Xác định kiểu hình và kiểu gen của các vi khuẩn đường ruột tiết esbl phân lập được tại bệnh viện bạc liêu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN THÀNH TÍN

XÁC ĐỊNH KIỂU HÌNH VÀ KIỂU GEN
CỦA CÁC VI KHUẨN ĐƢỜNG RUỘT TIẾT ESBL
PHÂN LẬP ĐƢỢC TẠI BỆNH VIỆN BẠC LIÊU
Ngành: Kỹ thuật xét nghiệm y học
Mã số: 8270601

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:
GS.TS. NGUYỄN THANH BẢO

TP. HỒ CHÍ MINH - NĂM 2018


LỜI CẢM ƠN
Trước hết tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới GS.TS. Nguyễn Thanh Bảo,
người thầy đã tận tình hướng dẫn, hết lòng chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp
đỡ tơi trong suốt q trình học tập và nghiên cứu.
Trong q trình nghiên cứu và hồn thiện luận văn, tôi đã nhận được rất
nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo, cùng đồng nghiệp, bạn bè và
gia đình.
Đồng thời, tơi cũng xin cảm ơn Ban chủ nhiệm Bộ mơn xét nghiệm,
Phịng sinh học phân tử, Ban giám đốc Bệnh viện đa khoa Bạc Liêu, phòng vi

sinh Bệnh viện Bạc Liêu, đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tơi trong q trình làm
việc để hồn thành luận văn này.


i

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi, tất cả
những số liệu và kết quả trong luận văn này là trung thực và chưa được công
bố bởi người khác.
Tác giả luận văn

NGUYỄN THÀNH TÍN


ii

MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
Lời cảm ơn
Lời cam đoan ...................................................................................................... i
Mục lục .............................................................................................................. ii
Danh mục từ viết tắt .......................................................................................... v
Danh mục bảng................................................................................................ vii
Danh mục hình ............................................................................................... viii
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 3
1.1. Tổng quan về vi khuẩn ............................................................................... 3
1.1.1. Vi khuẩn .................................................................................................. 3

1.1.2. Các vi khuẩn nghiên cứu thường gặp ..................................................... 3
1.2. Khái quát lịch sử và phân loại ESBL ......................................................... 5
1.2.1. Vài nét về lịch sử phát hiện ESBL .......................................................... 5
1.2.2. Đặc điểm phân loại ESBL ....................................................................... 7
1.3. Các phương pháp phát hiện về kiểu hình ESBL ...................................... 10
1.3.1. Phương pháp đĩa đơn ............................................................................ 10
1.3.2. Phương pháp đĩa đôi ............................................................................. 11
1.3.3. Phương pháp đĩa kết hợp....................................................................... 13
1.3.4. Phương pháp que E test ......................................................................... 14
1.3.5. Phương pháp tìm ESBL (Bằng máy tự động vitek2 compact): ............ 15
1.4. Phương pháp sinh học phân tử phát hiện kiểu gene ESBL:..................... 15
1.4.1. Tầm quan trọng của việc phát hiện ESBL: ........................................... 17
1.4.2. Tình hình phân bố ESBL trên thế giới và Việt Nam: ........................... 18
1.4.3. Tình hình kháng thuốc của vi khuẩn đường ruột: ................................. 20


iii

1.4.4. Phòng ngừa vi khuẩn sinh ESBL: ......................................................... 21
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 22
2.1. Đối tượng nghiên cứu: ............................................................................. 22
2.1.1. Tiêu chuẩn chọn mẫu: ........................................................................... 22
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ: ............................................................................... 22
2.2. Phương pháp nghiên cứu: ........................................................................ 22
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu:.............................................................................. 22
2.2.2. Cỡ mẫu: ................................................................................................. 22
2.2.3. Biến số: .................................................................................................. 22
2.2.4. Phân tích và xử lý số liệu: ..................................................................... 23
2.3. Số chủng vi khuẩn đường ruột dùng để thực hiện multiplex PCR: ......... 23
2.4. Địa điểm thực hiện và thời gian nghiên cứu: ........................................... 23

2.5. Một số kỹ thuật vi sinh lâm sàng: ............................................................ 23
2.5.1. Cách lấy bệnh phẩm máu: ..................................................................... 23
2.5.2. Cách lấy bệnh phẩm nước tiểu: ............................................................. 24
2.5.3. Cách lấy bệnh phẩm đàm: ..................................................................... 24
2.5.4. Cách lấy bệnh phẩm mủ (tổn thương phần mềm):................................ 24
2.6. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu: ...................................................... 24
2.6.1. Vật liệu: ................................................................................................. 24
2.6.2. Phương pháp thực hiện: ........................................................................ 26
2.7. Đạo đức trong nghiên cứu: ....................................................................... 37
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................... 38
3.1. Xác định tỷ lệ các vi khuẩn đường ruột theo từng loại bệnh phẩm: ........ 38
3.2. Tỷ lệ vi khuẩn E. coli, K. pneumoniae và K. oxytoca sinh ESBL: .......... 38
3.3. Kết quả khảo sát về kiểu gene qui định ESBL......................................... 41
3.3.1. Kết quả thí nghiệm monoplex PCR ...................................................... 41
3.3.2. Kết quả khảo sát nhiệt độ lai tối ưu của các mồi: ................................. 42


iv

3.3.3. Hiệu quả phản ứng multiplex PCR: ...................................................... 44
3.4. Xác định kiểu gene thường gặp của vi khuẩn đường ruột sinh ESBL: ... 48
3.4.1. Tỷ lệ phân bố kiểu gien sinh men ESBL .............................................. 48
3.4.2. Tỷ lệ các kiểu tổ hợp gene mã hóa men ESBL: .................................... 49
CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN ............................................................................. 51
4.1. Tỷ lệ các vi khuẩn đường ruột trong từng loại bệnh phẩm: ..................... 51
4.2. Tỷ lệ E. coli, K. pneumoniae và K. oxytoca sinh ESBL: ......................... 55
4.3. Xác định kiểu gene: .................................................................................. 62
4.3.1. Tối ưu hóa quy trình khảo sát kiểu gene: .............................................. 62
4.3.2. Tỷ lệ các gene sinh ESBL phát hiện được: ........................................... 63
4.4. Hạn chế của đề tài .................................................................................... 67

KẾT LUẬN .................................................................................................... 69
KIẾN NGHỊ ................................................................................................... 71
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
1. Các quy trình ni cấy và phân lập vi khuẩn
2. Quy trình định danh và thử nghiệm kháng sinh đồ bằng máy VITEK2
COMPACT
3. Bảo quản và vận chuyển mẫu
4. Tách chiết dna từ vi khuẩn bằng phương pháp cột
5. Kết quả giải trình tự các sản phẩm nhân bản của các mồi dùng trong nghiên cứu
6. Kết quả điện di của mẫu nghiên cứu danh sách kết quả Multiplex PCR
Danh sách đối tượng tham gia nghiên cứu tại bệnh viện đa khoa tỉnh Bạc Liêu


v

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
TIẾNG VIỆT
KS

: Kháng sinh

TNHH

: Trách nhiệm hữu hạn

VK

: Vi khuẩn

VKĐR

: Vi khuẩn đường ruột

TIẾNG ANH
AES

: Advanced Expert System

AST Card

: Antimicrobial Susceptibility Test Card

A

: Adenine

BA

: Blood Agar

CFU

: Colony Forming Unit

CTX-M

: Cefotaximase

CARB

: Carbapenem

CLSI

: Clinical and laboratory Standards institute (Viện các

chuẩn mực lâm sàng và xét nghiệm)
C

: Cytosine

DNA

: Deoxyribonucleic Acid

dNTP

: Deoxynucleotide

EPEC

: Enteropathogenic E. coli (Gây bệnh đường ruột)

ETEC

: Enterotoxigenic E. coli (Gây độc tố ruột)

EIEC

: Enteroinvasive E. coli (Xâm nhập đường ruột)

EHEC

: Enterohemorrhagic E. coli (gây xuất huyết ruột)

EAEC

: Enteroaggregative E. coli (Bám dính đường ruột)

ESBLs

: Extended spectrum beta lactamases


vi

GN

: Gram Negative

GP

: Gram Possitive

G

: Guanine

H2S

: Hydroge Sulfide

LT

: Heat Labile Toxin

MIC

: Minimum Inhibitory Concentration

MC

: Mac Conkey Agar

PCR

: Polymerase Chain Reaction

RNA

: Ribonuclic acid

SHV-1

: Sulfhydryl variable type 1

SMART

: Study for Monitoring Antimicrobial Resistance Trend

ST

: Heat Stable Toxin

TEM

: Temoneria

TAE

: Tris Acetate EDTA

T

: Thymine

VP

: Voges Proskauer


vii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Phân loại theo chức năng: ................................................................. 9
Bảng 1.2: Kết quả kháng sinh đồ .................................................................... 11
Bảng 1.3: Tóm tắt các phương pháp phát hiện vi khuẩn sinh ESBL .............. 17
Bảng 2.1: Trình tự mồi dùng trong nghiên cứu .............................................. 25
Bảng 3.1: Tỷ lệ các vi khuẩn đường ruột theo từng loại bệnh phẩm .............. 38

Bảng 3.2: Tỷ lệ E. coli, K. pneumoniae và K. oxytoca sinh ESBL................. 39
Bảng 3.3: Tỷ lệ vi khuẩn đường ruột sinh ESBL ở bệnh phẩm máu .............. 39
Bảng 3.4: Tỷ lệ vi khuẩn đường ruột sinh ESBL ở bệnh phẩm nước tiểu..... 39
Bảng 3.5: Tỷ lệ vi khuẩn đường ruột sinh ESBL ở bệnh phẩm đàm .............. 40
Bảng 3.6: Tỷ lệ vi khuẩn đường ruột sinh ESBL ở bệnh phẩm mủ................ 40
Bảng 3.7: Tỷ lệ phân bố kiểu gene sinh ESBL ............................................... 48
Bảng 3.8: Các kiểu tổ hợp gene mã hóa ESBL ở E. coli ................................ 49
Bảng 3.9: Các kiểu tổ hợp gene mã hóa ESBL ở K. pneumoniae .................. 49
Bảng 4.1: Tóm tắt vi khuẩn sinh ESBL của các nghiên cứu .......................... 60
Bảng 4.2: So sánh với nghiên cứu của các bệnh viện trong nước và SMART
vùng châu Á Thái Bình Dương. ...................................................................... 61


viii

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Minh họa xét nghiệm khuếch tán đĩa đơi ........................................ 12
Hình 1.2: Minh họa xét nghiệm khuếch tán đĩa kết hợp ................................. 13
Hình 1.3: Minh họa xét nghiệm bằng phương pháp E-test ............................. 15
Hình 2.1: Minh họa nguyên tắc PCR đơn mồi (monoplex). ........................... 31
Hình 3.1: Kết quả điện di sản phẩm monoplex PCR ...................................... 41
Hình 3.2: Kết quả điện di khảo sát nhiệt độ lai của mồi CTX-M-Group-1
và CTX-M-Group-9 ........................................................................................ 42
Hình 3.3: Kết quả điện di khảo sát nhiệt độ lai của mồi TEM và 16S rRNA 42
Hình 3.4: Kết quả điện di khảo sát nhiệt độ lai của mồi SHV. ....................... 43
Hình 3.5: Hiệu quả nhân bản của phản ứng multiplex PCR. .......................... 44
Hình 3.6: Kết quả tối ưu nồng độ mồi nhân bản gene TEM ........................... 45
Hình 3.7: Kết quả tối ưu nồng độ mồi nhân bản gene 16S rRNA .................. 45
Hình 3.8: Kết quả tối ưu nồng độ Mg2+ .......................................................... 46
Hình 3.9: Kết quả tối ưu nồng độ men DNA polymerase .............................. 46

Hình 3.10: Kết quả đánh giá độ nhạy của phản ứng multiplex PCR .............. 47
Hình 3.11: Kết quả đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng multiplex PCR ........ 48


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Nhiễm trùng do vi khuẩn Gram âm sinh ESBL vẫn là yếu tố góp phần
quan trọng nhất gây ra đề kháng KS nhóm β-Lactam và gây tử vong cao trên
toàn thế giới. Men này được phát hiện đầu tiên ở Tây Âu vào giữa thập niên
80, gia tăng một cách đều đặn do vi khuẩn tiết β-lactamases đặc biệt là
ESBLs. Cũng vì chính men β-lactamases giúp cho vi khuẩn đề kháng tất cả
các KS nhóm penicillins, cephalosporin thế hệ 1, 2, 3, 4 và monobactam
(aztreonam), trừ carbapenem [43], [58]. Nhưng hiện nay một số chủng đã
giảm nhạy cảm với KS nhóm carbapenem như imipenem, meropenem hay
ertapenem, trong khi việc tìm ra kháng sinh mới trên thế giới ngày càng giảm
thì mức độ đề kháng KS ngày càng tăng. Trong khi đó E. coli và
K. pneumoniae là hai loại vi khuẩn đường ruột chiếm đa số trong các trường
hợp bệnh lý như nhiễm khuẩn máu, nhiễm khuẩn tiết niệu…mà thuốc chính
được lựa chọn để điều trị cho tác nhân gây bệnh trên là β-lactams.
Hiện nay đã có hơn 350 loại men ESBL khác nhau đã được mô tả, Kiểu
gene thường gặp nhất là TEM (Temoneria), SHV (Sulfhydryl variable),
CTX-M (Cefotaxime hydrolyzing capabilities). Sự phân bố các kiểu gene
cũng khác nhau giữa các quốc gia và các vùng địa lý [19]. Theo nghiên cứu
của SMART ở vùng châu Á Thái Bình Dương kiểu gene CTX-M-14,
CTX-M-15 chiếm ưu thế ở các vi khuẩn đường ruột [53]. Nhiều nghiên cứu
báo cáo vi khuẩn Escherichi. coli và Klebsiella. pneumoniae là loài sinh
ESBL thường gặp nhất. Tuy nhiên những loài vi khuẩn khác trong họ đường
ruột và Pseudomonas cũng có khả năng tiết ra men này. Đặc biệt thuốc KS
nhóm β-lactam sẽ khơng có hiệu quả (trừ Carbapenem) nếu ESBL dương tính

kể cả kháng sinh đồ cho kết quả nhạy cảm. Ngoài kháng sinh đồ thường quy
thì xác định vi khuẩn đường ruột sinh ESBL là cần thiết. Tuy nhiên việc xác
định kiểu gene giúp hiểu sâu hơn cơ chế kháng thuốc ở mức độ phân tử.


2

Bên cạnh đó, tỷ lệ hiện hành của vi khuẩn sinh ESBL thay đổi trên thế
giới; Nam Phi [55] chiếm 8,8% – 13,1%; Ai Cập [21], [47] chiếm từ
11 – 42,9%; ở Việt Nam tỷ lệ ngày càng gia tăng; Bệnh viện An Bình
TP. HCM (2014) [14] chiếm 29,9%, bệnh viện Đại học Y Dược TP. HCM
(2015) [12] chiếm 57,8%.
Truy tìm qua các y văn, tạp chí khoa học, ngày càng có nhiều thơng tin
và nhiều nghiên cứu sâu hơn về vi khuẩn sinh ESBL.
Việc chọn lựa kháng sinh ban đầu hiện nay là chọn lựa KS phổ rộng đủ
mạnh, bao phủ phần lớn các tác nhân gây bệnh. Sau khi có kết quả kháng sinh
đồ sẽ điều chỉnh cho phù hợp, đảm bảo tính hiệu quả, ít tốn kém và giảm sự
phơi nhiễm của kháng sinh.
Bệnh viện Bạc Liêu là một bệnh viện tuyến tỉnh, mỗi năm số lượng
bệnh nhân nhập viện với tình trạng nhiễm trùng do vi khuẩn tiết ESBL ngày
càng nhiều nhưng ở Bạc Liêu chưa có nghiên cứu nào về vi khuẩn tiết ESBL
cũng như các gen có liên quan. Vì vậy chúng tơi thực hiện đề tài với các mục
tiêu cụ thể như sau:
1. Xác định tỷ lệ các vi khuẩn đường ruột phân lập được theo từng loại
bệnh phẩm thường gặp (máu, đàm, nước tiểu, mủ dịch tổn thương phần mềm)
tại phòng vi sinh Bệnh viện Bạc Liêu.
2. Xác định tỷ lệ vi khuẩn đường ruột thường gặp Escherichia coli,
Klebsiella pneumoniae và Klebsiella oxytoca tiết ESBL.
3. Xác định kiểu gene thường gặp của các vi khuẩn đường ruột tiết
ESBL.

3

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về vi khuẩn:
1.1.1. Vi khuẩn: [9]
Vi khuẩn (Bacteria) theo tiếng Hy Lạp có nghĩa là cái gậy. Được hiểu
theo nghĩa rộng bao gồm các vi sinh vật thuộc ngành Bacteria. Họ vi khuẩn
đường ruột (Enterobacteriaceae) là một họ vi khuẩn hiện diện với số lượng
nhiều. Các thành viên của họ này phân bố rộng rãi trên người, các loài động
vật, thực vật và ngồi mơi trường. Nơi thường gặp nhất là ruột người và các
loài động vật, trong thuật ngữ tên họ của chúng (Entero – ruột , bacteri – vi
khuẩn, aceae – họ). Nhưng các thành viên họ đường ruột có thể gặp ở nhiều
nơi khác ngoài ruột và ở ruột còn hiện diện nhiều các thành viên của nhiều họ
vi khuẩn khác.
Một vi khuẩn được xếp vào họ vi khuẩn đường ruột khi có các tính chất
sau:
Trực khuẩn Gram âm hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý, khơng có men
oxidase, lên men đường glucose (sinh hơi hoặc không sinh hơi), khử nitrat
thành nitrit, có thể di động hoặc khơng di động (nếu có thì có nhiều lơng ở
xung quanh thân), khơng sinh nha bào.
Họ đường ruột có tầm quan trọng trong y học bởi nhiều thành viên có
khả năng gây bệnh ở người, trong đó những thành viên có thể gây dịch.
Chúng chiếm tới 80% các vi khuẩn Gram âm gây bệnh ở người. Chúng có thể
gây rất nhiều bệnh khác nhau, hầu như tất cả các cơ quan, các mô của cơ thể.
Bất cứ bệnh phẩm lâm sàng nào cũng phân lập được họ vi khuẩn đường ruột.
1.1.2. Các vi khuẩn nghiên cứu thƣờng gặp:
Escherichia coli (E. coli) và Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) là
hai vi khuẩn gây bệnh thường gặp tại bệnh viện. Chúng là thành viên chính

của họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriacae) gây bệnh nhiễm khuẩn bệnh


4

viện do có tỷ lệ đề kháng KS rất cao. Đặc biệt là hai loài vi khuẩn gắn liền với
lịch sử phát hiện cơ chế sinh ESBL ở vi khuẩn Gram âm với các loại men
TEM, SHV và CTX-M…. Điều quan trọng là gene mã hóa ESBL ở các vi
khuẩn này chủ yếu di truyền qua trung gian plasmid [37].
1.1.2.1. Escherichia coli: [9]
Escherichia coli do Theodore Eschrich (1857 – 1919) phát hiện lần đầu
tiên năm 1885. Vi khuẩn này chiếm tỉ lệ rất cao trong số các vi khuẩn hiếu khí
( khoảng 80%) ở đại tràng.
Đặc điểm sinh học:
Hình thể, tính chất bắt màu: Trực khuẩn bắt màu Gram âm, nhưng hầu
hết có lơng và có khả năng di động.
Ni cấy: Hiếu khí, kỵ khí tùy tiện, nhiệt độ thích hợp là 37 0C, dễ mọc
trên môi trường thông thường, khuẩn lạc dạng S, R hoặc M.
Tính chất sinh vật học: Lên men glucose (+), lactose (+/-), Oxidase (-),
Citrate (-), Urease (+), indole (+), H2S (-), di động (+/-), VP (-), MR (+)
Kháng nguyên: Hiện có 160 loại kháng nguyên thân O, 100 kháng
nguyên bề mặt K, 50 kháng nguyên H, có kháng nguyên ngoại độc tố LT, ST.
Dựa vào kháng nguyên O, H, K có rât nhiều type huyết thanh khác nhau.
Theo tính chất tiêu chảy có 5 loại:
o EPEC (Enteropathogenic E. coli): Gây bệnh đường ruột
o ETEC (Enterotoxigenic E. coli): Gây độc tố ruột
o EIEC (Enteroinvasive E. coli): Xâm nhập đường ruột
o EHEC (Enterohemorrhagic E. coli): gây xuất huyết ruột
o EAEC (Enteroaggregative E. coli): Bám dính đường ruột
Khả năng gây bệnh: E. coli gây nhiều loại bệnh lý khác nhau như

nhiễm khuẩn tiết niệu, nhiễm khuẩn máu, viêm màng não, nhiễm khuẩn
đường mật và nhiễm khuẩn vết thương.


5

Chẩn đốn vi sinh vật: Dựa vào ni cấy phân lập xác định tính chất
sinh vật hóa học, định type huyết thanh, PCR…
1.1.2.2. Klebsiella: [9]
Thuộc họ Enterobacteriaceae, cư trú ở ống tiêu hóa, trên da và ngồi
mơi trường. Ở người bình thường chúng chiếm một tỉ lệ thấp trong hệ vi
khuẩn đường ruột.
Đặc điểm sinh học:
Hình thể, tính chất bắt màu: Là trực khuẩn Gram âm, có vỏ, khơng có
lơng.
Ni cấy: Nhiệt độ thích hợp là 370C, dễ mọc trên mơi trường thơng
thường, khuẩn lạc rất nhầy có màu đỏ trên mơi trường MC.
Tính chất sinh vật học: Lên men glucose (+), lactose (+), Oxidase (-),
Citrate (+), Urease (+), indole (+/-), H2S (-), di động (-), VP (+), MR(-).
Kháng nguyên: Chỉ có hai loại kháng nguyên đó là kháng nguyên O và
kháng nguyên K. Dựa vào kháng nguyên O có 6 nhóm, dựa vào kháng
nguyên K có 80 type huyết thanh.
Khả năng gây bênh: Gây nhiều bệnh như viêm phổi, viêm xoang, viêm
tai giữa, nhiễm khuẩn vết thương.
Chẩn đoán vi sinh vật: Dựa vào nuôi cấy phân lập xác định tính chất
sinh vật hóa học, định type huyết thanh.
1.2. Khái quát lịch sử và phân loại ESBL:
1.2.1. Vài nét về lịch sử phát hiện ESBL:
Tình hình vi khuẩn đề kháng với KS nhóm β-lactam được biết đến từ
rất lâu. Men β-lactamase được phát hiện từ Escherichia coli trước khi kháng

sinh β-lactam đầu tiên là penicillin được đưa vào sử dụng. Vào đầu những
năm 1960, các nhà khoa học đã phát hiện ra men TEM-1, là một enzym
truyền qua plasmid được phân lập trên bệnh nhân tên là Temoneira – một


6

người Hy lạp – bị nhiễm trùng huyết do E. coli và lấy luôn tên bệnh nhân này
đặt là TEM-1. Đến năm 1961 thế hệ penicilline phổ rộng đầu tiên là
ampicillin được ra đời có tác dụng điều trị với cả trực khuẩn Gram âm và cả
cầu khuẩn Gram dương [20], [27].
Năm 1965 cũng ở nơi đây từ E. coli người ta phát hiện ra TEM-2 là do
TEM-1 biến đổi một amino acid. Nhờ TEM-1 và TEM-2 đã làm cho vi khuẩn
Gram âm kháng lại penicillin, ampicillin và cephalosporin thế hệ 1 [27].
Cho đến năm 1974 chủng K. pneumoniae có gene mã hóa β- lactamases
trên plasmid được phát hiện, men này có nhiều thay đổi về amino acid so với
TEM-1 và TEM-2 nên đặt tên là SHV-1 (Sulfhyryl variable), như vậy vi
khuẩn đã có TEM-1, TEM-2 và SHV-1 nên các penicillin, cephalosporine thế
hệ 1 đã bị kháng lại rất nhiều. Đến năm 1980 thì các kháng sinh β- lactam phổ
rộng như cephalosporin thế hệ 2, thế hệ 3 và monobactam được đưa vào điều
trị các vi khuẩn kháng thuốc [33]. Sự ra đời các kháng sinh mới này đặc biệt
là caphalosporin thế hệ 3 đã là thành công lớn của khoa học trong cuộc chiến
đấu dài lâu với vi khuẩn gây bệnh sinh men TEM-1, TEM-2, SHV-1. Nhưng
rồi một loại β- lactamases có khả năng phân hủy các cephalosporine thế hệ 2,
3 và monobactam, có nguồn gốc do TEM-1, TEM-2, SHV-1 đột biến thay đổi
một số amino acid gọi là ESBLs đã xuất hiện [23].
Năm 1983 ở Đức đã phát hiện chủng K. ozaenae sinh β- lactamases
phân hủy cefotaxime được đặt tên là SHV-2, đây là trường hợp sinh ESBL
đầu tiên được ghi nhận. Năm 1984 đến năm 1987 tại pháp đã phát hiện chủng
K. pneumoniae có gene mã hóa ESBL trên plasmid kháng cefotaxime đặt tên

là CTX-1 [26], [56]. Cũng vào những năm 1986 ở Nhật Bản Masumato và
năm 1989 ở Đức, Bauerfein phát hiện E. coli sinh ESBL kháng cefotaxime
không phải là TEM và SHV nên đặt tên là CTX-M-1. Đáng ngại là CTX-M
có khả năng phân hủy hầu hết cephalosporine thế hệ 3 và cả cephalosporine


7

thế hệ 4 [29], [45]. β-lactamases là loại men do vi khuẩn tiết ra có thể thủy
phân các liên kết amin của β-lactam gây mở vòng β-lactam và làm mất tác
dụng diệt khuẩn của kháng sinh họ β-lactam.
β-lactamases được sinh tổng hợp có thể do gene nằm trên nhiễm sắc
thể hay plasmid quy định. Trong một số chủng vi khuẩn có thể tồn tại cả 2 cơ
chế này.
β-lactamases của vi khuẩn Gram dương (đại diện là tụ cầu) là đại diện
cho phần lớn các men nhóm A là do cảm ứng, được hình thành ở màng tế bào
cũng như được tiết ra ngoại bào.
β-lactamases của vi khuẩn Gram âm phức tạp hơn. Hầu hết các vi
khuẩn đường ruột có chứa các enzym chủ yếu là do plasmid qui định, được
tạo ra ở mức độ thấp tùy theo loài, lan truyền tính kháng thuốc từ lồi này
sang lồi khác và lây lan trong cộng đồng.
Như vậy, với việc sử dụng các kháng sinh nhóm β-lactam ngày càng
làm gia tăng tỉ lệ kháng thuốc. Đến nay các ESBL mới vẫn đang tiếp tục được
thông báo, điều này cảnh báo một nguy cơ gia tăng vi khuẩn đề kháng KS và
khơng cịn KS điều trị trong tương lai gần. Tuy nhiên, việc phát hiện sớm các
vi khuẩn sinh ESBL và thơng báo cịn chưa có sự thống nhất.
1.2.2. Đặc điểm phân loại ESBL:
Hiện nay các nghiên cứu trên thế giới đã biết đến trên 200 loại ESBL.
Những enzyme được nhiều nhà khoa học phân loại theo các cách khác nhau
và cũng khá phức tạp. Tuy vậy, có hai hệ thống phân loại chính được thống

nhất sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới. Hệ thống phân loại của Ambler và hệ
thống phân loại của nhóm tác giả Bush karen, Jacoby và Medeiros A [27].
1.2.2.1. Hệ thống phân loại theo Ambler: [31].
Ambler chia các β-lactamase thành 4 lớp: A, B, C, D, dựa trên cấu trúc
enzyme có sự giống nhau về các amino acid. Trong đó các lớp A, C, D chỉ có


8

serin trong cấu trúc ở vị trí khởi động nên gọi là các Serin- β-lactamase, cịn
lớp B do có Metallo ở vị trí khởi động trong cấu trúc men nên gọi là các
Metallo- β-lactamase, một số β-lactamase lớp A và D được gọi là ESBL.
1.2.2.2. Hệ thống phân loại theo Bush- Jacoby- medeiros: [38]
Dựa vào các yếu tố sau:
(1) Khả năng hoạt động của men hay gọi là phổ tác dụng của men đối
với các kháng sinh.
(2) Tầm ảnh hưởng của men đối với các chất ức chế β-lactamase
(thường dùng là clavulanic acid) ở các mức khác nhau như bị ức chế, giảm ức
chế hay kháng ức chế.
(3) Vị trí gene mã hóa ESBL nằm trên nhiễm sắc thể hay plasmid.
Lồi vi khuẩn sinh ESBL thuộc nhóm thường gặp hay hiếm gặp. Hệ
thống phân loại này chia β-lactamase ra 4 nhóm chính: 1, 2, 3, 4 và trong đó
nhóm 2 lại được chia thành 8 nhóm phụ: 2a, 2b, 2be, 2br, 2c, 2d, 2e, 2f.


9

Bảng 1.1: Phân loại theo chức năng:
Nhóm

phân tử

Khả năng ly giải

(Ambler)

kháng sinh

Bị ức chế bởi
AC

EDTA

Loại men

Cephalosporinase, đề
1

C

Cẹhalosporins

-

-

kháng tất cả các βlactam trừ carbapenem

2a

A

2b

A

Penicillins
Penicillins, early
cephalosporins

-

+

-

+

-

±

-

TEM-30, SHV-10

+

-

PSE-1, CARB-3

±

-

OXA-1, OXA-10

+

-

+

-

KPC-2, IMI-1, SME-1

-

-

Metalloenzymes

Extended-spectrum
2be

A

cephalosporins,

Các penicillinase từ vi

+

khuẩn Gram dương
TEM-1, TEM-2, SHV1
TEM-3 , SHV-2

monobactams
2br

A

2c

A

2d

D

2e

A

Penicillins
Penicillins,
Carbenicillins
Penicillins,

Cloxacillin
Extended-spectrum
Cephalosporins

Cephalosporinase từ
Proteus vulgaris

Penicillins,
2f

A

Cephalosporins,
Carbapenems

3a,3b,3c

B

4

*

Carbapenems

Penicillinase từ
Burkholderia cepacia

(*): chưa xác định được

Theo bảng phân loại trên, hầu hết ESBL có nguồn gốc từ TEM hay
SHV, chủ yếu do đột biến điểm tại vài vị trí chọn lọc nào đó trên gene.


10

Nhóm 2a: Gồm các penicillinase, khơng bị ức chế bởi clavulanic acid
thường xuất hiện ở những vi khuẩn Gram dương như: S.aureus, Enterobacter
spp.
Nhóm 2b: Gồm các men cổ điển như: TEM-1-2, SHV-1, bị ức chế bởi
Clavulanic acid, các type này thường gặp ở E. coli, chúng không phân hủy
được các cephalosporins phổ rộng thế hệ 3.
Nhóm 2be: Đây là nhóm β- lactamase phổ rộng, không phân hủy
carbapenems, và cả cephamycins ( cefoxitin, cefotetan, cefmetazole…) các
men này gọi là ESBL, bị ức chế bởi Clavulanic acid, sulbactam và
tazobactam. Xuất hiện nhiều ở E. coli, K. pneumoniae và các vi khuẩn đường
ruột khác.
Nhóm 2br: Gồm các men CARB có khả năng phân hủy carbapenem,
thường xuất hiện ở P. aeruginosa, Acinetobacter spp.
1.3. Các phƣơng pháp phát hiện về kiểu hình ESBL:
Tần suất của các vi khuẩn đường ruột sinh ESBL ngày càng tăng đòi
hỏi những phương pháp phát hiện ESBL phải ngày càng chính xác. Trong
những năm gần đây đã có một số cơng trình nghiên cứu về phương pháp phát
hiện vi khuẩn sinh ESBL.
1.3.1. Phƣơng pháp đĩa đơn: [17]
Nguyên tắc: Phương pháp đĩa đơn hay còn gọi là phương pháp sàng
lọc phát hiện khả năng tiết ESBL dựa trên đường kính vơ khuẩn, hoặc giá trị
nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cephalosporines thế hệ 3, aztreonam đối
với vi khuẩn thử nghiệm.
Phƣơng pháp thực hiện:

Thực hiện kháng sinh đồ phương pháp khuếch tán hay phương pháp
tìm MIC trên các loại kháng sinh cefpodoxime, ceftazidime, aztreonam,
cefotaxime và ceftriaxone. Xác định đường kính vô khuẩn hoặc giá trị MIC.


11

Bảng 1.2: Kết quả kháng sinh đồ
Kháng sinh

Đƣờng kính vịng vơ khuẩn

Giá trị MIC
( µg/ml)

K. pneumoniae, K. oxytoca, E. coli
Cefpodoxime

≤ 17

≥4

Ceftazidime

≤ 22

≥1

Aztreonam

≤ 27

≥1

Cefotaxime

≤ 27

≥1

Ceftriaxone.

≤ 25

≥1

Cefpodoxime

≤ 22

≥1

Ceftazidime

≤ 22

≥1

Cefotaxime

≤ 27

≥1

P. mirabillis

Hạn chế:
Phương pháp này chỉ mang tính sàng lọc tức là tiên đốn khả năng cao
là vi khuẩn có tiết ESBL, nếu kết quả dương tính cần phải xác định lại bằng
phương pháp đĩa kết hợp.
1.3.2. Phƣơng pháp đĩa đôi: [17]
Nguyên tắc:
Phương pháp đĩa đôi phát hiện ESBL được Jarlier mô tả đầu tiên vào
năm 1988. Phương pháp này dựa trên nguyên tắc clavulanic acid và các ức
chế β-lactamse khác (sulbactam, tazobactam) sẽ ức chế enzyme ESBL nên
làm giảm mức độ đề kháng của cephalospin thế hệ 3, sẽ được mở rộng ra khi
đặt gần một đĩa kháng sinh có chứa clavulanic acid hoặc ức chế β-lactamses
khác.
Phƣơng pháp thực hiện:
Thực hiện kháng sinh đồ khuếch tán các đĩa kháng sinh cephalospin thế
hệ 3 (ceftazidime, cefotaxime, ceftriaxone), cefpodoxime, cefuroxime hay
aztreonam đặt cách đĩa β-lactam / ức chế β-lactamse (amoxicillin /


12

clavulanicacid, Ampicillin / sulbactams, Ticarcillin / clavulanic acid,
Piperacillin / tazobactam) khoảng 15mm.
Kết quả:
Vi khuẩn tiết ESBL khi có hiện tượng nới rộng vịng vơ khuẩn của đĩa

kháng sinh cephalosporin thế hệ 3 hướng về đĩa kháng sinh β-lactam/ức chế
β-lactamse làm thành hình cổ chai champagne.

Hình 1.1: Minh họa xét nghiệm khuếch tán đĩa đôi
Phát hiện ESBL bằng phương pháp đĩa đơi cho thấy hình cổ chai
champagne (AMC: amoxicillin/clavulanic acid, CAZ: ceftazidime, CTX:
cefotaxime).
Hạn chế:
Phương pháp đĩa đơi có độ đặc hiệu cao nhưng độ nhạy thay đổi vì phụ
thuộc vào:
Khoảng cách của hai loại đĩa kháng sinh: Nếu vịng vơ khuẩn của hai
loại đĩa kháng sinh lớn thì phải đặt hai loại đĩa cách xa nhau để tránh đường
kính của hai loại đĩa kháng sinh trùng lắp lên nhau. Ngược lại, nếu một trong
hai loại đĩa kháng sinh có vịng vơ khuẩn nhỏ thì phải đặt gần nhau để đủ sức
nới rộng vịng vơ khuẩn.


13

Kiểu ESBL mà vi khuẩn tiết ra: Đối với vi khuẩn tiết men ESBL kiểu
CTX-M, kết quả dương tính chỉ thực hiện trên đĩa kháng sinh cefotaxime
hoặc cefodoxime.
1.3.3. Phƣơng pháp đĩa kết hợp: [17]
Nguyên tắc:
Phương pháp đĩa kết hợp do Jacoby và Hans mô tả đầu tiên vào năm
1999. Phương pháp dựa trên nguyên tắc phát hiện tính hiệp lực của đĩa kháng
sinh kết hợp cephalosporin thế hệ 3 với ức chế β-lactamase so với đĩa kháng
sinh cephalosporin thế hệ 3 đơn thuần.
Phƣơng pháp thực hiện:
Thực hiện kháng sinh đồ phương pháp khuếch tán đồng thời hai cặp đĩa

kháng sinh: (i) Ceftazidime và Ceftazidime/ clavulanic acid; cefotaxime và
cefotaxime /clavulanic acid phải bắt buộc trên cùng một đĩa thạch làm kháng
sinh đồ cho ít nhất từng cặp.

Hình 1.2: Minh họa xét nghiệm khuếch tán đĩa kết hợp
Kết quả: Đo đường kính vịng vơ khuẩn. Tính hiệu số đường kính
vịng vơ khuẩn của từng cặp đĩa kháng sinh. Biện luận kết quả như sau:
o ESBL (+) khi đường kính vơ khuẩn ≥ 5mm giữa
Ceftazidime/ clavulanic acid và Ceftazidime, hoặc
Cefotaxime /clavulanic và cefotaxime.


14

o ESBL (-) khi đường kính vơ khuẩn < 5mm trên đồng thời cả hai cặp
kháng sinh.
Hạn chế:
o Phương pháp đĩa kết hợp phải thực hiện trên đồng thời cả hai cặp đĩa
kháng sinh là Ceftazidime có / khơng có clavulanic acid và cefotaxime có/
khơng có clavulanic acid. Nếu thực hiện trên cặp đĩa kháng sinh là
Ceftazidime có/ khơng có clavulanic acid thì độ nhạy 88%, nếu thực hiện trên
cặp đĩa kháng sinh cefotaxime có/ khơng có clavulanic acid có độ nhạy là
66%. Nhưng nếu thực hiện trên cả hai cặp đĩa kháng sinh thì độ nhạy đạt đến
93%.
o Một số vi khuẩn tiết β-lactamase AmpC không phải ESBL, nhưng cũng
làm gia tăng đường kính vịng vơ khuẩn khi có sự hiện diện của clavulanic
acid, và gây dương tính giả.
1.3.4. Phƣơng pháp que E test: [17]
Que E-test phát hiện ESBL có cấu tạo một đầu là cephalosporin thế hệ
3 và đầu đối diện là cephalosporin thế hệ 3 phối hợp với clavulanic acid.

Thực hiện thử nghiệm phát hiện ESBL theo phương pháp giống như
phương pháp kháng sinh đồ tìm MIC với que E-test. Các que E-test được sử
dụng để làm xét nghiệm là cefotaxime/cefotaxime + clavulanic acid
(CT/CTL), ceftazidime/ceftazidime + clavulanic acid (TZ/TZL). Đọc kết quả
MIC và biện luận bằng cách so sánh MIC của các kháng sinh của từng cặp
trên que E-test. ESBL (+) khi đầu que có chứa clavulanic acid có MIC giảm
trên hoặc 8 lần so với đầu que khơng có chứa clavulanic acid.


15

Hình 1.3: Minh họa xét nghiệm bằng phƣơng pháp E-test
1.3.5. Phƣơng pháp tìm ESBL (Bằng máy tự động vitek2 compact):
Hệ thống xét nghiệm tự động Vitek 2 (Biomerieux) tìm ESBL thì sử
dụng ceftazidine hay cefotaxime (0.5µg/ml) đơn độc và kết hợp clavulanic
acid (4µg/ml). Nếu có giảm sinh sản vi khuẩn trong giếng có clavulanic acid
so với giếng khơng có clavulanic acid, thì có sự hiện diện của ESBL. Với một
nghiên cứu của Senders và các cộng sự cho thấy rằng độ đặc hiệu và độ nhạy
cảm của hệ thống máy tự động Vitek2 tìm ESBL đạt tới 99% [22]. Mà ưu thế
của hệ thống vitek2 compact là phân tích tự động và phân loại men βlactamase từ các vi khuẩn gram âm dựa vào kiểu nhạy với nhiều loại kháng
sinh β-lactam khác nhau [24].
Mỗi phương pháp thì có ưu điểm khác nhau, tuy nhiên chưa có phương
pháp nào phát hiện chính xác 100% các chủng sinh men ESBL.
1.4. Phƣơng pháp sinh học phân tử phát hiện kiểu gene ESBL:
Nguồn gốc gene làm cho vi khuẩn sản xuất được ESBL là TEM, SHV,
CTX-M và OXA. Ngồi ra cịn có một số gene khác như PER-1, PER-2 và
VEB-1. Trong tất cả các gene này, chúng tôi chỉ đề cập đến kỹ thuật PCR và
giải trình tự phát hiện TEM, SHV và CTX-M vì đây là các gene phổ biến trên
các vi khuẩn đường ruột; cịn các gene khác thì trên các vi khuẩn Gram âm
không lên men đường (bao gồm P. aeruginosa, A. baumanii…) và cũng

không phải là nguồn gốc đề kháng chính yếu các kháng sinh họ β-lactam trên