BÁO cáo (dược PHÂN TÍCH) xác định chất bảo quản natri benzoat bằng phương pháp HPLC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CHĂN NUÔI – THÚ Y
--------------------------------------------

XÁC ĐỊNH CHẤT BẢO QUẢN NATRI BENZOAT BẰNG
PHƯƠNG PHÁP HPLC
GVHD:
DANH SÁCH NHÓM:


I . Đặt vấn đề:
Vấn đề các chất phụ gia trong thực phẩm là mối quan tâm của rất nhiều người
trong chúng ta. Nhất là khi thực phẩm được đưa vào sản xuất ở quy mơ cơng nghiệp
thì con người mới thấy được tầm quan trọng của phụ gia, với mục đích đáp ứng nhu
cầu cơng nghệ trong q trình sản xuất, vận chuyển, đóng gói, bảo quản, tăng giá trị
dinh dưỡng của thực phẩm. Các phụ gia khi sử dụng quá liều lượng trong một thời
gian dài sẽ gây ra các ngộ độc hóa học nhất là đối với trẻ em, hoặc nhạy cảm của một
số người ngay cả khi sử dụng ở mức an toàn. Hiện nay, hơn 2500 phụ gia đã được sử
dụng trong công nghệ thực phẩm với nhiều mục đích khác nhau, trong đó, việc sử
dụng phụ gia chống vi sinh vật là Natri Benzoat được sử dụng khá phổ biến. Một
trong những nguyên nhân của việc gia tăng sử dụng phụ gia này là do sự thay đổi
trong sản xuất và tiêu thụ các sản phẩm thực phẩm... Ngày nay, người tiêu dùng
mong muốn rằng tất cả các loại thực phẩm đều có quanh năm, khơng bị nhiễm độc
và có thời hạn sử dụng hợp lý. Do đó phụ gia chống vi sinh vật có vai trị quan trọng
trong việc bảo quản thực phẩm, mặc dù đã có sự cải tiến trong hệ thống đóng gói và chế
biến để bảo vệ thực phẩm mà khơng cần dùng đến hóa chất.
Để định lượng hoạt chất trên, Thường qui kỹ thuật (4021/2003/QĐ-BYT) và
Qui chuẩn Việt Nam (QCVN 4-12: 2010/BYT) của Bộ Y tế chỉ xác định trong nguyên
liệu hóa chất bằng phương pháp chuẩn độ trong môi trường khan. Trong nền mẫu
phức tạp của thực phẩm, phương pháp này không thể áp dụng được. Cho đến nay,

việc xác định hàm lượng các chất bảo quản này trong các sản phẩm thực phẩm bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) chưa có tài liệu nào đề cập đến.
Trong bài báo này, chúng tôi giới thiệu quy trình xác định chất phụ gia Natri Benzoate
trong một số sản phẩm thực phẩm bằng phương pháp HPLC đã được nghiên cứu và
áp dụng trên một số mẫu thực phẩm tại Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc mỹ phẩm
thực phẩm TP HCM cho kết quả tốt.


II. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu:
1. Đối tượng:
Khảo sát hàm lượng Natri benzoat trên nền mẫu nước giải khát tại TP HCM.
1.1.

Tính chất lí hố của Natri benzoat:

Natri benzoat có cơng thức hố học là NaC 6H5CO2. Nó là muối natri của axit
benzoic và tồn tại ở dạng này khi hồ tan trong nước. Nó có thể được sản xuất bằng
phản ứng giữa natri hydroxit và axit benzoic.
Natri benzoate

Danh
IUPAC
Tên khác

Natri benzoate
pháp Natri benzoate
E211, benzoat natri
Thuộc tính

Cơng

thức NaC6H5CO2
phân tử
Phân tử gam 144.11 g/mol
Tỷ trọng
Điểm
chảy

1.497 g/cm3
nóng 300 °C

Độ hịa tan tan được
trong nước
Độ hịa tan có thể tan trong etanol
trong
Độ axít (pKa) 8.0


Nguồn: vi.wikipedia.org

1.2.

Ảnh hưởng của Natri benzoat tới sức khoẻ
Thúc đẩy ung thư và tiêu diệt các tế bào khỏe mạnh. Nó có khả năng ngăn

cản các phần tử của ADN, gây ra bệnh Parkinson và xơ gan, có thể gây ra thiệt hại
cho các ty thể – nguồn cung cấp năng lượng cho tế bào. Ty thể hấp thụ oxi và
cung cấp năng lượng, nếu mất đi chúng bệnh tật sẽ tấn công cơ thể bạn. Một số
nghiên cứu đã chỉ ra rằng Natri benzoat cùng với phẩm màu thực phẩm nhân tạo
có thể làm tăng hành vi hiếu động ở một số trẻ.
III. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

1. Dụng cụ và hóa chất:
1.1.

Dụng cụ:

- Cân phân tích AUW220D ( 0,01 mg) của hãng Shimadzu, Nhật Bản.
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Series 20A của hãng Shimadzu, Nhật Bản.
- Cột sắc ký pha đảo C18; màng lọc 0,45 µm.
- Các thiết bị khác như, tủ sấy, máy lắc, máy cất nước hai lần, thiết bị lọc nước
siêu sạch.
- Các dụng cụ thủy tinh như bình định mức các loại, pipet vạch và pipet bầu các loại,
cốc mỏ...
- Micropipet các loại (0,5-10 L, 10-100 mL, 100-1000 mL,…).
- Syranh lọc mẫu; bình định mức các loại, cốc có mỏ các loại

1.2.

Hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao


Hình: Hệ thống máy sắc ký lỏng cao áp HPLC
a.

Bình chứa pha động :

Máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp cho phép chúng
ta sử dụng 4 bình chứa dung mơi cùng một lần để rửa giải theo tỉ lệ mong
muốn và tổng tỉ lệ của 4 đường là 100%.
Tuy nhiên, theo kinh nghiệm, ít khi sử dụng 4 đường dung môi cùng một lúc
mà thường sử dụng 2 hoặc 3 đường để cho hệ pha động luôn được pha trộn

đồng nhất hơn, hệ pha động đơn giản hơn giúp ổn định quá trình rửa giải.
Lưu ý: Tất cả dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết sử dùng
cho HPLC. Tất cả các hóa chất dùng để chuẩn bị mẫu và pha hệ đệm đều phải
là hóa chất tích khiết dùng cho phân tích.
Việc sử dụng hóa chất tinh khiết nhằm tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường
nền, tạo nên các peak tạp trong q trình phân tích.
b.

Bộ khử khí Degases

Mục đích sử dụng bộ khử khí nhằm lọai trừ các bọt nhỏ cịn sót lại trong dung
mơi pha động, tránh xảy ra một số hiện tượng có thể có như sau:
 Tỷ lệ pha động của các đường dung môi không đúng làm cho thời gian lưu của
peak thay đổi.


 Trong trường hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí khơng thể lọai trừ hết được thì
bơm cao áp có thể khơng hút được dung mơi, khi đó ảnh hưởng đến áp suất
và hoạt động của cả hệ thống HPLC.
Trong các trường hợp trên đều dẫn đến sai kết quả phân tích.
c. Bơm cao áp
Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký. Bơm phải
tạt được áp suất cao khỏang 250-600bar và tạo dòng liên tục. Lưu lượng bơm từ
0.1 đến 10ml/phút.
d. Bộ phận tiêm mẫu
Để đưa mẫu vào cột phân tích theo với thể tích bơm có thể thay đồi.
Có 2 cách đưa mẫu vào cột: bằng tiêm mẫu thủ công và tiêm mẫu tự động
(autosample).
e. Cột sắc ký
Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao.

Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột thay đổi từ 525cm đường kính trong 1-10mm, hạt nhồi cỡ 0.3-5µm,…
Chất nhồi cột phụ thuộc vào lọai cột và kiểu sắc ký.
f. Đầu dò
Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc
ký đồ để có thể định tính và định lượng. Tùy theo tính chất của các chất phân tích
mà người ta lựa chọn lọai đầu dị phù hợp.
Tín hiệu đầu dị thu được có thể là: độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường
độ điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất,…
Trên cơ sở đó, người ta sản xuất các lọai đầu dò sau:
- Đầu dò quang phổ tử ngọai 190-360nm để phát hiện UV
- Đầu dò quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) (190-900nm) để phát hiện các chất
hấp thụ quang. Đây là lọai đầu dò thơng dụng nhất.
- Đầu dị hùynh quang (RF) để phát hiện các chất hữu cơ chứa huỳnh quang tự
nhiên và các dẫn suất có huỳnh quang.


- Đầu dị DAD (Detector Diod Array) có khả năng quét chồng phổ để định tính các
chất theo độ hấp thụ cực đại của các chất.
- Đầu dò khúc xạ (chiết suất vi sai) thường dùng đó các loại đường.
- Đầu dị điện hóa: đo dịng, cực phổ, độ dẫn.
- Đầu dò đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt,…
g. Bộ phận ghi nhận tín hiệu
Bộ phận này ghi tín hiệu do đầu dò phát hiện. Đối với các hệ thống HPLC hiện đại,
phần này được phần mềm trong hệ thống ghi nhận, lưu các thông số, sắc ký đồ,
các thông số liên quan đến peak như tính đối xứng, hệ số phân giải,… đồng thời
tính tóan, xử lý các thơng số liên quan đến kết quả phân tich.
h. In dữ liệu
Sau khi phân tích xong, dữ liệu sẽ được in ra qua máy in kết nối với máy tính có cài
phần mềm điều khiển.
1.3.

Hóa chất:

Tất cả hóa chất đều là loại tinh khiết phân tích.
- Chất chuẩn Natri Benzoat , Acid phosphoric đậm đặc, dung dịch NaOH 0,1N
pha từ ống chuẩn, dung dịch H2SO4 10%, dung dịch Phenolphtalein 1% pha trong
ethanol 600.
- Dung dịch kalifericyanid K3Fe(CN)6: Hoà tan 10,6g K3Fe(CN)6 trong 50ml
nước, lắc cho tan hoàn toàn, thêm nước vừa đủ 100ml.
- Dung dịch Dikali hydrophosphat K 2HPO4 0,02M: Hòa tan 3,484g K2HPO4 trong
100ml nước.

1.3. Dung dịch chuẩn


-

Dung dịch chuẩn gốc 1000ppm: Cân 0,1000g chuẩn mỗi loại, thêm 2-3ml

methanol, lắc cho tan hoàn toàn, thêm nước cất vừa đủ 100 ml.
-

Từ dung dịch chuẩn gốc, pha ra các chuẩn làm việc có nồng độ 1 ppm ;5 ppm;

10 ppm; 20 ppm ; 50 ppm ; 100 ppm ; 200 ppm.
2. Điều kiện qui trình và quá trình thực hiện
2.1.

Điều kiện quy trình
Pha động: hỗn hợp dikali hydrophosphat : methanol [70:30]; chỉnh pH = 5,0

bằng axit H3PO4. Lọc qua màng 0,45 µm, lắc siêu âm đuổi bọt khí.
- Ct pha o RP18 (150 ì 4,6 mm ; 3àm)
- Thể tích bơm mẫu 20µl
- Tốc độ dịng 1,5 ml/phút
- Nhiệt độ cột : nhiệt độ phòng
- Detector : DAD bước sóng λ = 230 nm
2.2. Qúa trình thực hiện
Hút chính xác 20-50ml mẫu cho vào cốc có mỏ 250 ml, thêm 25ml dung dịch
dung dịch NaOH 1N, thủy phân trên bếp cách thủy ở nhiệt độ 70 0C trong 30 phút. Làm
nguội về nhiệt độ phịng, chuyển vào bình định mức 100ml, trung hòa mẫu bằng
dung dịch H2SO4 10% để dung dịch có pH = 8,5. Thêm 2ml dung dịch kalifericyanid, lắc
đều và loại tạp. Dùng methanol tráng rửa cốc cho vào bình định mức, thêm 10ml
dung dịch K2HPO4 0,2M, lắc kỹ, và định mức methanol vừa đủ 100ml. Lọc qua màng
lọc 0,45µm trước khi bơm vào máy HPLC.
→ Kết quả tính theo cơng thức:

C(mg/l) = Cx n/R


20 -50ml mẫu lỏng
+ 25 ml NaOH 0,1N
Cách thủy t0 = 700 c
30 phút
+ H2SO4 10%
→ pH = 8,5
+ 2 ml ddịch fericyamid
+ 10 ml K2HPO4 0,2 M

Định mức vừa đủ 100ml

lọc qua 0,45µm

HPLC

IV . Tính tốn và kết quả
1. Khảo sát độ tuyến tính
Khảo sát trên dung dịch chuẩn Natri Benzoat với nồng độ khác nhau. Kết quả
thực nghiệm được thể hiện ở bảng sau


2. Sắc kí đồ

Hình: Sắc ký đồ của mẫu chuẩn Natri benzoat và mẫu nước ngọt có chứa Natri
benzoat
3. Khảo sát độ lặp lại
Tiến hành khảo sát độ lặp lại của phương pháp trên nền mẫu nước giải khát có
chất Natri benzoat với điều với sắc ký đã lựa chọn. Kết quả khảo sát được trình bày ở
bảng sau

Nhận xét: Phương pháp định lượng đã xây dựng có độ lặp lại tốt, có RSD < 2%


4. Khảo sát độ đúng
Độ đúng được xác định trên nền mẫu nước giải khát, với chương trình sắc ký đã
chon. Tiến hành thêm chính xác một lượng dung dịch chuẩn Natri Benzoat vào mẫu thử
với tỷ lệ thêm 50(µg/ml); 100(µg/ml); 150(µg/ml). Sau đó định lượng chất chuẩn tìm
lại được so với lượng thêm vào (với 5 phép thử song song). Kết quả khảo sát độ đúng
của phương pháp được trình bày ở bảng
Kết quả khảo sát độ đúng trên mẫu nước giải khát (n= 5)

5. Kết quả khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của
phương pháp
Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng được xác định theo “qui tắc 3σ”. Từ
khoảng tuyến tính đã xây dựng với phương trình đường chuẩn tương ứng của hoạt
chất Natri Benzoat ta tính xác định LOD và LOQ của phương pháp được trình bày ở
bảng
Kết quả xác định LOD và LOQ của phương pháp phân tích HPLC

V. Kết luận
 Phương pháp định lượng hoạt chất Natri Benzoat trong một số sản
phẩm thực phẩm bằng phương pháp HPLC đã được xây dựng và thẩm
định. Các kết quả thực nghiệm thu được cho thấy phương pháp có giới


hạn định lượng rộng, độ tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ và
diện tích peak, độ lặp lại và độ thu hồi khá tốt....
 So sánh với nồng độ Natri Benzoat cho phép trong thực phẩm với liều
lượng 647–825 mg/kg khối lượng cơ thể mỗi ngày, hàm lượng Natri
benzoat trong mẫu nằm trong mức cho phép.

VI. Tài liệu tham khảo
 AOAC (2005), Official methods of analysis of AOAC international.
 Bộ Y tế, Cục an toàn vệ sinh thực phẩm (2005), “Các văn bản quy phạm pháp
luật về vệ sinh an toàn thực phẩm”, Nhà xuất bản Hà nội, tập II, tr. 186-192
 Bộ Y tế, QCVN 4-2010/BYT “Qui chuẩn các kỹ thuật quốc gia về phụ gia thực
phẩm – Chất bảo quản”, Nhà xuất bản Hà nội, phụ lục 2,5
 Bộ Y tế (1998), “Danh mục các tiêu chuẩn vệ sinh đối với lương thực thực
phẩm” QĐ số 867/1998/QĐ-BYT của Bộ trưởng Bộ Y tế ngày 04 tháng 04 năm
1998