Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme chitosanase từ vi khuẩn bacillus subtilis bằng phương pháp lên men chìm năng suất 1200 lít sản phẩm ngày

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA HÓA

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐỀ TÀI:

THIẾT KẾ NHÀ MÁY SẢN XUẤT ENZYME
CHITOSANASE TỪ VI KHUẨN BACILLUS
SUBTILIS BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN CHÌM
NĂNG SUẤT 1200 LÍT SẢN PHẨM / NGÀY

Người hướng dẫn: TS. NGUYỄN HOÀNG MINH
Sinh viên thực hiện: TRẦN THÁI THANH TÂM
Số thẻ sinh viên: 107120271
Lớp: 12SH

Đà Nẵng, 5/2017
iii


MỤC LỤC

Tóm tắt
Nhiệm vụ đồ án
Lời nói đầu

i

Lời cam đoan liêm chính học thuật
Mục lục
Danh sách các bảng biểu, hình vẽ

ii
iii
x

Danh sách các cụm từ viết tắt

xii
Trang

Chương 1: LẬP LUẬN KINH TẾ KỸ THUẬT ........................................................ 1
1.1. Đặc điểm thiên nhiên.............................................................................................. 1
1.2. Nguồn nguyên liệu .................................................................................................. 1
1.3. Hợp tác hóa ............................................................................................................. 1
1.4. Nguồn cung cấp điện .............................................................................................. 1
1.5. Nguồn cung cấp hơi ................................................................................................ 2
1.6. Nhiên liệu................................................................................................................. 2
1.7. Nguồn cung cấp nước và vấn đề xử lí nước ......................................................... 2
1.8. Thốt nước .............................................................................................................. 2
1.9. Giao thông ............................................................................................................... 2
1.10. Năng suất nhà máy ............................................................................................... 2
1.11. Cung cấp nhân công ............................................................................................. 2
Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 4
2.1. Giới thiệu về chitosan ............................................................................................. 4
2.1.1. Định nghĩa, công thức, cấu tạo của chitosan ......................................................... 4
2.1.2. Phương pháp sản xuất chitosan ............................................................................. 4
2.1.3. Ứng dụng của chitosan .......................................................................................... 4

2.2. Giới thiệu enzyme chitosanase .............................................................................. 4
iv


2.2.1. Định nghĩa, công thức, cấu tạo enzyme chitosanase ............................................. 5
2.2.2. Phân loại ................................................................................................................ 5
2.2.3. Cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase ................................................................ 6
2.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme chitosanase của vi
sinh vật ............................................................................................................................. 7
2.2.5. Nguồn thu nhận ..................................................................................................... 8
2.3. Tình hình nghiên cứu enzyme chitosanase trong nước và thế giới .................... 8
2.3.1. Trong nước ............................................................................................................ 8
2.3.2. Thế giới .................................................................................................................. 9
2.4. Giới thiệu về Bacillus subtilis ............................................................................... 10
2.4.1. Lịch sử phát hiện ................................................................................................. 10
2.4.2. Phân loại .............................................................................................................. 10
2.4.3. Đặc điểm của B. subtilis ...................................................................................... 10
2.4.4. Ứng dụng của vi khuẩn B. subtilis....................................................................... 13
2.4.5. Các loại enzyme do B. subtilis sinh ra ................................................................. 14
2.5. Lên men ................................................................................................................. 15
2.5.1. Định nghĩa ........................................................................................................... 15
2.5.2. Các phương pháp lên men ................................................................................... 15
2.6. Rỉ đường ................................................................................................................ 16
Chương 3: QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME CHITOSANASE TỪ VI
KHUẨN B. SUBTILIS BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN CHÌM NĂNG SUẤT
1200 LÍT SẢN PHẨM/NGÀY .................................................................................... 18
3.1. Quy trình cơng nghệ ............................................................................................. 18
3.2. Thuyết minh quy trình cơng nghệ....................................................................... 19
3.2.1. Định lượng ........................................................................................................... 19
3.2.2. Pha loãng sơ bộ.................................................................................................... 19

3.2.3. Xử lý rỉ đường ..................................................................................................... 19
3.2.4. Ly tâm 1 ............................................................................................................... 20
v


3.2.5. Pha loãng ............................................................................................................. 20
3.2.6. Nhân giống .......................................................................................................... 20
3.2.7. Phối trộn môi trường lên men ............................................................................. 21
3.2.8. Tiệt trùng ............................................................................................................. 21
3.2.9. Làm nguội............................................................................................................ 21
3.2.10. Lên men ............................................................................................................. 21
3.2.11. Lọc thu dịch lên men ......................................................................................... 22
3.2.12. Cô đặc ................................................................................................................ 22
3.2.13. Tủa enzyme chitosanase .................................................................................... 22
3.2.14. Ly tâm lạnh........................................................................................................ 22
3.2.15. Hòa tan tủa......................................................................................................... 22
3.2.16. Lọc loại muối .................................................................................................... 22
3.2.17. Phối trộn glycerol .............................................................................................. 22
3.2.18. Rót chai và bảo quản ......................................................................................... 22
Chương 4: TÍNH CÂN BẰNG VẬT CHẤT ............................................................. 23
4.1. Kế hoạch sản xuất của nhà máy.......................................................................... 23
4.2. Cân bằng vật chất ................................................................................................. 23
4.2.1. Rót chai................................................................................................................ 24
4.2.2. Lọc loại muối ...................................................................................................... 25
4.2.3. Hịa tan tủa........................................................................................................... 25
4.2.4. Ly tâm lạnh .......................................................................................................... 25
4.2.5. Tủa enzyme chitosanase ...................................................................................... 25
4.2.6. Cô đặc .................................................................................................................. 27
4.2.7. Lọc ....................................................................................................................... 27
4.2.8. Lên men ............................................................................................................... 28

4.2.9. Nhân giống .......................................................................................................... 28
4.2.10. Tiệt trùng và làm nguội ..................................................................................... 31
vi


4.2.11.Phối trộn mơi trường lên men............................................................................. 31
4.2.12. Pha lỗng ........................................................................................................... 32
4.2.13. Ly tâm 1 ............................................................................................................. 33
4.2.14. Xử lý rỉ đường ................................................................................................... 33
4.2.15. Pha loãng sơ bộ.................................................................................................. 33
4.3. Tổng kết ................................................................................................................. 34
Chương 5: TÍNH VÀ CHỌN THIẾT BỊ ................................................................... 36
5.1. Cách chọn và tính tốn......................................................................................... 36
5.1.1. Chọn thiết bị ........................................................................................................ 36
5.1.2. Tính tốn thiết bị ................................................................................................. 36
5.2 Tính thiết bị ............................................................................................................ 36
5.2.1. Thùng chứa rỉ đường ........................................................................................... 36
5.2.2. Thùng pha loãng sơ bộ ........................................................................................ 37
5.2.3. Thùng chứa nước cho pha loãng sơ bộ ................................................................ 38
5.2.4. Thiết bị thủy phân đường .................................................................................... 39
5.2.5. Máy ly tâm 1 ........................................................................................................ 39
5.2.6. Thùng pha loãng .................................................................................................. 41
5.2.7. Thùng chứa nước cho pha loãng ......................................................................... 41
5.2.8. Thùng phối trộn môi trường ................................................................................ 42
5.2.9. Thiết bị tiệt trùng và làm nguội ........................................................................... 42
5.2.10. Thùng chứa dịch sau khi tiệt trùng và làm nguội .............................................. 44
5.2.11. Thiết bị nhân giống ............................................................................................ 45
5.2.12. Thiết bị lên men có bộ đảo trộn cơ học dạng sủi bọt ........................................ 48
5.2.13. Thùng chứa dịch sau khi lên men ...................................................................... 50
5.2.14. Máy lọc ép khung bản ....................................................................................... 50

5.2.15. Thùng chứa bã sinh khối ................................................................................... 52
5.2.16. Thùng chứa dịch sau lọc .................................................................................... 52
vii


5.2.17. Thiết bị cô đặc chân không ............................................................................... 53
5.2.18. Thiết bị kết tủa ................................................................................................... 54
5.2.19. Máy ly tâm lạnh................................................................................................. 55
5.2.20. Thùng khuấy trộn hòa tan tủa ............................................................................ 56
5.2.21. Thiết bị siêu lọc ................................................................................................. 56
5.2.22. Thùng chứa glycerol .......................................................................................... 58
5.2.23. Thùng chứa dịch sau lọc và phối trộn glycerol ................................................. 59
5.2.24. Thiết bị rót chai và đóng nhãn ........................................................................... 59
5.2.25. Chọn bơm .......................................................................................................... 64
5.3 Tổng kết .................................................................................................................. 66
Chương 6: CƠ CẤU TỔ CHỨC NHÀ MÁY............................................................ 68
6.1. Bộ máy tổ chức nhà máy của cơng ty ................................................................. 68
6.2. Tính nhân lực của nhà máy ................................................................................. 69
6.2.1. Chế độ làm việc .................................................................................................. 69
6.2.2. Nhân lực ............................................................................................................. 69
Chương 7: TÍNH XÂY DỰNG ................................................................................... 73
7.1. Phân xưởng sản xuất chính ................................................................................. 73
7.2. Kho chứa thành phẩm ......................................................................................... 73
7.3. Kho chứa nguyên vật liệu .................................................................................... 73
7.4. Phịng kỹ thuật ...................................................................................................... 74
7.5. Phịng quản lí chất lượng ..................................................................................... 74
7.6. Nhà hành chính ..................................................................................................... 74
7.7. Nhà để xe ............................................................................................................... 74
7.8. Gara ô tô ................................................................................................................ 75
7.9. Nhà thường trực bảo vệ ....................................................................................... 75

7.10. Nhà sinh hoạt vệ sinh ......................................................................................... 75
7.11. Nhà ăn .................................................................................................................. 75
viii


7.12. Khu đất mở rộng ................................................................................................ 76
7.13. Khu xử lý nước thải ............................................................................................ 76
7.14. Khu xử lí nước .................................................................................................... 76
7.15. Khu cung cấp nước ............................................................................................. 76
7.16. Trạm phát điện dự phòng .................................................................................. 76
7.17. Trạm biến áp ....................................................................................................... 76
7.18. Phân xưởng cơ khí .............................................................................................. 76
7.19. Phân xưởng lị hơi ............................................................................................... 77
7.20. Trạm bơm ............................................................................................................ 77
7.21. Kho vật tư thiết bị............................................................................................... 77
7.22. Tổng kết ............................................................................................................... 78
Chương 8: TÍNH NHIỆT - HƠI - NƯỚC ................................................................. 80
8.1. Tính nhiệt – hơi ..................................................................................................... 80
8.1.1. Quá trình nâng nhiệt ............................................................................................ 80
8.1.2. Quá trình giữ nhiệt............................................................................................... 81
8.1.3. Tính nhiệt – hơi cho các cơng đoạn ..................................................................... 82
8.1.4. Tổng lượng hơi dùng trong nhà máy, trong một ngày ........................................ 87
8.1.5. Tính và chọn lị hơi .............................................................................................. 87
8.1.6. Tính nhiên liệu dầu FO ........................................................................................ 88
8.1.7. Dầu DO ................................................................................................................ 89
8.2. Tính nước .............................................................................................................. 89
8.2.1. Nước dùng cho sản xuất ...................................................................................... 89
8.2.2 Nước sử dụng phục vụ cho việc sản xuất ............................................................. 89
8.2.3. Nước sinh hoạt ..................................................................................................... 89
Chương 9: KIỂM TRA SẢN XUẤT VÀ SẢN PHẨM ............................................. 91

9.1. Kiểm tra nguyên liệu đầu vào.............................................................................. 91
9.1.1. Rỉ đường .............................................................................................................. 91
ix


9.1.2. Nước dùng để thủy phân rỉ đường ...................................................................... 91
9.2. Kiểm tra các công đoạn sản xuất ........................................................................ 91
9.2.1. Thủy phân rỉ đường ............................................................................................. 91
9.2.2. Pha chế dịch lên men ........................................................................................... 92
9.2.3. Lên men ............................................................................................................... 92
9.2.4. Công đoạn sau lên men ....................................................................................... 92
9.3. Kiểm tra chất lượng sản phẩm............................................................................ 92
Chương 10: AN TỒN LAO ĐỘNG VÀ BẢO VỆ MƠI TRƯỜNG .................... 94
10.1. An toàn lao động ................................................................................................. 94
10.1.1. Tai nạn xảy ra do các nguyên nhân sau............................................................. 94
10.1.2. Những biện pháp hạn chế tai nạn lao động ....................................................... 94
10.1.3. An toàn vận hành trong sản xuất các chất sinh học .......................................... 94
10.1.4. Các trạm khí nén ............................................................................................... 95
10.1.5. Các máy lọc để làm sạch và thu hồi khí, bụi ..................................................... 95
10.2. Bảo vệ môi trường .............................................................................................. 95
10.2.1. Làm sạch không khí .......................................................................................... 95
10.2.2. Làm sạch nước thải ........................................................................................... 95
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. 97
KẾT LUẬN .................................................................................................................. 98
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 99

x


DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Phân loại enzyme chitosanase dựa vào sự phân cắt đặc hiệu .......................... 6
Bảng 2.2 Phản ứng sinh hóa của vi khuẩn B. subtilis ................................................... 12
Bảng 3.1 Thành phần môi trường giữ giống và nhân giống.......................................... 21
Bảng 3.2 Thành phần môi trường lên men ................................................................... 21
Bảng 4.1 Kế hoạch sản xuất của nhà máy năm 2017 .................................................... 23
Bảng 4.2 Mức hao hụt qua từng công đoạn................................................................... 24
Bảng 4.3 Bảng thay đổi độ ẩm của nguyên liệu qua các công đoạn ............................. 24
Bảng 4.4 Bảng tổng kết số liệu tính tốn cân bằng vật chất.......................................... 34
Bảng 5.1 Một số thông số kỹ thuật của máy ly tâm ..................................................... 41
Bảng 5.2 Thông số kỹ thuật của thiết bị tiệt trùng và làm nguội .................................. 44
Bảng 5.3 Thông số kỹ thuật tủ cấy ................................................................................ 46
Bảng 5.4 Thông số thiết bị nhân giống Bionet F3 50.................................................... 47
Bảng 5.5 Thông số thiết bị nhân giống Bionet F3 500.................................................. 48
Bảng 5.6 Thông số kỹ thuật thiết bị lọc ép khung bản ................................................. 51
Bảng 5.7 Thông số kỹ thuật thiết bị cô đặc hút chân không ........................................ 54
Bảng 5.8 Thông số thiết bị ly tâm ................................................................................ 56
Bảng 5.9 Các thông số của thiết bị là ............................................................................ 58
Bảng 5.10 Thông số máy rửa chai ................................................................................. 60
Bảng 5.11 Các thơng sơ của máy chiết rót và đóng nút chai ........................................ 62
Bảng 5.12 Các thơng số kỹ thuật của máy dãn nhãn ..................................................... 63
Bảng 5.13 Các thông số kỹ thuật của bơm định lượng ................................................. 64
Bảng 5.14 Các thông số kỹ thuật của bơm ly tâm ......................................................... 65
Bảng 5.15 Bảng tổng kết thiết bị ................................................................................... 66
Bảng 6.1 Bảng phân công lao động gián tiếp ................................................................ 69
Bảng 6.2 Bảng phân công lao động trong nhà máy theo từng thời gian làm việc ........ 70
Bảng 6.3 Bảng phân công lao động trực tiếp ................................................................ 71
Bảng 7.1 Bảng kích thước các cơng trình xây dựng tồn nhà máy ............................... 78
Bảng 8.1 Bảng tổng kết hơi dùng trong nhà máy .......................................................... 87
Bảng 8.2 Kích thước lị hơi ........................................................................................... 88

xi


DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Cấu trúc của chitosan ...................................................................................... 4
Hình 2.2 Tế bào vi khuẩn B. subtilis quan sát dưới kính hiển vi .................................. 12
Hình 3.1 Sơ đồ quy trình sản xuất enzyme chitosanase ................................................ 19
Hình 5.1 Thùng chứa rỉ đường ...................................................................................... 37
Hình 5.2 Thiết bị pha lỗng ........................................................................................... 38
Hình 5.3 Máy ly tâm dạng đĩa ...................................................................................... 40
Hình 5.4 Cấu tạo máy ly tâm đĩa .................................................................................. 40
Hình 5.5 Thiết bị tiệt trùng Alpha-laval ....................................................................... 43
Hình 5.6 Cơ chế tiệt trùng và làm nguội ...................................................................... 44
Hình 5.7 Tủ cấy KLC-VC-3 ......................................................................................... 45
Hình 5.8 Thiết bị nhân giống Bionet F3 50 .................................................................. 47
Hình 5.9 Thiết bị nhân giống Bionet F3 500 ................................................................ 48
Hình 5.10 Thiết bị lên men có bộ đảo trộn cơ học dạng sủi bọt ................................... 49
Hình 5.11 Máy lọc ép khung bản ................................................................................. 50
Hình 5.12 Thiết bị cơ đặc chân khơng .......................................................................... 53
Hình 5.13 Máy ly tâm lạnh ........................................................................................... 55
Hình 5.14 Thiết bị siêu lọc ............................................................................................ 57
Hình 5.15 Cấu tạo của thiết bị siêu lọc TUF. ................................................................ 58
Hình 5.16 Máy rửa chai tự động ................................................................................... 60
Hình 5.17 Máy kiểm tra chai sau rửa ............................................................................ 60
Hình 5.18 Máy chiết rót và đóng nút chai .................................................................... 61
Hình 5.19 Máy kiểm tra mức dịch trong chai ............................................................... 63
Hình 5.20 Máy dán nhãn ............................................................................................... 63
Hình 5.21 Bơm định lượng ........................................................................................... 64

Hình 5.22 Bơm ly tâm .................................................................................................. 65
Hình 8.1 Lị hơi LD3/10W ............................................................................................ 88

xii


DANH SÁCH CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT

CCVC: Công chức viên chức.
KKT: Khu kinh tế.
NMR: Nuclear Magnetic Resonance
GlcN: Glucosamine
GlcNAc: N –Acetylglucosamine
COD: Chemical Oxygen Demand
BOD: Biochemical Oxygen Demand
VSV: Vi sinh vật

xiii



Đề tài: Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme chitosanase từ vi khuẩn Bacillus subtilis bằng phương pháp
lên men chìm năng suất 1200 lít sản phẩm/ ngày

Chương 1: LẬP LUẬN KINH TẾ KỸ THUẬT [1]

Miền trung Việt Nam là cầu nối thông thương giữa các tỉnh miền Bắc và miền
Nam nước ta. Nơi đây nền kinh tế đang ngày càng phát triền với nhiều khu công
nghiệp lớn, như khu công nghiệp Hịa Cầm, khu cơng nghiệp Hịa Khánh (Đà Nẵng)
và khu kinh tế mở Chu Lai (Quảng Nam), khu kinh tế Dung Quất (Quảng Ngãi). Cùng

với sự phát triển của các ngành công nghiệp nặng, công nghiệp nhẹ: dệt may, y tế, thực
phẩm,…thì sự có mặt của nhà máy sản xuất enzyme sẽ có ý nghĩa vơ cùng to lớn, khi
đây là một ngành sản xuất còn khá mới ở nước ta và có khả năng mang lại kinh tế lớn.
Do đó, nhà máy mà sản xuất enzyme chitosanase từ nguyên liệu rỉ đường sẽ
nằm ở khu kinh tế Dung Quất (Quảng Ngãi), nơi có nhà máy đường lớn nhất Miền
trung – Tây Nguyên.
1.1. Đặc điểm thiên nhiên
- Quảng Ngãi có vị trí thuận lợi gần với các nguồn cung cấp rỉ đường từ Nhà
máy đường Phổ Phong, vì khơng những việc vận chuyển nguyên liệu gặp thuận lợi, mà
còn giảm chi phí vận chuyển và những rủi ro trong lúc sản xuất.
- Giao thông thuận lợi, việc đi lại và vận chuyển hàng hóa với các tỉnh thành
khơng gặp trở ngại, đặc biệt khi nhà máy nằm ở miền trung, rất thuận lợi để vận
chuyển sản phẩm đến miền Bắc và cả miền Nam
- Thời tiết nơi đây không bao giờ quá nóng như miền Nam hay quá lạnh như
miền Bắc, nên ít ảnh hưởng đến q trình sản xuất.
1.2. Nguồn nguyên liệu
Nguồn nguyên liệu dồi dào từ nội tỉnh do gần nhà máy đường, rồi việc vận
chuyển các nguyên liệu khác từ các nơi về cũng rất thuận lợi.
1.3. Hợp tác hóa
Do nằm gần nguồn ngun liệu chính, nên sẽ tiết kiệm chi phí vận chuyển, Nhà
máy đặt trong khu cơng nghiệp nên việc hợp tác hóa, liện hợp hóa được tiến hành chặt
chẽ, do đó việc sử dụng những cơng trình điện, nước, giao thơng, cũng như việc nhập
nguyện liệu và tiêu thụ sản phẩm… được tiến hành thuận lợi cho nên giảm bớt được
vốn đầu tư xây dựng, rút ngắn thời gian hoàn vốn, đồng thời tận dụng tuần hồn các
sản phẩm phụ tránh được ơ nhiễm môi trường.
1.4. Nguồn cung cấp điện
Nguồn cung cấp điện cho nhà máy lấy từ mạng điện lưới quốc gia, nhờ trạm
biến áp 500 KV có dịng điện tiêu thụ với điện áp 220/380V.
SVTH: Trần Thái Thanh Tâm – 12 SH

GVHD: TS. Nguyễn Hoàng Minh

1


Đề tài: Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme chitosanase từ vi khuẩn Bacillus subtilis bằng phương pháp
lên men chìm năng suất 1200 lít sản phẩm/ ngày

Để đề phịng mất điện nhà máy có lắp đặt thêm máy phát điện dự phòng.
1.5. Nguồn cung cấp hơi
Hơi nước được dùng để tiệt trùng thiết bị, thanh trùng mơi trường,…vì khơng có
nhà máy sản xuất hơi nước trong khu vực nên hơi sẽ do nhà máy tự cung cấp nếu vậy
cần có lò hơi riêng, áp suất của hơi dùng là 3at, nhiên liệu dùng để đốt lò là dầu FO.
1.6. Nhiên liệu
Chủ yếu được dùng để đốt lò hơi cho nhà máy và trạm phát điện dự phòng.
Nhiên liệu sử dụng để đốt lò hơi là dầu FO, còn sử dụng cho trạm phát điện là dàu DO,
cả 2 nguồn nhiên liệu đều được nhập từ bên ngoài.
1.7. Nguồn cung cấp nước và vấn đề xử lí nước
Nước là nhu cầu không thể thiếu được, nguồn nước cung cấp cho nhà máy được
lấy từ Cơng ty cổ phần cấp thốt nước và xây dựng Quảng Ngãi. Để chủ động nguồn
nước nhà máy có thể tự xây dựng thêm các bể chứa.
Đồng thời nước cần cho quá trình sản xuất, lên men cần phải xử lí để đạt tiêu
chuẩn cho q trình sản xuất.
1.8. Thoát nước
Nước thải ra từ nhà máy cần được xử lí đạt chuẩn trước khi thải ra ngồi. Tránh
gây ảnh hưởng đến môi trường xung quanh. Đặc biệt với những nhà máy về công nghệ
sinh học như thế này thì vấn đề xử lí nước thải càng phải được xem trọng.
1.9. Giao thông
Trong nhà máy cần phải đảm bảo giao thơng thuận lợi cho q trình đi lại của
nhân viên và vận chuyển hàng hóa. Đồng thời phải đảm bảo an tồn tính mạng cho con

người. Đồng thời phương tiện vận chuyển cũng phải đảm bảo tránh gây trở ngại trong
quá trình sản xuất.
1.10. Năng suất nhà máy
Nhà máy sản xuất enzyme chitosanase với năng suất 1200 lít sản phẩm/ ngày.
1.11. Cung cấp nhân công
Đến năm 2013 dân số trung bình của tỉnh Quảng Ngãi là 1.236.250 người. Tồn
tỉnh có khoảng 324.000 hộ gia đình, bình qn 3,75 nhân khẩu/hộ. Dân số thành thị có
chiếm 14,62% và dân số nông thôn chiếm 85,38%. Trong cơ cấu dân số phân theo giới
tính, nữ chiếm 50,7%, nam chiếm 49,3%; phân theo độ tuổi, từ 0-59 tuổi chiếm
khoảng 88,51%, chỉ tiêu này cho thấy đây là cơ cấu dân số trẻ, riêng dân số dưới 15
tuổi chiếm 25,55%, đây là lực lượng lao động dự trữ dồi dào của tỉnh.
Đội ngũ cán bộ, cơng chức, viên chức trong hệ thống chính trị ngày càng được
nâng lên. Trong số lực lượng CCVC tồn tỉnh có trên 50% có trình độ đại học, sau đại
SVTH: Trần Thái Thanh Tâm – 12 SH

GVHD: TS. Nguyễn Hoàng Minh

2


Đề tài: Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme chitosanase từ vi khuẩn Bacillus subtilis bằng phương pháp
lên men chìm năng suất 1200 lít sản phẩm/ ngày

học và 5,9% có trình độ cao cấp chính trị; từ năm 2010 đến năm 2013, tỉnh đã cử cán
bộ, công chức, viên chức đi đào tạo 18 tiến sĩ, 277 thạc sĩ, 124 bác sĩ chuyên khoa cấp
I và 26 bác sĩ chuyên khoa cấp II. Tuy nhiên, qua khảo sát, công tác quy hoạch phát
triển nguồn nhân lực của tỉnh còn hạn chế, chất lượng vẫn chưa đáp ứng yêu cầu, nhất
là cán bộ công chức ngành y tế, khoa học và công nghệ,…Theo dự báo trong thời gian
tới, KKT Dung Quất và các KCN trên địa bàn tỉnh cần hàng ngàn lao động có tay nghề
và kỹ thuật cao,…

Do đó, tỉnh Quảng Ngãi có thể đáp ứng nhu cầu nhân cơng của nhà máy.
(Tổng cục tống kê – Cục thống kê tỉnh Quảng Ngãi)

SVTH: Trần Thái Thanh Tâm – 12 SH

GVHD: TS. Nguyễn Hoàng Minh

3


Đề tài: Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme chitosanase từ vi khuẩn Bacillus subtilis bằng phương pháp
lên men chìm năng suất 1200 lít sản phẩm/ ngày

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Giới thiệu về chitosan
2.1.1. Định nghĩa, công thức, cấu tạo của chitosan
Chitosan một polysacarit mạch thẳng, là dẫn xuất deacetyl hố của chitin, trong
đó nhóm (–NH2) thay thế nhóm (-COCH3) ở vị trí C (2). Chitosan được cấu tạo từ các
mắc xích D-glucozamin liên kết với nhau bởi các liên kết β-(1-4)-glicozit, do vậy
chitosan có thể gọi là poly β-(1-4)-2-amino-2-deoxi-D-glucozơ hoặc là poly β-(1-4)-Dglucozamin (cấu trúc III).

Hình 2.1 Cấu trúc của chitosan (hay Poliglusam; Deacetylchitin; Poly-(D)
glucosamine) [13]
2.1.2. Phương pháp sản xuất chitosan
Chitosan được sản xuất trong công nghiệp bằng phương pháp deacetyl hóa
chitin, vốn là chất tạo nên cấu trúc của lớp vỏ của các loài giáp xác và thành tế bào của
lồi nấm. Độ deacetyl hóa (%DD) có thể được xác định bằng phương pháp đo phổ
NMR, %DD của chitosan thương mại thường dao động trong khoảng từ 60 đến 100%.
Nhìn chung, phân tử lượng của chitosan thương mại nằm trong khoảng 3.800 – 20.000

Daltons. Phương pháp deacetyl hóa chitin thơng dụng là sử dụng phương pháp hố học
và phương pháp vật lý, nhưng do chi phí lớn, hiệu suất thấp, sản phẩm có hoạt tính
khơng cao nên phương pháp sinh học sử dụng các enzyme thủy phân chitin là phương
pháp đang được áp dụng. Các enzyme có thể dùng như: papain,
hemicellulase, cellulase, lipase.
2.1.3. Ứng dụng của chitosan
Khác với chitin thì chitosan là chất hịa tan trong dung acid lỗng, cùng với tính
khơng độc, khả năng tương thích sinh học và phân huỷ sinh học, nên chitosan được
ứng dụng nhiều trong nông nghiệp, mỹ phẩm, xử lý nước và y học…
- Nó có thể được dùng trong nơng nghiệp với vai trị xử lý hạt giống và Thuốc
SVTH: Trần Thái Thanh Tâm – 12 SH

GVHD: TS. Nguyễn Hoàng Minh

4


Đề tài: Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme chitosanase từ vi khuẩn Bacillus subtilis bằng phương pháp
lên men chìm năng suất 1200 lít sản phẩm/ ngày

trừ dịch hại sinh học, giúp cây trồng chống lại các loại bệnh do nấm.
- Trong sản xuất rượu vang, nó có thể được sử dụng như là tác nhân lọc cặn và
bảo quản.
- Trong cơng nghiệp, nó có thể được sử dụng trong sơn tự làm liền vết trầy
xước polyurethane.
- Trong y học, nó có thể được ứng dụng trong băng gạc y tế để làm giảm chảy
máu và chống nhiễm khuẩn; truyền tải thuốc qua da.
Không chỉ chitosan mà ngay cả sản phẩm thủy phân từ nó cũng đang được
nghiên cứu và ứng dụng khá rộng rãi hiện nay. Trong đó, có thể kể đến [14]:
- O-and N-Carboxymethlchitosans. Carboxymethylchitosan (CM-chitosan).

- Chitosan 6-O-sulfate.
- Alkylated chitosans.
- Đặc biệt, Chitooligosaccharides (CHOS) là homooligomers - heterooligomers
của N-acetylglucosamine và D-glucosamine. CHOS là sản phẩm thủy phân từ chitosan
bằng enzyme: chitosanase, phương pháp hóa học hoặc kết hợp. Một số ứng dụng của
CHOS như là ức chế sự tăng trưởng khối u, chống loãng xương,...
Với những ứng dụng to lớn như vậy thì việc nghiên cứu phương pháp để tạo ra
các sản phẩm thủy phân là hoàn toàn cần thiết, đặc biệt là sử dụng enzyme thủy phân –
chitosanase [12].
2.2. Giới thiệu enzyme chitosanase
2.2.1. Định nghĩa, công thức, cấu tạo enzyme chitosanase
Chitosan N - acetylglucosaminohydrolase hoặc chitosanase (EC3.2.1.132) là
enzyme xúc tác thủy phân liên kết β-(1-4)-glicozit của chitosan [12].
2.2.2. Phân loại
2.2.2.1 Theo chức năng
Enzyme chitosanase được chia làm 2 loại:
- Enzyme chỉ thủy phân chitosan.
- Enzyme thủy phân cả chitosan và carboxymethyl cellulose [14].
2.2.2.2. Theo sự tương đồng về cấu trúc chuỗi aminoacid
Theo cách phân loại này, chitosanase được phân loại thành 5 họ: GH-5, GH-8,
GH-46, GH-75, GH-80.
- GH7 là một họ cellulase và trong một vài trường hợp, hoạt tính của
chitosanase đã được phát hiện như một hoạt tính phụ của các enzym này.
- GH5 chứa nhiều hoạt tính enzyme, bao gồm chitosanase, xenlulase,
licheninase, mannanase và xylanases. Một lần nữa, hoạt tính của chitosanase chỉ được
SVTH: Trần Thái Thanh Tâm – 12 SH

GVHD: TS. Nguyễn Hoàng Minh

5

Đề tài: Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme chitosanase từ vi khuẩn Bacillus subtilis bằng phương pháp
lên men chìm năng suất 1200 lít sản phẩm/ ngày

phát hiện trong một số ít trường hợp, và hoạt tính này dường như là một hoạt tính phụ.
- Trong GH8, các enzyme được chú giải là chitosanase xảy ra thường xuyên hơn
(bên cạnh ví dụ như cellulase và xylanases), và họ này dường như chứa một vài
chitosanase thực sự.
- Ba gia đình khác, GH46, GH75 và GH80, chỉ chứa chitosanase. Gia đình
GH75 và GH80 chỉ có một vài thành viên và khơng có thơng tin về cấu trúc đồng thời
có rất ít thơng tin chức năng sẵn có cho các enzym này. Các chitosanase được nghiên
cứu tốt nhất, đến nay là những loại thuộc về gia đình GH46 [20].
2.2.2.3. Dựa vào sự cắt đặc hiệu của enzyme chitosanase
Dựa vào sự cắt đặc hiệu của enzyme chitosanase thì enzyme này được chia làm
3 loại: I, II và II [14].
Bảng 2.1 Phân loại enzyme chitosanase dựa vào sự phân cắt đặc hiệu
Enzyme chitosanase

Kiểu phân cắt

Đặc điểm

Loại III
Streptomyces griseus HUT 6037
Bacillus circulans MH-K1
Nocardia orientalis
Bacillus circulans WL-12

Phân cắt liên kết

GlcNAc - GlcN

Loại II
Bacillus sp. Không 7-M

Phân cắt liên kết
GlcN - GlcN

Loại III

Phân cắt liên kết

Streptomyces griseus HUT 6037
Bacillus circulans MH-K1
Nocardia orientalis
Bacillus circulans WL-12

GlcN - GlcN

: GlcN

GlcN – GlcN

GlcN - GlcNAc

: GlcNAc

2.2.3. Cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase
Đây là phản ứng "một bước", nơi sự proton hóa của sự oxy hoá glycozit xảy ra
đồng thời với một cuộc tấn công vào carbon dị thường bằng một phân tử nước đã được

kích hoạt. Phân tử nước này nằm giữa một nhóm carboxylic và cacbon anomeric và nó
được kích hoạt bởi nhóm cacboxylic có vai trị là một bazơ. Do đó phân tử nước tiếp
cận cacbon anomeric với vai trò của cơ chất xúc tác, cơ chế này dẫn tới sự đảo ngược
cấu hình [12].
SVTH: Trần Thái Thanh Tâm – 12 SH

GVHD: TS. Nguyễn Hoàng Minh

6


Đề tài: Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme chitosanase từ vi khuẩn Bacillus subtilis bằng phương pháp
lên men chìm năng suất 1200 lít sản phẩm/ ngày

2.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme chitosanase
của vi sinh vật
Q trình tổng hợp enzyme nói chung cũng như tổng hợp enzyme chitosanase ở
vi sinh vật chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau như: độ ẩm, nhiệt độ, pH, độ
thơng thống, thành phần mơi trường...
- Ảnh hưởng của nhiệt độ: nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng sinh
tổng hợp enzyme của vi sinh vật cũng như tính chất của enzyme được tổng hợp. Mỗi
loại vi sinh vật có nhiệt độ thích hợp có khác nhau. Tuy nhiên, đa số các vi sinh vật
sinh tổng hợp enzyme không bền với nhiệt độ và bị kiềm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ
cao hơn nhiệt độ thích hợp. Vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme chitosanase bao gồm: vi
khuẩn, xạ khuẩn và nấm thường là những vi sinh vật ưa ấm, nhiệt độ nuôi cấy thưởng
từ 20 – 400C.
- Ảnh hưởng của pH môi trường: khi dùng phương pháp ni cấy bề mặt, pH
mơi trường ít ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp enzyme ở vi sinh vật, hơn nữa pH môi
trường hầu như không thay đổi trong quá trình phát triển của vi sinh vật. Ngược lại,
trong phương pháp lên men chìm pH mơi trường ảnh hưởng rất lớn đến sự tích luỹ

enzyme chitosanase trong môi trường. Các vi sinh vật sinh tổng hợp chitosanase được
nghiên cứ chủ yếu là các vi sinh vật ưa pH trung tính 5,5 - 7
- Độ thơng khí: độ thơng khí trong mơi trường có ảnh hưởng lớn đến quá trình
sinh tổng hợp chitosanase. Tuy nhiên, ảnh hưởng này có khác nhau tuỳ theo giống vi
sinh vật.
- Ảnh hưởng thành phần mơi trường: thành phần mơi trường có ảnh hưởng rất
lớn đến khả năng sinh tổng hợp enzyme. Để tăng lượng enzyme trong môi trường cần
lựa chọn nguồn C, N, muối khống thích hợp. Khi so sánh ảnh hưởng của các nguồn
nitơ khác nhau tới khả năng sinh tổng hợp enzyme chitosanase từ Gongronella sp. JG
(W.Zhou et al, 2007) thấy rằng: peptone, glutamic acid và aspartic acid làm tăng khả
năng sinh enzyme chitosanase, phenyl alanine, amoni sunfate và cao men thì khơng
ảnh hưởng lớn tới khả năng sinh enzyme, trong đó ure, tyrosine, ammonium nitrat và
ammonium chloride cho khả năng sinh enzyme thấp hơn.
- Ảnh hưởng của thời gian ni cấy: trong suốt q trình ni cấy tồn bộ quá
trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật gắn liền với sự thay đổi theo thời gian.
Chitosanase là sản phẩm của q trình trao đổi chất, nó vừa có nhiệm vụ phân giải cơ
chất của mơi trường làm nguồn dinh dưỡng cho quá trình sinh trưởng và phát triển của
cơ thể, mặt khác chitosanase cũng là một thành phần trong thành tế bào nên sự sản
sinh chitosanase của chúng có ý nghĩa sinh lý quan trọng đặc biệt trong quá trình phân
SVTH: Trần Thái Thanh Tâm – 12 SH

GVHD: TS. Nguyễn Hoàng Minh

7


Đề tài: Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme chitosanase từ vi khuẩn Bacillus subtilis bằng phương pháp
lên men chìm năng suất 1200 lít sản phẩm/ ngày

chia tế bào. Chính vì vậy quá trình sinh tổng hợp chitosanase cũng biến thiên theo

đường cong sinh trưởng của vi sinh vật (pha tiềm phát, pha log, pha cân bằng và pha tử
vong) [15].
2.2.5. Nguồn thu nhận
Enzyme chitosanase được tìm thấy từ: vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm, virus, sâu bọ,
côn trùng, và từ một số loài thực vật.
Tuy nhiên, việc thu nhận enzyme từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm nổi trội hơn so
với các nguồn khác [2]:
- Đây là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzyme với số lượng lớn.
- Là nguồn nguyên liệu mà con người có thể chủ động tạo ra được
- Enzyme vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vượt xa các sinh vật khác.
- Hệ enzyme vi sinh vật vô cùng phong phú.
- Vi sinh vật phát triển với tốc độ vô cùng nhanh chóng.
Do đó, hiện nay nguồn cung cấp chủ yếu là vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm (từ nấm
gây bệnh cho thực vật - Fusarium solani f. sp. Phaseoli) [17].
Đồng thời, các vi sinh vật muốn được sử dụng là nguồn nguyên liệu tách
enzyme cần phải thỏa mãn các điều kiện sau [2]:
- Khả năng tổng hợp enzyme mạnh trong một thời gian ngắn.
- Dễ tách enzyme và không sinh độc tố.
Dưới đây là một số nguồn vi sinh vật từng được nghiên cứu để sản xuất enzyme
chitosanase như:
- Từ Bacillus pumilus BN-262 thì có khoảng 25-35% N -acetylated chitosan đã
được phân cắt bởi chitosanase [18].
- Từ Penicillium islandicum thì có khoảng 30-60% N -acetylated chitosan đã
được phân cắt bởi chitosanase [19].
- Từ Bacillus sp. MET 1299 thì có khoảng 90% N -acetylated chitosan đã được
phân cắt bởi chitosanase [20].
Có thể thấy enzyme chitosanase được sinh tổng hợp từ Bacillus sp. mang lại
hiệu quả cao hơn hẳn. Trong các loài thuộc giống Bacillus: B. subtilis, B.
megaterium, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens…thì lồi được sử dụng phổ nhất
hiện này là B. subtilis vì nó có khả năng sinh tổng hợp enzyme mạnh nhất [2].

2.3. Tình hình nghiên cứu enzyme chitosanase trong nước và thế giới
2.3.1. Trong nước
Từ những ứng dụng thực tiễn do enzyme chitosanase mang lại mà ở nước ta
trong những năm gần đây đã có khá nhiều báo cáo, nghiên cứu về loại enzyme này như
SVTH: Trần Thái Thanh Tâm – 12 SH

GVHD: TS. Nguyễn Hoàng Minh

8


Đề tài: Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme chitosanase từ vi khuẩn Bacillus subtilis bằng phương pháp
lên men chìm năng suất 1200 lít sản phẩm/ ngày

là:
- Năm 2008, ThS. Phạm Ngọc Thùy đã bước đầu nghiên cứu thu nhận chế
phẩm enzyme chitosanase kỹ thuật từ Streptomyces griseus [3].
- Hai năm sau 2010, ThS. Ngô Xuân Mạnh, ThS. Nguyễn Thị Phương Nhung đã
tiếp tục nghiên cứu trên và phát triển theo hướng lựa chọn điều kiện
tối ưu để sản xuất chitosanase từ Streptomyces Griseus (Chủng NN2) [4].
- Tiếp theo vào năm 2012 thì Th.S Nguyễn Thị Phương Nhung tiếp tục thực
hiện nghiên cứu thu nhận đồng thời mô tả đặc tính của enzyme chitosanasse từ Vi
khuẩn Bacilus Licheniforrmis NN1” [5].
- Năm 2014, Th.S Bùi Thị Hường (2014) đã nghiên cứu thu nhận và xác định
một số đặc tính enzyme chitosanase từ vi khuẩn Bacillus licheniformis VKNN1 [6].
2.3.2. Thế giới
Từ những năm đầu thập niên 90 thì đã có khá nhiều nghiên cứu về enzyme
chitosanase ở trên thế giới.
- Từ năm 1995 thì T Fukamizo , Y Honda , S Goto , Boucher , R Brzezinski đã
nghiên cứu cơ chế phản ứng của chitosanase từ Streptomyces sp. N174. Chitosanase

được sản xuất bởi các dòng Streptomyces lividans TK24 mang gen CSN từ
Streptomyces sp. N174, và tinh chế bằng S-Sepharose và Bio-Gel - phương pháp sắc
ký cột. Khoảng (25-35%) chitosan đã được N-acetyl hóa bởi chitosanase tinh khiết, và
cấu trúc của sản phẩm đã được phân tích bằng quang phổ NMR [21].
- Đồng thời khối lượng phân tử của enzyme chitosanase vào khoảng 10 - 50
kDal đã được xác định bởi khá nhiều tác giả như Fenton and Eveleigh (1981),
Somashekar và Joseph (1996), Zhang et al (2001), Tanabe et al (2003), Kim et al
(2004), Chen et al (2005) [19].
- Và hiệu quả deacetyl chitosan của enzyme chitosanase đã được nghiên cứu từ
vi khuẩn P. islandicum bởi Fenton and Eveleigh (1981), Bacillus circulans MH-K1
Yabuki et al (1988), Bacillus sp. 7I-7S Seino et al (1991) [22].
- Năm 2006, các tác giả Pyoung Il Kim, Tae Heung Kang, Kyoung Jin Chung,
In Seon Kim, Ki-chul Chung đã có nghiên cứu về enzyme chitosanase được sản xuất
bởi Bacillus sp. MET 1299 và đã được tinh chế bằng sắc ký cột SP-Sephadex. Trọng
lượng phân tử được ước tính là 52 kDa bởi sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel
electrophoresis (SDS-PAGE). Hoạt động của enzyme tối ưu đã được quan sát ở độ pH
5,5 và nhiệt độ 60 ° C [20]
- Năm 2013 thì Ingunn A. Hoell, Gustav Vaaje-Kolstad & Vincent G.H. Eijsink,
đã nghiên cứu cấu trúc và chức năng của các enzym tác động lên chitin và chitosan
SVTH: Trần Thái Thanh Tâm – 12 SH

GVHD: TS. Nguyễn Hoàng Minh

9


Đề tài: Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme chitosanase từ vi khuẩn Bacillus subtilis bằng phương pháp
lên men chìm năng suất 1200 lít sản phẩm/ ngày

[14].

- Cách đầy vài năm, vào năm 2014 thì các tác giả Masaru MITSUTOMI,
Makoto ISONO, Asako UCHIYAMA, Naoki NIKAIDOU, Taiji IKEGAMI & Takeshi
WATANABE, đã có nghiên cứu và báo cáo hoạt động của enzyme chitosanase về liên
kết β-1,3-1,4-glucanase từ Bacillus circulans WL-12 [22].
2.4. Giới thiệu về Bacillus subtilis
2.4.1. Lịch sử phát hiện
B. subtilis được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835 do Christion Erenberg và
tên của loài vi khuẩn này lúc bấy giờ là “Vibrio subtilis”. Gần 30 năm sau, Casimir
Davaine đặt tên cho loài vi khuẩn này là “Bacteridium”. Năm 1872, Ferdimand Cohn
xác định thấy lồi trực khuẩn này có đầu vng và đặt tên là B. subtilis.
Năm 1941, B. subtilis được phát hiện trong phân ngựa bởi tổ chức y học Nazi
của Đức. Lúc đầu, chúng được dùng chủ yếu để phòng bệnh lị cho các binh sĩ Đức
chiến đấu ở Bắc Phi. Năm 1949 - 1957, Henry và cộng sự tách được các chủng thuần
khiết của B. subtilis. Gần đây, B. subtilis đã được nghiên cứu, sử dụng rộng rãi trên thế
giới. Từ đó, thuật ngữ “Subtilis therapy” ra đời. B. subtilis được sử dụng ngày càng
phổ biến và được xem như sinh vật phòng và trị các bệnh về rối loạn đường tiêu hóa,
các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, tiêu chảy…
Ngày nay, B. subtilis đã và đang được nghiên cứu rộng rãi với nhiều tiềm năng
và ứng dụng hiệu quả trong chăn nuôi, công nghiệp, xử lý môi trường…
2.4.2. Phân loại
Theo phân loại của Bergey (1974), B. subtilis thuộc:
- Giới (Kingdom): Bacteria.
- Ngành (Division): Firmicutes.
- Lớp (Class): Bacilli.
- Bộ (Order): Bacillales.
- Họ (Family): Bacillaceae.
- Giống (Genus): Bacillus.
- Loài (Species): B. subtilis
2.4.3. Đặc điểm của B. subtilis
2.4.3.1. Đặc điểm sinh thái học và phân bố trong tự nhiên

- Vi khuẩn B. subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi.
Chúng phân bố hầu hết trong môi trường tự nhiên, phần lớn cư trú trong đất và rơm rạ,
cỏ khô nên được gọi là “trực khuẩn cỏ khơ”, thơng thường đất trồng trọt có khoảng
106 - 107 triệu CFU/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, đất hoang thì sự hiện
SVTH: Trần Thái Thanh Tâm – 12 SH

GVHD: TS. Nguyễn Hoàng Minh

10


Đề tài: Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme chitosanase từ vi khuẩn Bacillus subtilis bằng phương pháp
lên men chìm năng suất 1200 lít sản phẩm/ ngày

diện của chúng rất hiếm. Ngồi ra, chúng cịn có mặt trong các ngun liệu sản xuất
như bột mì (trong bột mì vi khuẩn B. subtilis chiếm 75 - 79% vi khuẩn tạo bào tử), bột
gạo, trong các thực phẩm như mắm, tương, chao… B. subtilis đóng vai trị đáng kể về
mặt có lợi cũng như mặt gây hại trong quá trình biến đổi sinh học.
- B. subtilis có khả năng dùng các hợp chất vơ cơ làm nguồn carbon trong khi
một số lồi khác như Bacillus sphaericus, Bacillus cereus cần các hợp chất hữu cơ là
vitamin và amino acid cho sự sinh trưởng. Đặc biệt các lồi như Bacillus popilliae,
Bacillus lentimobus có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, chúng không phát triển trong
môi trường nuôi cấy vi khuẩn thông thường như: Nutrient Agar (NA), Nutrient Broth
(NB).
- Năm 1993, giáo sư Richard Losik và cộng sự thuộc Đại học Havard ở Boston
(Mỹ) và Jose Gonzalez - Pastor của Trung tâm công nghệ sinh học quốc gia ở Madrid
(Tây Ban Nha) đã chứng minh được lồi B. subtilis có tập tính ăn thịt đồng loại.
Chúng dùng cách này như một phương pháp đơn giản để thốt khỏi những trường hợp
có đời sống giới hạn như dinh dưỡng trong môi trường đã cạn kiệt. Một cách đơn giản
là các cá thể khỏe mạnh sinh tổng hợp kháng sinh tiêu diệt những cá thể xung quanh cả

khác loài lẫn cùng loài, để thu lấy chất dinh dưỡng bên trong, giúp chúng sống sót chờ
đến khi mơi trường thuận lợi hơn. Ngoài ra, để tránh những ảnh hưởng của môi trường
khắc nghiệt, chúng thường tạo ra bào tử, nhưng cách này tiêu hao khá nhiều năng
lượng.
2.4.3.2. Đặc điểm hình thái
B. subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu trịn, bắt màu tím Gram (+), kích thước 0,5
– 0,8µm x 1,5 – 3µm, đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di động, có
8 – 12 lơng, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn nằm giữa hoặc lệch tâm tế bào, kích
thước từ 0,8 – 1,8µm. Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào tử,
khơng kháng acid, có khả năng chịu nhiệt (ở 100oC trong 180 phút), chịu ẩm, tia tử
ngoại, tia phóng xạ, áp suất, chất sát trùng. Bào tử có thể sống vài năm đến vài chục
năm. Đã có những chứng cứ về việc duy trì sức sống của bào tử B. subtilis trong 200 –
300 năm.

SVTH: Trần Thái Thanh Tâm – 12 SH

GVHD: TS. Nguyễn Hoàng Minh

11


Đề tài: Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme chitosanase từ vi khuẩn Bacillus subtilis bằng phương pháp
lên men chìm năng suất 1200 lít sản phẩm/ ngày

Hình 2.2 Tế bào vi khuẩn B. subtilis quan sát dưới kính hiển vi
2.4.3.3. Đặc điểm sinh hóa
- Lên men khơng sinh hơi các loại đường như: glucose, maltose, manitol,
saccharose, xylose và arabinose.
- Thử nghiệm indol (-), VP (+), nitrate (+), H2S (-), NH3 (+), catalase (+),
amylase (+), casein, (+), citrate (+), có khả năng di động (+) và hiếu khí (+).

Bảng 2.2 Phản ứng sinh hóa của vi khuẩn B. subtilis
Phản ứng sinh hóa

STT

Kết quả

1

Hoạt tính catalase

+

2

Sinh indol

-

3

MR (metyl red)

+

4

VP (Voges - Proskauer

+

5

Sử dụng citrate

+

6

Khử nitrat

+

7

Tan chảy gelatin

+

8

Di động

+

9

Phân giải tinh bột

+

10

Arabinose

+

11

Xylose

+

12

Saccharose

+

13

Manitol

+

14

Glucose

+

15

Lactose

-

16

Maltose

+

2.4.3.4. Đặc điểm nuôi cấy
- Vi khuẩn B. subtilis phát triển trong điều kiện hiếu khí, tuy nhiên vẫn phát
triển được trong môi trường thiếu oxy. Nhiệt độ tối ưu là 37o C.
SVTH: Trần Thái Thanh Tâm – 12 SH

GVHD: TS. Nguyễn Hoàng Minh

12


Đề tài: Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme chitosanase từ vi khuẩn Bacillus subtilis bằng phương pháp
lên men chìm năng suất 1200 lít sản phẩm/ ngày

- Vi khuẩn B. subtilis phát triển hầu hết trên các môi trường dinh dưỡng cơ bản:
+ Trên môi trường thạch đĩa Trypticase Soy Agar (TSA): khuẩn lạc dạng trịn,
rìa răng cưa khơng đều, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm, sau 1 – 4 ngày bề mặt
nhăn nheo, màu hơi nâu.

+ Trên môi trường Trypticase Soy Broth (TSB): vi khuẩn phát triển làm đục
môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn, kết lại như vẩn mây ở đáy, khó tan khi lắc đều.
+ Trên môi trường giá đậu – peptone: khuẩn lạc dạng trịn lồi, nhẵn bóng, đơi
khi lan rộng, rìa răng cưa khơng đều, đường kính 3 – 4 cm sau 72 giờ nuôi cấy.
- Nhu cầu dinh dưỡng: chủ yếu cần các nguyên tố C, H, O, N và một số nguyên
tố vi lượng khác. Vi khuẩn phát triển tốt trong môi trường cung cấp đủ nguồn carbon
(như glucose) và nitơ (như peptone).
2.4.3.5. Bào tử
Bào tử là một khối nguyên sinh chất đặc, có chứa các thành phần hóa học cơ
bản như ở tế bào sinh dưỡng nhưng có một vài điểm khác về tỉ lệ giữa các thành phần
và có thêm một số thành phần mới.
Bào tử B. subtilis có dạng elip đến hình cầu, có kích thước 0,6 – 0,9µm x 1,0 –
1,5µm, được bao bọc bởi nhiều lớp màng với các thành phần lipoprotein,
peptidoglycan… Bào tử của chúng có khả năng chịu được pH thấp của dạ dày, tiến
đến ruột và nảy mầm tại phần đầu của ruột non. Đây là đặc điểm quan trọng trong ứng
dụng sản xuất probiotic từ B. subtilis.
Nhờ khả năng tạo bào tử mà vi khuẩn có thể tồn tại được trong các điều kiện bất
lợi (dinh dưỡng trong môi trường cạn kiệt, mơi trường tích lũy các sản phẩm trao đổi
chất có hại và nhiệt độ cao…).
2.4.4. Ứng dụng của vi khuẩn B. subtilis
B. subtilis là vi khuẩn probiotic - vi khuẩn có lợi. An tồn và dễ sử dụng do vậy
được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp, nông nghiệp, y học, y tế,
thực phẩm, chăn nuôi, nuôi trồng thủy sản và nghiên cứu các lĩnh vực khác nhau.
- B. subtilis trong sản xuất enzyme công nghiệp
Theo thống kê, B. subtilis sản xuất số lượng 50% tổng số enzyme cung cấp cho
các lĩnh vực công nghiệp enzyme như thực phẩm, tẩy rửa, dệt may, da, giấy, thuốc
men…
- Ứng dụng của vi khuẩn B. subtilis trong lĩnh vực kiểm soát sinh học
B. subtilis dùng để kiểm soát sinh học các bệnh thực vật, giúp ngăn ngừa và
điều trị nhiều loại bệnh ở cây trồng như bệnh phấn trắng, sương giá, bệnh do nấm…

- B. subtilis ứng dụng trong sinh học phân tử vi sinh vật học
SVTH: Trần Thái Thanh Tâm – 12 SH

GVHD: TS. Nguyễn Hoàng Minh

13