Nghiên cứu phân loại nấm men moniliella phân lập tại việt nam
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (3.09 MB, 90 trang )
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------
Đinh Đức Hiền
NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI NẤM MEN
MONILIELLA PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội – 2014
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------
Đinh Đức Hiền
NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI NẤM MEN
MONILIELLA PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60420107
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS. TS. Vũ Nguyên Thành
PGS. TS. Bùi Thị Việt Hà
`Lời cảm ơn
Lời cảm ơn
Hà Nội – 2014
Lời cảm ơn
Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Vũ Nguyên
Thành và PGS. TS Bùi Thị Việt Hà - những người thầy đã ln tận tình hướng dẫn,
chỉ bảo, tạo mọi điều kiện giúp em thực hiện luận văn này.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể cán bộ Trung tâm Vi sinh vật
Công nghiệp - Viện Công nghiệp Thực phẩm đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện, hỗ trợ
kỹ thuật, chia sẻ tài liệu và kinh nghiệm nghiên cứu.
Qua đây, em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô Khoa Sinh học, Trường Đại
học Khoa học Tự nhiên đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt thời gian
sinh viên và học viên cao học.
Cuối cùng, em xin dành lời cảm ơn chân thành đến gia đình, người thân bạn
bè những người ln động viên, khích lệ em trên con đường học tập, và nghiên cứu
khoa học.
Hà Nội, ngày 25 tháng 11 năm 2014
Học viên
Đinh Đức Hiền
DANH MỤC HÌNH
Hình 1. Hình thái tế bào đặc trƣng của Phaeococcus catenatus CBS 650. 76.
Hình 2. Hình ảnh tế bào Exophiala salmonis CBS 157.67.
Hình 3. Hình ảnh tế bào Aureobasidium pullulans.
Hình 4. Hình ảnh tế bào Moniliella suaveolens CBS 120.63 (trái) và Moniliella
acetoabuten CBS 169.66 (phải).
Hình 5. Cây phả hệ mơ tả mối quan hệ giữa các lồi thuộc chi Moniliella.
Hình 6. Hình ảnh tế bào của Geotrichum candidum (trái) và
Trichosporon beigelii (phải).
Hình 7. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR sử dụng mồi đặc hiệu phát hiện.
Candida albicans và Candida dubliniensis.
Hình 8. Một số mẫu hoa phân lập đƣợc Moniliella.
Hình 9. Vị trí các địa điểm thu thập mẫu phân lập Moniliella tại Việt Nam.
Hình 10. Hình ảnh khuẩn lạc và tế bào một số chủng nấm men Moniliella phân lập
đƣợc.
Hình 11. Phổ fingerprinting của 126 chủng Moniliella phân lập đƣợc.
Hình 12. Vị trí các chủng đại diện phân lập đƣợc thuộc chi Moniliella.
Hình 13. Phổ PCR fingerprinting với mồi (GAC)5 của các chủng Moniliella carnis
và Moniliella dehoogii.
Hình 14. Phổ PCR fingerprinting với mồi (GAC)5 của các chủng Moniliella byzovii.
Hình 15. Tế bào sinh dƣỡng của Moniliella carnis (KFP 246T) sinh trƣởng trên môi
trƣờng YM ở 25C sau 5 ngày (trái) và trên môi trƣờng tinh bột ngô Dalmau agar
sau 7 ngày (phải).
Hình 16. Tế bào sinh dƣỡng của Moniliella dehoogii KFP 211T sinh trƣởng trong
YM ở 25C sau 5 ngày (trái) trên mơi trƣờng Dalmau tinh bột ngơ sau 7 ngày
(phải).
Hình 17. Tế bào sinh dƣỡng của chủng TBY 2041.7T sinh trƣởng trên mơi trƣờng
Dalmau tinh bột ngơ sau 5 ngày.
Hình 18. Sự hình thành Chlamydospore ở chủng TBY 2041.7T sinh trƣởng trên mơi
trƣờng Yeast Cacbon Base agar khơng có nguồn nito.
Hình 19. Hình thái khuẩn lạc của Moniliella byzovii TBY 2041.7T (trái) và TBY
2041.8 (phải) trên môi trƣờng Malt-Glucoseagar sau 45 ngày ni cấy ở 28C.
Hình 20. Hình thái khuẩn lạc của M. dehoogii KFP 211T và TBY 2041.5 trên môi
trƣờng Malt glucose 2°Bx sau 10 ngày nuôi cấy ở 28°C
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. So sánh đặc điểm của chi Moniliella và một số chi khác.
Bảng 2. Phƣơng pháp trộn lẫn tế bào các chủng trong cùng 1 loài để phát hiện pha
sinh sản hữu tính.
Bảng 3. Các chủng nấm men đen Moniliella phân lập đƣợc.
Bảng 4. Ký hiệu các chủng trong PCR fingerprinting.
Bảng 5. Kết quả phân nhóm các chủng bằng fingerprinting.
Bảng 6. Danh sách chủng Moniliella trong mô tả loài mới.
Bảng 7. Danh sách các chủng thuộc 2 nhóm M. byzovii.
Bảng 8. Sự khác nhau những đặc tính quan trọng giữa M. carnis, M. dehoogii, M.
byzovii và những loài đã biết thuộc chi Moniliella.
Bảng 9. Phân lập Moniliella tại Việt Nam và trên thế giới
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CBS – Centraalbureau voor Schimmelcultures (Bảo tàng giống Vi sinh vật Hà Lan)
h – hour (giờ)
NRRL-Northern Regional Research Laboratory (hiện là National Center For
Agricultural Utilization Research) (Bảo tàng giống Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ)
DGGE-Denaturing gradient gel electrophoresis
rDNA-Ribosomal DNA
rRNA-Ribosomal RNA
PCR – Polymerase Chain Reaction (phản ứng trùng hợp chuỗi)
RFLP-Restriction Fragment Length Polymorphism (đánh giá đa hình DNA theo
phƣơng pháp cắt hạn chế)
T – Type strain (chủng chuẩn)
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .............................................................................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1- TỔNG QUAN ......................................................................................................................... 2
1.1. NHÓM NấM MEN ĐEN ......................................................................................................... 2
Một số chi nấm men đen ...................................................................................................... 2
1.1.1. Chi Phaeococcomyces ............................................................................................... 2
1.1.2. Chi Exophiala ............................................................................................................ 3
1.1.3. Chi Aureobasidium .................................................................................................... 3
1.1.4. Chi Moniliella ............................................................................................................ 4
1.2. MộT Số PHƢƠNG PHÁP PHÂN LOạI NấM MEN ...................................................................... 10
1.2.1. Các phương pháp phân loại truyền thống ............................................................... 10
1.2.2. Các phương pháp hóa phân loại và sinh học phân tử............................................. 12
1.3. MộT Số PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIệN VÀ ĐÁNH GIÁ ĐA DạNG VI SINH VậT ............................. 14
CHƢƠNG 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................... 18
2.1. ĐốI TƢợNG ....................................................................................................................... 18
2.2. HÓA CHấT, DụNG Cụ, TRANG THIếT Bị MÁY MÓC ............................................................... 18
2.2.1. Hóa chất .................................................................................................................. 18
2.2.2. Dụng cụ và trang thiết bị, máy móc ........................................................................ 19
2.3. THÀNH PHầN MƠI TRƢờNG Sử DụNG TRONG NGHIÊN CứU .................................................. 19
2.3.1. Môi trường làm giàu có nồng độ đường cao ........................................................... 19
2.3.2. Mơi trường Malt-Glucose 2Bx có axit lactic 1‰ .................................................. 19
2.3.3. Mơi trường Malt-Glucose 2Bx khơng có axit lactic .............................................. 20
2.3.4. Mơi trường thử khả năng chuyển hóa các nguồn cacbon khác nhau ...................... 20
2.3.5. Mơi trường thử khả năng đồng hóa các nguồn nitơ khác nhau .............................. 20
2.3.6. Thử khả năng sinh trưởng trên mơi trường có nồng độ đường và muối cao .......... 21
2.3.7. Môi trường xác định khả năng sinh trưởng trong các điều kiện nhiệt độ khác
nhau.
2.3.8. Môi trường thử khả năng hình thành tinh bột ......................................................... 22
2.3.9. Mơi trường đánh giá hoạt tính phân giải urea ........................................................ 22
2.3.10. Mơi trường đánh giá khả năng sinh trưởng khi có mặt Cycloheximide ................ 23
2.3.11. Môi trường đánh giá khả năng chống chịu acid acetic 1 % ................................. 23
2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CứU ............................................................................................. 24
2.4.1. Phương pháp phân lập ............................................................................................ 24
2.4.3. Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào ....................................................................... 25
2.4.4. Phương pháp tách chiết DNA tế bào nấm men ....................................................... 25
2.4.5. Phương pháp tinh chế DNA..................................................................................... 25
2.4.6. Phương pháp tiến hành phản ứng PCR fingerprinting ........................................... 26
2.4.7. Phương pháp điện di ............................................................................................... 26
2.4.8. Nhuộn gel và đọc kết quả ........................................................................................ 27
2.4.9. Phương pháp phân loại nấm men dựa vào đọc trình tự rDNA ............................... 27
2.4.10. Đánh giá khả năng sử dụng nguồn cacbon khác nhau.......................................... 28
2.4.11. Đánh giá khả năng đồng hóa các nguồn nito khác nhau. ....................................... 28
2.4.12. Đánh giá khả năng sinh trưởng trên mơi trường có nồng độ đường và nồng độ
muối cao. ........................................................................................................................... 29
2.4.13. Đánh giá khả năng sinh trưởng trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau ................ 29
2.4.14. Thử khả năng hình thành tinh bột ........................................................................... 29
2.4.15. Thử khả năng phân giải urea.................................................................................. 29
2.4.16. Thử khả năng chống chịu với cycloheximit ............................................................. 30
CHƢƠNG 3 – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................................................. 32
3.1. KếT QUả PHÂN LậP ............................................................................................................ 32
3.2. QUAN SÁT HÌNH THÁI KHUẩN LạC, Tế BÀO ........................................................................ 36
3.3. PHÂN NHÓM BằNG Kỹ THUậT FINGERPRINTING ................................................................. 37
3.5. MƠ Tả CÁC NHĨM LỒI MớI THUộC CHI MONILIELLA ........................................................ 44
3.5.1. Phân tích đặc tính di truyền của 3 lồi mới ............................................................ 46
3.5.2. Đặc tính kiểu hình, sinh lý, sinh hóa của 3 lồi mới ............................................... 48
3.6. Sự ĐA DạNG MONILIELLA PHÂN LậP TạI VIệT NAM ............................................................ 55
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................................................... 60
CÁC CƠNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN .................................................................... 62
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................................................... 63
PHỤ LỤC
Luận văn thạc sĩ
MỞ ĐẦU
Chi Moniliella đƣợc thiết lập bởi bởi Stolk và Dakin năm 1966 để xác lập vị trí
phân loại cho 2 lồi mới tìm đƣợc khi đó là Moniliella acetoabutens và Moniliella
tomentosa. Năm 2009, căn cứ vào sự tƣơng đồng nhất định về di truyền cũng nhƣ
một số đặc tính sinh lý, sinh hóa quan trọng, Rosa và cộng sự đã xếp một chi khác
là Trichosporonoides vào Moniliella. Nhƣ vậy, trƣớc khi nghiên cứu của chúng tôi
đƣợc thực hiện, chi Moniliella bao gồm 9 lồi, đó là Moniliella acetoabutens, M.
fonsecae, M. megachiliensis, M. mellis, M. nigrescens, M. oedocephalis, M. pollinis,
M. spathulata và M. suaveolens. Phân loại của Moniliella thực sự vẫn chƣa rõ ràng.
Trình tự gần nhất của Moniliella fonsecae trong Genbank là Phylloporia pectinata,
một thành viên của Agaricomycotina. Với những trình tự khác, Moniliella thuộc
Ustilagionomycotina. Hơn nữa, sự khác biệt về mặt di truyền giữa các lồi thuộc chi
Moniliella lại rất lớn, có thể tới 15-16% trong đoạn D1/D2. Do vậy việc tìm kiếm
những lồi trung gian giữa các lồi đã biết sẽ góp phần làm sáng tỏ phân loại của
Moniliella.
Moniliella đƣợc sử dụng trong công nghiệp sản xuất erythriltol, một loại đƣờng
chức năng có giá trị thƣơng mại cao. Gần đây, Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp,
Viện Công nghiệp Thực phẩm đã phát hiện một số đặc tính cơng nghệ ít hoặc chƣa
đƣợc biết tới của Moniliella nhƣ khả năng chuyển hóa thầu dầu thành γ-declactone
(tinh dầu đào) với độ tinh khiết cao, khả năng sinh lipase, khả năng sinh một loại
kháng sinh (zymocin) mới. Các nội dung nghiên cứu trong bản luận văn này đƣợc
thực hiện nhằm đánh giá đa dạng nấm men Moniliella tại Việt Nam, góp phần củng
cố hệ thống phân loại của chi và tạo cơ sở cho nghiên cứu cơng nghệ có sử dụng
Moniliella, cụ thể những nội dung nghiên cứu bao gồm:
- Phân lập nấm men Moniliella từ các nguồn mẫu khác nhau tại các địa điểm
khác nhau ở Việt Nam.
- Phân nhóm, phân loại Moniliella phân lập đƣợc bằng hình thái; PCR
fingerprinting; giải trình tự DNA; phân tích cây phả hệ.
- Phân tích sự đa dạng nấm men Moniliella phân lập tại Việt Nam về số loài,
phân bố.
K20 – Vi sinh vật học
1
Đinh Đức Hiền
Luận văn thạc sĩ
Chƣơng 1 - TỔNG QUAN
1.1. Nhóm nấm men đen
Nấm men đen đƣợc phát hiện từ khoảng đầu thế kỷ 20 nhƣng khi đó ngƣời ta
mới chỉ biết đến một vài chi trong số chúng. Nấm men đen sinh sản vơ tính là chủ
yếu, bằng nảy chổi, tạo sợi hay mô phân sinh. Điều tạo nên sự khác biệt giữa chúng
và các nhóm nấm men khác là chúng có melanin trong thành tế bào làm cho khuẩn
lạc có thể có màu vàng lục, màu ơ liu đến nâu sẫm, đen. Ngồi ra, nấm men đen cịn
chứa carotenoid và mycosporines. Một trong các lý do khiến những hiểu biết về
nấm men đen kém xa so với các vi sinh vật khác có lẽ là do sự sinh trƣởng chậm,
khả năng cạnh tranh thấp với loài khác nên dễ bị bỏ qua trong các nghiên cứu, thêm
nữa cấu trúc bào tử đính của chúng lại ít đặc điểm phân biệt, trong khi hiện tƣợng
đa hình thái của cùng một chủng lại khá phổ biến và gây khó khăn trong quá trình
phân loại [9].
Một số chi nấm men đen
1.1.1. Chi Phaeococcomyces
Gồm 3 lồi đã đƣợc cơng nhận là: P. exophialae, P. Catenatus, P.nigricans
Đặc điểm hình thái: Khuẩn lạc sinh trƣởng chậm, nhầy, bề mặt có nhiều nếp
nhăn, màu đen. Tế bào dạng hình cầu đến elip. Bào tử đính chuyển từ khơng màu
sang nâu đậm hoặc đen [5, 7].
Hình 1. Hình thái tế bào đặc trƣng của Phaeococcus catenatus CBS 650. 76.
(nguồn www.mycobank.org)
K20 – Vi sinh vật học
2
Đinh Đức Hiền
Luận văn thạc sĩ
1.1.2. Chi Exophiala
Đƣợc mô tả đầu tiên vào năm 1966 bởi Carmichael với loài mới Exophiala
salmonis [5]. Đến nay chi này gồm 28 loài: E. castellanii, E. jeanselmei, E.
moniliae, E. pisciphila, E. salmonis, E. spinifera. E. jeanselmei.... Exophiala phân
bố nhiều trong đất, nƣớc, thực vật, gỗ mục,..... và là nguyên nhân gây nhiều bệnh ở
ngƣời.
Exophiala có đặc điểm hình thái và sinh lý rất đa dạng, hình thái cơ bản có thể
tóm tắt nhƣ sau: Chiếm ƣu thế trong môi trƣờng nuôi cấy là tế bào là dạng phân đốt,
thon dần về phía ngọn, một vài đốt hợp với nhau ở bên trong, mỗi đốt là một tế bào,
đơi khi gồm hai tế bào. Khi cịn trẻ, các tế bào có dạng hình cầu, sinh sản bằng nảy
chồi giống nhƣ nấm men thông thƣờng, xếp thành chuỗi dài. Sau một thời gian ni
cấy, bắt đầu hình thành các vách ngăn bên trong sợi nấm, tạo thành đốt. Các đốt này
có hình trụ, mọc kiểu tia và đặc trƣng bởi các eo thắt hẹp. Sau đó, từ các đốt sinh ra
các bào tử hình elip kích thƣớc 1-3 3-6 μm. Các bào tử này thƣờng gồm một tế
bào, tập trung ở đỉnh của đốt hay trên cuống bào tử đính [5, 7].
Hình 2. Hình ảnh tế bào của Exophiala salmonis CBS 157.67
(Nguồn www.cbs.knaw.nl)
1.1.3. Chi Aureobasidium
Các loài thuộc Aureobasidium có phổ phân bố tƣơng đối rộng và đƣợc tìm thấy
trong đất, xác thực vật, lá cây. Aureobasidium gồm 14 lồi trong đó A. pullulans
đƣợc biết đến nhiều nhất. Về mặt hình thái, Aureobasidium tạo khuẩn lạc lúc đầu
màu trắng, sau chuyển sang màu sẫm hoặc đen. Đƣờng kính sợi nấm từ 2-10 μm.
K20 – Vi sinh vật học
3
Đinh Đức Hiền
Luận văn thạc sĩ
Không phát hiện thấy cuống bào tử đính. Aureobasidium sinh sản vơ tính với bào tử
đơn bào, kích thƣớc 2-3 4-6 µm, khơng màu, hình bầu dục đến hình trụ, tập trung
thành từng đám. Các bào tử này sau đó tiếp tục sinh sản bằng nảy chồi hoặc hình
thành túi bào tử thứ cấp [7].
Hình 3. Hình ảnh tế bào chủng Aureobasidium pullulans
(Nguồn www.mycobank.org)
1.1.4. Chi Moniliella
Sau khi chi Moniliella đƣợc thiết lập bởi Stolk & Dakin (1966) cho hai loài mới
là M. acetoabutens và M. tomemtosa. Tiếp theo hai loài Moniliella suaveolens và
Moniliella mellis, đã đƣợc miêu tả bởi von Arx (1972) và Rao & de Hoog (1975),
đến năm 1984, de Hoog miêu tả một loài mới là M. pollinis. Chi Trichosporonoides
đƣợc coi là tƣơng tự nhƣ chi Moniliella, khác biệt chủ yếu bởi kích thƣớc khuẩn lạc
và tế bào nhỏ hơn [8]. Trong các nghiên cứu sau đó, cho thấy hai chi này tƣơng
đồng với nhau [8]. Năm 2009, Rosa và cộng sự đã xác định các giả thuyết này bằng
so sánh trình tự vùng D1/D2 của rDNA 26S và đi đến kết luận Moniliella và
Trichosporonoides đƣợc xếp vào cùng một chi, loài M. pollinis có trình tự vùng
D1/D2 giống với Trichosporonoide madida, chỉ khác nhau bởi tỉ lệ G+C tƣơng ứng
là 50.4 và 50.2, do đó hai lồi này thống nhất tên là M. pollinis. M. pollinis đƣợc mô
tả khác với M. tomemtosa về hình thái và mức độ chuyển hóa tạo erythritol, nhƣng
về trình tự D1/D2 cho thấy chúng tƣơng đồng nhau. Nhƣ vậy cho đến trƣớc nghiên
cứu này chi Moniliella gồm 9 loài nhƣ sau [24].
K20 – Vi sinh vật học
4
Đinh Đức Hiền
Luận văn thạc sĩ
Moniliella acetoabutens Stolk & Dakin (1966)
Moniliella fonsecae Rosa, Jindamorakot, Limtong, Nakase, Lachance, FidalgoJiménez, Daniel, Pagnocca, Inácio & Morais (2008)
Moniliella megachiliensis (Inglis & Sigler) Rosa & Lachance (2008)
Moniliella mellis (Fabian & Quinet) V. Rao & de Hoog (1975)
Moniliella nigrescens (Hocking & Pitt) Rosa & Lachance (2008)
Moniliella oedocephalis (Haskins & Spencer) Rosa & Lachance (2008)
Moniliella pollinis (Hennebert & Verachtert) de Hoog & Guého (1984)
Moniliella spathulata (de Hoog) Rosa & Lachance (2008)
Moniliella suaveolens (Lindner) von Arx (1972)
Phần lớn các loài thuộc chi Moniliella phân lập đƣợc thƣờng phân bố ở những
nơi có nhiều dầu mỡ hoặc nơi có nồng độ đƣờng cao nhƣ phấn hoa, mật ong…Ví
dụ, M. acetoabutens cho tới nay chỉ gặp trên các mẫu thực phẩm lên men có độ
chua cao nhƣ xốt hoa quả, dƣa muối, M. mellis từ mật ong, M. nigrescens từ jam,
marmalade hỏng, M. spathulata từ sữa trâu, M. suaveolens từ sữa, bơ, phomat … M.
fonsecae phân lập từ hoa Angelonia pilosella, M. megachiliensis phân lập từ côn
trùng, M. oedocephalis từ mật ong, M. pollinis từ phấn hoa.
Về mặt hình thái học, những lồi thuộc chi Moniliella có khuẩn lạc màu hơi
xám đến đen oliu, sinh sản vơ tính bằng cách nảy chồi và hình thành sợi nấm và bào
tử đốt. Ngoại trừ M. fonsecae, những loài thuộc chi Moniliella mang những đặc tính
đặc biệt trong số những nấm đảm (Basidiomycetous) với khả năng chịu áp suất thẩm
thấu và lên men. Moniliella có những đặc trƣng về cấu trúc nhƣ thành tế bào gồm
nhiều lớp và thiếu xylose, fucose. Vách tế bào có các cấu trúc lỗ, vách ngăn
(dolispores) với các kênh hẹp [20]. Moniliella phản ứng dƣơng tính với Diazonium
blue. Tất cả các lồi có khả năng đồng hóa nitrat và sản sinh urease. Ubiquinone
isoprenologue chính đƣợc xác định trong Moniliella là Co-Q9.
Sự phân nhánh các loài của chi Moniliella đƣợc nghiên cứu bởi phân tích trình
tự vùng D1/D2 của gen LSU rRNA, mức độ sai khác về mặt di truyền giữa các loài
là cao. Trong đoạn D1/D2 của gen LSU rRNA, các lồi có thể sai khác nhau đến
K20 – Vi sinh vật học
5
Đinh Đức Hiền
Luận văn thạc sĩ
15% thậm chí là hơn [22]. Di truyền không đồng nhất trong chi cũng đƣợc thể hiện
qua hơn 16% sai khác về tỷ lệ G+C trong DNA [4]. Mặc dù các loài thuộc chi
Moniliella biểu hiện một số hóa phân loại và siêu cấu trúc giống những loài thuộc
ngành Ustilaginomycotina, thế nhƣng việc sắp xếp vào bậc phân loại cao hơn là
khơng đảm bảo bởi phân tích D1/D2 LSU rRNA hoặc các đoạn gen rRNA khác
[22]. Một sự hiểu biết rõ ràng hơn về sự tiến hóa của chi sẽ đƣợc xác định dựa trên
việc phát hiện ra nhiều loài mới để lấp vào các khoảng trống giữa các đơn vị phân
loại đã đƣợc thiết lập. Thêm nữa, nghiên cứu về chi Moniliella ngày càng đƣợc thúc
đẩy do những đặc tính trong sinh trƣởng của chúng nhƣ ƣa lipit, chịu áp suất thẩm
thấu, điều này hứa hẹn triển vọng cho các q trình cơng nghệ sinh học. Thực tế,
những loài thuộc chi Moniliella đang đƣợc dùng trong sản xuất erythritol thƣơng
mại [23].
Hình 4. Hình ảnh tế bào Moniliella suaveolens CBS 120.63 (trái) và Moniliella
acetoabuten CBS 169.66 (phải). (Nguồn www.mycobank.org)
K20 – Vi sinh vật học
6
Đinh Đức Hiền
Luận văn thạc sĩ
Hình 5. Cây phả hệ mơ tả mối quan hệ giữa các loài thuộc chi Moniliella. Phylloporia
pectinata đƣợc sử dụng nhƣ nhóm ngồi. Mã số GenBank của trình tự rDNA đƣợc đƣa ra
sau tên lồi. Thanh chèn tƣơng ứng 5% khác biệt trình tự.
Bảng 1. So sánh đặc điểm hình thái của chi Moniliella với một số chi thƣờng gặp có thể bị
nhầm lẫn với Moniliella.
Chi
Đặc điểm
Phân bố
Moniliella
Khuẩn lạc mịn, sau đó bơng xù, thƣờng từ
màu trắng rồi chuyển dần sang màu vàng
xanh, xám, đen. Sinh sản bằng phƣơng thức
này chồi hoặc phân đốt. Thành tế bào dày, có
sắc tố đen.
Phân bố ở những nơi có
nhiều dầu mỡ hoặc
những nơi có áp suất
thẩm thấu cao nhƣ mật
ong, phấn hoa.
Geotrichum
Khuẩn lạc màu trắng, bột hoặc lông xù giống
Moniliella nhƣng khuẩn lạc không chuyển
Phân bố trong đất, nƣớc
sang màu xám đen. Chỉ sinh sản bằng phân
và khơng khí.
đốt, khơng nảy chồi. Tế bào to và dài, khoảng
xấp xỉ 10µm.
Trichosporon
Khuẩn lạc màu kem, ƣớt hoặc khơ, có hoặc
khơng bơng xù. Tế bào bé, mỏng. Sinh sản
bằng nảy chồi hoặc phân đốt. Kích thƣớc từ
5-10µm.
K20 – Vi sinh vật học
7
Phân bố trong đất hoặc
nơi nhiều dầu mỡ.
Đinh Đức Hiền
Luận văn thạc sĩ
Candida
Tế bào hình trịn hay elip. Sinh sản vơ tính
theo kiểu nảy chồi
Khuẩn lạc lúc đầu màu trắng, sau chuyển
sang màu sẫm hoặc đen. Đƣờng kính sợi nấm
Aureobasidium
từ 2-10 μm. Sinh sản theo phƣơng thức nảy
chồi.
Phân bố nhiều trong tự
nhiên, thƣờng ở những
nơi có nồng độ đƣờng
cao nhƣ mật mía, một số
chi xuất hiện ở những
nơi nhiều dầu mỡ nhƣ C.
sake, C. haemulonii.
Phân bố trong đất, xác
thực vật, lá cây.
Hình 6. Hình ảnh tế bào của Geotrichum candidum.(trái) và
Trichosporon beigelii (phải)
Từ khía cạnh cơng nghệ, nấm men Moniliella có nhiều ƣu điểm nhƣ khả năng
sinh sản nhanh trong điều kiện hiếu khí, vi hiếu khí, phát triển dạng đơn bào trong
môi trƣờng lỏng, phù hợp với công nghệ lên men chìm phổ biến hiện nay.
Moniliella cịn có khả năng phát triển trong điều kiện áp suất thẩm thấu cao tƣơng
đƣơng với nồng độ glucose 60%. Điều này có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong sản
xuất thƣơng mại khi cần nâng cao nồng độ cơ chất và sản phẩm. Tính ƣa áp suất
thẩm thấu cũng góp phần giảm tạp nhiễm trong quá trình lên men. So với các nấm
men khác cũng nhƣ vi khuẩn, tế bào nấm men Moniliella có kích thƣớc khá lớn
thuận lợi cho cơng nghệ thu hồi sản phẩm (lọc, ly tâm). Ngoài ra, trên mơi trƣờng
cơ chất rắn, Moniliella có thể phát triển ở dạng sợi và thích hợp với cơng nghệ sản
xuất lên men bề mặt [8].
Moniliella đƣợc quan tâm nhiều tới khả năng chuyển hóa glucose thành
erythritol. Erythritol là loại đƣờng chứa 4 nguyên tử cacbon và có một số đặc tính
quan trọng trong cơng nghiệp thực phẩm, dƣợc phẩm nhƣ hàm lƣợng calo thấp
K20 – Vi sinh vật học
8
Đinh Đức Hiền
Luận văn thạc sĩ
(1/10 so với sucrose), mát lạnh khi tan, độ ngọt dịu tƣơng đƣơng 70-80% sucrose,
không gây sâu răng, và có ƣu điểm hơn so với các loại đƣờng chức năng khác nhƣ
xylitol, maltitol vì khơng gây khó chịu cho đƣờng tiêu hóa (Munro và cộng sự,
1998). Trên quy mô công nghiệp, erythritol đƣợc sản xuất bởi hai phƣơng pháp
khác nhau là: phƣơng pháp Misubishi/Nikken (phƣơng pháp M/N) và phƣơng pháp
Cerestar (phƣơng pháp C). Đây thực chất là q trình lên men nhờ vi sinh vật, trong
đó, phƣơng pháp M/N sử dụng chủng nấm men Moniliella megachiliensis còn
phƣơng pháp C lại sử dụng chủng Moniliella pollilis. Moniliella suaveolens cịn
đƣợc biết đến với khả năng chuyển hóa sinh γ-decalactone khi sử dụng bánh ép dầu
(oil press cakes) nhƣ một cơ chất tạo ra tới 180 mg γ-decalactone trên 1 kg chất khô
khi chƣa tối ƣu [13].
Tại Việt Nam, gần đây trong hoạt động bảo tồn gen Vi sinh vật công nghiệp,
trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm đã phát hiện
Moniliella có khả năng sinh zymocin, một loại kháng sinh kháng nấm men.
Zymocin có thể đƣợc ứng dụng hiệu quả trong công nghiệp để bảo vệ các quá trình
lên men khỏi sự xâm nhiễm và phá hoại của các loài nấm men hoang dại, trong bảo
quản nƣớc hoa quả. Zymocin đồng thời cũng hứa hẹn nhiều khả năng đƣợc ứng
dụng nhƣ một chất kháng sinh chống nấm trong y học. Ngồi ra, nhiều chủng
Moniliella cịn có khả năng sinh lipase, một enzyme đƣợc ứng dụng phổ biến trong
công nghiệp tẩy rửa và công nghiệp thực phẩm…
Hiện nay, Viện Công nghiệp Thực phẩm đang tiến hành thực hiện đề tài cấp
Nhà nƣớc “Nghiên cứu công nghệ sản xuất đƣờng chức năng erythritol từ tinh bột”
thuộc Đề án phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực công nghiệp
chế biến đến năm 2020, sử dụng nấm men Moniliella. Một trong những mục tiêu
đƣợc đặt ra trong luận văn là đánh giá đa dạng nấm men Moniliella tại Việt Nam và
cung cấp một số lƣợng lớn chủng giống phong phú về mặt di truyền, đáp ứng các
yêu cầu của nội dung sàng lọc trong đề tài khoa học công nghệ cấp Nhà nƣớc.
K20 – Vi sinh vật học
9
Đinh Đức Hiền
Luận văn thạc sĩ
1.2. Một số phƣơng pháp phân loại nấm men
Hệ thống phân loại của nấm men hiện nay gồm có 14 lớp, 5 phân lớp, 15 họ, 95
chi và khoảng 1500 loài [18]. Hệ thống phân loại nấm men đƣợc xây dựng dựa trên
các sự tƣơng đồng và khác biệt giữa các taxa theo các đánh giá phân loại truyền
thống với cơ sở là đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và phân loại hiện đại với cơ
sở là thông tin di truyền.
1.2.1. Các phương pháp phân loại truyền thống
Phƣơng pháp phân loại truyền thống dựa vào các đặc điểm về hình thái, sinh lý,
sinh hóa để phân loại nấm men [1, 18].
Dựa vào đặc điểm hình thái tế bào nấm men: nấm men là cơ thể đơn bào nhƣng
rất đa dạng về hình thái tế bào. Thơng thƣờng tế bào nấm men có hình elip, hình
cầu, một số có hình kéo dài dạng que, đơi khi có hình quả chanh....Vì vậy, dựa vào
sự khác nhau về hình thái ta có thể sơ bộ phân loại các giống nấm men khác nhau.
Dựa vào đặc điểm nuôi cấy: Quan sát sự thay đổi của môi trƣờng lỏng trong
quá trình ni cấy để phân loại nhƣ: độ đục, độ tạo váng, bọt khí... Nếu ni trên
mơi trƣờng thạch thì đánh giá bằng hình thái, kích thƣớc, màu sắc (trắng, kem,
đục,...) và bề mặt khuẩn lạc (nhẵn, xù xì, lồi, lõm,...)
Dựa vào đặc điểm sinh sản:
Sự nảy chồi: Quan sát số lƣợng chồi, vị trí nảy chồi, sự sắp xếp chồi trên tế bào
mẹ, chồi có tách ra khỏi tế bào mẹ hay không nhằm phân biệt các chủng khác nhau.
Khả năng sinh bào tử: Sử dụng môi trƣờng tạo bào tử, theo dõi thời gian sinh
bào tử, hình dạng, số lƣợng bào tử trong nang, hình dạng nang, khả năng phá vỡ
nang.
Dựa vào các đặc điểm sinh lý, sinh hóa: sử dụng các kiểm tra về sinh lý sinh
hóa nhƣ: khả năng lên men đƣờng, khả năng đồng hóa đƣờng và các hợp chất nitơ,
khả năng tạo màng, khả năng tạo sắc tố, khả năng tiết một số enzym ngoại bào quan
trọng (amylase, protease, lipase, kitinase, xenlulolase, cazeinase), khả năng tiết axit
K20 – Vi sinh vật học
10
Đinh Đức Hiền
Luận văn thạc sĩ
amin, vitamin ra môi trƣờng nuôi cấy [1, 18]. Xác định các đặc tính sinh lý, sinh
hóa là một bƣớc rất quan trọng để phân loại nấm men, là cơ sở sàng lọc các đặc tính
cơng nghệ, theo đó ngƣời ta phải tiến hành nghiên cứu các đặc điểm cụ thể sau đây:
Lên men 13 loại đƣờng nhƣ: D-glucose, D-galactose, sucrose, maltose, lactose,
raffinose, inulin, starch, melibiose, cellobiose, D-xylose.
Đồng hóa 46 nguồn carbon bao gồm: glucose, galactose, L-sorbose, sucrose,
maltose, cellobiose, trelalose, lactose, melibiose, raffinose, melezitose, inulin,
tinh bột tan, D-xylose, L-arabinose, D- arabinose, D-ribose, L-rhamnose, Dglucosamin, N-acetyl-D-glucosamin, methanol, ethanol, glycerol, erythritol,
ribitol, galactitol, D-mannitol, D-glucitol, a- metyl-D-glucosid, salicin,
glucono-d-lacton, D-gluconat, 2-ketogluconat, 5-ketogluconat, DL-lactat,
succinat, citrat, inositol, saccharat, xylitol, L-arabinitol, propan 1,2 diol, butan
2,3 diol, D-glucuronic acid, D-galacturonic acid.
Tính chống chịu với mơi trƣờng có nồng độ 0,01 % hoặc 0,1 % cycloheximide .
Đồng hoá 6 nguồn nitơ: nitrate, nitrite, ethylnamine hydrochloride, L-lyzine,
cadaverine dihydrochloride, creatine.
Khả năng sinh trƣởng khi thiếu hụt một số vitamin (myo-Inositol, calcium
pantothenate, biotin, thiamine hydrochloride, pyridoxin hydrochloride, niacin,
folic acid, p-aminobenzoic acid.
Khả năng sinh trƣởng tại các nhiệt độ khác nhau: 25, 30, 35, 37, 42°C.
Khả năng tạo thành tinh bột trong môi trƣờng nuôi cấy.
Sản sinh acid từ glucose.
Khả năng thủy phân Urê.
Khả năng phân giải Arbutin.
Khả năng phân giải lipid.
K20 – Vi sinh vật học
11
Đinh Đức Hiền
Luận văn thạc sĩ
Khả năng sản sinh sắc tố.
Sinh trƣởng trên môi trƣờng chứa 50% và 60% glucose.
Khả năng hóa lỏng gelatine
Phản ứng với Diazonium Blue B
Phát triển trên mơi trƣờng chứa acid acetic 1%
Ngồi ra để xác định lồi mới cịn cần phân tích thành phần acid béo của tế bào,
thành phần đƣờng trong tế bào, phân tích hệ coenzyme Q, tỷ lệ G+C, đặc tính huyết
thanh miễn dịch.
1.2.2. Các phương pháp hóa phân loại và sinh học phân tử
Ngoài phƣơng pháp phân loại truyền thống các nhà phân loại cịn có thêm một
cơng cụ nữa là phƣơng pháp phân loại bằng sinh học phân tử. Nhờ sự phát triển của
kỹ thuật di truyền và máy móc hiện đại giúp các nhà phân loại học có thêm cơ sở
vững chắc để phân loại, thậm chí định tên đến lồi một cách chính xác mà khơng
cần nghiên cứu đến nhiều khía cạnh cùng một lúc.
Phân tích thành phần thành tế bào: Dựa trên cơ sở thành phần trong chuỗi
polysaccarit cấu tạo nên thành tế bào giữa các lồi nấm men khác nhau thì khác
nhau. Việc phân tích thành phần thành tế bào cung cấp một đặc điểm quan trọng để
phân loại nấm men. Các thành phần của thành đƣợc sử dụng để phân tích bao gồm
glucan, mannan, kitin, xylose [18].
Thành phần G/C: Tỉ lệ (G+C)/(A+T+G+C) có xu hƣớng khơng đổi đối với các
lồi nhất định, và khác nhau giữa các loài. Do vậy thành phần (G+C) phản ánh mối
quan hệ phát sinh loài. Các chủng có thành phần (G+C) khác nhau 2- 2,5% thì thuộc
hai loài khác nhau. Tuy nhiên thành phần (G+C) chỉ giúp phân biệt đƣợc hai lồi
khác nhau mà khơng xác định đƣợc hai chủng có cùng lồi hay khơng vì nếu tỷ lệ
(G+C) giống nhau nhƣng trình tự khác nhau thì chúng thuộc hai loài khác nhau [18,
19].
K20 – Vi sinh vật học
12
Đinh Đức Hiền
Luận văn thạc sĩ
Loại CoQ: CoQ là chất mang quan trọng trong q trình vận chuyển điện tử
trong chuỗi hơ hấp. Các lồi nấm men khác nhau có số lƣợng và loại CoQ khác
nhau là cơ sở để phân loại nấm men đến mức độ chi. Các CoQ phát hiện ở nấm
men: CoQ 6, CoQ 7, CoQ 8, CoQ 9, CoQ 10 và CoQ10 (H2) [18].
Kỹ thuật PCR fingerprinting: phƣơng pháp fingerprinting là phƣơng pháp dùng
để phân nhóm dƣới lồi dựa trên sự tƣơng đồng các đoạn DNA vệ tinh. DNA vệ
tinh là các đoạn DNA có trình tự lặp lại lớn phân bố ngẫu nhiên trong hệ gen của tế
bào, thƣờng khơng mã hóa cho gen và ít bị đột biến, thay đổi. Do đó chúng thƣờng
đƣợc dùng làm công cụ đắc lực trong phân loại. Sử dụng các mồi đƣợc thiết kế theo
trình tự của các DNA vệ tinh trong phản ứng PCR. Sau đó các đoạn DNA vệ tinh đã
khuếch đại sẽ đƣợc điện di để so sánh kích thƣớc. Sự tƣơng đồng của các phổ băng
thể hiện sự gần gũi của các chủng nấm men.
Trình tự rDNA: Do ribosome có ở tất cả các tế bào sinh vật và ít biến đổi nên nó
là cơ sở nghiên cứu tổ tiên chung cho mọi sinh vật. Các rDNA có nhiều bản sao, dễ
phân lập, kích thƣớc nhỏ nên dễ dàng phân tích các đặc điểm liên quan bằng các kĩ
thuật hiện đại nhƣ: RFLP, AFLP, hoặc đọc trình tự nucleotit, từ đó phân loại các vi
sinh vật một cách chính xác hơn. Các đoạn rDNA thƣờng đƣợc chọn là: rDNA 5S,
rDNA 5.8S, rDNA 18S, rDNA 26S, và ITS.
Đoạn gen mã hóa rDNA 5S: trƣớc đây đƣợc sử dụng nhiều trong phân loại do
nó có kích thƣớc nhỏ (120 Nu) dễ xác định trình tự và có tính bảo thủ cao, là cơ sở
để xác định mối quan hệ phát sinh loài trên phổ rộng. Hiện nay vai trò rDNA 5S
đƣợc thay thế bởi rDNA 18S, rDNA 26S do chúng cung cấp nhiều thông tin hơn.
Đoạn gen mã hóa rDNA 18S: Đoạn gen này có kích thƣớc lớn, có chứa các
vùng bảo thủ ở các phần khác nhau. Do vậy phân tích trình tự rDNA 18S cho phép
xác định mối quan hệ sinh vật từ ngành cho đến loài, hiệu quả hơn khi kết hợp với
đặc điểm (G+C), CoQ, thành tế bào để phân loại. Tuy nhiên việc phân tích trình tự
rDNA 18S có nhiều hạn chế do kích thƣớc của chúng quá lớn gây tốn kém trong
K20 – Vi sinh vật học
13
Đinh Đức Hiền
Luận văn thạc sĩ
đọc trình tự, làm cản trở việc áp dụng kỹ thuật này một cách rộng rãi trong phân
loại.
Đoạn gen mã hóa rDNA 26S: Một trong những thành tựu quan trọng đã đạt
đƣợc trong nghiên cứu đa dạng nấm men gần đây là thiết lập đƣợc cơ sở dữ liệu về
trình tự D1/D2 của rDNA 26S cho tất cả các nấm men đã biết. Điều đó cho phép so
sánh loài mới phân lập với các loài đã biết, nhờ đó xác định đƣợc tên và vị rí của nó
trong hệ thống phân loại một cách nhanh chóng và dễ dàng. Đoạn D1/D2 của rDNA
26S đƣợc chọn để nghiên cứu vì kích thƣớc nhỏ (600 bp), và khác nhau giữa các
lồi (tính đặc hiệu lồi cao), các chủng khác nhau dƣới 1% nucleotit thì cùng một
lồi và trên 1% có thể thuộc các lồi khác nhau. Tuy nhiên cần phải sử dụng nhiều
gen để phân tích thì hiệu quả phân loại sẽ cao và chính xác hơn.
Vùng ITS: Vùng này nằm giữa rDNA 18S và rDNA 26S, có kích thƣớc khoảng
500 bp. Do có tính bảo thủ cao, kích thƣớc nhỏ nên vùng ITS đƣợc sử dụng trong
phân loại khá phổ biến nhƣ đoạn D1/D2 của rDNA 26S. So với mức độ tƣơng đồng
của đoạn D1/D2 thì vùng ITS cũng tƣơng tự, các chủng khác nhau dƣới 1%
nucleotit thì đƣợc coi là cùng lồi và trên 1% thì có thể chúng thuộc các loài khác
nhau [14, 16].
1.3. Một số phƣơng pháp phát hiện và đánh giá đa dạng Vi sinh vật
Phương pháp Peptide axit nucleic (PNA): cung cấp một cơng cụ để phát hiện và
định lƣợng của các lồi trong các mẫu bệnh phẩm và các sản phẩm thực phẩm,
thông qua lai huỳnh quang tại chỗ (FISH). PNA đầu dị có một peptide nhƣ một
khung xƣơng sống để nối các chuỗi nucleotide bổ sung đặc trƣng cho một loài cụ
thể, và một nhãn huỳnh quang đƣợc gắn thêm vào, phản ứng lai sau đó đƣợc phát
hiện bằng kính hiển vi huỳnh quang (Stender và cộng sự 2001). Nếu đầu dị bổ sung
với rRNA, tồn bộ tế bào của các loài mục tiêu sẽ "phát sáng" khi quan sát, mặt
khác kỹ thuật này cũng cho phép định lƣợng số lƣợng tế bào. Một lợi thế là một
mẫu có thể đƣợc pha lỗng và trực tiếp dùng đầu dị. Nhƣng bất lợi là đầu dị phải
đƣợc phát triển cho mỗi lồi quan tâm, một vấn đề phổ biến nhất cho công nghệ
K20 – Vi sinh vật học
14
Đinh Đức Hiền
Luận văn thạc sĩ
dùng đầu dò. Kỹ thuật PNA đã có hiệu quả để phát hiện Dekkera (Brettanomyces)
bruxellensisin trong rƣợu vang hỏng (Stender và cộng sự 2001) và để phát hiện
Candida albicansin trong mẫu máu (Rigby và cộng sự 2002) [18].
Hình 7. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR sử dụng mồi đặc hiệu phát hiện Candida
albicans và Candida dubliniensis. Phản ứng PCR gồm mồi cho đoạn D1/ D2 và mồi đặc
hiệu dành riêng cho Candida albicans (Mannarelli và Kurtzman 1998).
Kỹ thuật Realtime PCR: kỹ thuật này cũng đã đƣợc nghiên cứu và ứng dụng
rộng rãi trong nấm học y học, đặc biệt là những mục tiêu nhằm phát hiện và định
lƣợng C. albicans. Trong các thử nghiệm, kỹ thuật này có thể phát hiện đƣợc 5
cfu/ml. Một lợi thế của phƣơng pháp này là phát hiện sớm các tác nhân gây bệnh
tiềm ẩn, góp phần khởi đầu điều trị. Các mồi phổ biến nhất đƣợc sử dụng là dựa về
trình tự của rDNA lặp lại, chẳng hạn nhƣ vùng ITS1, ITS2, hoặc gen rRNA 18s. Kỹ
thuật này cũng đang trở nên sử dụng rộng rãi trong phân tích thực phẩm và nƣớc
giải khát, và đã đƣợc sử dụng để phát hiện và định lƣợng của nấm men hƣ hỏng
trong nƣớc cam (Casey và Dobson 2004) cũng nhƣ trong quá trình lên men rƣợu
vang (Cocolin và cộng sự 2001) [18].
Kỹ thuật DGGE: Điện di gradient biến tính (DGGE) là một kỹ thuật đầy hứa
hẹn đã đƣợc sử dụng để nhận dạng các loài và định lƣợng các quần thể nấm men
trong thực phẩm và đồ uống. DGGE là một công cụ đƣợc phát minh nhằm ứng dụng
cho việc phân tích DNA. Kỹ thuật này đƣợc sử dụng để phát hiện sự thay đổi mã di
truyền trong DNA và có thể xác định sự sai khác 1 bp giữa các sợi DNA. Nguyên lý
K20 – Vi sinh vật học
15
Đinh Đức Hiền
