Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC MS MS xác định dư lượng một số kháng sinh nhóm sulfonamides trong thịt gia súc gia cầm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Vũ Thị Trang

PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ (LC-MS/MS) XÁC ĐỊNH
DƢ LƢỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH NHÓM SULFONAMIDES
TRONG THỊT GIA SÚC GIA CẦM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2012

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

1


TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Vũ Thị Trang

PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ (LC-MS/MS) XÁC ĐỊNH
DƢ LƢỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH NHÓM SULFONAMIDES
TRONG THỊT GIA SÚC GIA CẦM

Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60.44.29

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN XUÂN TRUNG

Hà Nội - 2012

2


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy PGS.TS. Nguyễn Xuân
Trung đã tận tình hƣớng dẫn, đóng góp những ý kiến q báu, tạo mọi điều kiện
giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài và viết luận văn.
Em xin bày tỏ lịng biết ơn tới các thầy cơ giáo giảng dạy tại khoa Hố học,
đặc biệt là các thầy cơ trong bộ mơn Hố Phân Tích, đã cho em những kiến thức
quý giá, tạo điều kiện cho em đƣợc học tập và nghiên cứu trong môi trƣờng hiện
đại.
Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm
An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi đƣợc học
tập và hồn thành đề tài này.
Tơi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các đồng nghiệp tại labo Hóa – Viện kiểm
nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã giúp đỡ tơi rất nhiều trong q trình
làm thực nghiệm.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã ln động viên,
chia sẻ mọi khó khăn cùng tơi.

Hà Nội, năm 2012
Học viên

Vũ Thị Trang

3


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU…………………………………………………………………………... 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN……………………… ………………………….… 3
1.1. Giới thiệu về kháng sinh nhóm sulfonamid (SAs)……………………………...3
1.1.1 Lịch sử phát hiện…………………………………………………………...….3
1.1.2 Phân loại SAs……………………………………………………………….....3
1.1.3 Cấu tạo của SAs……………………………………………………………….4
1.1.4 Tác dụng của SAs……………………………………………………………..6
1.1.5 Tình hình sử dụng kháng sinh Sulfonamid........................................................8
1.1.6 Giới hạn tồn dƣ tối đa cho phép của SAs trong thực phẩm...............................9
1.2 Các phƣơng pháp xác định SAs............................................................................9
1.2.1 Trong nƣớc.......................................................................................................10
1.2.2 Thế giới.......................................................................................................... .10
CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................19
2.1. Đối tƣợng và mục tiêu nghiên cứu.....................................................................19
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu....................................................................................19
2.2.1. Nguyên tắc chung của sắc ký lỏng………………………………………..…19
2.2.2 Detector khối phổ………………………………………………………….…21
2.2.3. Phân tích định tính và định lƣợng bằng LC/MS…………………………….26
2.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong nghiên cứu……………………...…26
2.3.1 Thiết bị và dụng cụ………………………………………………………...…26
2.3.2 Hóa chất, chất chuẩn……………………………………………………....…27
2.4. Lấy mẫu .............................................................................................................28
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.........................................................29
3.1. Tối ƣu điều kiện tách và xác định Sulfonamid trên thiết bị LC/MS/MS...........29
3.1.1. Tối ƣu các điều kiện của detector khối phổ (MS)…………………………...29

3.1.2. Lựa chọn cột tách………………………………………………………...…32
3.1.3 Khảo sát chƣơng trình gradient…………………………………………....…32
3.1.4 Khảo sát tốc độ pha động.................................................................................36
3.1.5 Khảo sát thành phần acid formic trong pha động............................................38

4


3.2 Tối ƣu q trình xử lý mẫu phân tích các SAs ..................................................40
3.2.1 Khảo sát qui trình chiết....................................................................................43
3.2.2 Khảo sát nồng độ acid acetic trong dung môi chiết.........................................46
3.2.3 Khảo sát thành phần MeOH trong dung môi chiết..........................................48
3.2.4 Khảo sát khối lƣợng pha rắn PSA....................................................................49
3.3. Đánh giá phƣơng pháp phân tích.......................................................................52
3.3.1. Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đƣờng chuẩn...........................................52
3.3.2 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lƣợng (LOQ) của phƣơng pháp......56
3.3.2 Đánh giá độ chụm (độ lặp lại) và độ đúng (độ thu hồi)...................................58
3.3 Phân tích mẫu thực .............................................................................................65
KẾT LUẬN..............................................................................................................73
TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................................75
PHỤ LỤC.................................................................................................................80
Phụ lục 1: Sắc đồ khảo sát nồng độ acid formic trong pha động..............................80
Phụ lục 2: Kết quả khảo sát qui trình chiết mẫu.......................................................82
Phụ lục 3: Kết quả khảo sát nồng độ acid acetic trong dung môi chiết....................87
Phụ lục 4: Kết quả khảo sát nồng độ MeOH trong dung môi chiết
và khối lƣợng PSA................................................................................................ ....92
Phụ lục 5: Sắc đồ thẩm định phƣơng pháp (độ lặp lại, độ thu hồi)...........................94
Phụ

lục

6:

Một

số

sắc

đồ

tế......................................................104

5

phân

tích

mẫu

thực


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1: Cấu trúc hoá học của một số SAs đƣợc xác định trong đề tài

4

Bảng 1.2: Giới hạn tồn dƣ tối đa cho phép đối với SAs tại một số thị trƣờng

9

Bảng 3.1: Các thông số tối ƣu hóa điều kiện phân mảnh
Bảng 3.2: Các thơng số tối ƣu cho nguồn và khí

29
31

Bảng 3.3: Ảnh hƣởng nồng độ acid formic tới diện tích píc SAs

38

Bảng 3.4: Các qui trình chiết dự kiến chiết các SAs

44

Bảng 3.5: Ảnh hƣởng của qui trình chiết đến hiệu suất thu hồi các SAs

45

Bảng 3.6: Ảnh hƣởng của nồng độ acid acetic đến hiệu suất thu hồi các SAs

46

Bảng 3.7: Ảnh hƣởng của nồng độ MeOH đến hiệu suất thu hồi các SAs

48

Bảng 3.8: Ảnh hƣởng của khối lƣợng PSA đến hiệu suất thu hồi của các SAs

49

Bảng 3.9 : Cách pha các dung dịch chuẩn để lập đƣờng chuẩn có chứa IS

53

Bảng 3.10: Đƣờng chuẩn của các SAs (có IS)

53

Bảng 3.11: Đƣờng chuẩn các SAs (khơng có IS)

55

Bảng 3.12: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của các SAs

56

Bảng 3.13: Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi của các SAs trên nền mẫu thịt lợn
tại 5ppb

59

Bảng 3.14: Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi của các SAs trên nền mẫu thịt lợn
tại 10ppb

61

Bảng 3.16: Qui định độ chụm của các phƣơng pháp định lƣợng phụ thuộc
nồng độ chất theo 2002/657/EC

65

Bảng 3.17: Kết quả phân tích mẫu thực

67

6


DANH MỤC HÌNH VẼ
Trang
Hình 2.1: Sơ đồ khối của khối phổ kế

21

Hình 2.2: Chế độ ion hóa phun điện tử ESI

23

Hình 2.3: Cấu tạo của bộ phân tích khối tứ cực MS/MS

25

Hình 3.1: Sắc ký đồ các SAs theo chƣơng trình gradient 1

33

Hình 3.2: Sắc ký đồ các SAs theo chƣơng trình gradient 2

34

Hình 3.3: Sắc ký đồ các SAs theo chƣơng trình gradient 3

34

Hình 3.4: Sắc ký đồ các SAs theo chƣơng trình gradient 4

35

Hình 3.5: Sắc ký đồ các SAs theo chƣơng trình gradient 5

35

Hình 3.6: Sắc đồ rửa giải các SAs tại tốc độ dịng 0,2 ml/phút

36

Hình 3.7: Sắc đồ rửa giải các SAs tại tốc độ dịng 0,3 ml/phút

37

Hình 3.8: Sắc đồ rửa giải các SAs tại tốc độ dịng 0,4 ml/phút

37

Hình 3.9: Sắc đồ rửa giải các SAs tại tốc độ dịng 0,5 ml/phút

37

Hình 3.10: Sắc đồ các SAs tại nồng độ acid formic 0,15%

39

Hình 3.11: Ảnh hƣởng của quy trình chiết đến hiệu suất thu hồi của SIM

45

Hình 3.12: Đồ thị ảnh hƣởng của nồng độ acid acetic đến hiệu suất thu hồi
các SAs

47

Hình 3.13: Sắc đồ 10SAs tại nồng độ acid acetic 1%

47

Hình 3.14: Đồ thị sự ảnh hƣởng của nồng độ MeOH đến hiệu suất thu hồi
của các SAs

49

Hình 3.15: Ảnh hƣởng của khối lƣợng PSA đến hiệu suất thu hồi của các
SAs

50

Hình 3.16: Mối tƣơng quan giữa diện tích pic và nồng độ STZ trong khoảng

0,5-500ppb

52

Hình 3.17: Mối tƣơng quan giữa diện tích pic và nồng độ SDM trong khoảng
0,5-500ppb

52

7


Hình 3.18: Đƣờng chuẩn SMM (R2 = 1,0000)

54

Hình 3.19: Đƣờng chuẩn SSA (R2 = 0,9991)

54

Hình 3.20: Đƣờng chuẩn SIM (R2 = 0,9999)

55

Hình 3.21: Đƣờng chuẩn SSA (R2 = 0,9998)

56

Hình 3.22: Sắc đồ SMM tại giới hạn phát hiện LOD 0,025ppb (S/N = 3,5)

57

Hình 3.23: Sắc đồ STZ tại giới hạn phát hiện LOD 0,025ppb (S/N = 3,3)

57

Hình 3.24: Sắc đồ SP tại giới hạn định lƣợng LOQ 0,05ppb (S/N = 10,5)

58

Hình 3.25: Sắc đồ mẫu thịt lợn thêm chuẩn 10 SAs tại mức nồng độ 5ppb

60

Hình 3.26: Sắc đồ mẫu thịt lợn thêm chuẩn 10 SAs tại mức nồng độ 10ppb

62

Hình 3.27: Sắc đồ mẫu thịt lợn thêm chuẩn 10 SAs tại mức nồng độ 20ppb

64

Hình 3.28: Sắc đồ mẫu gan lợn khơng nhiễm SAs

72

Hình 3.29: Sắc đồ mẫu phủ tạng gà nhiễm SDM

73

8


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
ACN

Acetonitrile

CE

Collision energy

Năng lƣợng va chạm

EI

Electron Ionization

Ion hóa bằng dịng electron

ESI

Eelectrospray ionization

Chế độ ion hóa phun điện tử

EU

European Union

Châu Âu

HPLC

High
performance
chromatography

IUPAC

International Union of Pure and Liên minh quốc tế về hóa học
Applied Chemistry
cơ bản và ứng dụng

LOD

Limit of detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of quantity

Giới hạn định lƣợng

MeOH

Methanol

metanol

MRL

Maximum Residue Limit

Giới hạn dƣ lƣợng tối đa

PSA

Primary and secondary amine

Các amin bậc 1, bậc 2

RSD

Relative standard deviation

Độ lệch chuẩn tƣơng đối

SPE

solid phase extraction

Chiết pha rắn

U.S. NRP United States
Program

National

UPLCMS/MS

Ultral
performance
chromatography
tandem
spectrometry

UV

Ultraviolet

liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Residue Chƣơng trình quốc gia về tồn
dƣ chất độc của Mỹ
liquid Sắc ký lỏng siêu hiệu năng kết
mass nối khối phổ
Tử ngoại

9


MỞ ĐẦU
An toàn thực phẩm đang là mối quan tâm hàng đầu của toàn xã hội. An toàn
thực phẩm trong sản phẩm chăn nuôi không chỉ đơn thuần là sản phẩm (thịt, trứng,
sữa) không nhiễm bẩn, ôi thiu, nhiễm khuẩn (yếu tố gây ngộ độc cấp tính), mà cịn
ở chỗ sản phẩm chứa các chất gây ra ngộ độc tích luỹ, mãn tính hay trƣờng diễn
(hocmon, kháng sinh, độc chất).

Trong vô số các nguyên nhân dẫn đế n viê ̣c mấ t an toàn vê ̣ sinh thƣ̣c phẩ m

,

thì vấn đề về dƣ lƣợng thuốc kháng sinh và tồn dƣ chất kích thí ch tăng tro ̣ng trong
thịt gia súc gia cầm cũng là thực trạng nan giải và đáng báo động

. Với mô ̣t lƣơ ̣ng

thƣ̣c phẩ m khổ ng lồ tƣ̀ đô ̣ng vâ ̣t đang đƣơ ̣c tiêu thu ̣ trên thi ̣trƣờng

, ít ai nghĩ đến

viê ̣c mỗi ngày trong cơ thể chúng ta đa ng phải dần tić h lũy dƣ lƣơ ̣ng chấ t kić h thić h
tăng tro ̣ng và thuố c kháng sinh . Nguyên nhân do ngƣời dân sƣ̉ du ̣ng rấ t tùy tiê ̣n các
loại thức ăn tăng trọng và thuốc kháng sinh nhằm ngăn ngừa , trị bệnh và giúp vật
nuôi mau ăn chó ng lớn. Hâ ̣u quả là dƣ lƣơ ̣ng chấ t kích thích và thuố c kháng sinh
trong thiṭ gia súc, gia cầ m vƣơ ̣t ngƣỡng cho phép gấ p nhiề u lầ n , tuy không gây ngô ̣
đô ̣c cấ p tiń h tƣ́c thời, nhƣng sẽ gây nguy ha ̣i về lâu dài cho sƣ́c khỏe của ngƣờ i tiêu
dùng.
Sulfonamid (SAs) là một nhóm thuốc kháng sinh tổng hợp đóng một vai trị
quan trọng và hiệu quả trong việc hạn chế sự nhiễm trùng do vi khuẩn và vi sinh vật
trong hệ thống tiêu hóa của vật ni. Vì vậy, chúng đƣợc sử dụng trong thức ăn
chăn nuôi nhằm kích thích tăng trƣởng, ngăn chặn và điều trị một loạt các bệnh ở
gia súc gia cầm nhƣ các bệnh về tiêu hóa hay hơ hấp... Song hệ quả khơng thể tránh
khỏi khi sử dụng nhóm các chất kháng sinh này là tồn dƣ của chúng trên thịt gia súc
gia cầm, gây nguy cơ kháng thuốc kháng sinh của vi sinh vật, làm giảm sức đề
kháng của vật nuôi, và gây hại cho sức khỏe con ngƣời nhƣ: ung thƣ tuyến giáp, sốc
phản vệ và kháng thuốc [1].
Ngộ độc thực phẩm thƣờng xảy ra do thiếu sót trong cơng tác kiểm tra, thanh

tra từ nguyên liệu dùng để chế biến thực phẩm, do sơ xuất trong nấu nƣớng, vệ sinh.

10


Việc nghiên cứu xác định dƣ lƣợng SAs trong thịt gia súc gia cầm đã đƣợc nhiều
tác giả trên thế giới quan tâm. Tuy nhiên, ở Việt Nam, vấn đề này vẫn chƣa đƣợc
nghiên cứu sâu. Việc nghiên cứu và đƣa ra phƣơng pháp xác định nhanh, chính xác
SAs giúp cho công tác thanh tra kiểm tra đƣợc chặt chẽ, đảm bảo an toàn cho ngƣời
tiêu dùng. Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ là phƣơng pháp hiện đại, có độ nhạy
cao, cho phép xác định nhanh và chính xác. Vì vậy, chúng tơi đã tiến hành đề tài:
“Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ(LC-MS/MS) xác đinh dư lượng một số
kháng sinh nhóm Sulfonamid trong thịt gia súc gia cầm ”. Với nội dung nghiên
cứu nhƣ sau:
-

Tối ƣu các điều kiện chạy máy LC-MS/MS để tách và xác định các
SAs

-

Tối ƣu q trình xử lý mẫu.

-

Ứng dụng phân tích trên một số mẫu thực tế.

11

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về kháng sinh nhóm sulfonamid (SAs)
1.1.1 Lịch sử phát hiện [6]
Năm 1935 ngƣời ta thấy chất màu prontosil đƣợc chuyển hóa invitro thành
hoạt chất sulfanilamide, một dẫn xuất ngăn ngừa đƣợc nhiễm liên cầu ở chuột. Sau
đó các sulfonamid khác đƣợc tổng hợp, là những chất chuyển hóa của sulfanilamide
với các vị trí thế N1 và N4.
Trong đó sulfanilamide và sulfadiazine đƣợc cấp phép vào năm 1939 và
1941.
Theo các nhà Dƣợc học phân loại thì Sulfonamid là một nhóm thuốc có tác
động tĩnh khuẩn miễn dịch giữ vai trò chủ yếu trong việc loại bỏ tận gốc sự nhiễm
trùng. Do đó, các sulfonamid trở thành những tác nhân hóa trị liệu đầu tiên đƣợc
dùng để ngăn ngừa và điều trị nhiễm khuẩn toàn thân ở ngƣời. Từ đó tới nay, một
loạt sulfonamid khác đƣợc cấp phép, mặc dù hiện nay, hiếm khi chúng đƣợc dùng
đơn độc mà thƣờng hay kết hợp với một vài chất khác.
1.1.2. Phân loại SAs
Các SAs đƣợc phân loại theo khả năng hấp thu và thời gian bài thải chúng ra
khỏi cơ thể, đa số bài thải qua đƣờng thận bằng cách khuếch tán thụ động. Tuy
nhiên, có một số bị tái hấp thụ ở ống thận làm cho chúng duy trì lâu hơn trong cơ
thể [8].
Dựa vào thời gian tác dụng có thể chia SAs thành 4 nhóm nhƣ sau:
-

SAs tác động toàn thân, bao gồm:

+ SAs tác động nhanh (3-6 giờ), bài thải nhanh: sulfamerazin, sulfadimidin,
sulfathiazole...
+ SAs nửa chậm (6-10 giờ): sulfapyridin, sulfamethoxazol, sulfadiazine...

12

+SAs bài thải chậm (10-12 giờ): sulfamethoxypyridazin, sulfadimethoxin,
sulfadoxin...
-

SAs kháng khuẩn đƣờng ruột: sulfaguanidin,phtalylsulfathiazon...

-

SAs tác động tại chỗ (thuốc nhỏ mắt): sulfacetamid,sulfadiazine bạc...

-

SAs trị cầu trùng (thƣờng kết hợp với nhóm diaminopyrimidin):
sulfadimidin, solfaquinoxalin, sulfadimethoxin,sulfadoxin....

1.1.3 Cấu tạo của SAs
Thay thế các gốc R1, R2, R3 khác nhau, sẽ cho các SAs
khác nhau

Bảng 1.1: Cấu trúc hoá học của một số SAs đƣợc xác định trong đề tài
Khối
SAs
STT

Công thức

lƣợng

phân tử

phân tử

pKa

(g/mol)
Sulfisomidine
(SIM)
1

4-amino-N-(2,6-

C12H14N4O2S

278,331

7,35

C10H10N4O2S

250,278

6,5

C9H9N3O2S2

255,319

7,24

dimethylpyrimidin-4-yl)
benzenesulfonamid

Sulfadiazine
2

(SD)
4-amino-N-pyrimidin2-yl-benzenesulfonamid

Sulfathiazole
3
(STZ)

13

Công thức cấu tạo


4-amino-N-(1,3-thiazol2-yl)benzenesulfonamid

Sulfapyridine
4

(SP)

C11H11N3O2S

249,29

8,54

C11H12N4O2S

264,305

6,98

C11H12N4O3S

280,30

6,05

C10H9ClN4O2S

284,72

5,90

C10H11N3O3S

253,279

5,81

(4-amino-N-pyridin-2ylbenzenesulfonamid)
Sulfamerazine
(SM)
5

4-amino-N-(4methylpyrimidin-2-yl)
benzenesulfonamid
Sulfamonomethoxine
(SMM)

6

4-Amino-N-(6methoxy-4pyrimidinyl)benzenesulf
onamid
Sulfachloropyridazine
(SCP)

7

N’-(6-Chloro-3pyridazinyl)sulfanilamid
e
Sulfamethoxazole
(SMX)

8

4-amino-N-(5methylisoxazol-3-yl)benzenesulfonamid

14


Sulfisoxazole
(SSA)
9

4-amino-N-(3,4-

C11H13N3O3S

267,30

4,83

C12H14N4O4S

310,33

6,21

dimethyl-1,2-oxazol-5yl)benzenesulfonamid
Sulfadimethoxine
(SDM)
4-amino-N-(2,610

dimethoxypyrimidin-4yl)
benzenesulfonamid

đồng vị của SDM: trong phân tử có
Sulfadimethoxine-d4

C12H10D4N4O4

(IS)

S

11

314

6,21

bốn nguyên tử hidro 1H bị thay thế
bởi bốn nguyên tử deuteri 2H, đƣợc
dùng làm nội chuẩn

1.1.4 Tác dụng của SAs


Cơ chế tác động:
SAs là một hợp chất hữu cơ có chứa các gốc SO2NH2 (amid của acid

sulfonic). Cấu trúc phân tử của nó tƣơng tự nhƣ p-aminobenzoic acid (PABA) là
cần thiết trong các vi khuẩn sinh vật, nhƣ một chất nền của enzym dihydropteroat
cho sự tổng hợp của acid tetrahydrofolic (THF). Cơ chế tác dụng kìm khuẩn của
SAs là do nó cạnh tranh với acid PABA trong tế bào vi khuẩn, làm cho việc tổng
hợp và vận chuyển acid folic (động vật có vú dùng acid folic có trong thực phẩm
cịn vi khuẩn phải tổng hợp folic) thành nucleoprotein cần cho mọi tế bào sống của
vi khuẩn bị ngƣng trệ, gây rối loạn sự sinh sản và phát triển của vi khuẩn. PABA
kết hợp với pteroic acid hoặc glutamic để tạo pteroylglutamic acid (PGA), chất này
nhƣ một coenzyme trong sự tổng hợp purin và timin. PGA cũng là một phần của
phân tử B12 có liên quan tới sự biến dƣỡng acid amin và purin. Do đó khi thiếu

15

PABA sẽ gây thiếu purin, acid nucleic. Điều này cũng giải thích tại sao các vi
khuẩn tự tổng hợp đƣợc PABA thì đề kháng với SAs và tại sao thymin, purin,
methionin, và một số amin khác lại đối kháng hiệu quả với SAs. Do đó vi khuẩn bị
tiêu diệt trƣớc sức đề kháng của cơ thể hoặc nhờ tác dụng của thuốc.. Chúng đƣợc
sử dụng trong phòng và điều trị nhiễm trùng do vi khuẩn, đái tháo đƣờng, phù, tăng
huyết áp, và bệnh gút… Các sulfonamid có tác dụng kháng khuẩn cho hệ miễn dịch
giữ vai trò chủ yếu trong loại trừ tận gốc sự nhiễm trùng. Sulfonamid có hiệu quả
cao trong giai đoạn đầu của nhiễm trùng cấp tính vì giai đoạn này vi khuẩn có mức
biến dƣỡng cao, dễ kết hợp với Sulfonamid, thêm vào đó khả năng thực bào còn
mạnh và sự khuếch tán của thuốc chƣa bị cản trở bởi q trình xơ hóa trong viêm
mãn tính. Chúng có khả năng kháng khuẩn trên vi khuẩn Gram dƣơng, Gram âm,
Protozoa [9].


Tác dụng phụ của SAs:
Các loại SAs đƣợc các nhà sản xuất đƣa vào trong thức ăn gia súc, gia cầm,

các thuốc chống mốc, thuốc chống oxy hóa giúp sinh vật tăng sức đề kháng, phịng
trị nhiễm khuẩn đồng thời giống nhƣ một chất kích thích tăng trƣởng đem lại lợi ích
cho ngƣời chăn ni. Tuy nhiên những năm gần đây xảy ra hiện tƣợng kháng kháng
sinh và tồn dƣ kháng sinh trong thịt, cá, tôm…do ngƣời nông dân sử dụng không
đúng cách và quá nhiều thuốc kháng sinh và không đảm bảo thời gian ngƣng sử
dụng trƣớc khi thu hoạch, làm cho kháng sinh tích tụ trong thịt. Khi ngƣời tiêu dùng
sử dụng thực phẩm có chứa dƣ lƣợng kháng sinh SAs trong thịt, tơm, cá, trứng,
sữa...sau một thời gian dài sử dụng chúng sẽ tích lũy trong cơ thể, có thể gây hiện
tƣợng kháng kháng sinh ở ngƣời, làm mất đi cả vi khuẩn có lợi, ngồi ra SAs dễ bị
acetyl hóa ở gan thành N4- acetyl sulfonamid khó tan trong nƣớc, đồng thời từ quản
cầu thận tới ống dẫn tiểu, SA đƣợc làm đậm đặc 50 lần, sự bài tiết H+ vào ống thận

làm nƣớc tiểu càng acid hơn, giảm tính tan của sulfonamid từ đó trở thành tinh thể
trong ống thận, gây hiện tƣợng kết tinh ở đƣờng tiết niệu gây viêm thận và sỏi thận,
tiểu ra máu. Sulfonamid có khả năng gây ra một loạt các phản ứng bất lợi, bao gồm
cả rối loạn đƣờng tiết niệu, rối loạn tạo máu , rối loạn chuyển hóa porphyrin, và

16


phản ứng quá mẫn cảm. Khi sử dụng với liều lƣợng lớn, chúng có thể gây ra phản
ứng dị ứng mạnh mẽ. Hai hội chứng nghiêm trọng nhất là hội chứng StevensJohnson và hoại tử biểu bì độc hại (cũng đƣợc gọi là hội chứng Lyell).
SAs hấp thu tốt qua đƣờng tiêu hóa, ngoại trừ các SAs có tác động tại chỗ.
1.1.5 Tình hình sử dụng kháng sinh Sulfonamid
SAs là một trong những nhóm chất lâu đời nhất của các hợp chất kháng
khuẩn. Chúng đƣợc sử dụng lâm sàng trong 50 năm và lần đầu tiên đƣợc đăng ký
tại Úc năm 1940. Tại nhiều quốc gia, việc sử dụng SAs trong chăn ni đƣợc xem
xét trên nhiều khía cạnh nhƣ dƣ lƣợng còn lại trong thịt sau giết mổ, mức độ ảnh
hƣởng tới sức khỏe con ngƣời…trở thành vấn đề khá nhạy cảm trong thƣơng mại
quốc tế.
Tại Hoa Kỳ, trong suốt 25 năm, dƣ lƣợng SAs trong thịt gia súc, đặc biệt là
trong thịt lợn, thịt bê và thịt gia cầm rất cao là vấn đề đƣợc quan tâm bởi mức độ
tồn dƣ vi phạm nhiều hơn bất cứ một loại thuốc kháng sinh nào khác. Cục quản lý
thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) bắt đầu tiến hành điều tra các SAs trong đầu
những năm 1970, và tiến hành thủ tục thu hồi đối với sulfadimidine (SA đƣợc sử
dụng rộng rãi nhất), bởi nó đã đƣợc chứng minh gây ra khối u cho động vật. Năm
2009 chƣơng trình kiểm soát dƣ lƣợng Hoa Kỳ (viết tắt là U.S. NRP) [25] tiến hành
kiểm tra 17.241 mẫu thịt gia súc, gia cầm phân tích 128 hợp chất thuốc thú y và
thuốc trừ sâu thì mẫu có chứa SAs có tỉ lệ cao nhất, trong tổng số 2496 mẫu kiểm
tra SAs có tới 0,24% mẫu vi phạm. Kết quả phân tích trên gan các loài gia súc gia
cầm trong 101 mẫu gan lợn và 99 mẫu thịt lợn quay có hai mẫu vi phạm hàm lƣợng
trong khoảng 1,01-2,51 ppm, lấy 53 mẫu gan bê phân tích có một mẫu nhiễm hàm

lƣợng lên tới 0,31-0,5 ppm. Một mẫu gan lợn nhiễm sulfamethazine lên tới 2,39
ppm và một mẫu nhiễm sulfadimethoxine trong thịt bò là 0,38ppm.
Tại Việt Nam, kháng sinh đƣợc sử dụng rộng rãi trong chăn nuôi và nuôi
trồng thủy sản với mục đích kích thích tăng trƣởng, phịng và điều trị bệnh. Mới
đây, trên website của Cục Quản lý chất lƣợng nông lâm thủy sản, trong các báo cáo

17


Kết quả thực hiện chƣơng trình kiểm sốt dƣ lƣợng các chất độc hại hàng tháng [1]
cho thấy: trong tháng 2, tiến hành kiểm tra 250 mẫu phát hiện dƣ lƣợng nhóm
Sulfonamid có Sulfadimidine hàm lƣợng 4,18 ppb và Sulfadiazine là 4,16 ppb trên
1 mẫu cá lóc thƣơng phẩm tại vùng ni Vị Thủy (Hậu Giang), kết quả phân tích
400 mẫu vào tháng 3 phát hiện dƣ lƣợng Sulfadimidine là 123,26 ppb và
Sulfadiazine có hàm lƣợng 15,26 ppb trên 1 mẫu cá rơ đồng thƣơng phẩm tại tỉnh
Hậu Giang.
Tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi rất phổ biến, khi dƣ lƣợng
kháng sinh trong các sản phẩm thịt cao, thì hậu quả tất yếu là chất lƣợng thịt kém,
khơng đáp ứng đƣợc yêu cầu của thị trƣờng, điều này ảnh hƣởng không nhỏ tới xuất
khẩu.
1.1.6 Giới hạn tồn dƣ tối đa cho phép của SAs trong thực phẩm
Giới ha ̣n tồ n dƣ tố i đa

(MRL – Maximum Residue Limit ) của từng loại

kháng sinh cho phép sử dụng đối với từng loại thực phẩm có thể đƣợc qu y đinh
̣ rấ t
khác nhau ở các nƣớc , căn cƣ́ vào đă ̣c điế m sinh lý , sinh thái, nhấ t là đă ̣c điể m dinh
dƣỡng, thói quen ăn uống của ngƣời dân từng nƣớc . Qua tham khảo một số tài liệu
[7, 11, 12] có mức MRL nhƣ bảng dƣới đây.

Bảng 1.2: Giới hạn tồn dƣ tối đa cho phép đối với SAs tại một số thị trƣờng
Nƣớc

Đối tƣợng

Liên minh Châu Âu

Thịt, gan gia súc, gia cầm

(EU)

Thủy hải sản

MRL (µg/kg)
100

Thịt, gan, thận
Hoa Kì

100
Thủy hải sản
Thịt, gan, thận

Việt Nam

100
Thủy hải sản

18

Thịt, gan , thận

20

Sữa

10

Nhật Bản
Thịt, gan, thận
Hàn Quốc

10
Thủy hải sản

1.2 Các phƣơng pháp xác định SAs
Vấn đề tồn dƣ kháng sinh SAs trong thực phẩm đã và đang đƣợc nhiều quốc
gia trên thế giới quan tâm. Rất nhiều nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu nhóm
kháng sinh này bằng nhiều phƣơng pháp khác nhau trên các đối tƣợng nhƣ thịt, sữa,
trứng, mật ong, nƣớc thải… Dƣới đây là một số phƣơng pháp phổ biến đã đƣợc tiến
hành thực nghiệm và ban hành thành tiêu chuẩn.
1.2.1 Trong nƣớc
Tổng Cục Tiêu chuẩn đo lƣờng chất lƣợng đã ban hành TCVN 8345-2010
[10] xác định 10 SAs (bao gồm: sulfadiazin, sulfathiazol, sulfamerazin,
sulfamethazin,

sufamethoxypiridazin,

sulfacloropyridazin,

sulfadoxin,

sulfamethoxazol, sulfadimethoxin và sulfachinoxalin) trong thủy sản và sản phẩm
thủy sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC. Các chất nhóm SAs có trong mẫu
sản phẩm thủy sản đƣợc chiết tách bằng hỗn hợp axetonitril và diclometan. Dịch
chiết sau khi cô cạn cho tác dụng với dung dịch fluorescamin để tạo dẫn xuất huỳnh
quang. Hàm lƣợng các dẫn xuất đƣợc xác định trên hệ thống HPLC pha đảo: cột
C18, pha động: dung dịch H3PO4 0,02 M, acetonitril, metanol theo chƣơng trình
gradient, phát hiện và định lƣợng bằng detector huỳnh quang tại bƣớc sóng kích
thích Ex: 405 nm và bƣớc sóng phát xạ Em: 495 nm. Giới hạn phát hiện của phƣơng
pháp nhỏ hơn 5 g/kg
1.2.2 Thế giới
1.2.2.1 Phương pháp sắc ký lỏng với detector UV

19


Phƣơng pháp sắc ký lỏng rất phù hợp cho việc xác định SAs nên nó đƣợc sử
dụng rộng rãi. Các tác giả nghiên cứu bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng trên nhiều loại
detector khác nhau. Trong đó detector UV là loại detector thơng dụng nhất. Chất
phân tích sau khi đƣợc tách khỏi cột sắc ký, dẫn vào flowcell đo đƣợc chiếu bởi một
chùm tử ngoại. Sự hấp thụ tia bức xạ bởi các chất tan tuân theo định luật LambertBeer.
Tác giả Rodrigo H.M.M. Granja [20] và cộng sự đã phát triển phƣơng pháp
sắc ký lỏng với detector UV để xác định 3 SAs trong mật ong. Các SAs đƣợc chiết
từ mật ong với diclometan sau khi đƣợc hòa tan với NaCl 30%, làm sạch qua cột
chiết pha rắn Florisil. Dịch rửa giải đƣợc phân tích trên hệ thống HPLC: cột C18
(4àmì3.9mmì150mm), pha ng: Natri acetate 0,005mol/L, pH 4,5 (kờnh A),
metanol (kênh B), acetonitril (kênh C) theo chƣơng trình gradient; detector UV tại
bƣớc sóng 280nm. Giới hạn phát hiện lần lƣợt là: sulfathiazole: 3µg/kg,

sulfamethazine: 4µg/kg và sulfadimethoxine: 5µg/kg. Hiệu suất thu hồi lần lƣợt là:
61% (sulfathiazole), 94,5% (sulfamethazine) và 86% (sulfadimethoxine).
Tác giả W. Hela [24] và cộng sự đã phát triển phƣơng pháp HPLC với
detector DAD để xác định 12 SAs trong thịt, gan, thận động vật (lợn, bò, gà). Mẫu
đƣợc đồng nhất với acetonitril, loại béo với n-hexan, làm sạch qua cột chiết pha rắn
trao đổi cation OASIS MCX. Dịch rửa giải đƣợc bơm vào hệ thống HPLC-DAD:
cột Phenomenex Luna C18 (250ì2mm; 5àm) , pha ng: amoni acetate 0,01M ; pH
4,6 (kênh A) và acetonitril (kênh B) theo chƣơng trình gradient. Detector DAD tại
bƣớc sóng 260nm. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp là 1ppb cho tất cả các SAs.
Sử dụng bƣớc sóng 270 nm phân tích trên đối tƣợng mẫu sữa bị tại Hàn
Quốc nhóm nghiên cứu Hyun-Hee Chung, Jung-Bin Lee,Yun-Hee Chung [15] qua
kiểm tra 269 mẫu sữa phát hiện có 21 mẫu nhiễm kháng sinh SAs. Trong đó
sulfamethazine lên tới 12ng/g vƣợt quá giới hạn cho phép.
Nhóm tác giả Nancy T. Malintan [18] xác định 8 SAs trên đối tƣợng mẫu
nƣớc tiểu của lợn tại Malaysian. Mẫu đƣợc làm sạch, làm giàu bằng chiết qua cột

20


Oasis HLB, sau khi hoạt hóa cột bằng metanol, nƣớc, tiến hành nạp mẫu và rửa tạp
bằng nƣớc, cuối cùng rửa giải chất bằng hỗn hợp amoniac và metanol. Phƣơng pháp
phân tích có giới hạn định lƣợng 5 ppb. Kết quả phân tích 300 mẫu có tới 103 mẫu
nhiễm kháng sinh chủ yếu là sulfanilamide lên tới 500ppb.
1.2.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng với detector huỳnh quang
Để tăng độ nhạy và độ chọn lọc, nhiều nghiên cứu đã sử dụng detector
huỳnh quang, bằng cách cho chất phân tích tạo dẫn xuất có khả năng phát huỳnh
quang. Đây là phƣơng pháp rất phổ biến để xác định các SAs trong giai đoạn trƣớc
đây. Dẫn xuất huỳnh quang thƣờng đƣợc sử dụng là Fluorescamine.
Tác giả T.A. Gehring và cộng sự [21] đã phát triển và thẩm định phƣơng
pháp xác định 14 SAs trong thịt cá trê, cá hồi và tôm. Các SAs đƣợc tách ra khỏi

nền mẫu bằng hỗn hợp dung dịch 0.2% acetic acid–metanol–acetonitril (85:10:5),
chiết lỏng – lỏng với diclometan, làm sạch dịch chiết trên cột chiết pha rắn trao đổi
cation mạnh SPE SCX. Điều kiện sắc ký: Cột Symmetry C18, 3.5μm,
150mm×4.6mm; pha động: 2% acetic acid–metanol–acetonitril với chƣơng trình
gradient, dẫn xuất sau cột với fluorescamine và phát hiện với detector huỳnh quang
tại λex = 400nm, λem = 495nm. Hiệu suất thu hồi của các SAs nằm trong khoảng từ
67 – 90%.
Tác giả G. Stoev và cộng sự [13] đã phát triển phƣơng pháp xác định
định lƣợng 10 SAs trong thực phẩm có nguồn gốc động vật bằng sắc ký lỏng với
detector huỳnh quang. Các SAs đƣợc tách ra khỏi nền mẫu bởi sự chiết lỏng-lỏng,
lần 1 với etyl acetate, lần 2 với acetone, và làm sạch thêm bởi sự chiết lặp 3 lần với
nƣớc-metylen clorid. SAs đƣợc dẫn xuất trƣớc cột với Fluorescamine, đƣợc tách
trên hệ HPLC: cột (ODS-2 RP18 (250 ì 4 mm, 5àm); pha ng: kờnh A (m
phosphate 0,01M, pH 3,0), kênh B (acetonitril) với tỉ lệ 65/35. Detector huỳnh
quang tại λex = 405nm, λem = 490nm. Hiệu suất thu hồi trong khoảng 64-75%, giới
hạn phát hiện là 1µg/kg cho sulfaquinoxaline và 0,5µg/kg cho các SAs cịn lại.
1.2.2.3 Phương pháp điện di mao quản

21


Đây là phƣơng pháp tách các chất phân tích là các ion hoặc các chất
khơng ion nhƣng có mối liên hệ chặt chẽ với các ion trong một ống mao quản hẹp
chứa đầy dung dịch đệm, đặt trong điện trƣờng. Do độ linh động điện di của các ion
khác nhau, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.
Tác giả Ming-Ren S. Fuh [17] và cộng sự đã phát triển phƣơng pháp điện di
mao quản vùng CE kết hợp với chiết pha rắn để chiết và định lƣợng 8 SAs trong thịt
lợn, bò, gà. Mẫu đƣợc đồng nhất với acetonitril, làm sạch lần một qua cột chiết pha
rắn SPE Alumina, làm sạch lần hai qua cột chiết SPE HLB, dịch rửa giải đƣợc bay
hơi, hòa cặn và xác định bằng điện di mao quản vùng: cột mao quản silica nung

chảy khơng phủ (80.5 cm × 50 µm i.d.; 72 cm to detector), pha động: đệm
phosphate 35mM, pH 6,5; thế: 25kV; detector UV tại 205nm. Hiệu suất thu hồi từ
80 – 97%. Giới hạn phát hiện cho mỗi SAs trong khoảng 5 - 10µg/kg. Độ nhạy đáp
ứng yêu cầu về MRLs theo qui định của liên minh Châu Âu EC.

1.2.2.4 Phương pháp sắc ký khí kết nối với detector phát xạ nguyên tử (GC-AED)
Các SAs đƣợc tách trên hệ thống sắc ký khí và phát hiện bằng phổ phát
xạ nguyên tử. Ứng dụng phƣơng pháp này, tác giả B. Chiavarino và cộng sự [11] đã
phát triển phƣơng pháp để xác định 9 SAs. Các SAs đƣợc metyl hóa sử dụng
diazomethane. Điều kiện sắc ký khí: cột mao quản silica nung chảy 12.5 m × 30.22
mm, chƣơng trình nhiệt độ: 75oC trong 1 phút, tăng nhiệt độ lên 290oC, với bƣớc
tăng 20oC/phút, duy trì ở 290oC trong 5 phút. Nhiệt độ tiêm mẫu 300oC. Detector
AED với việc lựa chọn các nguyên tố: C, S, N.
1.2.2.5 Phương pháp ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
Hiện nay, ELISA đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu nhƣ
y học, nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lƣợng
các sản phẩm sinh học. Nguyên tắc chung đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa
kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể đƣợc gắn với một enzyme, thƣờng

22


cho nitrophenol phosphate vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân thành một chất có
màu.
Tác giả Weilin L. Shelver and Fernando M. Rubio [23] đã kiểm tra SAs bằng
phƣơng pháp ELISA và khẳng định lại bằng LC-MS/MS, kết quả cho thấy ELISA
là một phƣơng pháp nhạy phát hiện sulfamethoxazole tại nồng độ 15ppt. Tuy nhiên,
có sự nhiễm chéo giữa sulfamethoxypyridazine, sulfachloropyridazine và
sulfadimethoxine do bị ảnh hƣởng bởi điều kiện môi trƣờng phản ứng và các phản
ứng cạnh tranh có thể gây ra hiện tƣợng âm tính hoặc dƣơng tính giả. Do vậy việc

xác nhận lại các mẫu dƣơng tính bằng LC-MS là rất cần thiết.
1.2.2.6 Phương pháp sắc ký lỏng với detector khối phổ LC/MS/MS
Đây là một phƣơng pháp nhanh, nhạy để xác định đồng thời các SAs. Sau
khi qua cột tách, chất phân tích đƣợc hóa hơi, các hợp chất hữu cơ trung hồ bị ion
hố thành các ion phân tử hay ion mảnh của phân tử mang điện dƣơng hoặc âm, các
gốc tự do. Sau đó, các ion đựơc đƣa sang bộ phận tách theo khối lƣợng. Từ các tín
hiệu thu đƣợc, dựa vào khối lƣợng ion phân tử, dựa vào đồng vị, dựa vào các mảnh
ion phân tử, dựa vào cơ chế tách và dựa vào ngân hàng dữ liệu các ion và mảnh ion,
ngƣời ta định tính và định lƣợng đƣợc chất phân tích một cách chính xác.
Thomas S. Thompson và Donald K. Noot [22] đã ứng dụng và phát triển
phƣơng pháp sắc kí lỏng khối phổ để xác định dƣ lƣợng kháng sinh trong mật ong.
Quá trình chuẩn bị mẫu gồm có thủy phân acid để giải phóng liên kết đƣờng với
sulfonamid, sau đó lọc qua màng lọc và đem phân tích LC-MS/MS. Điều kiện chạy
máy pha động kênh A là acid formic 0,1% (v/v) trong nƣớc, kênh B là acid formic
0,1% (v/v) trong acetonitril (ACN) và kênh C là trifluoroacetic 2% (v/v) trong
acetonitril (ACN). Phƣơng pháp có độ nhạy cao, giới hạn phát hiện (LOD)
0,5µg/kg, khoảng tuyến tính từ 5-100µg/kg, độ thu hồi nằm trong khoảng cho phép
của cấp hàm lƣợng phân tích, sự lặp lại trong ngày có độ thu hồi trong khoảng RSD
± 12%, trong các ngày khác nhau có RSD ± 17,2%. Tính tốn hàm lƣợng của SAs
bằng phƣơng pháp thêm chuẩn có sử dụng nội chuẩn sulfachloropyridazine. Ngồi

23


định tính chất bằng thời gian lƣu thì ƣu điểm của phƣơng pháp là xác nhận chính
xác chất bằng sự phân mảnh phổ, mảnh pic đặc trƣng cho cấu trúc SAs là mảnh có
m/z 156 [NH2C6H4SO2]+ dùng để định lƣợng.
Trong nghiên cứu nồng độ của dung dịch đệm, thành phần pha động, loại ion
hóa để tách và xác định SAs tồn dƣ trong thịt bò tác giả Dal-Ho Kim và Dai Woon
Lee [13] cũng dùng phƣơng pháp LC-MS. Tác giả khảo sát nguồn ion hóa hóa học

áp suất khí quyển (Atmospheric pressure chemical ionization APCI) và nguồn ion
hóa phun electron (Electrospray ionization-ESI). Khi dùng CH3COONH4 làm đệm
thì ion hóa áp suất khí quyển cho phản ứng tốt hơn, theo tác giả nếu sử dụng dung
dịch đệm là acid acetic thì dùng nguồn ESI thay thế APCI, chế độ ESI sự proton
hóa các ion SAs dễ dàng xảy ra trong điều kiện dung dịch acid. Mặt khác nguồn
APCI ion H3O+ và NH4+ có thể đƣợc tạo thành từ dung mơi, dung dịch đệm và
cation nitrogen do sự phóng điện khí N2, vì vậy mà ion H3O+ và NH4+ trong pha khí
dễ dàng proton SAs, nồng độ của CH3COONH4 lựa chọn là 0,05M có (pH 6-7)
trong nƣớc chứa 13-15% acetonitril. Xác định hàm lƣợng SAs bằng phƣơng pháp
thêm chuẩn cấp hàm lƣợng 75ng/g với nội chuẩn 13C6-sulfamethazine kết hợp chiết
lỏng-lỏng bằng acetonitril và chiết pha rắn (Solid phase extraction SPE).
Tại bộ môn khoa học thực phẩm và dinh dƣỡng trƣờng đại học Zhejiang,
Hangzhou, Trung Quốc tác giả Zengxuan Cai và cộng sự [26] đã sử dụng phƣơng
pháp sắc kí lỏng siêu hiệu năng kết nối khối phổ (Ultral performan liquid
chromatography tandem mass spectrometry UPLC-MS/MS) xác định kháng sinh
SAs trong thịt. Mẫu thịt đƣợc chiết bằng acetonitril và loại chất béo bằng n-hexan,
chiết lỏng-lỏng bằng ethyl acetate, phƣơng pháp đã tách 24 SAs trong 15 phút thơng
qua theo dõi nguồn ion hóa phun electron ESI+. Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng trên
nền mẫu thực để loại trừ các ảnh hƣởng nền mẫu trong quá trình ion hóa, phƣơng
pháp có hệ số tƣơng quan tuyến tính tốt R2= 0,991-0,999 và khoảng tuyến tính rộng
từ 0,2-50ng/g, độ thu hồi đạt 67,8-113,9% cho tất cả sulfonamid. Trong phƣơng
pháp này tác giả đã khảo sát và lựa chọn ct C18 (2,1mm ì 100mm ì 1,7àm), hai
kờnh pha ng sử dụng là acid formic 0,2% (v/v) trong nƣớc và acid formic 0,2%

24


(v/v) trong metanol. Hàm lƣợng acid formic trong pha động có thể cải thiện hiệu
quả ion hóa, tuy nhiên lại ảnh hƣởng tới phân tách sắc kí. Kết quả phân tích 240
mẫu thịt đƣợc mua từ các cơng ty, xác định tổng SAs trong thịt có hàm lƣợng lớn

hơn 5µg/kg có 40 mẫu (xấp xỉ 15%), có 9 mẫu (xấp xỉ 3,75%) có chứa hàm lƣợng
vƣợt giới hạn cho phép 100µg/kg. Sulfamethazine có hàm lƣợng cao nhất đƣợc tìm
thấy trong mẫu lên tới 774,9µg/kg, sulfanilamide có nồng độ 5,9µg/kg,
sulfamethoxazole 78,3µg/kg, sulfamethazine 14,8µg/kg trong cùng một mẫu.
Năm 2011 tác giả Huan Yu và các cộng sự [16] đã nghiên cứu phƣơng pháp
chiết lỏng-lỏng, 5g mẫu đƣợc chiết bằng acetonitril, dịch chiết đƣợc thổi khơ bằng
khí N2, hịa cặn bằng 10ml acid acetic 2% (v/v) trong nƣớc, sau đó làm sạch bằng
chiết pha rắn dùng cột HLB, sử dụng metanol và nƣớc để hoạt hóa và rửa tạp, cuối
cùng rửa giải bằng metanol, xác định 18 SAs bằng HPLC-UV tại bƣớc sóng 285 nm
trong thời gian 60 phút, sau đó xác nhận lại trên sắc ký LC-MS/MS tứ cực với
chƣơng trình gradient hai kênh pha động là acid formic trong nƣớc và ACN, chế độ
ion hóa phun điện tử ESI ở chế độ dƣơng trong 30 phút. Phƣơng pháp có độ nhạy
cao, giới hạn phát hiện 3 ppb và giới hạn định lƣợng 10 ppb, độ thu hồi đạt 71,1%118,3%.
Bằng sự tƣơng tác trực tiếp chiết pha rắn phân tán cột C18-Silica với sắc ký
lỏng khối phổ chế độ bẫy tứ cực nhóm tác giả Yanbin Lu, Quing Shen [25] tiến
hành đồng nhất 0,6g C18 đã đƣợc hoạt hóa bằng 2ml ACN và làm khơ chân khơng
với 0,2g mẫu sau đó làm khơ tại nhiệt độ phịng, tất cả chuyển vào ống chiết và nút
chặt, tiến hành chiết trực tiếp khuôn pha rắn phân tán (MSPD-matrix solid-phase
dispersion) dùng 5ml ACN/nƣớc (v/v 1:1) để chiết SAs với tốc độ dòng 1ml/phút
trong 5 phút, dịch chiết đƣợc chuyển vào cột phân tách, chế độ rửa giải gradient bao
gồm acid acetic 0,1% (v/v) trong nƣớc và acetonitril. Phƣơng pháp này đã xác định
đƣợc 13 SAs chỉ trong 7 phút với độ nhạy cao, LOQ từ 2-10 ppb, phƣơng pháp đạt
độ thu hồi tốt RSD < 13%. Phân tích trên mẫu cá trắm phát hiện 4 mẫu nhiễm với
tổng SAs là 124,6ng/g, 6 mẫu nhiễm sulfamethazine, sulfameter với tổng là
48,8ng/g.

25