Phân lập và tuyển chọn một số chủng nấm sợi có khả năng sinh chất đối kháng diệt sâu bệnh trên cây lúa ở khóm trung hưng phường mỹ thới thành phố long xuyên tỉnh an giang

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG
KHOA SƯ PHẠM

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP KHOA

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ
CHỦNG NẤM SỢI CÓ KHẢ NĂNG SINH
CHẤT ĐỐI KHÁNG DIỆT SÂU BỆNH TRÊN
CÂY LÚA Ở KHÓM TRUNG HƯNG, PHƯỜNG
MỸ THỚI, THÀNH PHỐ LONG XUYÊN, TỈNH
AN GIANG

Chủ nhiệm đề tài: PHẠM TẤN ĐẠT

Năm 2012


TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG
KHOA SƯ PHẠM

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP KHOA

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ
CHỦNG NẤM SỢI CÓ KHẢ NĂNG SINH
CHẤT ĐỐI KHÁNG DIỆT SÂU BỆNH TRÊN
CÂY LÚA Ở KHÓM TRUNG HƯNG, PHƯỜNG
MỸ THỚI, THÀNH PHỐ LONG XUYÊN, TỈNH
AN GIANG

BAN GIÁM HIỆU

LÃNH ĐẠO ĐƠN VỊ
THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

Năm 2012

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI


MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục bảng và danh mục hình
Chƣơng I : MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài ............................................................................................. 1
2. Mục tiêu của đề tài .......................................................................................... 2
3. Nhiệm vụ nghiên cứu của đề tài ..................................................................... 2
Chƣơng II : TỔNG QUAN
1. Đặc điểm hình thái chung của nấm sợi ........................................................... 4
2. Đặc điểm một số loài nấm ký sinh sâu bệnh phổ biến ................................... 5
2.1. Đặc điểm hình thái và khả năng gây bệnh ........................................ 5
2.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa ............................................................... 8
2.3. Đặc điểm phân loại chung ................................................................ 9
2.4. Phân bố ............................................................................................. 9
3. Khả năng sinh các chất có hoạt tính sinh học ............................................... 10
3.1. Khả năng sinh enzyme thủy phân ngoại bào .................................. 10
3.2. Khả năng sinh các chất đối kháng .................................................. 11
3.3. Cơ chế tác động của nấm lên sâu bệnh ........................................... 12
Chƣơng III: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1. Vật liệu.......................................................................................................... 13
2. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 15
2.1. Phương pháp thu mẫu ..................................................................... 15
2.2. Phương pháp phân lập mẫu theo Uyenco, 1988 ............................. 15
2.3. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme ngoại bào ....................... 16
2.4. Phương pháp xác định hoạt tính chất đối kháng ............................ 17
2.5. Phương pháp định danh .................................................................. 17
2.6. Phương pháp bảo quản nấm sợi...................................................... 18


2.7. Phương pháp sử dụng phần mềm thống kê để xử lý số liệu
thực nghiệm .................................................................................... 19
Chƣơng IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1. Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm sợi có khả năng ký sinh cơn trùng .... 20
2. Nghiên cứu đặc tính sinh học của các chủng nấm sợi .................................. 21
2.1. Nghiên cứu hoạt tính enzyme chitinase .......................................... 21
2.2. Nghiên cứu hoạt tính enzyme protease .......................................... 22
2.3. Nghiên cứu khả năng sinh chất đối kháng...................................... 24
3. Nghiên cứu đặc điểm hình thái và phân loại sơ bộ ba chủng nấm sợi ......... 26
Chƣơng V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận ......................................................................................................... 30
2. Kiến nghị ...................................................................................................... 30
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


Trang
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Thời điểm lấy mẫu 13 chủng nấm sợi ........................................................... 20
Bảng 2: Khả năng sinh enzyme chitinase của các chủng nấm sợi .............................. 21

Bảng 3: Hoạt tính enzyme protease của các chủng nấm sợi ....................................... 23
Bảng 4: Hoạt tính đối kháng của các chủng nấm sợi .................................................. 25
Bảng 5: 3 chủng nấm sợi được tuyển chọn ................................................................. 26
Bảng 6: Kết quả định danh 3 chủng nấm sợi .............................................................. 30
DANH MỤC HÌNH
Hình 1: Tác hại của thuốc trừ sâu hóa học .................................................................. 1
Hình 2: Bào tử mọc ra khuẩn ty ................................................................................... 4
Hình 3: Khuẩn lạc nấm ................................................................................................ 4
Hình 4: Các dạng bào tử trần của nấm sợi ................................................................... 5
Hình 5: Sự tiếp hợp của nấm sợi .................................................................................. 5
Hình 6: Côn trùng bị nấm Beauveria bassina ký sinh ................................................. 6
Hình 7: Bào tử nấm Beauveria bassina ....................................................................... 6
Hình 8: Cơn trùng bị nấm Metarhizium ký sinh .......................................................... 7
Hình 9: Hình dạng bào tử nấm Metarhizium anisopliae ............................................. 7
Hình 10: Cơn trùng bị nấm Paecilomyces ký sinh....................................................... 7
Hình 11: Hình dạng bào tử nấm Peacilomyces ............................................................ 7
Hình 12: Hoạt tính enzyme chitinase của 9 chủng nấm sợi....................................... 22
Hình 13: Hoạt tính enzyme protease của 8 chủng nấm sợi ....................................... 24
Hình 14: Hoạt tính đối kháng của các chủng nấm sợi với vi khuẩn E.coli ............... 25
Hình 15: Mặt phải, trái khuẩn lạc chủng M3 ............................................................. 27
Hình 16: Hình dạng hệ sợi nấm và cuống sinh bào tử của chủng M3 (×40) ........................ 27

Hình 17: Mặt phải, trái khuẩn lạc chủng M9 ............................................................. 28
Hình 18: Hình dạng hệ sợi nấm và cuống sinh bào tử của chủng M9 (×40) ............. 28
Hình 19: Mặt phải, trái khuẩn lạc chủng M10 ........................................................... 28
Hình 20: Hình dạng hệ sợi nấm và cuống sinh bào tử của chủng M10 (×40) ........... 29


LỜI CẢM ƠN
----  ---Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ThS. Khưu Phương Yến Anh, là người

luôn quan tâm, theo dõi và hướng dẫn rất tận tình trong suốt thời gian em thực hiện
đề tài.
Em xin gửi lời cảm ơn đến ThS. Phan Thị Trúc Linh và ThS. Nguyễn Thanh
Đào, các cô đã quan tâm và chỉ dạy em rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài.
Đồng thời em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô trong bộ
môn Sinh, đã quan tâm và tạo nhiều điều kiện thuận lợi cho em có thể hồn thành tốt
đề tài này.
Tác giả


I. MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Theo thống kê của Tổ chức Lương – Nông Thế giới cho thấy: các loại cây
trồng trên đồng ruộng hiện nay phải chống đỡ với 100.000 loại sâu hại khác
nhau, 10.000 loài nấm, 200 loại vi khuẩn, 600 loại tuyến trùng và 600 loài virus
gây bệnh. Dẫn đến hàng năm khoảng 20% sản lượng lương thực thực phẩm trên
thế giới bị mất trắng (Trần Thị Thanh, 2001).
Từ những năm 50 của thế kỷ XX, các loại thuốc hóa học trừ sâu bệnh cho
cây trồng được dùng phổ biến và rộng rãi. Các loại thuốc này là hợp chất clo và
phospho hữu cơ có tác dụng diệt sâu bệnh, diệt muỗi rất hiệu quả. Ban đầu người
ta đặt niềm tin vào chúng rất nhiều và hi vọng chúng sẽ là cứu cánh cho ngành
trồng trọt và trồng rừng ở trên khắp Trái Đất. Song cùng với thời gian, thuốc trừ
sâu hóa học đã lộ ra nhược điểm không thể khắc phục được, như làm cho sâu hại
quen dần và “nhờn thuốc”, đáng lẽ sâu bị giảm đi nhưng lại có chiều hướng gia
tăng, thuốc tồn dư ngấm vào đất gây ô nhiễm môi trường đất và nước (đặt biệt là
nước ngầm), tồn dư trong sản phẩm lương thực – thực phẩm làm ảnh hưởng tới
sức khỏe con người và vật nuôi (Lương Đức Phẩm, 2011).

Hình 1: Tác hại của thuốc trừ sâu hóa học
(Nguồn: />

Biện pháp phịng trừ của nơng dân chủ yếu dựa vào việc phun thuốc hóa
học là chính mà rất ít biết đến các biện pháp khác. Sự phát triển tính kháng thuốc
của sâu hại cũng như ảnh hưởng của thuốc hóa học lên sức khoẻ con người và
mơi trường đã tạo áp lực mạnh mẽ cho sự phát triển của các tác nhân sinh học
trong phịng trừ tổng hợp cơn trùng gây hại (Lê Hữu Phước, 2011).
Trên đồng ruộng Việt Nam hiện nay đã xuất hiện khá nhiều dịch vi sinh
vật gây bệnh côn trùng hại như dịch virus (virus sâu xanh bông NPV .Ha, virus
sâu khoang NPV .Sl, virus sâu róm thơng NPV .Dp,…), vi khuẩn Bacillus
thuringiensis (Bt), vi nấm Beauveria, Metarhizium, Paecilomyces, Normuraea,…
có ích trong tự nhiên. Chúng có khả năng hạn chế hoặc khống chế được một phần
dịch sâu hại cây trồng khi gặp điều kiện thời tiết thích hợp (Phạm Thị Thùy,
2010).
1


Trước thực trạng này, con người không ngừng thử nghiệm các biện pháp
mới để phịng chống sâu bệnh mà khơng gây nhiều tác hại như thuốc trừ sâu hóa
học. Cũng từ đó, các chế phẩm thuốc trừ sâu bệnh có nguồn gốc sinh học được ra
đời và đang ngày càng được nghiên cứu, ứng dụng rộng rãi. Chế phẩm thuốc trừ
sâu bệnh có nguồn gốc vi sinh có nhiều điểm ưu việt như sau:
- Không gây độc hại cho người và gia súc, không nhiễm bẩn môi trường
sống. Không làm mất đi những nguồn tài ngun có ích như các lồi thiên địch
và các vi sinh vật có lợi cho con người. Không ảnh hưởng đến chất lượng nông
sản, thực phẩm cũng như đất trồng trọt (Phạm Thị Thùy, 2010).
- Việc sử dụng các chế phẩm vi sinh vật diệt sâu bệnh cho đến nay chưa
phát hiện thấy hiện tượng “lờn thuốc” ở các loại cơn trùng. Đó là điều rất đáng
được quan tâm, vì ở các thuốc trừ sâu bệnh hóa học, do đã được sử dụng lâu dài
trước nay và việc sử dụng còn quá tùy tiện nên tính “lờn thuốc” xuất hiện ngày
một nhiều ở các lồi sâu bệnh, bắt buộc người dân phải tăng nồng độ sử dụng lên
mà hiệu quả lại cứ giảm dần. Các vi sinh vật diệt cơn trùng có thể tồn tại trong

điều kiện môi trường không thuận lợi (không vật chủ, điều kiện khí hậu khắc
nghiệt,…) (Trần Thị Thanh, 2001).
- Hiệu quả của thuốc vi sinh thường kéo dài, vì chúng không chỉ tiêu diệt
trực tiếp lứa sâu đang phá hại mà cịn có thể lan truyền cho thế hệ tiếp theo, ví dụ
như đợt trứng kế tiếp nở ra lứa sâu non mới nếu tiếp xúc với sâu hại đã chết do vi
sinh vật, thì cũng sẽ bị chết bởi vi sinh vật. Điều này cho thấy hiệu quả phòng trừ
của thuốc trừ sâu vi sinh là rất cao và kéo dài, thuốc vi sinh khắc phục được hạn
chế của thuốc hóa học (Phạm Thị Thùy, 2010).
Với những đặc tính ưu việt của chế phẩm diệt cơn trùng có nguồn gốc vi
sinh vật, nên các chế phẩm này không ngừng được nghiên cứu và ứng dụng rộng
rãi hơn. Chính vì lý do đó, đề tài: “Phân lập và tuyển chọn một số chủng nấm
sợi có khả năng sinh chất đối kháng diệt sâu bệnh trên cây lúa ở khóm Trung
Hưng, phường Mỹ Thới, thành phố Long Xuyên, tỉnh An Giang” được thực
hiện là cơ sở để có thể tạo ra chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học diệt sâu có hiệu
quả, an tồn cho con người, vật ni và mơi trường.
2. Mục tiêu của đề tài
- Phân lập và tuyển chọn từ 3 – 4 chủng nấm sợi trên xác cơn trùng thu
được từ ruộng lúa có khả năng sinh chất đối kháng mạnh.
- Tiến hành định danh đến chi.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu của đề tài
- Phân lập nấm sợi từ xác cơn trùng.
- Thử hoạt tính enzyme chitinase và protease bằng phương pháp khối
thạch.
- Kiểm tra khả năng sinh chất đối kháng của các chủng nấm sợi phân lập
được bằng phương pháp đục lỗ và tuyển chọn các chủng nấm sợi có khả năng
sinh chất đối kháng mạnh.
2


- Quan sát đại thể và vi thể.

- Định danh các chủng đến chi.

3


II. TỔNG QUAN
1. Đặc điểm hình thái chung của nấm sợi
Nấm sợi là vi sinh vật có nhân chuẩn. Thành tế bào nấm chủ yếu cấu tạo
từ chitin-glucan, chitosan. Hệ nấm sợi được cấu tạo bởi các sợi nấm không vách
ngăn hoặc có vách ngăn. Các sợi nấm vừa phát triển theo chiều dài do tăng
trưởng ở ngọn, vừa phân nhánh tạo thành hệ sợi nấm hay còn gọi là khuẩn ty thể
(hình 2). Hệ sợi nấm phát triển thành các dạng khuẩn lạc khác nhau tùy theo cơ
chất rắn, lỏng hay mềm (hình 3). Khuẩn lạc nấm sợi thường có dạng hình trịn,
hoặc gần trịn. Bề mặt khuẩn lạc có thể mượt, nhẵn bóng, dạng bột, dạng sợi,
dạng hạt, dạng xốp, dạng phẳng, có những vết khía xun tâm, hoặc lồi lõm
khơng đều. Mép khuẩn lạc có thể trơn hoặc răng cưa (Nguyễn Lân Dũng, 2001).

Hình 2: Bào tử mọc ra khuẩn ty

Hình 3: Khuẩn lạc nấm

(Nguồn: />diay.htm
/>Petri_dish.png)

Một số sợi nấm có thể tiết sắc tố vào mơi trường hoặc tiết chất hữu cơ kết
tinh trên bề mặt sợi nấm.
Các đặc điểm hình thái khác như có bó sợi, bó giá, thể quả, hạch nấm, giọt
tiết, sắc tố hịa tan…, làm khuẩn lạc nấm sợi có tính đặc trưng cho loài (Bùi Xuân
Đồng, 2000).
Phương thức dinh dưỡng của nấm là hấp thụ qua màng, khơng có cơ quan

tiêu hóa, khơng có khả năng quang hợp. Đa phần là các cơ thể hoại sinh, một số
ký sinh, một số gây bệnh trên người và động thực vật.
Nấm sợi sinh sản chủ yếu bằng bào tử, bào tử có thể hình thành theo kiểu
vơ tính hoặc hữu tính (Bùi Xn Đồng, 2000).
Bào tử vơ tính: Bao gồm các động bào tử, bào tử trần, bào tử kín. Bào tử
trần là dạng bào tử phổ biến nhất.

4


Hình 4: Các dạng bào tử trần của nấm sợi
(Nguồn: />
Sinh sản hữu tính: Nấm sợi có các hình thức sinh sản hữu tính như: đẳng
giao, dị giao, nỗn giao và tiếp hợp. Ngoài ra, lớp nấm Túi và nấm Đảm sinh sản
hữu tính bằng bào tử túi và bào tử đảm.

Hình 5: Sự tiếp hợp của nấm sợi
(Nguồn: />
2. Đặc điểm một số loài nấm ký sinh sâu bệnh phổ biến
2.1. Đặc điểm hình thái và khả năng gây bệnh
2.1.1. Nấm Beauveria (nấm Bạch Cƣơng)
Bệnh do nấm này được nghiên cứu tương đối sớm. Cuối thế kỷ XIX ở Mỹ
đã dùng nấm Beauveria để trừ một loại bọ xít cánh trắng. Sau khi tiếp xúc với bề
mặt cơ thể vật chủ, bào tử của nấm Beauveria bắt đầu mọc mầm và xâm nhập
vào bên trong cơ thể vật chủ. Quá trình này bắt đầu từ sau khi vật chủ bị nhiễm
bào tử khoảng 10 giờ và có thể kéo dài vài ngày. Sau khi xâm nhập vào trong cơ
thể vật chủ, nấm bắt đầu sinh trưởng và phát triển. Nấm tiêu diệt dần các tế bào
bạch huyết khi bị tấn công trong giai đoạn đầu xâm nhiễm cơ thể ký chủ. Khi
nấm tiêu diệt hết tế bào bạch huyết thì vật chủ chết. Nấm tiếp tục sinh trưởng và
phát triển. Lượng sợi nấm bên trong cơ thể vật chủ ngày càng tăng và xác côn

trùng càng trở nên rắn lại. Khi gặp độ ẩm thuận lợi, các sợi nấm mọc ra ngoài bề
mặt cơ thể vật chủ và tạo thành bào tử mới (Chu Thị Thơm, Phan Thị Lài,
Nguyễn Văn Tó, 2006).
Nấm có sợi từ màu trắng đến màu kem có pha một ít màu đỏ, da cam, đơi
khi pha một ít màu lục, có thể tiết vào mơi trường sắc tố màu vàng, màu đỏ nhạt
hoặc màu xanh da trời (Lê Hữu Phước, 2011).
Sợi nấm phân nhánh mảnh, có vách ngăn, đường kính sợi là 2 – 5µm.
Cuống bào tử trần đứng riêng rẽ hoặc tụ thành đám, khơng phân nhánh hoặc có
phân nhánh, hình ống hoặc hình bình, chiều dài khơng đều nhau. Trên cuống có
những mảnh nhỏ mang bào tử trần (Lương Đức Phẩm, 2011).
5


Hình 6: Cơn trùng bị nấm Beauveria
ký sinh

Hình 7: Bào tử nấm Beauveria
(Nguồn: asa.

(Nguồn: />
gob.pe/0/modulos/JER/JER_Interna.aspx?

fang/Hort/screens/thrips.htm)

ARE=0&PFL=2&JER=42)

Beauveria sinh sản bằng bào tử trần, đơn bào, bào tử khơng màu có dạng
hình cầu, đường kính 1 - 4µm hay hình trứng (1,5 – 5,5) ì 1,3àm (Lng c
Phm, 2011). Chỳng mang nhiu giỏ sinh bào tử, phồng to ở phía dưới với kích
thước (3 5) ì (3 6)àm. Cỏc giỏ bo tử trần thường tạo thành các nhánh ở

phần ngọn hoặc trực tiếp tạo thành nhánh của giá, phần ngọn của bào tử có dạng
cuống hẹp hình zích zắc khơng đều (Phạm Thị Thùy, 2010).
Nấm Beauveria xâm nhiễm nhiều lồi cơn trùng gây hại cho nông nghiệp
thuộc bộ cánh vẩy Lepidoptera, bộ cánh cứng Coleoptera, bộ cánh màng
Hymenoptera, và cả bộ cánh nửa cứng Himiptera, bộ hai cánh Diptera (Yoshinori
Tanada và Harry K. Kaya, 1993).
2.1.2. Nấm Metarhizium (nấm Lục Cƣơng, nấm xanh)
Nấm này được Metschinikov phát hiện đầu tiên vào năm 1878 trên bọ
hung hại lúa mì bị bệnh. Nấm xanh thường gây bệnh cho côn trùng sống trong
đất, thuộc hệ vi sinh vật đất trong tự nhiên. Bào tử của nấm xanh sau 24 giờ tiếp
xúc với bề mặt cơ thể cơn trùng thì bắt đầu mọc mầm và xâm nhập vào bên
trong. Trong cơ thể côn trùng sợi nấm phát triển xâm nhập vào các bộ phận nội
quan. Sau khi vật chủ chết, sợi nấm mọc ra ngoài cơ thể côn trùng tạo thành lớp
nấm màu trắng hơi hồng nhạt. Trên đó tạo thành các bào tử màu xanh xám (Chu
Thị Thơm, Phan Thị Lài, Nguyễn Văn Tó, 2006).
Nấm Metarhizium có dạng sợi phân nhánh, có vách ngăn ngang, đường
kính sợi 3- 4µm. Sợi có màu từ trắng đến hồng. Bào tử của nấm là bào tử trần,
dạng hình que, có kích thước 3,5 – 7,2µm, có bào tử xám đến ôliu – lục (xanh
ôliu) (Lương Đức Phẩm, 2011). Bào tử xếp thành chuỗi khá chặt chẽ và nhìn
bằng mắt thường thấy bào tử tạo ra trên bề mặt côn trùng một lớp phấn khá rõ
(Trần Thị Thanh, 2001).
M. anisopliae với bào tử dạng trụ và khuẩn lạc xanh đen hoặc đôi khi màu
tối hoặc hồng vỏ quế, khuẩn lạc mọc chậm. M. anisopliae có 2 thứ với đặc điểm:
6


M. anisopliae var major có bào tử dài và M. anisopliae var anisoliae có bào tử
ngắn.

Hình 8: Cơn trùng bị nấm Metarhizium

ký sinh

Hình 9: Hình dạng bào tử nấm
Metarhizium

(Nguồn: (Nguồn: />2335.htm)
detail.cfm?imgnum=1276025)

Nấm xanh ký sinh trên 200 lồi cơn trùng, thuộc các bộ: Orthoptera (11
loài), Dermaptera (1 loài), Hemiptera (21 loài), Lepidoptera (27 loài), Diptera (4
loài), Hymenoptera (6 loài), và Coloptera (134 loài). (Chu Thị Thơm, Phan Thị
Lài, Nguyễn Văn Tó, 2006).
2.1.3. Nấm Paecilomyces
Chi nấm này tựa như nấm mốc xanh (Penicillium) và nấm chổi
(Gliocladium). Khuẩn lạc dạng thảm nhung, dạng bó sợi, màu trắng, hồng nhạt,
màu tím đinh hương, màu nâu vàng và màu nâu xám, thỉnh thoảng có màu lục
nhạt. Cuống bào tử phân sinh phân nhánh, mức độ phân nhánh lớn hơn nấm mốc
xanh. Gốc cuống dạng bình phình to, phía trên nhỏ và uốn cong. Cuống bình sắp
xếp thường dạng vịng hoặc khơng đồng đều. Bào tử phân sinh đơn bào, khơng
màu, mọc thành chuỗi, hình bầu dục, bề mặt nhẵn hoặc có gai (Trần Văn Mão,
2004).

Hình 10: Cơn trùng bị nấm

Hình 11: Hình dạng bào tử nấm

Paecilomyces ký sinh

Paecilomyces

(Nguồn: Lưu Hữu Phước, 2011)

(Nguồn: />view/423/)
7


2.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
2.2.1. Nấm Beauveria (nấm Bạch Cƣơng)
Nấm Beauveria khó sinh trưởng tốt trên nền cơ chất khơng có chitin. Ở
nhiệt độ dưới 100C và trên 450C thì nấm thường khơng hình thành bào tử. Nhiệt
độ thích hợp cho sự nảy mầm của bào tử là 25 - 300C và bị chết ở 49 - 550C,
nhiệt độ cho nấm phát triển tốt nhất là 22 - 250C, pH thích hợp là 6 và có thể dao
động trong khoảng 3 – 8,5. Nấm Beauveria có khả năng phân giải tinh bột,
cellulose và chitin (Lê Hữu Phước, 2011).
Nấm Beauveria có thể đồng hóa nhiều nguồn thức ăn carbon khác nhau.
Chúng phát triển tốt trên mơi trường có thể chứa glucose hay lipid. Muốn tạo
thành bào tử, nấm Beauveria địi hỏi phải có độ ẩm khơng khí cao, tuy nhiên độ
ẩm dưới 50% vẫn kích thích nấm sinh bào tử (Gottwald. G. L, H. L Tedders,
1982).
Trên các nguồn thức ăn khác nhau nấm sinh ra các men thủy phân thành
các chất đơn phân tử rồi đồng hóa. Việc phân giải vỏ chitin được tiến hành ngay
khi nấm xâm nhập vào cơ thể cơn trùng, sau đó là việc phân giải protein và lipid
ở các mô bên trong. Trong nuôi cấy nấm thì tỷ lệ C : N cần được xác định. Ngoài
ra một lượng chitin nhất định là cần thiết cho q trình phát triển bào tử đính
(conidiospore) và bào tử chồi (blastospore). Khơng chỉ có vậy, các ngun tố vi
lượng, vitamin đều cần thiết cho việc phát triển của nấm (Nguyễn Văn Đĩnh và
cộng sự, 2007).
2.2.2. Nấm Metarhizium (nấm Lục Cƣơng, nấm xanh)
Nấm Metarhizium phát triển trong giới hạn pH 6,9 – 7,4, nhiệt độ thích
hợp cho sự phát triển của nấm là 25 – 300C (Lương Đức Phẩm, 2011). Nếu t0 >

280C sợi nấm sẽ không sản sinh ra bào tử trần. Ngồi ra muốn nấm có bào tử cần
phải có độ ẩm khơng khí khá cao (Trần Thị Thanh, 2001).
Nấm Metarhizium không thể sinh trưởng tốt trên nền cơ chất khơng có
chitin, chúng sống được ở nhiệt độ thấp 80C, có biên độ về độ ẩm rộng, ở nơi tích
lũy nhiều CO2 và thiếu O2 chúng có thể sống tới 445 ngày (Lê Hữu Phước,
2011).
Ở dưới 100C và trên 350C thì sự hình thành bào tử không thể xảy ra. Nhiệt
độ tốt nhất cho sự nảy mầm bào tử là 25 – 300C và chết ở 490C trong 10 phút.
Nhiệt độ tốt nhất cho sự sinh trưởng là 250C và pH 3,3 – 8,5. Metarhizium có khả
năng phân giải tinh bột, cellulose và chitin (lông và da côn trùng) (Chu Thị
Thơm, Phan Thị Lài, Nguyễn Văn Tó, 2006).
2.2.3. Nấm Paecilomyces
Gần đây Stathers, T.E., D. Moore và C. Prior (2004) đã cho công bố
những kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm
Paecilomyces thích hợp ở nhiệt độ 280C và độ ẩm thích hợp trong phạm vi 80 –
90% (Phạm Thị Thùy, 2004).
8


Độ ẩm cao sẽ rất có lợi cho bào tử nảy mầm và sinh trưởng của sợi nấm.
Tuy nhiên, độ ẩm thấp sẽ có lợi cho nấm duy trì sự sống. Bào tử phân sinh của
nấm Paecilomyces có khả năng sống lâu trong điều kiện độ ẩm từ 0 – 34% hơn là
trong điều kiện độ ẩm 75% (Trần Văn Mão, 2002).
Nấm ký sinh cơn trùng nói chung rất cần ánh sáng cho sự phát triển và
nấm Paecilomyces cũng không ngoại lệ. Vì vậy, ánh sáng là nhân tố khơng thể
thiếu trong sự hình thành bào tử của nấm Paecilomyces (Trần Văn Mão, 2002).
2.3. Đặc điểm phân loại chung
Nấm gây bệnh cho cơn trùng thuộc nhiều nhóm nấm khác nhau: từ nhóm
nấm nguyên thủy sống dưới nước đến nhóm nấm bậc cao sống trên cạn. Nấm gây
bệnh cho côn trùng có mặt trong cả 4 lớp nấm:

- Lớp nấm bậc thấp Phycomycetes: Trong lớp nấm này, các loài ký sinh ở
côn trùng tập trung ở 3 bộ: Chytridiales, Blastocladiales và Entomophthorales.
Đặc biệt có những họ nấm gồm tất cả các lồi đều là ký sinh trên cơn trùng như
Entomophthoraceae và Coelomomycetaceae. Những giống nấm ký sinh côn
trùng quan trọng của lớp nấm bậc thấp là: Coelosporidum, Chrytridiosis (bộ
Chrytridiales), Coelomonyces (bộ Blastocladiales) và Entomophthora (bộ
Entomophthorales).
- Lớp nấm túi Ascomycetes: Trong lớp nấm túi có bộ Laboulbiniales là
những nấm ngoại ký sinh cơn trùng có chun tính cao, cịn các lồi nấm túi khác
đều là nội ký sinh của côn trùng. Những giống nấm quan trọng gây bệnh cho côn
trùng là: Cordyceps, Aschrsonia (bộ Hypocreales).
- Lớp nấm đảm Basidiomycetes: Trong lớp nấm đảm chỉ ở 2 giống có các
lồi gây bệnh trên cơn trùng. Đó là giống Septobasidium và Ureinella.
- Lớp nấm bất toàn Deuteromycetes: Phần lớn các loài nấm ký sinh côn
trùng đều thuộc bộ Moniliales. Những giống Beauveria, Paecilomyces, Spicaria,
Metarhizium, Cephalosporium và Sorosphorella chứa các loài sau khi xâm
nhiễm vào côn trùng đã tạo thành độc tố và gây chết vật chủ trong khoảng thời
gian nhất định.
2.4. Phân bố
Hai giống nấm Beauveria và Metarhizium khá phổ biến trong tự nhiên. Vì
vậy, có thể phân lập chúng từ mẫu đất hoặc tốt nhất từ xác cơn trùng chết (khi
cịn ở dạng sâu, kể cả tằm bị bệnh). Khi thời tiết khắc nghiệt khơng có cơn trùng,
người ta cũng có thể lấy mẫu đất ở những nơi có chất thải hữu cơ, xác thực vật, ở
đất trồng các cây đước ở đầm lầy, ở đất trầm tích các dịng sơng, trong tổ một số
loài chim và cả trong rễ cây dâu tây cũng có thể phân lập được những nấm này.
Các lồi thuộc giống Paecilomyces phân bố phổ biến trong môi trường đất
và vật liệu hữu cơ mục nát (Samson và cộng sự, 1974). Nấm Paecilomyces có rất
nhiều lồi, có phổ ký sinh côn trùng rất rộng, cả những vùng nhiệt đới và ơn đới
(Trần Văn Mão, 2002). Nấm Paecilomyces có thể được tìm thấy ở đất tơi xốp,
9

phân hữu cơ và thức ăn, xác bã hữu cơ,... Một số lồi có ý nghĩa sinh học quan
trong như:
+ Paecilomyces carneus được tìm thấy trên một loạt các vật liệu hữu cơ và
đặc biệt là từ đất. Đôi khi nó được phân lập từ cơn trùng, nấm Paecilomyces
carneus được xem là một tác nhân gây bệnh côn trùng yếu.
+ Paecilomyces farinosus cũng được phân lập từ đất. Nó là một tác nhân
gây bệnh cơn trùng phổ biến, đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng nấm này như một
tác nhân kiểm sốt sinh học trong phịng trừ dịch bệnh.
+ Paecilomyces fumosoroseus được phân lập từ côn trùng, bơ, đất và
gelatine. Là lồi nấm có phổ ký sinh cơn trùng rộng, ký sinh trên nhiều vật chủ
như: Luciana separata, Pyrausta nubilalis, Carposina niponensis và nhiều lồi
cơn trùng biết bay khác (flies).
+ Paecilomyces lilacinus được phân lập từ côn trùng, đất, trên các vật liệu
hữu cơ, cao su tổng hợp,... Đây cũng là lồi có khả năng ký sinh cơn trùng, đặc
biệt ở giai đoạn ấu trùng. Ngoài ra, người ta đã thành cơng trong việc sử dụng
lồi nấm này như một tác nhân kiểm sốt lồi giun trịn ký sinh trong ruột người
(nematodes).
3. Khả năng sinh các chất có hoạt tính sinh học
3.1. Khả năng sinh enzyme thủy phân ngoại bào
3.1.1. Khái quát về enzyme
Enzyme là một loại protein được sinh vật tổng hợp nên, và tham gia vào
các phản ứng sinh học. Enzyme có phân tử lượng từ 20.000 đến 1.000.000
Dalton, được cấu tạo từ L-acid amine liên kết nhau bởi liên kết peptid. Bộ phận
đặc hiệu tham gia phản ứng gọi là trung tâm hoạt động của enzyme. Bản chất
sinh học của enzyme là sản phẩm của các quá trình sinh học và thực hiện các
phản ứng sinh hóa trong và ngồi tế bào sinh vật.
Enzyme gồm 2 nhóm: Nhóm enzyme một cấu tử gồm những enzyme có
thành phần hóa học duy nhất là protein và nhóm enzyme hai cấu tử gồm những

enzyme có hai thành phần: phần protein thuần gọi là apoenzyme có vai trị xúc
tác, phần thứ hai là coenzyme gồm những chất hữu cơ đặc hiệu có vai trị thúc
đẩy q trình xúc tác. Ngồi ra, có một số kim loại như Fe, Cu, Zn, Mn, …đóng
vai trị liên kết giữa enzyme và cơ chất, liên kết giữa apoenzyme và coenzyme,
tham gia trực tiếp vào quá trình vận chuyển điện tử (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
3.1.2. Cơ chế hoạt động của enzyme
Hoạt động của phân tử enzyme được biểu hiện trong trung tâm hoạt động.
Trung tâm hoạt động của enzyme có cấu trúc khơng gian tương ứng với cơ chất
mà chúng tham gia. Phản ứng khơng có sẳn mà được hình thành trong quá trình
enzyme tiếp xúc với cơ chất giống như chìa khóa vào ổ khóa tạo thành phức hợp
enzyme - cơ chất.

10


Cơ chế tác động của enzyme vào cơ chất qua ba giai đoạn:
• Giai đoạn 1: Enzyme tương tác với cơ chất bằng những liên kết yếu tạo
thành phức hợp enzyme - cơ chất.
• Giai đoạn 2: Khi cơ chất tạo phức với enzyme, thì cơ chất sẽ bị thay đổi
cấu hình khơng gian và mức độ bền vững các liên kết. Các liên kết bị phá vỡ và
tạo ra sản phẩm. Phức enzyme cơ chất sẽ được tách ra.
• Giai đoạn 3: Enzyme được giải phóng, cơ chất chuyển thành sản phẩm
và tách khỏi enzyme.
3.1.3. Khái quát một số loại enzyme phổ biến do nấm sợi ký sinh
côn trùng tiết ra
• Protease là enzyme phân cắt mối peptide (- CO - NH -) trong phân tử
protein và chuỗi polypeptide, xúc tác phản ứng thủy phân protein thành peptide
và acid amine. Vì vậy protease gồm có proteinase phân hủy phân tử protein thành
các đoạn peptide có khối lượng phân tử nhỏ và peptidase phân hủy các liên kết ở
cuối mạch polypeptide và tách các gốc acid amine thành acid amine tự do.

• Lipase là một enzyme xúc tác trong quá trình thủy phân các triglyceride
khơng trộn nước ở mặt phân cách nước và lipid. Các chất tạo thành trong quá
trình thủy phân là monoglyceride, diglyceride hoặc glyxerol và các acid béo nhờ
hoạt động trên bề mặt phân pha dầu nước.
• Chitinase là enzyme thủy phân chitin qua việc xúc tác sự thủy giải liên
kết 1,4 – β – glucoside giữa C1 và C4 của 2 phân tử N – acetyl – D – glucosamin
liên tiếp nhau trong chitin. Dựa vào khả năng phân cắt, enzyme phân giải chitin
bao gồm 4 loại:
+ Endochitinase là enzyme phân cắt nội mạch chitin một cách ngẫu nhiên
tạo các đoạn olygosaccharides.
+ Chitin – 1,4 – β – chitobiosidase là enzyme phân cắt chitin tạo thành các
sản phẩm chính là các dimer chitobiose.
+ N – acetyl – β – D – glucosaminidase (exochitinase) là enzyme phân cắt
chitin từ một đầu, cho sản phẩm chính là các monomer N – acetyl – D –
Glucosamine.
+ Chitobiase là enzyme phân cắt chitobiose thành 2 đơn phân N–acetyl–
D–glucosamine.
3.2. Khả năng sinh các chất đối kháng
3.2.1. Khái quát về chất đối kháng
Chất đối kháng côn trùng là những sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật
có khả năng kìm hãm hoặc ức chế sự phát triển của côn trùng.

11


3.2.2. Đặc điểm các chất đối kháng do nấm sợi ký sinh sâu bệnh
tiết ra
Nấm Beauveria diệt được côn trùng nhờ độc tố Beauvericin. Độc tố này
có cơng thức C45H57O9N3, đây là một loại depsipeptide mạch vòng và tên gọi là
cyclo (N – metyl – L – phelnyl alanin – D – α – hydroxy – izovaleryl)3, có điểm

sơi ở 93 – 940C. Từ một lít dịch lên men tách được 1,5g và một ký mơi trường
lên men rắn có thể tách được 3,8g Beauvericin (Lương Đức Phẩm, 2011).
Độc tố diệt côn trùng của nấm Metarhizium bao gồm nhiều ngoại độc tố
có tên Destruxin A, B, C và D. Destruxin A và B có thể tách ra từ dịch ni cấy
nấm Metarhizium. Destruxin A có cơng thức là C29H47O7N5, điểm sơi ở 1880C.
Destruxin B có cơng thức là C30H51O7N5 và điểm sơi là 2340C. Đó là những
depsipeptide vịng (Lương Đức Phẩm, 2011). Năm 1961, 1962, Y. Kodaira đã
tách được ngoại độc tố Destruxin A và Destruxin B từ dịch nuôi cấy nấm lục
cương Metarhizium. Trong một lít dịch ni cấy, tác giả có thể thu được 13 –
15mg độc tố Destruxin A và B (Phạm Thị Thùy, 2010)
Độc tố của nấm Paecilomyces là Paecilotoxin, cấu trúc rất phức tạp, có
pháp danh hóa học là (2S) – N – [(1S) – 1 – [[(1S) – 1 – [2 – [[(1S) – 1 – [[(1S)
– 1 – [2 – [2 – (3 – arbamoylpropylcarbamoyl] – 3 – methyl – butyl] carbamoyl]
propan – 2 – ylcarbamoyl] – 2 – hydroxy – 3 – methyl – butyl] carbamoyl] – 5 –
hydroxy – 3 – methyl – 7 – oxo – nonyl] – 4 – methyl – 1 – [(E,4S) – 4 –
methylhex – 2 – enoyl] pyrrolidine – 2 – carboxamide (Nevalainen Helena,
1977).
4. Cơ chế tác động của nấm lên sâu bệnh
Beauveria: Trong tự nhiên, khi bào tử nấm Beauveria rơi vào cơ thể cơn
trùng, gặp điều kiện thời tiết thích hợp, chỉ sau 12 – 24 giờ thì bào tử nấm nảy
mầm, chúng hình thành sợi đâm xuyên qua lớp vỏ chitin, sau đó phát triển bên
trong cơ thể cơn trùng, cơn trùng phải huy động các tế bào bạch huyết để chống
đỡ, nhưng nấm Beauveria đã tiết ra độc tố Beauvericin có chứa protease và một
số chất khác phá hủy ngay cả tế bào bạch huyết làm cho sâu chết, sợi nấm mọc
rất nhiều trong cơ thể sâu và sau đó chui ra ngoài, tạo một lớp bào tử phủ trên cơ
thể sâu (Phạm Thị Thùy, 2010).
Metarhizium: Khi bào tử nấm lục cương bám lên bề mặt côn trùng trong
khoảng 24 giờ thì bào tử sẽ nảy mầm, tạo thành ống mầm xun qua vỏ cơn
trùng, sau đó tiếp tục phân nhánh tạo nên một mạng sợi nấm chằng chịt bên trong
cơ thể côn trùng, cũng giống như nấm Beauveria. Nấm Metarhizium đã tiết ra

các độc tố Destruxin A, B và chính các độc tố trên đã gây chết côn trùng.
Paecilomyces: Côn trùng bị nấm này tấn cơng thì ở chỗ bào tử bám vào sẽ
sản sinh ra enzyme phân hủy vỏ chitin của côn trùng. Nấm sẽ phát triển bên trong
thân của sâu non tạo nên một vệt đen khơng có hình thù nhất định. Cơn trùng
chết đi thường có màu trắng, đơi khi có màu tím nhạt, thân hơi cứng lại (Phạm
Thị Thùy, 2004).
12


III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Vật liệu
1.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Các chủng nấm sợi ký sinh trên xác côn trùng được phân lập tại các ruộng
lúa thuộc khóm Trung Hưng, phường Mỹ Thới, thành phố Long Xuyên, tỉnh An
Giang.
1.2. Hóa chất
- Các hóa chất có nguồn gốc từ Việt Nam: Glucose, pepton, chitin, tinh
bột tan, agar, cồn đốt, nước cất,...
- Các hóa chất có nguồn gốc từ Trung Quốc: K2HPO4, KCl, NaCl, NaOH,
NaNO3, MgSO4.7H2O, FeSO4.7H2O, HgCl2, lugol,...
1.3. Thiết bị, dụng cụ
- Các thiết bị: Nồi hấp vô trùng, tủ sấy, tủ ấm, kính hiển vi, tủ lạnh, máy
đo pH, cân phân tích điện tử, máy chụp ảnh kỹ thuật số,…
- Các dụng cụ thí nghiệm: thước đo khuẩn lạc, lị điện, bình tam giác, ống
nghiệm, đĩa petri, đèn cồn, diêm quẹt, que trang, que cấy, giấy quỳ, giấy lọc, giấy
báo cũ, phiến kính, lá kính, bơng mỡ, bông thấm nước, khoan nút chai,…
1.4. Môi trƣờng (MT)
MT phân lập, nuôi cấy và giữ giống, định danh nấm sợi
MT 1: MT Czapek- Dox cải tiến dùng để phân lập nấm sợi (Nguyễn Đức
Lượng, 2003)

- NaNO3

:

3,5 g

- K2HPO4

:

1,5 g

- MgSO4.7H2O

:

0,5 g

- KCl

:

0,5 g

- FeSO4.7H2O

:

0,01 g (vết)

- Glucoza

:

20 g

- Agar

:

20 g

- Nước cất

:

1000ml

- pH = 6,5. Khử trùng 1 atm/ 30 phút
MT 2: MT Potato glucose agar (PGA) dùng để nuôi cấy, giữ giống và
định danh nấm sợi (Nguyễn Đức Lượng, 2003)
- Nước chiết khoai tây

:

200 ml

- Agar

:

20 g

- Nước cất

:

1000 ml
13


- pH = 5,5 - 6,0. Khử trùng 1atm trong 30 phút
* Cách chế nước chiết khoai tây.
Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch. Cân 200g, xắt lát, thêm 1 lít nước cất, đun sôi
trong 30 phút. Lọc lấy dịch trong.
MT thử hoạt tính enzyme bằng phương pháp khuếch tán trên thạch
MT 3: MT thử hoạt tính protease (Trần Thanh Thủy, 1999)
- NaNO3

:

3,5 g

- K2HPO4

:

1,5 g

- MgSO4.7H2O

:

0,5 g

- KCl

:

0,5 g

- FeSO4.7H2O

:

0,01 g (vết)

- Cazêin

:

15 g

- Agar

:

20 g

- Nước cất

:

1000ml

- pH = 6,5. Khử trùng 1 atm/ 30 phút
MT 4: MT thử hoạt tính Chitinase (Lê Duy Linh, 1997)
- NaNO3
:
3,5 g
- K2HPO4

:

1,5 g

- MgSO4.7H2O

:

0,5 g

- KCl

:

0,5 g

- FeSO4.7H2O

:

0,01 g (vết)

- Bột chitin

:

10 g

- Agar

:

20 g

- Nước cất

:

1000ml

- pH = 6,5. Khử trùng 1 atm/ 30 phút
* Cách chiết chitin từ vỏ, đầu tôm
- Vỏ, đầu tôm rửa sạch, sấy khô.
- Xử lý tách protein bằng dung dịch NaOH 4% ở 700C-750C/ 4 giờ, sau đó
rửa sạch bằng nước cất.
- Tách khống bằng dung dịch HCl 8% ở 260C- 300C/ 16 giờ, rửa sạch.
- Sấy khô, xay nhuyễn thành dạng bột, bảo quản trong lọ thủy tinh.

14


2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.1. Phƣơng pháp thu mẫu
Cách lấy mẫu: Dùng kẹp đặt xác côn trùng bị nhiễm nấm vào trong ống
tuýp, bên trong để kèm theo một ít bơng gịn thấm ướt, ghi rõ thời gian và địa
điểm lấy mẫu.
Nhận biết côn trùng bị nhiễm nấm: Côn trùng nhiễm nấm ký sinh thường
có tơ (sợi nấm) xuất hiện trên bề mặt cơ thể, có thể quan sát bằng mắt thường.
Xác chết sâu thường bám chặt trên lá hoặc thân cây và dần khơ cứng lại. Có thể
lấy mẫu ở bất cứ giai đoạn nào trong chu trình phát triển của cây lúa, tuy nhiên
nên lấy mẫu ở giai đoạn gần cuối chu trình phát triển, vì giai đoạn này số lượng
cơn trùng gây hại thường nhiều, do đó nấm ký sinh côn trùng cũng tăng theo.
Thời điểm lấy mẫu thích hợp nhất là buổi sáng sớm hoặc chiều mát, vì đây
là lúc khơng khí có độ ẩm cao, sợi nấm trương nước, phát triển mạnh, thuận lợi
cho việc phân lập.
2.2. Phƣơng pháp phân lập mẫu trực tiếp và pha loãng mẫu theo
Uyenco, 1988
2.2.1. Phƣơng pháp pha loãng mẫu
Lấy 10g mẫu côn trùng nhiễm nấm (cùng một ruộng lúa) cho vào ống
nghiệm, thêm 90ml nước cất vô trùng, lắc đều, mạnh ta được dung dịch pha
loãng 10-1.
Lắc đều, rồi hút 1 ml dung dịch 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước
cất vô trùng ta được dung dịch pha loãng nồng độ 10-2.
Tiếp tục pha loãng như thế ta được dung dịch nồng độ 10-3, 10-4, 10-5.
2.2.2. Phƣơng pháp cấy mẫu
Nhỏ 2 giọt dung dịch ở mỗi nồng độ lên đĩa petri chứa môi trường
Czapek-dox. Dùng que trang trải đều khắp mặt thạch. Sau đó sử dụng que trang
đó trải tiếp hai đĩa tiếp theo.

2.2.3. Phƣơng pháp ủ mẫu
Lật ngược đĩa petri, gói vào giấy báo cũ, ủ ở nhiệt độ phòng từ 3 – 7 ngày.
Chọn khuẩn lạc riêng rẽ cấy truyền sang ống nghiệm thạch nghiêng chứa môi
trường PGA.
2.2.4. Phƣơng pháp làm thuần
Lấy một khuẩn lạc riêng rẽ trong ống thạch nghiêng, hịa vào nước cất vơ
trùng, trải lên đĩa petri chứa mơi trường PGA, sau đó ủ mẫu và quan sát. Nếu các
dạng khuẩn lạc đồng đều, có màu sắc giống nhau, soi dưới kính hiển vi đều có
một dạng tế bào chứng tỏ giống phân lập thuần khiết.
Sau đó chọn khuẩn lạc riêng rẽ cấy truyền sang 3 ống thạch nghiêng để
bảo quản và nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa.
15


2.3. Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzyme ngoại bào của nấm sợi
bằng cách khoan khối thạch và đo đƣờng kính vịng thủy phân
2.3.1. Ngun tắc
Cho enzyme tác dụng lên cơ chất trong môi trường thạch, cơ chất bị phân
hủy, độ đục môi trường giảm, môi trường trở nên trong suốt. Độ lớn của phần
môi trường trong suốt phản ánh hoạt động của enzyme.
2.3.2. Tiến hành thí nghiệm
Ni nấm cần thử hoạt tính enzyme: Cấy nấm vào mơi trường PGA, ni
ở nhiệt độ phịng từ 3 – 5 ngày, chờ khi nấm phát triển thành khuẩn lạc tương đối
lớn, đường kính khuẩn lạc khoảng từ 1 – 2 cm.
Dùng khoan nút chai (d=10mm) vô trùng, khoan các khối thạch trên mơi
trường PGA có chứa hệ sợi nấm, đặt khối thạch vào mơi trường cần thử hoạt tính
enzyme protease, chitinase trên các đĩa petri. Giữ đĩa petri ở nhiệt độ phòng. Sau
3 – 4 ngày dùng thuốc thử nhỏ lên bề mặt thạch và đo đường kính vịng phân giải
bằng thước đo khuẩn lạc.
2.3.3. Kiểm tra kết quả

- Kiểm tra hoạt tính chitinase: Dùng thuốc thử lugol nhỏ lên bề mặt
thạch. Nếu nấm sợi có hoạt tính chitinase, vùng chitin bị phân giải có màu nâu đỏ
nhạt hoặc trắng, các vùng khác có màu nâu đỏ.
- Kiểm tra hoạt tính protease: Dùng HgCl2 nhỏ lên bề mặt thạch. Nếu
nấm sợi sinh ra protease, sẽ có một vịng trong suốt quanh khuẩn lạc, do các
phân tử protein bị phân giải khơng cịn phản ứng với HgCl2. Vùng chứa protein
chưa bị phân giải có màu trắng đục do khi phản ứng với HgCl2 protein bị kết tủa.
2.3.4. Đánh giá khả năng tạo enzyme
Đặt ngược đĩa petri. Dùng thước đo đường kính vịng phân giải (D) và đo
đường kính lỗ thạch (d = 10mm).
Dựa vào kết quả (D - d) để đánh giá khả năng sinh enzyme của các chủng
nấm sợi. Nếu giá trị (D - d) càng lớn thì khả năng sinh enzyme của nấm sợi càng
cao.
Theo Mai Thị Hằng (2002) quy ước:
 D-d ≥ 20mm

: hoạt tính enzym mạnh

 D-d ≥ 10mm

: hoạt tính enzym trung bình

 D-d < 10mm

: hoạt tính enzym yếu

16


2.4. Phƣơng pháp xác định hoạt tính chất đối kháng của nấm sợi phân

lập đƣợc bằng phƣơng pháp đục lỗ (Xác định kháng sinh trong môi trƣờng
dịch thể)
2.4.1. Nguyên tắc
Chất đối kháng do nấm sợi sinh ra sẽ ức chế sự phát triển của vi sinh vật
kiểm định làm cho vi sinh vật không phát triển được xung quanh lỗ khoan chứa
dịch đối kháng hay khối thạch chứa nấm tạo thành vịng vơ khuẩn trong suốt.
2.4.2. Cách tiến hành
Ni nấm sợi trên môi trường PG, rồi ủ ba ngày ở nhiệt độ phòng. Ly tâm
3000 vòng/ 10 phút, thu dịch đối kháng.
Dùng khoan nút chai khoan các khối thạch của mơi trường có chứa vi sinh
vật kiểm định (E.coli).
Dùng pipet vô trùng nhỏ 0,1ml dịch đối kháng vào các lỗ khoan.
Để trong tủ lạnh 40C trong 8 giờ để dịch đối kháng khuếch tán vào trong
thạch. Sau đó chuyển sang tủ ấm 300C. Kiểm tra vòng ức chế sau 24h.
2.4.3. Kiểm tra kết quả
Nếu nấm nghiên cứu sinh ra chất đối kháng sẽ có một vịng trong suốt
xung quanh khối thạch do các chất đối kháng đã ức chế sự phát triển của VSV
kiểm định tạo thành vòng tròn trong suốt (vịng vơ khuẩn) xung quanh lỗ khoan.
Khả năng sinh đối kháng được đánh giá bằng hiệu số D - d (mm). Vịng vơ khuẩn
càng lớn thì hoạt tính kháng sinh của chủng đó càng mạnh. Bố trí thí nghiệm 3
lần lặp lại.
2.5. Phƣơng pháp định danh
Sau khi phân lập các chủng nấm sợi thuần khiết, định danh các chủng nấm
đến giống theo hình thái khuẩn lạc và tế bào (theo hệ thống phân loại của
Nguyễn Đức Lượng).
2.5.1. Phƣơng pháp quan sát đại thể nấm sợi
Nấm sợi sau khi cấy truyền sang thạch nghiêng, ta tiến hành tạo khuẩn
lạc khổng lồ theo các bước sau:
- Cho vào ống nghiệm 5 ml nước cất vô trùng.
- Dùng que cấy lấy một ít bào tử từ ống giống thạch nghiêng cho vào ống

nghiệm. Lắc đều tạo dung dịch huyền phù.
- Dùng que cấy chấm vào dung dịch huyền phù rồi nhanh chóng chấm
điểm vào mặt thạch ở giữa hộp petri. Làm 2, 3 hộp.
- Ủ ấm trong một tuần để tạo khuẩn lạc. Hàng ngày lấy ra quan sát.
Dùng kính lúp ba chiều soi mơ tả các đặc điểm:
+ Kích thước khuẩn lạc để biết tốc độ phát triển của nó
17


+ Hình dạng khuẩn lạc
+ Màu sắc khuẩn lạc mặt phải, mặt trái và sự thay đổi màu sắc
+ Màu sắc của môi trường do sắc tố nấm sợi tạo ra
+ Dạng sợi nấm mọc ở mặt trên môi trường
+ Đặc điểm của mép khuẩn lạc
+ Giọt nước đọng, chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt khuẩn lạc…
2.5.2. Phƣơng pháp quan sát vi thể nấm sợi
- Chuẩn bị môi trường PGA, đổ một lớp thật mỏng trong các đĩa petri.
- Dùng khoan nút chai vơ trùng có d = 8 mm, khoan các khối thạch.
- Chuẩn bị các đĩa petri sạch, phiến kính, lá kính, bơng thấm nước, nước
cất vô trùng.
- Đặt 1 hoặc 2 khối thạch trên mỗi phiến kính. Cấy một ít bào tử lên bề
xung quanh khối thạch. Đặt lá kính vơ trùng lên trên bề mặt các khối thạch.
- Các phiến kính có khối thạch cấy nấm sợi nghiên cứu được đặt trong các
hộp petri có sẳn một ít bơng thấm nước được làm ẩm bằng nước cất vô trùng.
Giữ các hộp petri này trong tủ ấm 3-4 ngày.
- Khẽ gỡ lá kính ra, úp lên một phiến kính sạch có một giọt thuốc nhuộm
lactophenol, ta được tiêu bản thứ nhất.
- Gỡ bỏ lớp thạch và để nguyên phần nấm sợi trên phiến kính, nhỏ giọt
lactophenol, đậy lá kính lên trên là ta được tiêu bản thứ hai.
- Dùng kính hiển vi quan sát và vẽ mơ tả các đặc điểm:

+ Hình dạng cuống sinh bào tử
+ Hình dạng thể bình
+ Hình dạng các thể bọng
+ Sợi nấm có hay khơng có sự phân nhánh và vách ngăn
+ Đặc điểm bào tử đính
+ Màu sắc, kích thước bào tử…
- Chụp hình trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 40-100 lần.
2.6. Phƣơng pháp bảo quản nấm sợi trên mơi trƣờng thạch có lớp dầu
khống
Dầu khống là paraffin hay vaseline, hấp vơ trùng dầu khống ở 1210C
trong 2 giờ rồi sấy khơ ở 1700C trong 1- 2 giờ, để nguội.
Chuẩn bị 3 ống giống đã ni ở nhiệt độ phịng và thời gian thích hợp. Đổ
lớp dầu khống đã vơ trùng lên bề mặt. Hàn kín ống nghiệm bằng parafin bảo
quản ở nhiệt độ 40C.
18


2.7. Phƣơng pháp sử dụng phần mềm thống kê để xử lý số liệu thực
nghiệm
Các kết quả thí nghiệm trong đề tài được xử lý bằng phần mềm SPSS 13.0
for Windows. Do yêu cầu của đề tài, chỉ một số chức năng được sử dụng như:
Tính đại lượng thống kê mơ tả (Decriptives) và phân tích ANOVA (analysis of
variance) ở mức ý nghĩa 0,05.

19