Nghiên cứu quần xã vi khuẩn trong đất trồng sâm ngọc linh panax vietnamensis ha et grushv và tuyển chọn một số chủng có tiềm năng ứng dụng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-----------------------------

Trần Bảo Trâm
ần Bảo Trâm

NGHIÊN CỨU QUẦN XÃ VI KHUẨN TRONG ĐẤT TRỒNG
SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) VÀ TUYỂN
CHỌN MỘT SỐ CHỦNG CÓ TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2020


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-----------------------------

Trần Bảo Trâm

NGHIÊN CỨU QUẦN XÃ VI KHUẨN TRONG ĐẤT TRỒNG
SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) VÀ TUYỂN
CHỌN MỘT SỐ CHỦNG CÓ TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số:

9420101.07

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. TS. Phạm Hương Sơn
2. PGS.TS. Phạm Thế Hải

Hà Nội - 2020


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ
cơng trình nào khác
Hà Nội, ngày 07 tháng 9 năm 2020
Tác giả

Trần Bảo Trâm

i


LỜI CẢM ƠN
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới tập thể hướng dẫn: TS. Phạm
Hương Sơn và PGS. TS. Phạm Thế Hải đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi
thực hiện luận án này. Trong thời gian làm NCS, tôi đã trưởng thành hơn rất
nhiều trong lĩnh vực nghiên cứu khoa học.
Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể giảng viên, cán bộ Bộ môn Vi sinh
vật học – Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (Đại học Quốc
gia Hà Nội) và lãnh đạo, đồng nghiệp tại Trung tâm Sinh học Thực nghiệm –
Viện Ứng dụng Công nghệ đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện luận án.

Cuối cùng tôi gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã ln ủng hộ,
động viên và tạo điều kiện về mọi mặt để tơi có thể hồn thành được
nghiên cứu này.

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................... viii
DANH MỤC BẢNG ........................................................................................ ix
DANH MỤC HÌNH .......................................................................................... x
MỞ ĐẦU1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 4
1.1. SÂM NGỌC LINH VÀ VÙNG PHÂN BỐ ....................................... 4
1.1.1. Giới thiệu về sâm Ngọc Linh .................................................................. 4
1.1.1.1. Phân loại ............................................................................................... 4
1.1.1.2. Đặc điểm sinh học ................................................................................ 4
1.1.1.3. Thành phần hoá học và tác dụng dược lý của SNL ............................. 5
1.1.2. Điều kiện tự nhiên vùng phân bố sâm Ngọc Linh .................................. 8
1.1.2.1. Phân bố ................................................................................................. 8
1.1.2.2. Điều kiện nhiệt độ ................................................................................ 9
1.1.2.3. Độ ẩm, lượng mưa................................................................................ 9
1.1.2.4. Thổ nhưỡng .......................................................................................... 9
1.2. QUẦN XÃ VI SINH VẬT ĐẤT ...................................................... 10
1.2.1. Quần xã vi sinh vật đất .......................................................................... 10
1.2.2. Quần xã vi sinh vật đất trồng Nhân sâm (Panax L.)............................. 11
1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG VI KHUẨN ... 14
1.3.1. Các phương pháp dựa trên nuôi cấy...................................................... 14

1.3.1.1. Phương pháp đếm khuẩn lạc (định lượng vi khuẩn) .......................... 14
1.3.1.2. Đánh giá khả năng sử dụng nguồn cacbon đơn (SCSU) ................... 15
1.3.1.3. Phân tích acid béo phospholipid/acid béo methyl ester ..................... 15
1.3.1.4. Đánh giá hoạt tính sinh học................................................................ 16

iii


1.3.2. Các phương pháp sinh học phân tử ....................................................... 17
1.3.2.1. Các phương pháp sinh học phân tử cơ bản ........................................ 17
1.3.2.2. Kỹ thuật metagenomics ...................................................................... 19
1.4. NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN LOÀI VI KHUẨN MỚI TRONG
ĐẤT TRỒNG NHÂN SÂM .................................................................... 26
1.4.1 Môi trường nuôi cấy sử dụng trong phân lập ......................................... 27
1.4.2 Định danh bằng phương pháp truyền thống ........................................... 27
1.4.2.1 Phân tích đặc điểm kiểu hình .............................................................. 27
1.4.2.2. Đánh giá đặc điểm sinh lý, sinh hóa (Phụ lục 1) ............................... 28
1.4.3. Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử ................................... 29
1.5. CÁC NHÓM VI KHUẨN CÓ TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG PHÂN
LẬP TỪ ĐẤT TRỒNG SÂM ................................................................. 30
1.5.1. Vi khuẩn phân giải phosphate (PSM) ................................................... 31
1.5.2. Vi khuẩn sinh tổng hợp IAA ................................................................. 33
1.5.3. Vi khuẩn chuyển hóa ginsenoside......................................................... 35
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................ 41
2.1. VẬT LIỆU ....................................................................................... 41
2.1.1. Mẫu đất .................................................................................................. 41
2.1.1.1. Địa điểm lấy mẫu ............................................................................... 41
2.1.1.2. Thời gian lấy mẫu, số lượng mẫu ...................................................... 41
2.1.2. Hóa chất................................................................................................. 41
2.1.2.1. Hóa chất sử dụng trong phân tích thành phần hóa lý đất ................... 41

2.1.2.2. Hóa chất sử dụng trong phân tích metagenome ................................. 41
2.1.2.3. Hóa chất sử dụng phân lập và định danh vi khuẩn ............................ 42
2.1.2.4. Hóa chất sử dụng trong phân tích ginsenoside: ................................. 42
2.1.3. Thiết bị chính ........................................................................................ 43
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................... 43

iv


2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu .................................................................................... 43
2.2.2 Phương pháp lấy mẫu đất (TCVN 7538-2:2005 - Phụ lục 2) ................ 44
2.2.3 Phân tích thành phần hóa lý của đất (Phụ lục 2).................................... 44
2.2.4 Phân tích quần xã vi khuẩn bằng kỹ thuật metagenomics ..................... 45
2.2.4.1 Sơ đồ quy trình phân tích metagenome .............................................. 45
2.2.4.2 Các bước tiến hành:............................................................................. 45
2.2.5 Phân tích vi khuẩn bằng phương pháp nuôi cấy .................................... 46
2.2.5.1. Phân lập và xác định thành phần/số lượng các nhóm vi sinh vật bằng
phương pháp đếm khuẩn lạc: .......................................................................... 46
2.2.5.2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính ứng dụng: ................... 47
2.2.5.3. Định danh vi khuẩn ............................................................................ 50
2.2.6. Phương pháp xác định lồi mới ............................................................ 51
2.2.6.1 Phân tích đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào ................................... 52
2.2.6.2. Đánh giá đặc điểm nuôi cấy ............................................................... 52
2.2.6.3. Định danh .......................................................................................... 53
2.2.6.4. Đánh giá hoạt tính ............................................................................. 53
2.2.6.5. Xác định thành phần G+C................................................................. 55
2.2.6.6. Lai DNA-DNA .................................................................................. 56
2.2.7. Phương pháp xử lí số liệu ..................................................................... 56
2.2.7.1. Xử lí số liệu phân tích thổ nhưỡng, đếm số lượng tế bào (khuẩn lạc): ...... 56
2.2.7.2. Xử lí số liệu phân tích đa dạng quần xã vi sinh vật ........................... 56

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 57
3.1. ĐẶC ĐIỂM THỔ NHƯỠNG VÙNG TRỒNG SÂM NGỌC LINH
Ở QUẢNG NAM .................................................................................... 57
3.2. NGHIÊN CỨU QUẦN XÃ VI KHUẨN TRONG ĐẤT TRỒNG
SÂM NGỌC LINH Ở QUẢNG NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP
METAGENOMICS ................................................................................ 60

v


3.3 NGHIÊN CỨU QUẦN XÃ VI KHUẨN TRONG ĐẤT TRỒNG
SÂM NGỌC LINH Ở QUẢNG NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI
CẤY......................................................................................................... 64
3.3.1. Phân tích quần xã vi khuẩn theo nhóm phân loại ................................. 64
3.3.2. Phân lập và xác định loài mới trong đất trồng SNL ............................. 65
3.3.2.1 Đặc điểm hình thái/ni cấy ............................................................... 66
3.3.2.2 Đặc điểm sinh hóa của chủng B23 ...................................................... 67
3.3.2.3. Định danh ........................................................................................... 69
3.3.2.4. Đánh giá đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng P. panacisoli B23
với 2 chủng tham chiếu P. sphaerophysae HAMBI 3106 T và P. caeni KCTC
22480T ............................................................................................................ 70
3.3.2.5. Phân tích acid béo .............................................................................. 73
3.3.2.6. Phân tích hàm lượng G+C.................................................................. 75
3.3.3 Phân tích quần xã vi khuẩn theo nhóm hoạt tính .................................... 75
3.4 TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG ỨNG
DỤNG ...................................................................................................... 77
3.4.1 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn phân giải phosphate ........................... 77
3.4.1.1 Phân lập ............................................................................................... 77
3.4.1.2 Định danh các chủng tuyển chọn ........................................................ 79
3.4.1.3 Đánh giá khả năng phân giải phosphate của các chủng tuyển chọn ......... 81

3.4.2 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp IAA ............................. 83
3.4.2.1 Phân lập ............................................................................................... 83
3.4.2.2 Định danh các chủng tuyển chọn ........................................................ 85
3.4.2.3 Đánh giá khả năng tăng trưởng thực vật của chủng tuyển chọn ......... 87
3.4.3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính chuyển hóa ginsenoside ........ 89
3.4.3.1 Phân lập ............................................................................................... 89
3.4.3.2. Định danh chủng tuyển chọn E3 ........................................................ 90

vi


3.4.3.3 Con đường chuyển hóa ginsenoside Rb1 của chủng tuyển chọn E3 ...... 92
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 95
DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN
ĐẾN LUẬN ÁN .............................................................................................. 97
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 99

vii


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

STT Kí hiệu

Nguyên nghĩa

1

DGGE

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis
(Điện di biến tính)

2

DNA

Deoxyribonucleic acid

3

FAME

Acid béo methyl ester

4

HPLC

High Performance Liquid Chromatography
(Sắc kí lỏng hiệu năng cao)

5

IAA

6

OTUs

Operational Taxonomic Units
(Đơn vị phân loài)

7

PLFA

Acid béo phospholipid

8

PSM

Phosphate Solubilizing Microorganisms
(Vi sinh vật phân giải phosphate)

9

RAPD

Random amplified polymorphic DNA
(Kỹ thuật đa hình DNA nhân ngẫu nhiên)

10

RNA

Ribonucleic acid

11

SCSU

Sole Carbon Source Utilization
(Khả năng sử dụng nguồn cacbon đơn)

12

SNL

Sâm Ngọc Linh

13

TLC

Thin Layer Chromatography (Sắc kí lớp mỏng)

14

VSV

Vi sinh vật

Indole - 3 - Axetic Acid
(Chất tăng trưởng thực vật nhóm auxin)

viii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Ưu nhược điểm của một số phương pháp sinh học phân tử trong
nghiên cứu đa dạng vi khuẩn đất [71] .......................................................... 17
Bảng 1.2. Một số loài vi khuẩn phân lập từ đất trồng Nhân sâm có hoạt
tính chuyển hóa ginsenoside ............................................................ 39
Bảng 3.1. Đặc điểm thổ nhưỡng vùng trồng SNL ở Quảng Nam ........ 58
Bảng 3.2 So sánh tỷ lệ các ngành chính trong quần xã vi khuẩn ở đất
trồng sâm khác nhau ........................................................................ 61
Bảng 3.3. Thành phần và số lượng các nhóm VSV trong đất ............. 64
Bảng 3.4 Ðặc điểm ni cấy và hoạt tính sinh học của chủng B23 .... 66
Bảng 3.5 Đặc điểm sinh hóa chủng B23 ........................................... 67
Bảng 3.6 Đặc điểm sinh hóa chủng B23 ........................................... 68
Bảng 3.7 So sánh đặc điểm giữa chủng phân lập và 2 chủng tham
chiếu ............................................................................................... 71
Bảng 3.8 Thành phần các acid béo của chủng phân lập .................... 73
Bảng 3.9 Thành phần và số lượng các nhóm vi khuẩn có hoạt tính sinh
học .................................................................................................. 76
Bảng 3.10 Kết quả sàng lọc các chủng vi khuẩn phân lập có hoạt tính
phân giải P ...................................................................................... 78
Bảng 3.11 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của các chủng tuyển chọn..80
Bảng 3.12 Kết quả định danh các chủng vi khuẩn phân giải P tuyển
chọn ................................................................................................ 81
Bảng 3.13 Kết quả sàng lọc các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng
hợp IAA .......................................................................................... 83
Bảng 3.14 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của các chủng ......... 86
Bảng 3.15 Kết quả định danh các chủng vi khuẩn sinh IAA tuyển chọn ....... 87
Bảng 3.16 Ảnh hưởng của dịch IAA thô đến sinh trưởng cây sâm non ......... 88

ix

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cây sâm Ngọc Linh và vùng phân bố ............................................... 5
Hình 1.2. Sơ đồ tổng quát về phân tích và các ứng dụng của metagenomics
[152] ....................................................................................................... 20
Hình 1.3 Quy trình xác định lồi vi khuẩn mới từ đất trồng sâm .............. 27
Hình 1.4 Một số loại phân bón vi sinh phân giải phosphate thương mại ............ 32
Hình 1.5. Con đường chuyển hóa ginsenoside sử dụng enzyme vi khuẩn . 36
Hình 1.6. Cơ chế thủy phân một số loại ginsenoside [142] ....................... 37
Hình 1.7 Sản phẩm hồng sâm chế biến bằng công nghệ lên men vi khuẩn
lactic ....................................................................................................... 38
Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu ....................................................................... 43
Hình 2.2 Sơ đồ quy trình phân tích metagenome ...................................... 45
Hình 3.1. Thành phần quần xã vi khuẩn trong đất trồng SNL ................... 60
Hình 3.2. Thành phần các chi vi khuẩn chính trong đất trồng SNL .......... 63
Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc (A) và tế bào (B) của chủng B23 ................ 66
Hình 3.5 Sắc kí lớp mỏng 2 chiều lipid tổng số của chủng B23 ................ 74
Hình 3.6 Khả năng phân giải phosphate của một số chủng vi khuẩn có hoạt
tính trên đĩa thạch..................................................................................... 78
Hình 3.7 Hình ảnh khuẩn lạc của các chủng tuyển chọn ........................... 79
Hình 3.8 Khả năng hịa tan P và sự thay đổi pH trong dịch nuôi cấy các
chủng vi khuẩn tuyển chọn ....................................................................... 82
Hình 3.9 Khả năng sinh IAA của một số chủng có hoạt tính ................... 84
Hình 3.10 Hình ảnh khuẩn lạc của các chủng tuyển chọn ......................... 85
Hình 3.11 Ảnh hưởng dịch IAA thơ đến sinh trưởng cây SNL ................. 88
Hình 3.12 Hoạt tính sinh β-glucosidase trên đĩa thạch của chủng E3 ....... 89
Hình 3.13 Kết quả chuyển hóa ginsenoside Rb1 của 07 chủng vi khuẩn
phân lập thể hiện qua sắc ký đồ TLC ........................................................ 90

x

Hình 3.14 Hình ảnh khuẩn lạc của chủng E3 ........................................... 90
Hình 3.15 Cây phát sinh lồi của chủng E3 .............................................. 92
Hình 3.16 Phân tích HPLC và con đường (giả thuyết) chuyển hóa
ginsenoside Rb1 bằng enzyme thơ trong dịch ni cấy chủng E3 ............. 93

xi


MỞ ĐẦU
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Sâm Ngọc Linh (SNL) hay sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et
Grushv.) là loài đặc hữu của Việt Nam, phân bố trong phạm vi hẹp trên vùng
có vĩ độ thấp (15o độ kinh đơng), độ cao trên 1.500m ở vùng núi Ngọc Linh
thuộc 2 tỉnh Kon Tum và Quảng Nam. Tác dụng dược lý của SNL cũng đã
được nghiên cứu và các kết quả cho thấy SNL làm giảm đáng kể rối loạn liên
quan đến stress, giúp ức chế khối u trên da và gan ở chuột. Hiệu quả thử
nghiệm lâm sàng đã khẳng định giá trị của SNL sánh ngang với Nhân sâm
(Panax ginseng). Do có giá trị dược liệu cao trên thị trường nên nhu cầu sử
dụng và khai thác SNL tăng mạnh, dẫn đến sự giảm đáng kể lượng sâm mọc
tự nhiên. Chính vì vậy trong thời gian gần đây việc phát triển vùng trồng
nhằm mở rộng sản xuất SNL đã được đặc biệt quan tâm. Tuy nhiên, việc
trồng sâm trong điều kiện tự nhiên đã gặp phải một số khó khăn như sự sinh
trưởng bất thường của cây, bệnh dịch... nên cần có thêm thời gian để hồn
thiện tồn bộ quy trình từ khâu nhân giống đến trồng thương mại. Các yếu tố
được cho là có ảnh hưởng trực tiếp đến việc canh tác cây sâm bao gồm: các
đặc tính hóa lý của đất, sự có mặt của các thành phần dinh dưỡng, và đáng lưu
ý là hệ vi sinh vật đất mà trong đó vi khuẩn có vai trị đặc biệt quan trọng.
Vi khuẩn đất là một trong những phần quan trọng nhất của hệ sinh thái

đất và được coi như một thành phần tích hợp trong chất lượng đất. Vi khuẩn
đất có tầm quan trọng cơ bản về năng lượng và các chu trình sinh địa hóa, cấu
trúc đất, cân bằng hệ sinh thái vi sinh vật đất… Vì vậy nghiên cứu quần xã vi
khuẩn trong đất trồng có ý nghĩa quan trọng, để hiểu được cơ chế tác động
của chúng với đất và cây, làm cơ sở cho việc tái canh cây trồng lâu năm như
cây SNL. Gần đây việc phân tích đa dạng và cấu trúc quần xã vi khuẩn trong

1


đất trồng Nhân sâm đang ngày được quan tâm, trong đó tập trung chủ yếu ở
Hàn Quốc và Trung Quốc - các quốc gia phát triển trồng và chế biến, thương
mại các sản phẩm từ sâm lớn nhất thế giới. Chính vì vậy việc thực hiện
“Nghiên cứu quần xã vi khuẩn trong đất trồng sâm Ngọc Linh (Panax
vietnamensis Ha et Grushv.) và tuyển chọn một số chủng có tiềm năng ứng
dụng” là hướng nghiên cứu mới ở Việt Nam cũng như trên thế giới. Kết quả
bước đầu thu được sẽ là cơ sở dữ liệu đóng góp vào nguồn dữ liệu khoa học
chung, góp phần phục vụ cho các nghiên cứu và ứng dụng liên quan đến việc
bảo tồn và phát triển bền vững cây SNL ở Việt Nam.
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
(1) Đánh giá được sơ bộ mức độ đa dạng của quần xã vi khuẩn trong
đất trồng sâm Ngọc Linh ở Quảng Nam bằng kĩ thuật metagenomics.
(2) Đánh giá được một số đặc điểm của quần xã vi khuẩn trong đất
trồng sâm Ngọc Linh ở Quảng Nam bằng phương pháp ni cấy:
+ Phân tích mật độ vi khuẩn nuôi cấy được trong đất trồng sâm Ngọc Linh;
+ Phát hiện lồi mới;
+ Phân tích các nhóm vi khuẩn ni cấy được trong đất trồng sâm Ngọc
Linh theo hoạt tính sinh học.
(3) Tuyển chọn được một số chủng vi khuẩn có tiềm năng ứng dụng:
+ Phân giải phosphate khó tan và sinh chất kích thích sinh trưởng thực

vật IAA, với định hướng ứng dụng trong sản xuất phân bón vi sinh và chế
phẩm vi sinh;
+ Chuyển hóa ginsenoside, với định hướng ứng dụng trong chế biến
dược phẩm và mỹ phẩm.
3. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
- Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam đánh giá mức độ đa dạng
quần xã vi khuẩn trong đất trồng sâm Ngọc Linh tự nhiên tại huyện Nam Trà
2


My, tỉnh Quảng Nam của Việt Nam.
- Đã công bố 01 loài vi khuẩn mới Paracoccus panacisoli sp. nov. trên
tạp chí IJSEM (International Journal of Systematic and Evolutionary
Microbiology).
- Đã tuyển chọn được 04 chủng vi khuẩn có hoạt tính phân giải
phosphate cao; 07 chủng vi khuẩn có khả năng sinh chất kích thích sinh
trưởng IAA; 01 chủng vi khuẩn có hoạt tính chuyển hóa ginsenoside Rb1.
4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN
- Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam bằng kỹ thuật metagenomic
đã đánh giá được sự đa dạng quần xã vi khuẩn trong đất trồng sâm Ngọc Linh
tự nhiên tại huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam, Việt Nam.
- Phát hiện và công bố 01 lồi vi khuẩn mới, góp phần bổ sung danh
mục lồi vi khuẩn ni cấy được có ý nghĩa cho khoa học ở Việt Nam và trên
thế giới.
- Tuyển chọn được 04 chủng vi khuẩn có hoạt tính phân giải phosphate
và 07 chủng vi khuẩn có khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật
(IAA) có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp; và 01 chủng vi
khuẩn có khả năng chuyển hóa ginsenoside Rb1, có tiềm năng ứng dụng trong
chế biến các sản phẩm từ sâm Việt Nam.
5. BỐ CỤC CỦA LUẬN ÁN

Luận án bao gồm 125 trang: Phần mở đầu (03 trang); Tổng quan tài
liệu (37 trang); Vật liệu và phương pháp (16 trang); Kết quả và thảo luận (38
trang); Kết luận (02 trang); Danh mục các cơng trình liên quan đến luận án
(02 trang); Danh mục tài liệu tham khảo tiếng Việt và tiếng Anh (27 trang);
Phụ lục gồm các bảng biểu minh họa kết quả điều tra và tính tốn. Luận án có
18 bảng, 25 hình.

3


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. SÂM NGỌC LINH VÀ VÙNG PHÂN BỐ
1.1.1. Giới thiệu về sâm Ngọc Linh
1.1.1.1. Phân loại
Tên khoa học: Panax vietnamensis Ha et Gruskv., thuộc chi Panax, họ
Ngũ gia bì Araliaceae.
Tên gọi: sâm Ngọc Linh, sâm Việt Nam, sâm khu năm (sâm K5), thuốc
dấu, Củ Ngải rợm con (Xê Đăng), sâm Cang (sâm đắng) …
Sâm Ngọc Linh được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1973, đến năm
1985 mới được cơng bố là một lồi mới [4]. Đến nay, SNL mới chỉ phát hiện
được duy nhất ở vùng núi Ngọc Linh thuộc hai tỉnh Quảng Nam và Kon Tum,
được coi là loài đặc hữu của Việt Nam. Việc phát hiện ra một loài mới của chi
này ở vùng cao nguyên Việt Nam có ý nghĩa lớn về mặt phân bố địa lý: lần
đầu tiên biên giới của chi Nhân sâm được tìm thấy rất xa về phía nam ở 15o vĩ
Nam và 108o kinh Đơng (đây cũng là giới hạn xa nhất về phía nam của bản đồ
phân bố chi Panax trên thế giới) thuộc vùng khí hậu nhiệt đới [1]. SNL hiện
đang ở trong tình trạng “cực kỳ bị nguy cấp” (mức phân hạng: CR. A1 c,d) và
đã được xếp vào một trong những đối tượng quí hiếm cần được bảo tồn.
1.1.1.2. Đặc điểm sinh học
- Đặc điểm sinh trưởng và tái sinh của SNL

Là cây thân thảo, sống lâu năm, lá thường rụng hàng năm sau mùa sinh
trưởng, vào mùa đơng thân khí sinh lụi đi để lại những vết sẹo gần tròn trên
thân rễ. Từ tháng 1 đến tháng 3 chồi thân (khí sinh) bắt đầu mọc và nhô lên
khỏi mặt đất mang theo tán hoa. Từ tháng 4 đến tháng 5 cây bắt đầu nở hoa,
nở rộ nhất vào giữa tháng 4. Giai đoạn quả xanh kéo dài 3 - 4 tháng (từ sau
khi thụ phấn) đến cuối tháng 7 đầu tháng 8 là thời kỳ quả chín. Quả chín rộ

4


vào tháng 8, cá biệt có cây quả chín muộn đến tháng 10 (Hình 1.1).

Hình 1.1. Cây sâm Ngọc Linh và vùng phân bố
(Nguồn: )
Từ tháng 10 - 12 hàng năm, sau mùa quả chín lá cây bắt đầu vàng úa và
tồn bộ phần khí sinh tàn lụi. Ngay trong quá trình tàn lụi, từ đầu mầm thân rễ
nằm sát hoặc dưới mặt đất hình thành một chồi thân mới. Các chồi này tồn tại
dưới dạng chồi ngủ trong suốt 3 - 4 tháng mùa đông và sẽ mọc lên vào mùa
xuân năm sau, để tiếp tục một chu trình sinh trưởng phát triển mới [1].
1.1.1.3. Thành phần hoá học và tác dụng dược lý của SNL
a) Thành phần hóa học
Chi Nhân sâm (Panax L.) là nguồn dược liệu tự nhiên mang lại lợi ích
cho con người được y học cổ truyền phương Đơng sử dụng từ lâu đời. Tính
đến cuối năm 2012 đã có ít nhất 289 saponin đã được cơng bố trong 11 lồi
khác nhau thuộc chi Nhân sâm, được phân loại thành các nhóm
protopanaxadiol, protopanaxatriol, octillol, acid oleanolic, các chuỗi C17 và
các phân nhóm khác theo sự khác biệt về cấu trúc của sapogenin [218].
Từ năm 1985 đã có nhiều cơng trình nghiên cứu về hố học và dược lý
của SNL góp phần khẳng định giá trị sử dụng của loài cây này. Về thành phần

5


hóa học: từ phần dưới mặt đất của SNL hoang dại đã phân lập và xác định
được cấu trúc protopanaxatriol oxyd II và 52 hợp chất saponin bao gồm 26
saponin đã biết và 26 saponin có cấu trúc mới được đặt tên là vina - ginsenoid
- R1 - R25. Các chất saponin dammarane được xem là hoạt chất quyết định
cho tác dụng sinh học có giá trị của sâm, chiếm một tỷ lệ rất cao về hàm
lượng và số lượng trong thành phần hợp chất saponin của SNL (50/52 saponin
được phân lập). Trong đó các saponin dẫn chất của 20(S) - protopanaxadiol
gồm 22 hợp chất với các đại diện chính là: ginsenoside - Rb1, - Rb3, - Rd. Các
saponin dẫn chất của 20(S) - protopanaxatriol gồm 17 hợp chất với các đại
diện chính là: ginsenoside - Re, - Rg1, notoginsenoside - R1. Các saponin có
cấu trúc ocotillol gồm 11 hợp chất với các đại diện chính là: majonoside - R1
và - R2. Đặc biệt majonoside - R2 chiếm gần 50% hàm lượng saponin toàn
phần từ rễ củ của SNL và trở thành 1 hợp chất chủ yếu của SNL. Như vậy, so
sánh về các hoạt chất của SNL và các lồi sâm khác, SNL có các hoạt chất
saponin dammarane, M - R2 là hoạt chất quí và nổi trội hơn so với Nhân sâm
(P. ginseng), sâm Mỹ (P. quinquefolium) và Tam thất (P. notoginseng).
Nghiên cứu sâu hơn về thành phần saponin của thân rễ và rễ của SNL,
nhóm tác giả Nguyễn Minh Đức đã phân lập và xác định cấu trúc của bảy
saponin dammarane mới có tên vina-ginsenoside-R3 , -R4, -R5, -R6, -R7, -R8,
-R9, cùng với việc xác định 6 saponin đã biết bao gồm 20-gluco-ginsenosideRf, ginsenoside-Rc, notoginsenoside-R6, quinquenoside-R1, gypenoside XVII
và majoroside F1. Các cấu trúc của saponin mới được xác định bằng phương
pháp hóa học và quang phổ. Vina-ginsenoside-R3 là glycoside tự nhiên đầu
tiên của dammarenediol II, trong khi vina-ginsenoside-R5 và -R6 là hai saponin
loại ocotillol [66].
Nhóm chất có tác dụng quyết định nhất đến tác dụng dược lí của loài

6

sâm này là các saponin triterpenoic mà đại diện chính là MR2, Rb1 và Rg1
[15]. SNL là một trong những lồi sâm có hàm lượng saponin khung
dammarane cao nhất (khoảng 12 - 15 %) và lượng saponin nhiều nhất so với
các loài khác của chi Panax trên thế giới [3]. Khi phân tích các hợp chất hóa
học rễ củ SNL chứa tới 50 saponin (sâm Triều Tiên có khoảng 25 saponin) và
những kết quả nghiên cứu mới nhất cho thấy danh sách saponin của SNL lên
tới 52 loại bao gồm 26 saponin đã biết và 26 saponin có cấu trúc mới được đặt
tên là vina-ginsenoside (VG) -R1 đến -R25 và 20-O-Me-G-Rh1 [67]. Với
những đặc điểm đó, SNL khơng chỉ là lồi sâm q của Việt Nam mà cịn của
cả thế giới.
Các saponin dammarane được xem là hoạt chất quyết định cho các tác
dụng sinh học có giá trị của sâm Triều Tiên cũng chiếm một tỷ lệ rất cao về
hàm lượng và số lượng trong thành phần hợp chất saponin của SNL (50/52
saponin phân lập được). Trong đó các saponin dẫn chất của 20(S)protopanaxadiol gồm 22 hợp chất với đại diện chính là ginsenoside-Rb1, Rb3, -Rd. Các saponin dẫn chất của protopanaxatriol gồm 17 hợp chất với các
đại diện chính là ginsenoside-Re, -Rg1, notoginsenoside-R1. Các saponin có
cấu trúc occotillol gồm 11 hợp chất với các đại diện chính là majonoside-R1
và -R2. Kết quả phân tích cho thấy SNL khơng chỉ có đầy đủ 4 nhóm saponin
như các lồi sâm khác mà cịn có hàm lượng cao hơn trên 2 lần, vì thế giá trị
sử dụng của SNL là rất quý [3]. Ngồi thành phần chính là saponin, trong
SNL cịn xác định có 17 acid amin, 20 chất khống vi lượng và hàm lượng
tinh dầu [12].
b) Tác dụng dược lý
Theo Đỗ Huy Bích và cs (2015), SNL có tác dụng trên hệ thần kinh
trung ương (với liều thấp có tác dụng kích thích thần kinh, làm tăng hoạt động
vận động và trí nhớ, chống trầm cảm nhưng liều cao lại ức chế), tác dụng tăng
sinh lực, tác dụng sinh thích ứng, chống oxy hố, kích thích miễn dịch, phục
7

hồi máu. SNL cịn có các tác dụng dược lý khác như tăng cường nội tiết tố sinh
dục, điều hoà hoạt động của tim, tác dụng chống tăng cholesterol máu, tác dụng
bảo vệ gan do các yếu tố gây độc với gan, hay tác dụng chống viêm và ức chế
phát triển của vi khuẩn Streptococcus gây bệnh viêm họng ở người [1] .
Các nghiên cứu trên động vật thực nghiệm cho thấy saponin trong SNL
có tác dụng tăng cường hoạt động thực bào bảo vệ động vật khỏi độc tính cấp
của E. coli [95], chống căng thẳng và thúc đẩy chống khối u [216], thử
nghiệm trong nuôi cấy in vitro cho thấy dịch chiết methanol của sâm Việt
Nam có tác dụng bảo vệ tế bào gan đối với yếu tố gây hoại tử do tế bào khối u
[198], saponin dạng chuyển hóa sau chế biến ở nhiệt độ cao có tác dụng ức
chế tế bào ung thư phổi [134]…
Như vậy, do những đặc tính q, có giá trị cao trong điều trị bệnh và
nâng cao sức khỏe con người của cây SNL mà công tác nghiên cứu việc trồng
loại cây này và phát triển thành sản phẩm hàng hóa là một vấn đề thời sự cấp
bách [12].
1.1.2. Điều kiện tự nhiên vùng phân bố sâm Ngọc Linh
1.1.2.1. Phân bố
Kết quả điều tra khảo sát từ năm 1973 cho thấy cây SNL mọc tập trung
ở 10 xã thuộc 2 huyện Đak Tô và Đak Lây (Kon Tum) và các xã Trà Linh,
Trà Cang, Trà Nam huyện Nam Trà My (Quảng Nam) tại khu vực có toạ độ
địa lý từ 107º50’ - 108º7’ kinh độ Đông và từ 15º0’0’’ - 15º10’ vĩ độ Bắc, ở
độ cao từ 1.500 m trở lên, tập trung ở độ cao 1.700 - 2.000 m [12, 14].
Sâm Ngọc Linh là loại cây thân thảo đặc biệt ưa ẩm và ưa bóng, thường
mọc rải rác hoặc tập trung thành từng đám nhỏ dưới tán rừng dưới tán rừng
hỗn giao giữa cây lá rộng và cây lá kim. Trong vùng phân bố gặp sâm mọc
chủ yếu ở hai bên sườn suối, nơi có độ mùn dày. Bộ rễ phát triển tập trung
trong tầng mùn lớp đất màu giàu dinh dưỡng. Hệ thực vật vùng núi Ngọc
8

Linh là sự phân bố hoàn hảo của các họ thực vật hỗ trợ, bảo vệ khỏi mưa băo,
ánh sáng trực xạ giúp cho cây SNL sinh trưởng và phát triển [20, 23]. Sự đa
dạng về thành phần thực vật đã phát hiện cho thấy vùng núi Ngọc Linh có thể
là điểm hội tụ của nhiều luồng di trú khác nhau. Ngoài ra, đây cũng là vùng
mà họ Nhân sâm phát triển mạnh với số loài và số cá thể phong phú [3].
1.1.2.2. Điều kiện nhiệt độ
Núi Ngọc Linh chạy dài theo hướng Tây Bắc - Đơng Nam. Khí hậu
trong tồn vùng núi Ngọc Linh có điểm chung là sự tương phản giữa hai mùa
mưa và khô rõ rệt. Nhiệt độ có sự dao động biên độ trong ngày cao nhất ở các
tháng mùa khơ. Nhiệt độ trung bình năm của khu vực này từ 18 - 20 oC. Mùa
hè dịu mát, trùng với mùa mưa bắt đầu từ tháng 5 đến tháng 10. Mùa đông
lạnh, trùng với mùa khô bắt đầu từ tháng 11 đến tháng 4 năm sau. Tháng lạnh
nhất là tháng 12, nhiệt độ trung bình nhỏ hơn 10 oC và nhiệt độ thấp nhất có
thể xuống 2 - 4 oC. Ở vùng núi cao trên 2.000 m nhiệt độ có thể xuống thấp
xấp xỉ 0 oC. Từ tháng 12 đến tháng 1 năm sau có nhiệt độ thấp nhất, trung
bình khoảng 8 - 11 oC, tháng 4 - 5 có nhiệt độ cao nhất, trung bình khoảng 22
- 23 oC. Nhiệt độ cao tuyệt đối không vuợt quá 30 oC [3].
1.1.2.3. Độ ẩm, lượng mưa
Lượng mưa trung bình năm từ 2.500 - 3.000 mm. Lượng mưa cực đại
vào các tháng 6,7,8, chiếm 85 - 90% lượng mưa cả năm. Độ ẩm trung bình
năm 80 - 85%. Độ ẩm cực đại thường xuất hiện từ tháng 7 đến tháng 9 (8994%), vào mùa mưa có khi liên tục trong nhiều ngày độ ẩm thường xuyên xấp
xỉ 100%. Mùa khô từ tháng 11 đến tháng 5 năm sau, nhưng độ ẩm thấp nhất là
từ tháng 2 đến tháng 4 (77 - 82%), tháng 5 độ ẩm trung bình có thể xuống
dưới 70%. Sương mù ở vùng này là hiện tượng phổ biến, thường bao phủ trên
các đỉnh núi hoặc tập trung dày đặc trong các thung lũng hẹp [3].
1.1.2.4. Thổ nhưỡng
9

Các dãy núi trong vùng Ngọc Linh thường là núi đá Granit và diệp
thạch. Đất chủ yếu là đất sét xám tro hoặc xám vàng nhạt trộn với lớp mùn
hữu cơ màu đen trên bề mặt khá dày, pH thấp (3,8 - 4,4). Theo hệ phân loại
Việt Nam, đây là đất mùn vàng đỏ trên núi cao, còn theo phân loại của của
FAO-UNESCO-WRB thì đây là đất xám giàu mùn (humic acrisol) [3].
1.2. QUẦN XÃ VI SINH VẬT ĐẤT
1.2.1. Quần xã vi sinh vật đất
Vi sinh vật đất có vai trị quan trọng đối với hệ sinh thái và có mối quan
hệ mật thiết với thảm thực vật nơi cư trú, đó là mối quan hệ tương hỗ và là
nguồn gốc của sự cân bằng trong hệ sinh thái. Trong đất có rất nhiều lồi
VSV có những chức năng khác nhau, sự phân bố của chúng phụ thuộc vào
điều kiện dinh dưỡng, nước, pH, độ sâu, mức độ thống khí, chế độ canh tác,
địa hình của đất và thảm thực vật… Đặc biệt đất vùng rễ là nơi thực vật và
VSV tương tác với nhau, VSV vùng rễ được cho là hoạt động mạnh và có vai
trị quan trọng đối với tình trạng (bệnh và tăng trưởng) của cây trồng. Ví dụ,
nấm và vi khuẩn rễ cung cấp phospho và nitơ, VSV thúc đẩy tăng trưởng
(PGPR) tác động trực tiếp hoặc gián tiếp lên sinh trưởng của thực vật với vai
trò hạn chế tác động của mầm bệnh (VSV đối kháng) hay điều hòa miễn dịch
thực vật [192]. Với mỗi loại đất khác nhau thì khu hệ VSV ở đó cũng có
những đặc điểm đặc trưng.
Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về hệ VSV của các loại đất
khác nhau. Nghiên cứu của Borneman và cộng sự về đa dạng vi sinh đất nông
nghiệp ở Wiscosin cho thấy trong số 124 dịng được giải trình tự DNA có tới
98,4% là vi khuẩn, chủ yếu thuộc các nhóm Proteobacteria (16,1%),
Cytophaga-Flexibacter-Bacteroides (21,8%), trong đó nhóm Gram (-) có hàm
lượng G+C thấp chiếm 21,8% [38]. Qua đó, có thể thấy vi khuẩn đóng vai trị
đặc biệt quan trọng trong hệ VSV đất trồng cây. Để phục vụ công tác quản lý
10

đất đai, trong hơn 2 năm Buckley & Schmidt đã tiến hành đánh giá cấu trúc
quần xã vi khuẩn của bảy nhóm vi khuẩn phổ biến nhất trong đất gồm Alpha
và Beta Proteobacteria, Actinobacteria, Cytophagales, Planctomycetes,
Verrucomicrobia trong một loạt mẫu đất thu ở các cánh đồng đang trồng trọt,
các cánh đồng bị bỏ hoang và các cánh đồng khơng có lịch sử canh tác. Số liệu
cho thấy hệ vi khuẩn đất có khả năng thay đổi đáng kể về quy mơ theo thời
gian [39]. Cịn nghiên cứu phân tích vi khuẩn đất vùng rễ trồng đậu tương của
nhóm tác giả Sugiyama cho thấy có sự biến động của các quần thể vi khuẩn
trong quá trình sinh trưởng của cây: các nhóm vi khuẩn chính là Proteobacteria
giảm trong khi Acidobacteria và Firmicutes tăng lên, số lượng các vi khuẩn
PGPR vùng rễ như Bacillus, Bradyrhizobium và Rhizobium tăng một cách đáng
kể [192]. Nghiên cứu VSV đất vùng trồng táo chính của Trung Quốc ở vịnh
Bohai cho thấy sự mất cân bằng hệ VSV vùng rễ là nguyên nhân gây bệnh ở
cây táo: ở cây táo lâu năm và cây tái canh cho thấy quần thể nấm Verticillium
và vi khuẩn Xanthomonadaceae gây bệnh điển hình tăng, và số lượng vi khuẩn
có lợi Pseudomonas và Bacillus giảm ở những cây tái canh; đồng thời có sự gia
tăng số lượng các VSV đối kháng là vi khuẩn Arthrobacter và nấm
Chaetomium, có thể chính là do lượng mầm bệnh tăng lên gây ra [100]…
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu các nhóm VSV (vi khuẩn, xạ khuẩn,
nấm...) nuôi cấy được trong những loại đất khác nhau đã được tiến hành đối
với nhiều loại đất khác nhau như đất trồng lúa, trồng mía, đất rừng, đất gị đồi,
đất khai mỏ, dưới tán rừng… [7, 9, 13, 16, 21].
1.2.2. Quần xã vi sinh vật đất trồng Nhân sâm (Panax L.)
Hàn Quốc và Trung Quốc là những nhà sản xuất Nhân sâm hàng đầu
thế giới hiện nay, việc sản xuất Nhân sâm đòi hỏi thời gian canh tác dài cần
thiết cho rễ củ sâm đạt được sự trưởng thành, thường từ 4 đến 6 năm. Việc sử
dụng biện pháp độc canh trong sản xuất Nhân sâm lâu dài có thể dẫn đến
11

những thay đổi trong quần xã VSV ở đất trồng Nhân sâm. Nhân sâm rất dễ bị
bệnh sau 4 năm canh tác, gây tổn thất năng suất lên đến 30% - 60% [125]. Do
đó, hệ VSV (chủ yếu là vi khuẩn) trong đất trồng Nhân sâm có tầm quan
trọng rất lớn bởi vì chúng thực hiện các quy trình quan trọng như phân hủy,
khống hóa, thống khí và tái chế.
Nghiên cứu về quần xã vi khuẩn của đất vùng rễ Nhân sâm trồng tại
Okcheon cho thấy ngành Actinobacteria chiếm ưu thế nhất, tiếp đó là các
ngành Proteobacteria, Spingomonadales, Rhizobiales. Quần xã vi khuẩn trong
vùng rễ thường dễ biến động và có thể bị ảnh hưởng theo giai đoạn phát triển
của cây trồng [204]. Bên cạnh đó, nhóm tác giả cũng đã phân lập được từ đất
vùng rễ sâm trồng 1 - 3 năm tại Okcheon 143 chủng thuộc 15 nhóm vi khuẩn
khác nhau nhưng chủ yếu thuộc ngành Firmicutes (chiếm 58%), trong đó
Bacillus là chi chiếm ưu thế trong tất cả các mẫu, không phụ thuộc vào số năm
trồng. 30 chủng phân lập được lựa chọn để đánh giá ảnh hưởng có ích đối với
cây trồng, kết quả cho thấy có một số chủng (B. subtilis, B. amyloliquefaciens,
B. velezensis và B. licheniformis) có tác dụng thúc đẩy tăng trưởng thực vật
như tạo chất tiết (enzyme) phân hủy thành tế bào, sinh tổng hợp IAA, vận
chuyển sắt, hòa tan phosphate và ức chế các tác nhân gây bệnh trong đất [93].
Nguyen và cộng sự đã phân tích các mẫu đất trồng Nhân sâm tại miền
bắc Hàn Quốc và thấy rằng các quần thể vi khuẩn chủ yếu được tìm thấy
thuộc các nhóm Acidobacteria, Alphaproteobacteria, Deltaproteobacteria,
Gammaproteobacteria và Sphingobacteria. Ngồi ra, kết quả phân tích cũng
cho thấy các chỉ số pH, phospho hữu dụng và Ca+ trao đổi dường như có mối
tương quan mật thiết với các nhóm vi khuẩn trong đất trồng Nhân sâm [156].
Một nghiên cứu khác về mức độ đa dạng của đất vùng trồng Nhân sâm tại
Jilin (Trung Quốc) cho thấy các nhóm vi khuẩn Acidobacteria,
Proteobacteria, Bacillus và Verrucomicrobia chiếm ưu thế [142, 222].
12