x + 12,043 với R 2 
 = 0,9967 (hình B)

 Phạm vi nồng độ thấp hơn từ 10 đến 90µM. Phương trình đường chuẩn thu được là y = 0.0307x 0,1417; R2 = 0,9905 (Hình C).

 Sử dụng HPLC-ED có thể phát hiện nồng độ ở mức độ nano của AA (LOD: 90 nM).



3.4 Phân tích các mẫu thực

 Điều kiện thực nghiệm tối ưu hóa: sử dụng HPLC kết hợp với đầu dị điện hóa CoulArray
 nồng độ của acid ascorbic là 98 ± 2 mg/ 1viên Celaskon. Lượng AA trên bao bì là 100 mg/viên
 Lượng AA trong cam tươi (Citrus aurantium):30-56 mg/100g, táo tươi (Malus sp.): 11-19 mg / 100 g và
trong huyết thanh người (38-78 µM).




IV. Kết luận:

HPLC kết hợp với một đầu dò điện hóa tám kênh là một cơng cụ phân
tích rất phù hợp để xác định axit ascorbic. Phương pháp được sử dụng để xác định
axit ascorbic trong các chế phẩm dược, trái cây và mẫu huyết thanh người.


Tài liệu tham khảo
1. Velisek, J.; Cejpek, K. Biosynthesis of food constituents: Vitamins. 2. Water-soluble vitamins: part 1 - a review. Czech. J. Food
Sci. 2007, 25, 49-64.
2. Linster, C.L.; Van Schaftingen, E. Vitamin C - Biosynthesis, recycling and degradation in mammals. Febs J. 2007, 274, 1-22.
3. Davey, M.W.; Van Montagu, M.; Inze, D.; Sanmartin, M.; Kanellis, A.; Smirnoff, N.; Benzie, I.J.J.; Strain, J.J.; Favell, D.; Fletcher,
J. Plant L-ascorbic acid: chemistry, function, metabolism, bioavailability and effects of processing. J. Sci. Food Agric. 2000, 80, 825860.
4. Noctor, G.; Foyer, C.H. Ascorbate and glutathione: Keeping active oxygen under control. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec.
Biol. 1998, 49, 249-279.
5. Long, G.L.; Winefordner, J.D. Limit of Detection. Anal. Chem. 1983, 55, A712-A724