Nghiên cứu cố định tế bào saccharomyces cerevisiae trên táo tươi (malus domessticus) bằng phương pháp bẫy hấp phụ và ứng dụng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

PHẠM THỊ PHƯỢNG

NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH TẾ BÀO SACCHAROMYCES
CEREVISIAE TRÊN TÁO TƯƠI (MALUS DOMESTICUS)
BẰNG PHƯƠNG PHÁP BẪY HẤP PHỤ VÀ ỨNG DỤNG

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số ngành: 60 42 80

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 10 năm 2010


2

CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học : PGS.TS. NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)

Cán bộ chấm nhận xét 1 :........................................................................................
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)

Cán bộ chấm nhận xét 2 :........................................................................................
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN
THẠC SĨ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày . . . . . tháng 10 năm 2010

HVTH: Phạm Thị Phượng
GVHD: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng


3

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC

----------------

CỘNG HỒ XÃ HỘI CHỦ NGHIÃ VIỆT NAM

Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc
---oOo--Tp. HCM, ngày 20 tháng 10 năm 2010

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ và tên học viên: PHẠM THỊ PHƯỢNG

Phái: Nữ

Ngày, tháng, năm sinh: 03/ 11/ 1983

Nơi sinh: Hải Dương

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh học
MSHV: 09310579
1- TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu cố định tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae
trên táo tươi (Malus domesticus) và ứng dụng
2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN:
 Xác định lượng enzyme pactinase tối ưu để thu nhận dịch trái thanh long ở điều
kiện nhiệt độ phòng và ở 40oC, 2 giờ, tỉ lệ phối trộn thịt quả với nước theo tỉ lệ 1:1.
 Khảo sát hiệu suất cố định của tế bào S.cerevisiae trên táo tươi (Malus domesticus)
 Khảo sát khả năng tái sử dụng của chế phẩm tế bào S.cerevisiae cố định
 Khảo sát hoạt tính của chế phẩm tế bào S.cerevisiae cố định sau khi bảo quản ở 4oC
 So sánh hoạt tính của tế bào S.cerevisiae cố định và tự do
3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ :
4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ :
5- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : PGS.TS Nguyễn Đức Lượng
Nội dung và đề cương Luận văn thạc sĩ đã được Hội Đồng Chuyên Ngành thông
qua.
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
CHỦ NHIỆM BỘ MÔN
(Họ tên và chữ ký)
QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH
(Họ tên và chữ ký)

HVTH: Phạm Thị Phượng
GVHD: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng

KHOA QL CHUYÊN NGÀNH
(Họ tên và chữ ký)


4

LỜI CẢM ƠN
Với tất cả tấm lòng và sự biết ơn chân thành nhất, qua đây tôi xin gởi lời cảm ơn
tới:
Bố, Mẹ, người luôn động viên và vuôn đắp cho mọi nỗ lực của con.
Thầy Nguyễn Đức Lượng đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo tơi trong suốt q trình
học tập và thực hiện luận văn này.
Cơ Nguyễn Th Hương, cơ Thuỷ Tiên, cơ Oanh đã tận tình hướng dẫn và tạo điều
kiện cho tôi thực hiện luận văn này tại PTN – ĐH Bách Khoa Tp.HCM.
Xin gởi lời cảm ơn tới các Thầy, Cô tại Bộ môn Công Nghệ Sinh học Trường ĐH
Bách Khoa Tp.HCM.
Xin chân thành cảm ơn sự cộng tác và sự động viên của các bạn: Huyền Trang, Mỹ
Đơng cùng tồn thể các bạn Cao học K2008 và các bạn tại PTN Công Nghệ Sinh
học Trường ĐH Bách Khoa Tp.HCM.
Xin gởi lời chúc tới Bố, Mẹ, Thầy, Cô sức khoẻ và thành công.
Chúc các bạn Cao học K2008 sức khoẻ và thành công trên những chặng đường phía
trước.
Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 10 Năm 2010
Phạm Thị Phượng

HVTH: Phạm Thị Phượng
GVHD: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng


5

ABTRACT
Immobilized Saccharomyces cerevisiae on apple piece to produce an immobilized
biocatalyst for fermentation of juice fruit both in batch and continuous system. The
immobilized yeast showed an important operational stability without any decrease

of its activity. Fermentation with the immobilized yeast on apple piece can be winemaking not only low temperature but also high-temperature without any diminution
of the ethanol productivity and improved quality product.
This experiment we have see that immobilized yeast productivity on apple piece is
69.24% with ratio between support and medium fermentation is 1:1.
Low-temperature fermentation, ethanol productivity from biocatalyst is higher than
free yeast and reverse.
Enzyme pectinase for harvest juice dragan is 0.1ml with ratio between fresh water
and flesh dragan is 1:1

HVTH: Phạm Thị Phượng
GVHD: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng


6

TĨM TẮT
Sự cố định tế bào lên chất mang nói chung đã và đang được nghiên cứu và ứng
dụng rất nhiều trong lĩnh vực sản xuất các thực phẩm có cồn cũng như trong sản
xuất các sản phẩm probiotic. Tế bào cố định được đánh giá là mang lại năng suất và
chất lượng được cải thiện. Tuy nhiên, ở nước ta việc nghiên cứu và sử dụng táo tươi
làm chất mang vẫn chưa được nghiên cứu và ứng dụng.
Trong bài nghiên cứu này, chúng tôi đã xác định được hiệu suất cố định đạt 69.24%
với tỷ lệ chất mang và môi trường cố định là 1 :1. Sử dụng chế phẩm tế bào
S.cerevisiae cố định và tự do cho lên men dịch trái thanh long cho thấy lượng cồn từ
tế bào nấm men cố định cao hơn so với nấm men tự do trong điều kiện nhiệt độ 4oC.
Tuy nhiên, trong điều kiện nhiệt độ phịng cho thấy hoạt tính của tế bào S.cerevisiae
tự do lại cao hơn.
Khảo sát hàm lượng enzyme pectinase trong thu nhận dịch trái thanh long ghi nhận
ở tỷ lệ thịt trái và nước là 1 : 1 thì lượng enzyme là 0.1ml.

HVTH: Phạm Thị Phượng
GVHD: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng


7

DANH MỤC HÌNH
Hình II.1: Tế bào hấp phụ trên bề mặt chất mang [39] ........................................... 12
Hình II.2: Tế bào gắn trên bề mặt chất mang bằng các liên kết cộng hóa trị [39] ...
.............................................................................................................................. 13
Hình II.3: Tế bào kết bơng trong tự nhiên (a) và sự kết bông của tế bào bằng liên kết
chéo (b) [39] .......................................................................................................... 14
Hình III.4: Tế bào cố định trong mạng lưới chất mang [39] ................................... 15
Hình II.5: Tế bào nấm men nhuộm Gram (x40) ..................................................... 21
Hình II.6: Tế bào S.cerevisiae [79] ........................................................................ 22
Hình II.7: Hình thái của trái táo tây (Malus domesticus) ........................................ 25
Hình II.8: Sơ đồ quy trình sản xuất vang thanh long .............................................. 31
Hình III. 1: Trái thanh long để nguyên và cắt dọc .................................................. 37
Hình III. 2: Trái táo tây (Malus domesticus) để nguyên và cắt miếng..................... 38
Hình III. 3: Sơ đồ quy trình huấn luyện thích nghi giống ....................................... 39
Hình III. 4: Khuẩn lạc tế bào nấm men sau 48 giờ ni cấy ở nhiệt độ phịng. ....... 40
Hình III. 5: Sơ đồ quy trình nhân giống cấp 1 ........................................................ 41
Hình III. 6: Ống giống cấp 1 .................................................................................. 42
Hình III. 7: Sơ đồ nhân giống cấp 2 ....................................................................... 42
Hình III. 8: Nhân giống cấp 2 ................................................................................ 43
Hình III.9: Sơ đồ thu sinh khối nấm men ............................................................... 44
Hình III.10: Sơ đồ thu nhận chất mang .................................................................. 45
Hình III.11: Miếng táo sau khi xử lý ...................................................................... 46
Hình III.12: Sơ đồ quy trình tạo chế phẩm tế bào nấm men cố định ....................... 47
Hình III.13: Tế bào nấm men nhuộm xanh methylen (x40) .................................... 49

Hình III.14: Tế bào S.cerevisiae trên buồng đếm hồng cầu (x40) Bảng III.2: Bảng
đánh giá hoạt tính lên men của tế bào nấm men tự do và cố định sau 7 ngày lên men ở
điều kiện nhiệt độ phòng. ...................................................................................... 51

HVTH: Phạm Thị Phượng
GVHD: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng


8

DANH MỤC BẢNG
Bảng II.1: Thành phần các chất có trong 100g táo ................................................ 26
Bảng III.1: Xác định mối quan hệ lượng chất mang và hiệu suất cố định ............... 48
Bảng III.2: Bảng đánh giá hoạt tính lên men của tế bào nấm men tự do và cố định sau
7 ngày lên men ở điều kiện nhiệt độ phòng. ........................................................... 55
Bảng III.3: Đánh giá khả năng tái sử dụng của tế bào nấm men cố định sau 7 ngày lên
men, nhiệt độ phòng. ............................................................................................. 56
Bảng III.4: Đánh giá khả năng tái sử dụng của tế bào nấm men cố định sau khi bảo
quản. ..................................................................................................................... 57

HVTH: Phạm Thị Phượng
GVHD: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng


9

DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ IV.1: Mối quan hệ lượng dịch trái thanh long thu được trong điều kiện xử
lý ở nhiệt độ phòng và nhiệt độ 40oC.
................................................................................................................................ 5

8
Biểu đồ IV.2: Khảo sát hiệu suất cố định tế bào S.cerevisiae trên táo tươi
................................................................................................................................ 6
1
Biểu đồ IV.3: Khảo sát khả năng tái sử dụng của chế phẩm tế bào S.cerevisiae cố
định
................................................................................................................................ 6
3
Biểu đồ IV.4: Khảo sát hoạt tính của tế bào S.cerevisiae cố định sau khi bảo quản ..
64
Biểu đồ IV.5: So sánh hoạt tính của tế bào S.cerevisiae cố định và tự do
............................................................................................ 65

HVTH: Phạm Thị Phượng
GVHD: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng


10

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DEAE – cellulose: Diethylaminoethyl cellulose
CM – cellulose: Carboxymethyl cellulose
DCM: delignified cellulosic materials
GP: gluten pellets
V/P: vòng/phút
CFU: Clony Form Unit

HVTH: Phạm Thị Phượng
GVHD: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng

11

CHƯƠNG 1
MỞ ĐẦU

HVTH: Phạm Thị Phượng
GVHD: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng


12

I.MỞ ĐẦU
Cố định tế bào còn được định nghĩa là việc gắn tế bào vi sinh vật vào chất mang
không hòa tan trong nước, tế bào cố định sau khi lên men có thể được tái sử dụng
nhiều lần, khơng bị lẫn vào sản phẩm và có thể chủ động ngừng phản ứng mong
muốn [36; 39].
Rất nhiều chất mang và các phương pháp cố định tế bào đã được nghiên cứu và thử
nghiệm không chỉ trong sản xuất rượu vang mà còn ở các lĩnh vực khác như sản
xuất cồn, bia, axit acetic, axit L- lactic, yogurt, β- Glucosidase, axit propionic, axit
glutamic,…[36]. Các phương pháp và kỹ thuật cố định không chỉ phù hợp với
ngành công nghệ sản xuất các sản phẩm có cồn, trong lên men sữa mà bên cạnh đó
có thể ứng dụng trong sản xuất xăng sinh học (bioethanol), đây không chỉ là vấn đề
được chú trọng về tính kinh tế như sự tăng sản lượng, khả năng tái sử dụng của chế
phẩm cũng như tối ưu hóa các điều kiện mà phương pháp và kỹ thuật cố định tế bào
mang lại [28; 36].
Cố định tế bào đã và đang được quan tâm trong ngành thức uống có cồn và lĩnh vực
sản xuất các sản phẩm có cồn cũng như trong sản xuất các sản phẩm probiotic trong
thời kỳ gần đây. Sự cố định tế bào mang lại nhiều thuận lợi như làm tăng sản lượng
lên men, đem lại nguồn lợi về kinh tế, có thể sử dụng chế phẩm tế bào cố định cho

lên men liên tục và lên men truyền thống trong điều kiện nhiệt độ thấp mà khơng
ảnh hưởng đến hoạt tính của tế bào, chủ động tăng mật độ tế bào, sự ổn định của tế
bào trong chất mang và có thể tái sử dụng được tế bào cố định (Margaritis và
Merchant, 1984; Stewart và Russel, 1986). Ngoài ra tế bào cố định còn được bảo vệ
chống lại các áp lực về nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất…. Và do đó có thể rút ngắn
được thời gian trong pha thích nghi của tế bào, đây là một trong những yếu tố quan
trọng mà trong lên men công nghiệp rất được chú ý [38; 72; 75]. Hiện đã có một vài
nghiên cứu về hiệu quả của sự cố định tế bào ở các mức nhiệt độ khác nhau cho
thấy đối với các tế bào cố định có thể lên men được trong tất cả các mức nhiệt độ
khác nhau mà không ảnh hưởng đến hiệu suất lên men, nếu như tế bào tự do lên
men ở 15 oC chỉ đạt hiệu suất 50% so với lên men ở 30oC, ở 10oC chỉ đạt hiệu suất
HVTH: Phạm Thị Phượng
GVHD: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng


13

30% so với ở 30 oC [60; 28]. Trong khi đó nếu sử dụng tế bào cố định lên men ở các
mức nhiệt độ khác nhau lại khơng có sự khác biệt đáng kể về sản lượng, thậm chí
sản lượng còn cao hơn so với tế bào tự do ở cùng điều kiện. Một ví dụ thấy rất rõ là
nếu lên men với tế bào cố định ở 10oC cho sản lượng cao gấp 4 đến 6 lần so với tế
bào tự do [9; 40]. Hiện nay, trong lĩnh vực công nghiệp việc sử dụng các tế bào cố
định vẫn cịn hạn chế do nó cịn phụ thuộc vào các phương pháp cố định và việc lựa
chọn chất mang phù hợp. Các phương pháp cố định tế bào dựa trên sự cố định tế
bào trong điều kiện tự nhiên như sự tự kết chùm của các vi sinh vật trong tự nhiên
để tránh sự rửa trôi, sự gắn vào giá thể bằng nha bào của chúng, dựa trên các yếu tố
vật lý, hóa học và sinh học [35; 68].

HVTH: Phạm Thị Phượng
GVHD: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng

14

CHƯƠNG 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

HVTH: Phạm Thị Phượng
GVHD: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng


15

Nghiên cứu cố định tế bào S.cerevisiae trên táo tươi

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
II.1. KHÁI QUÁT VỀ CHẤT MANG (SUPPORT)TRONG CỐ ĐỊNH TẾ
BÀO
II.1.1. Sơ lược về các loại chất mang dùng để cố định tế bào
Sự cố định tế bào trên chất mang rắn bằng phương pháp hấp phụ dựa trên các liên
kết hóa học: liên kết hóa trị, liên kết Van Der Walls, liên kết hidro giữa chất mang
với thành tế bào. Độ dày của bề mặt chất mang khoảng 1mm, sử dụng hệ thống cố
định tế bào trên bề mặt chất mang rất phổ biến vì sự cố định này rất đơn giản và dễ
dàng. Sự liên kết giữa tế bào với chất mang thường đi kèm sự gắn tế bào vào trong
lòng chất mang, khơng có rào cản giữa tế bào với mơi trường [2; 25; 30].
Ví dụ: chất mang rắn được sử dụng để cố định tế bào là vật liệu cellulose như mạt
cưa, khúc gỗ, DEAE-cellulose, vật liệu vô cơ khác như bông thủy tinh,
polygorskite, montmorilonite, hydromica, porous porcelain… Các chất mang này

được xử lý với chitosan hoặc các chất hóa học khác trước khi dùng cố định tế bào
(Norton và D’Amore, 1994; Navarro và Durand, 1977) [25].
II.1.2. Yêu cầu về chất mang [ 39; 36 ; 25]
Chất mang để cố định tế bào phải phù hợp cho việc sản xuất thức uống có cồn cũng
như phải an tồn về thực phẩm. Theo Freeman (1984) và Martin (1991) thì chất
mang phải đáp ứng được các yêu cầu sau:
 Chất mang phải có diện tích tiếp xúc lớn, độ trương tốt, là giá thể cho tế bào
vi sinh vật gắn vào.
 Chất mang phải dễ xử lý và phù hợp với dạng thiết bị lên men (fermenter).
 Chất mang phải bền về mặt cơ học, có tính trơ về mặt hóa học và sinh học,
không phải là thành phần dinh dưỡng hay cơ chất của vi sinh vật, không
thay đổi bởi áp suất và nhiệt độ.
 Chất mang phải rẻ tiền, dễ kiếm, an tồn về mặt thực phẩm
 Chất mang có thể tái sử dụng được nhiều lần
HVTH: Phạm Thị Phượng
GVHD: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng


16

Nghiên cứu cố định tế bào S.cerevisiae trên táo tươi

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

 Chất mang phải an tồn về mơi trường
 Vi sinh vật thể hiện đầy đủ hoạt tính sinh học khi được cố định trên chất
mang.
 Chất mang phải có cấu trúc xốp, cho phép các chất dinh dưỡng và các sản
phẩm trao đổi chất vào và ra tự do.
II.1.3. Phân loại chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật

Có nhiều loại chất mang được sử dụng trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật,
chúng được phân loại theo các nhóm sau: chất mang có nguồn gốc hữu cơ, chất
mang có nguồn gốc vơ cơ, chất mang có nguồn gốc tự nhiên và hệ thống màng.
Chất mang có nguồn gốc thiên nhiên thích hợp đối với các ứng dụng trong lĩnh vực
thực phẩm, dễ sử dụng, đối với chất mang là miếng trái cây hoặc bã mía… thì
khơng cần phải xử lý trước khi đưa vào sử dụng làm chất mang để cố định tế bào
hoặc chỉ cần xử lý qua như gỗ, mạt cưa [15; 25; 30].
II.1.3.1. Chất mang hữu cơ
II.1.3.1.1. Chất mang hữu cơ tự nhiên [10; 45; 25]
Chất mang là polysaccharide: là nhóm chất mang đang rất thịnh hành và được sử
dụng rộng rãi nhất hiện nay, đó là cellulose, agarose, dextran và các dẫn xuất của
chúng.
•

Cellulose

Cellulose được sử dụng rất rộng rãi làm chất mang để cố định tế bào.
Cellulose là thành phần cấu tạo chủ yếu của các vật liệu như: rơm, bã mía, dăm bào,
trấu, mạt cưa,… Đây là nguyên liệu dễ kiếm, giá thành rẻ ở Việt Nam.
Các cellulose là một loại homopolyme của β-D-glucose. Các gốc β-D-glucose được
nối kết với nhau qua liên kết β-D-1,4-glucan. Mức độ polymer hóa của phân tử
cellulose thay đổi nhiều, trung bình là 3000. Tùy theo từng loại thực vật mà các
phân tử cellulose có khối lượng phân tử khác nhau rất nhiều (từ 50000 đến
HVTH: Phạm Thị Phượng
GVHD: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng


17

Nghiên cứu cố định tế bào S.cerevisiae trên táo tươi

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2500000) [25]. Nhờ phương pháp phân tích bằng tia Ronghen người ta biết rằng
cellulose có cấu tạo sợi. Các sợi này liên kết thành các bó nhỏ người ta gọi là
microfibrin có cấu trúc khơng đồng nhất. Chúng có những phần đặc (phần kết tinh)
và những phần xốp hơn (phần vơ định hình). Cellulose là một trong các hợp chất tự
nhiên khá bền vững. Nó khơng tan trong nước mà chỉ bị trương lên do hấp thụ
nước. Cellulose chỉ bị phân hủy khi đốt nóng với acid hoặc kiềm ở nồng độ khá cao
[8; 43; 56].
Cellulose cũng bị phân hủy ở nhiệt độ thường hoặc ở nhiệt độ 40 ÷ 50oC nhờ các
enzyme phân hủy cellulose gọi là cellulase.
Cellulose và các dẫn xuất của chúng như CM - cellulose, DEAE - cellulose có tính
chất cơ lý khá bền vững nhưng lại không đồng nhất nên thường chỉ sử dụng ở dạng
sợi và vi hạt [14; 20].
•

DCM (delignified cellulosic materials) và GP (gluten pellets)

Chất mang có nguồn gốc tự nhiên để cố định tế bào như DCM - delignified
cellulosic materials (Bardi và Koutinas, 1994), gluten pellets - GP (Bardi và Cộng
sự, 1997) có hiệu quả trong lên men rượu vang ở nhiệt độ phòng và nhiệt độ thấp.
Các tế bào cố định trên chất mang này cho thấy tốc độ lên men tăng hơn so với tế
bào tự do. Rượu vang được sản xuất có hàm lượng cồn vừa phải và hàm lượng ethyl
acetate tăng trên tổng số axit bay hơi. Rượu vang được sản xuất sử dụng tế bào cố
định có chất lượng và mùi vị tốt hơn so với rượu vang lên men được sản xuất từ tế
bào không được cố định trên loại chất mang này (Mallouchos và Cộng sự, 2003) [4;
27].
DCM và GP là chất mang có tính an tồn về thực phẩm, giá thành rẻ, dễ kiếm, dễ
xử lý trong lĩnh vực công nghiệp, có tính ổn định và có thể sử dụng trong thời gian

dài. Tính thương mại của tế bào cố định trên hai loại chất mang này so với tế bào tự
do là chúng được bảo vệ trong điều kiện đông lạnh và đơng khơ [18].
Các loại trái cây cịn được giới thiệu như là một loại chất mang dùng để cố định tế
bào trong sản xuất rượu vang như táo tươi với giá thành rẻ, dễ kiếm, không cần xử
HVTH: Phạm Thị Phượng
GVHD: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng


18

Nghiên cứu cố định tế bào S.cerevisiae trên táo tươi

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

lý trước khi sử dụng, an toàn về mặt thực phẩm, cải thiện được mùi vị của sản
phẩm, phù hợp với lên men liên tục (Kourkoutas và Cộng sự, 2002) [31; 47].
Mallouchos và Cộng sự (2002) sản xuất rượu vang sử dụng tế bào nấm men
S.cerevisiae cố định trên trái nho khô cho thấy sản lượng cao hơn so với sử dụng tế
bào tự do. Chất mang này rất phù hợp với sự lên men rượu vang, đặc biệt tính đặc
thù của lên men rượu vang là giai đoạn lên men phụ hay lên men malolactic.
•

Collagen [25; 39]

Collagen là chất mang thích hợp cho q trình cố định tế bào ở điều kiện “nhẹ
nhàng”. Collagen là protein sợi, có nguồn gốc từ các mơ liên kết ở cơ thể động vật.
Collagen ưa nước, do vậy trong môi trường nước nó trương nở rất mạnh và khi ấy
nó dễ bị cải biến do sự thay đổi tương quan tỷ lệ giữa các gốc ưa nước và kỵ nước,
chính các tính chất này đã làm nó trở thành chất mang thuận tiện cho q trình cố
định tế bào.

•

Agarose

Agarose được thu nhận từ rong biển, nó cũng có thể đóng vai trị làm chất mang cho
cố định tế bào do nó là vật liệu đồng nhất, ổn định và dễ tạo hạt. Tuy nhiên nó rất ít
được sử dụng trong thực tế vì độ bền cơ học thấp, bên cạnh đó vấn đề giá thành hơi
cao. Do đó agarose thường chỉ được sử dụng trong phịng thí nghiệm mà ít được sử
dụng đại trà trong lĩnh vực công nghiệp ở nước ta [25; 55; 68].

HVTH: Phạm Thị Phượng
GVHD: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng


19

Nghiên cứu cố định tế bào S.cerevisiae trên táo tươi

•

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Alginate, carrageenan

Alginate, carrageenan là hai vật liệu còn khá mới, giá thành cịn cao vì ở nước ta
chưa tinh chế được hai loại chất này dưới dạng tinh khiết [11; 56]. Cả hai vật liệu
này tạo gel trong dung dịch CaCl2 dùng để nhốt tế bào và enzyme. Tuy nhiên hai
loại vật liệu này có một nhược điểm chung là cấu trúc không ổn định và thường bị
tan rữa trong mơi trường có phosphate và điều này ảnh hưởng đến chất lượng cảm
quan của sản phẩm, giảm số lần tái sử dụng, không thân thiện với môi trường [47;

59].
Alginat có trong vách của tế bào rong nâu (Phaeophycota). Nó có cấu tạo gồm các
polysaccharite khơng đồng nhất, gồm các đơn vị axit mannuronic và axit guluronic,
tỷ lệ giữa chúng phụ thuộc vào từng loài. Muối Na, Bari và Canxi được sử dụng để
cố định tế bào vi sinh vật. Nhưng canxi alginat được xem là phù hợp với sự lên men
các sản phẩm có cồn (Colagrande và Cộng sự, 1994) [60; 71]. 1980, Otsuka đã báo
cáo việc sử dụng canxi alginat để bao bọc chất mang trong cố định tế bào để sản
xuất rượu vang bằng phương pháp lên men liên tục.
Ciani và Ferraro (1996) đã nghiên cứu việc sử dụng Ca-alginat để cố định tế bào
nấm men sử dụng cho lên men rượu vang đã nhận thấy có sự gia tăng CO2 cao gấp
2 lần [25; 41].
Chitin và chitosan
Chitin và chitosan là một vật liệu polymer có nhiều triển vọng trong cố định tế bào
và cả enzyme. Chitin là một polymer rất phổ biến trong tự nhiên, chỉ đứng thứ hai
sau cellulose, là một polymer của 2-acetomido-deoxy-β-D-glucose [25]. Chitin
tham gia vào thành phần cấu trúc của vỏ tôm, cua, côn trùng, thành tế bào vi sinh
vật. Chitosan là dẫn xuất của chitin khi xử lý bằng kiềm đặc. Chitin, chitosan có cấu
trúc siêu lỗ, dễ tạo màng, tạo hạt, khả năng hấp thụ tốt, tính chất cơ lý bền vững, ổn
định [10; 14].
II.1.3.1.2. Chất mang hữu cơ tổng hợp

HVTH: Phạm Thị Phượng
GVHD: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng


20

Nghiên cứu cố định tế bào S.cerevisiae trên táo tươi

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Hiện nay có rất nhiều polymer tổng hợp được sử dụng làm chất mang cố định như
polyacrylamide, polyester, polyhydroxyethylmethacrylate,…[51; 28]. Ưu điểm
chung của các polymer tổng hợp là bền, tính chất cơ lý tốt, hồn tồn trơ với sự tấn
công của vi khuẩn, độ trương tốt, một số polymer có thể điều chỉnh được kích thước
siêu lỗ…[25]. Tuy nhiên polymer tổng hợp cũng bộc lộ những nhược điểm nhất
định như một số có giá thành cao như polyacrylamide, polyhydroxyethylacrylate,
khả năng tương hợp sinh học kém và một nhược điểm nữa là do quá bền vững,
không thể phân hủy trong tự nhiên vì vậy gây ơ nhiễm mơi trường [27; 30]. Đây là
một vấn đề quan trọng đặt ra địi hỏi con người cần quan tâm và giải quyết.
•

Polyacrylamide

Polyacrylamide là một polymer rất đồng nhất, độ trương tốt, kích thước của lỗ gel
có thể điều chỉnh được và diện tích tiếp xúc bề mặt lớn. Đây cũng là đối tượng đầu
tiên được sử dụng làm chất mang cố định tế bào vi sinh vật [25; 29; 66].
II.1.3.2. Chất mang vô cơ
II.1.3.2.1. Chất mang vô cơ tự nhiên
Zeolit: Là các Aluminosilicate có cấu trúc tinh thể theo khơng gian 3 chiều, hình
thành các cửa sổ và các lỗ xốp có kích cỡ phân tử.
Yếu tố quyết định hiệu quả hấp phụ của vi sinh vật trên các chất mang silicate và
zeolit là mật độ các nhóm hoạt hóa ở trên bề mặt cao cho phép gắn các phân tử
protein thông qua các liên kết hydrogen hoặc các tương tác tĩnh điện [21; 19].
II.1.3.2.2. Chất mang vô cơ tổng hợp
Các chất mang vơ cơ có nguồn gốc là đất kiềm thổ, Al2O3, TiO2, cũng được sử dụng
để gắn vi sinh vật, ví dụ như thủy tinh xốp, silicagel và silochrom [22, 41]. Các vật
liệu này có ưu điểm là chúng có khả năng thay đổi độ xốp lớn và có khả năng hấp
phụ cao đối với phần lớn protein. Một trong những chất mang phổ biến nhất hiện
nay là silochrom đã được amine hóa. Ngồi ra, ceramic có độ xốp điều chỉnh được

HVTH: Phạm Thị Phượng
GVHD: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng


21

Nghiên cứu cố định tế bào S.cerevisiae trên táo tươi

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

và có chứa các ion kim loại trong thành phần của nó cũng có một triển vọng to lớn
[11; 14].
Đôi khi, người ta sử dụng các hydroxide kim loại. Ở đây, tương tác giữa tế bào và
chất mang là nhỏ nhất, do vậy làm tăng khả năng sống sót của tế bào. Trong số các
hydroxide thì loại hydroxide titanium và zirconium là được nghiên cứu kỹ lưỡng
hơn cả.
Kissiris và γ-alumina
Kissiris là vật liệu có nguồn gốc từ sự phun trào núi lửa, giá thành rẻ (khoảng
60$/tấn), γ-alumina có giá thành cao hơn Kissiris. Việc xử lý 2 loại vật liệu này đơn
giản, thường xử lý bằng nước sôi, hoặc một số loại hóa chất khác [11; 53]. Trong
khi đó Ca-alginat thì khơng xử lý bằng phương pháp này do cấu trúc của nó bị thay
đổi và rất khó phục hồi sau khi xử lý. Bên cạnh đó việc sử dụng Kissiris và γalumina làm chất mang để cố định tế bào rất thân thiện với môi trường. Tuy nhiên,
trong sản xuất rượu vang cũng như sản xuất các sản phẩm probiotic thì các chất
mang có nguồn gốc vơ cơ ít được quan tâm [14; 47].
Khống kissiris có cấu trúc lỗ xốp, thành phần chính chứa 70% SiO2 được dùng cố
định tế bào nấm men trong lên men theo mẻ và lên men liên tục trong điều kiện
nhiệt độ thấp (Bakoyianis và Cộng sự, 1992, 1993). Hoạt tính xúc tác của tế bào
được cố định cho thấy chất mang này phù hợp với lên men ở nhiệt độ thấp. Sản
lượng lên men rượu vang ở 5 oC tương đương với sản lượng được lên men ở 22 đến

25oC [25; 24].
Chất lượng rượu vang được cải thiện về mùi vị, hàm lượng ethyl acetate cao.
Argiriou và Cộng sự (1996) đã nghiên cứu thấy tế bào S. Cerevisiae được bảo vệ ở
0 oC khi được cố định trên khoáng kissiris, sản lượng ethanol tăng và hoạt tính xúc
tác ổn định, có thể sử dụng được đến 2,5 năm cả trong lên men liên tục và lên men
theo mẻ.
Một vài sự cân nhắc về tính thuận lợi đối với chất mang vơ cơ so với chất mang hữu
cơ, chất mang vô cơ rẻ hơn chất mang hữu cơ mặc dù chúng cải thiện chất lượng,
HVTH: Phạm Thị Phượng
GVHD: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng


22

Nghiên cứu cố định tế bào S.cerevisiae trên táo tươi

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

sản lượng và mùi vị sản phẩm lên men. Tuy nhiên chất mang vô cơ cần được cân
nhắc về tính an tồn thực phẩm vì nồng độ chất khống cịn lại trong sản phẩm cuối
cao. Hơn nữa đối với các sản phẩm lên men không qua chưng cất thì các chất
khống này khơng được loại bỏ.
Loukatos và Cộng sự (2000) sử dụng γ-alumina làm chất mang cố định tế bào để
sản xuất rượu vang bằng phương pháp lên men liên tục.
Các chất mang hữu cơ được sử dụng để cố định tế bào trong sản xuất rượu vang
cũng như sản xuất các thức uống có cồn. Các vật liệu thường có nguồn gốc là
polyme như polysaccharide được tìm thấy trong tự nhiên như thành tế bào thực vật,
vỏ tôm, côn trùng… Nhưng thường sử dụng nhất là polysaccharide để cố định tế
bào trong sản xuất rượu vang như alginat, cellulose, carrageenan, agar, axit pectic
và chitosan [25; 60; 52].

II.1.3.3. Chất mang là các loại trái cây
Nếu như các loại chất mang hữu cơ tổng hợp hoặc các loại chất mang vô cơ được sử
dụng để cố định tế bào sử dụng trong sản xuất các sản phẩm thực phẩm, xử lý mơi
trường… thì trái cây được sử dụng như là chất mang để cố định tế bào trong sản
xuất các sản phẩm thuộc lĩnh vực thực phẩm là chủ yếu như các sản phẩm probiotic,
rượu vang, axit acetic, các sản phẩm từ sữa. Các loại trái cây được sử dụng để cố
định tế bào như: trái lê, táo tây, trái sung, cùi trái dưa hấu, vỏ trái cam, nho khô, trái
ổi ... [11; 26; 30; 33; 41; 47]. Trong số đó táo tây đã được nghiên cứu để cố định tế
bào trong sản xuất rượu vang, các sản phẩm probiotic từ vi khuẩn lactic [13]. Đặc
tính của việc sử dụng táo tươi để cố định tế bào vi sinh vật như nấm men trong sản
xuất rượu vang là mang lại tính hài hịa về hương vị trong sản phẩm cuối; thân thiện
với môi trường, giá thành rẻ, dễ kiếm; không xảy ra sự tương tác giữa chất mang
trong quá trình cố định, quá trình cố định đạt hiệu suất cao vì táo tươi khơng chỉ là
chất mang mà cịn có chứa một số chất dinh dưỡng là nguồn cơ chất cho tế bào nấm
men. Điều này đặc biệt quan trọng trong việc cố định tế bào nấm men bằng phương
pháp hấp phụ trên chất mang là táo tươi. Bên cạnh đó, táo tươi làm chất mang để cố

HVTH: Phạm Thị Phượng
GVHD: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng


23

Nghiên cứu cố định tế bào S.cerevisiae trên táo tươi

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

định tế bào nấm men rất thích hợp với các giai đoạn và điều kiện nhiệt độ thấp trong
lên men rượu vang.
II.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP VÀ KỸ THUẬT CỐ ĐỊNH TẾ BÀO

Tế bào cố định được định nghĩa là sự nhốt hoặc sự gắn tế bào vào một vùng trống
mà vẫn bảo vệ được hoạt tính xúc tác của chúng (Karel và Cộng sự, 1985) [14; 21;
25; 26]. Trong tự nhiên, sự cố định cũng xảy ra như sự tăng trưởng của tế bào trên
bề mặt các vật liệu tự nhiên, nhiều vi sinh vật có khả năng gắn vào các bề mặt vật
liệu khác nhau bởi nha bào của chúng.
Việc lựa chọn chất mang dùng để cố định tế bào phụ thuộc vào mục đích thu nhận
sản phẩm và phụ thuộc vào từng loài vi sinh vật cũng như kỹ thuật cố định mà ta
lựa chọn chất mang cho phù hợp [50; 63].
Các kỹ thuật trong công nghệ sinh học rất thuận lợi với các kỹ thuật cố định tế bào,
một vài kỹ thuật cố định và chất mang đã được nghiên cứu. Các kỹ thuật này được
chia ra thành 4 nhóm chính dựa trên các yếu tố vật lý, hóa học và sinh học
(Pilkington và Cộng sự, 1998) [11; 25].
1/ Phương pháp hấp phụ trên bề mặt chất mang
2/ Phương pháp bẫy tế bào trong mạng lưới chất mang
3/ Sự kết bông tự nhiên hoặc tạo tác nhân liên kết chéo
4/ Nhốt tế bào giữa 2 lớp màng
II.2.1. Kỹ thuật hấp phụ và liên kết hóa trị
Hấp phụ và liên kết hóa trị xảy ra giữa các tế bào và bề mặt chất mang thích hợp
hoặc giữa tế bào với tế bào. Một phần bề mặt của tế bào tiếp xúc trực tiếp với môi
trường, phần còn lại sẽ gắn trên bề mặt chất mang.
II.2.2.1. Kỹ thuật hấp phụ

Hình II.1: Tế bào hấp phụ trên bề mặt chất mang [39]
HVTH: Phạm Thị Phượng
GVHD: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng


24

Nghiên cứu cố định tế bào S.cerevisiae trên táo tươi

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Trong tự nhiên, tế bào thường gắn trên bề mặt của giá thể để đấu tranh sinh tồn,
tránh sự rửa trôi. Trong công nghiệp sản xuất dấm ăn: vi khuẩn acetic gắn trên bề
mặt của khúc gỗ nhỏ (wood chip). Các tế bào gắn vào chất mang bởi các liên kết
yếu như ion, hydro, tương tác Van der Walls. Các chất mang bao gồm: gỗ bào
(wood chip), các hạt nhựa (resin), các vật liệu vô cơ: cellulose và carbon hoạt tính
(Kennedy và Cabral, 1983; Klein và Vorlop, 1983; Gonqalves và Cộng sự, 1992;
Andrews và Fonta, 1989). Để tránh hiện tượng kết lắng của tế bào, chất mang phải
có cấu trúc lỗ xốp được sử dụng, cho phép tế bào không chỉ gắn trên bề mặt của
chất mang mà còn gắn sâu vào bên trong của cấu trúc chất mang (Iwasaki và Cộng
sự, 1992, 1993). Sau khi tế bào được cố định theo phương pháp này, chất mang sau
đó được rửa sạch để loại những tế bào không gắn vào chất mang hoặc dễ bị rửa trôi
trước khi sử dụng cho lên men. Phương pháp này đơn giản, chi phí rẻ, phù hợp với
điều kiện của tế bào. Tuy nhiên, phương pháp có nhược điểm là liên kết giữa màng
tế bào và chất mang rất yếu, phần lớn liên kết giữa tế bào với chất mang là các liên
kết yếu. Do đó, tế bào dễ bị rửa trơi [25; 39].
II.2.1.2. Liên kết hóa trị

Hình II.2: Tế bào gắn trên bề mặt chất mang bằng các liên kết cộng hóa trị [39].
II.2.2. Kỹ thuật nhốt tế bào trong mạng lưới chất mang
Phương pháp cố định này cho phép tế bào xâm nhập vào trong mạng lưới chất mang
cho đến khi sự di chuyển của nó bị cản trở bởi các tế bào khác cũng như sự tăng
trưởng về kích thước của chúng. Phương pháp bẫy này dựa trên sự chuyển động của
tế bào vào trong mạng lưới chất mang và bị ngăn cản bởi tế bào từ sự khuếch tán
vào mơi trường, trong khi đó vẫn cho phép sự vận chuyển các chất dinh dưỡng và
sự biến dưỡng xảy ra.
HVTH: Phạm Thị Phượng
GVHD: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng

25

Nghiên cứu cố định tế bào S.cerevisiae trên táo tươi

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Ví dụ về sự cố định bằng phương pháp bẫy trong gel polysaccharide như alginates,
k-carrageenan, agar, chitosan và polygalacturonic axit hoặc mạng lưới polyme khác
như gelatin, collagen và polyvinyl alcohol (Norton và D’Amore, 1994; Park và
Chang, 2000). Sự phát triển của tế bào trong mạng lưới phụ thuộc vào giới hạn sự
khuếch tán vào cấu trúc của vật liệu và sinh khối tế bào [25; 44; 45; 52].
Để tránh sự gián đoạn về các quá trình trao đổi chất cũng như sự thẩm thấu của
oxygen mà yêu cầu các viên carrageenan có kích thước 0,08 đến 0,1mm (Huang và
Cộng sự, 1990) và 0,1 đến 0,15mm cho các viên algin (Ogbonna và Cộng sự, 1991).
Tuy nhiên, các tế bào trong được cố định trên các viên chất mang phát triển không
đồng nhất, các tế bào trên bề mặt của viên chất mang khác với các tế bào ở bên
trong (Freeman và Lilly, 1998) [45; 58]. Do đó, cấu trúc của các viên này bị phá vỡ,
điều này ảnh hưởng đến chất lượng cảm quan cũng như hiệu quả kinh tế của chất
mang. Một trong những vấn đề cần quan tâm khi cố định tế bào trong mạng lưới
chất mang như gel polysaccharide là khả năng tế bào được cố định trên bề mặt chất
mang rất nhiều và điều này cho thấy tế bào rất dễ bị rửa trôi. Để tránh xảy ra hiện
tượng này người ta tiến hành sử dụng lớp bao đôi trên viên cố định nhằm tạo liên
kết hydrogel ở trong, nơi có chứa các tế bào với lớp bên ngồi để giảm sự rửa trơi
của tế bào đã được cố định trên bề nặt chất mang (Tanaka và Cộng sự, 1989;
Taillandier và Cộng sự, 1994; Ramon- Portugal và Cộng sự, 2003) [11]. Rất nhiều
loại tế bào tự do khác nhau được cố định trong mạng lưới chất mang.
II.2.3. Kỹ thuật cố định tế bào dựa trên sự kết bông của tế bào

HVTH: Phạm Thị Phượng
GVHD: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng