THỰC HÀNH hóa SINH ĐỘNG vật (hóa SINH ĐỘNG vật)

1. THỦY PHÂN MỠ BỞI LIPASE
Mỡ = Este của glycerol và acid béo


- Muốn cắt lk ester cần enzyme esterase.
- Lipase tuyến tụy thuỷ phân mạch ester trong mỡ.
- Đ/kiện cho lipase hđ: t° thích hợp, thời gian hđ, mỡ
được nhũ tương hoá nhờ các acid mật.
- Lipase thuỷ phân mỡ, cho ra glycerol và các acid béo
(mt acid). Chuẩn độ acid bằng base (NaOH 0,1N) với chỉ
thị màu fenolftalein (0,1% trong cồn).
- Nếu lipase hđ càng mạnh, acid mật h/hoá và nhũ hoá mỡ
càng tốt, thời gian càng lâu → lượng acid béo sinh ra càng
nhiều, lượng NaOH chuẩn độ càng tốn.


Thí nghiệm:
Hai bình tam giác, cho vào mỗi bình:
• 40 ml sữa tươi
• 2 ml chiết xuất lipase (dịch tuỵ)
• Một giọt fenolftalein
A
• Thêm 0,5 ml
dịch mật

B
• Thêm 0,5 ml
nước cất

• Lắc trộn đều

• Lấy từ mỗi bình 10 ml đem chuẩn độ bằng NaOH 0,1N, tới
khi có màu hồng bền nửa phút, ghi lại số ml NaOH.
• Số dd cịn lại cho vào tủ ấm 37-40°C
• Cứ sau 15 phút lại lấy tiếp 10 ml chuẩn độ tiếp (4 lần ch/độ)


Từ kết qủa thu được sẽ lập được đồ thị
NaOH
0,1N

?
?

15’

30’

45’

Thời gian


2. ĐỊNH LƯỢNG CATALASE TRONG MÁU
2.1. Catalase là gì?
- Là E phân huỷ perhydrol thành nước và ôxy
H2O2

Catalase

H2O + O2

perhydrol

- Ở đ.vật, catalase có nhiều trong hồng cầu, lách , gan
- Có nhiều cách định lượng E:
Trực tiếp: tìm xem có bao nhiêu mg E
Gián tiếp: thơng qua chất khác mà E tác dụng


Định lượng catalase gián tiếp; thông qua lượng H2O2
bị catalase của máu phân giải. Cơ sở của phản ứng:
2KMnO4 +8H2SO4 + 5H2O2 → 2MnSO4 + K2SO4 + 5O2 + 8H2O

Lượng H2O2 biết trước, KMnO4 chuẩn độ cũng biết
2.2. Ý nghĩa của việc định lượng catalase?
• Ý nghĩa của việc đ/lượng E nói chung: tìm ra kh/năng trao
đổi sâu kín của t/bào
• Đ/lượng catalase có t/dụng gì?



H2O2 là sản phẩm OXH của cơ thể; VD: trong ph/giải acid
amin, oxidase có nhóm ghép FMN hay FAD tách cặp hydro của
cơ chất. Bình thường cặp hydro tách ra sẽ vào chuỗi hô hấp,
nhường cho coenzyme Q, nhưng trong tr/hợp OXH aa, cặp
hydro được nhường tr/tiếp cho ôxy, tạo H2O2.
H2O2 sinh ra được catalase ph/giải. Có tr/hợp bị peroxydase
ph/giải cho H2O và O (ơxy ngun tử)
Ơxy ngun tử dễ t/động với acid béo gây độc (làm rách màng
TLT, chuỗi hơ hấp ngừng)

→ catalase có tác dụng khử độc


Nếu qt OXH mạnh → H2O2 sinh ra nhiều → lượng catalase
cũng nhiều và h/động mạnh.
Qua việc đ/lượng catalase, đánh giá được tình
trạng sức khoẻ của gia súc, gia cầm
2.3. Cách làm thí nghiệm
- Lấy máu: tĩnh mạch (tai thỏ, cánh gà)
- Lấy 0,1 ml máu, cho vào bình định mức đã có 100 ml nước
cất, thổi nhẹ máu xuống, hút nước cất lên vài lần và lại thổi nhẹ
vào bình → máu bị pha lỗng 1 0/00
- Lấy 2 bình nón, cho vào mỗi bình 7-8 ml nước cất và 1ml máu
pha.
- Một bình đem đun sơi 2 phút để khử men (ĐC), rồi để nguội.
- Cho vào cả 2 bình: 2 ml H2O2 1%
- Để 30 phút


- Thêm vào mỗi bình 4-5 ml H2SO4 10% (để làm ngừng
phản ứng và tạo m/trường để chuẩn độ)
- Dùng KMnO4 0,1N để chuẩn độ lượng H2O2 dư, khi thấy xuất
hiện màu hồng bền nửa phút thì dừng lại
- Lấy số liệu bình đối chứng (khử men) trừ số liệu bình khơng
khử men (thí nghiệm) và nhân với 1,7 ra số catalase, là số mg
H2O2 bị catalase của 1μl máu (1ml máu pha) ph/giải
Số catalase = (ĐC – TN). 1,7 = số mg H2O2
Chỉ số catalase/hồng cầu =

Số catalase

Số hồng cầu

1μl máu gà có 2,5x106 hồng cầu

[mg]