Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã cho thụ thể neurokinin 1 ở người việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-----------------------

Lê Hồng Thu

TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ CHO
THỤ THỂ NEUROKININ-1 Ở NGỪƠI VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2012


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

----------------------

Lê Hồng Thu

TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ CHO
THỤ THỂ NEUROKININ-1 Ở NGƯỜI VIỆT NAM

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số : 604230

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC : PGS.TS. Võ Thị Thƣơng Lan

Hà Nội - 2012


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .........................................................................................................1
Ch­¬ng 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................11

1.1 THỤ THỂ LIÊN KẾT VỚI G PROTEIN ............................................11
1.1.1. G protein..................................................................................................11
1.1.2. Thụ thể liên kết với G protein .................................................................11
1.2 HỌ TACHYKININ Ở ĐỘNG VẬT CÓ VÚ ........................................14
1.3 THỤ THỂ HỌ TACHYKININ VÀ THỤ THỂ NEUROKININ-1 ....18
1.3.1. Giới thiệu chung về thụ thể họ tachykinin ..............................................18
1.3.2. Thụ thể neurokinin – 1 ............................................................................20
1.4 ỨNG DỤNG CỦA THỤ THỂ NEUROKININ-1 TRONG ĐIỀU TRỊ
BỆNH .......................................................................................................................23
1.5 VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHO THỤ THỂ
NEUROKININ-1 .....................................................................................................26
Chƣơng 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......28
2.1. NGUYÊN LIỆU .....................................................................................28
2.1.1. Mẫu vật....................................................................................................28
2.1.2. Các cặp mồi sử dụng ...............................................................................28
2.1.3. Các hệ thống vector.................................................................................29
2.1.4. Chủng vi khuẩn .......................................................................................29
2.1.5. Hóa chất và thiết bị .................................................................................29
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................30
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu.....................................................................................30
2.2.2. Các kỹ thuật dùng trong nghiên cứu .......................................................31

2.2.2.1. Tách RNA tổng số................................................................................31
2.2.2.2. Phản ứng phiên mã ngược ....................................................................32


2.2.2.3. Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) ......................................32
2.2.2.4. Tinh sạch DNA bằng phương pháp thôi gel ........................................33
2.2.2.5. Nối ghép các đoạn DNA vào vector ....................................................33
2.2.2.6. Kỹ thuật biến nạp .................................................................................33
2.2.2.7. Sàng lọc khuẩn lạc ...............................................................................34
2.2.2.8. Tách plasmid ........................................................................................34
2.2.2.9. Kĩ thuật cắt sử dụng enzyme giới hạn ..................................................35
2.2.2.10. Kỹ thuật điện di ..................................................................................36
2.2.2.11. Phân tích trình tự cDNA của cDNA-NK1 .........................................36
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................37
3.1. TÁCH DÒNG GEN MÃ HÓA CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1
TỪ PHỔI NGƢỜI ...................................................................................................37
3.1.1. Tổng hợp cDNA từ mẫu phổi người .......................................................37
3.1.2. Khuếch đại đoạn 5’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 .37
3.1.3. Khuếch đại đoạn 3’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 .39
3.1.4. Tách dòng đoạn 5’-NK1 và 3’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể
neurokinin-1 ......................................................................................................41
3.1.5. Tách dịng đoạn cDNA hoàn chỉnh mã cho thụ thể neurokinin-1 ..........44
3.1.6. Giải trình tự cDNA hịan chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin-1..........49
3.2. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ CHO THỤ THỂ
NEUROKININ-1 .....................................................................................................49
3.2.1. Thiết kế mồi .........................................................................................49
3.2.2. Tách dòng vector biểu hiện mang cDNA mã hóa cho th ụ thể neurokinin1 .........................................................................................................................52
3.2.3. Giải trình tự gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 trong vector biểu hiện
...........................................................................................................................56
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .....................................................................57

KẾT LUẬN ...................................................................................................57
KIẾN NGHỊ ..................................................................................................57
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................58

\


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1: Họ các thụ thể liên kết với G protein (GPCRs).......................................................3.
Hình 2: Cấu trúc chung của thụ thể xuyên màng 7 lần liên kết với G protein.....................4.
Hình 3: Sơ đồ cắt-nối gen mã hóa cho tachykinin ở động vật có vú ..................................7.
Hình 4: Cấu trúc thụ thể NK1 mang chiều dài hịan chỉnh và NK1 có đầu carboxyl bị xén
cụt........................................................................................................................................12.
Hình 5: Sơ đồ nghiên cứu tách dịng và thiết kế vector biểu hiện cDNA mã hóa cho thụ thể
neurokinin – 1 ở phổi người Việt Nam..............................................................................22.
Hình 6: Sơ đồ khuếch đại đoạn 5’ và 3’-NK1 của gen mã hóa cho neurokinin-1…………9
Hình 7: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể
neurokinin-1.......................................................................................................................30.
Hình 8: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể
neurokinin-1........................................................................................................................30.
Hình 9: Điện di sản phẩm PCR dùng khuôn cDNA tổng hợp từ mồi oligo T khuếch đại
đoạn 3’-NK1. .....................................................................................................................30.
Hình 10: Điện di sản phẩm PCR sàng lọc các khuẩn lạc với cặp mồi NK1 F/ NK1 R1....34.
Hình 11: Điện di sản phẩm PCR sàng lọc các khuẩn lạc mang đoạn chèn 3’-NK1 bằng cặp
mồi NK1 F1/ NK1 R. .........................................................................................................35.
Hình 12. Sơ đồ tách dịng đoạn cDNA hồn chỉnh mã cho thụ thể neurokinin-1...............36
Hình 13: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1 bằng cặp mồi pJET R/ NK1
R………………………………………………………………………………………….37

Hình 14: Điện di sản phẩm cắt trước và sau khi tinh sạch bằng kit QIAquick Gel
Extraction………………………………………………………………………………..38.
Hình 15: Điện di sản phẩm PCR sàng lọc các khuẩn lạc mang đoạn cDNA NK1 hồn
chỉnh....................................................................................................................................40.
Hình 16: Sơ đồ thiết kế mồi NK1 F3/R3 để khuếch đại cDNA-NK1 từ vector pNK13...........................................................................................................................................41.
Hình 17: Điê ̣n di sản phẩ m PCR với khuôn là vector tái tổ hơ ̣p pNK 1-3 và hai mồ i NK 1
F3/NK1 R3.......................................................................................................................43.


Hình 18: Điê ̣n di sản phẩ m cắ t ve ctor pCDNA 3, pEGFP-N1 và eNK 1 với hai enzyme
Hind
III
và
Bam
HI.........................................................................................................................44.
Hình 19: Điê ̣n di sản phẩ m PCR kiể m tra khuẩ n la ̣c mang vector

tái tổ hợp pCDNA 3-

NK1.....................................................................................................................................46.
Hình 20: Điê ̣n di sản phẩ m PCR kiể m tra khuẩ n la ̣c mang vector tái tổ hơ ̣p pGFPN

1-

NK1.....................................................................................................................................47.


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DNA

Dedeoxyribonuleic acid

pb

base pair (cặp bazơ)

kb

kilobase = 1000 bp

dNTP

deoxyribonucleoside triphosphate

E.col

Escherichia coli

LB

Lubertani Both

PCR

Polymerase Chain Reception

RNA

Ribonucleic acid

GPCR

G protein coupled receptor

TACR

Tachykinin Receptor

TM

Transmembrane

IL

Ỉntacellular

CIN V

Chemotherapy induced nausea and vomiting


MỞ ĐẦU
Thụ thể neurokinin – 1 thuộc nhóm các thụ thể xuyên màng liên kết với G
protein. Khi thụ thể này tương tác với cấu tử gắn đặc hiệu SP sẽ dẫn truyền cảm
giác đau đớn từ vùng thần kinh ngoại vi về trung ương thần kinh, gây ra trạng thái
lo âu và các triệu chứng giống trầm cảm, mặt khác chúng cũng có tác dụng gây kích
thích co cơ trơn và điều hòa các phản ứng miễn dịch của cơ thể.
Trên cơ sở những nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của thụ thể
neurokinin-1, các hãng dược phẩm đã cố gắng tìm ra các chất đối vận với thụ thể

neurokinin-1 nhằm sản xuất thuốc giảm đau cho các bệnh nhân bị chứng đau nửa
đầu, thuốc chống trầm cảm, thuốc chống nôn cho các bệnh nhân ung thư, … Tuy
nhiên, các cơng trình nghiên cứu về thụ thể này ở người Việt Nam cịn rất ít hoặc
chưa được cơng bố. Chính vì vậy, với mục đích phân lập được đoạn cDNA hồn
chỉnh mã hóa cho thụ thể này ở người Việt Nam và biểu hiện chúng trên hệ thống tế
bào động vật để có thể chủ động được nguồn gen và các hệ thống sàng lọc thuốc từ
nguồn dược liệu Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Tách dịng và thiết kế
vector biểu hiện gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 ở ngườiViệt Nam”. Đề tài
được thực hiện tại Phịng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học; Phịng Genomic thuộc
Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzyme - Protein và Phòng Sinh học
Phân tử thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống,Trường Đại học Khoa học
Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.


Ch-¬ng 1.
1.1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

THỤ THỂ LIÊN KẾT VỚI G PROTEIN

1.1.1. G protein
G protein lần đầu tiên được phát hiện và mô tả bởi Alfred và Martin khi hai
ông nghiên cứu tác động của adrenaline đối với tế bào. Với cơng trình này, hai ơng
đã giành giải Nobel lý sinh – y học năm 1994 [4].
G protein một nhóm protein lớn có bản chất là enzyme GTPases [46]. Dựa
vào kích thước người ta chia chúng thành hai họ: GTPases dạng monomer kích
thước nhỏ và G protein dạng trimer kích thước lớn. G protein kích thước lớn được
tạo thành từ các tiểu đơn vị alpha (Gα), beta (Gβ) và gamma (Gγ). Hai tiểu đơn vị
beta (Gβ) và gamma (Gγ) hình thành phức dimer bền vững (Gβγ); phức này liên kết

với tiểu đơn vị alpha (Gα) [29].
G protein định vị ở mặt trong màng tế bào và được hoạt hóa nhờ thụ thể liên
kết với G protein (GPCRs) phân bố trên bề mặt màng tế bào.
1.1.2. Thụ thể liên kết với G protein
Họ thụ thể liên kết với G protein là những phân tử protein kích thước nhỏ
(350-500 acid amine) [45], được phân thành các phân họ khác nhau dựa theo độ
tương đồng về trình tự acid amine, chức năng và khả năng liên kết với các cấu tử.
Đến nay đã người ta đã phát hiện ra 367 thụ thể liên kết với G protein ở người,
trong đó có khoảng 150 GPCRs được tìm thấy vẫn chưa biết chức năng [52].


Hình 1: Sự đa dạng của các họ thụ thể liên kết với G protein (GPCRs) [56].

Họ GPCR được phân chia thành ba lớp chính: lớp A, B và C. Lớp A hay cịn
gọi là lớp Rhodopsin đơng đảo nhất về số lượng thụ thể trong họ GPCR với 19 phân
lớp (Hình 1). Lớp A cho phép nhận tín hiệu từ các monoamine, purine, opioid,
chemokine, một số hormone có bản chất peptide hoặc glycoprotein, ... trong đó đặc
biệt là truyền dẫn các tín hiệu có liên quan tới mùi hương. Lớp B còn được gọi là
lớp Secretin với 34 phân lớp chủ yếu dẫn truyền tín hiệu liên quan tới các hormone
có bản chất peptide như parathyroid, calcitonin, … Lớp C còn được gọi là lớp
Glutamate với 8 phân lớp có vai trị thu nhận tín hiệu trong q trình trao đổi dinh
dưỡng của tế bào [3, 60].
Về cấu trúc, tất cả các thụ thể liên kết với G protein đều có đầu amino ở
ngồi màng, 7 chuỗi xoắn xun màng, 3 vịng ở phía ngồi (exoloop), 3 vịng ở
phía trong màng (cytoloop) và đầu carboxyl phân bố trong màng (Hình 2). Hầu hết


các thụ thể này đều được gắn thêm carbonhydrate vào đầu amino và palmityl hóa ở
vị trí Cys ở đầu carboxyl. Mỗi chuỗi xuyên màng chứa 20-27 acid amine, đầu
amino chứa 7-595 acid amine, các vòng xoắn chứa 5-230 acid amine, đầu carboxyl

chứa 12-359 acid amine. Điều này cho thấy cấu trúc của GPCR rất đa dạng. Người
ta đã tìm ra mối liên hệ yếu giữa chiều dài của đầu amino với kích thước của cấu tử
gắn tương ứng [51].

Ngồi tế bào

tế bào

Trong tế bào
tế bào

Hình 2: Cấu trúc chung của thụ thể xuyên màng 7 lần liên kết với G protein [60].

Vùng xuyên màng với 7 chuỗi xoắn alpha tạo nên hình dạng đặc trưng cho
thụ thể GPCR. Trong đó vùng xuyên màng 1, 4, 7 chỉ chứa duy nhất một acid amine
kỵ nước là asparagine hoặc serine. Điều này khiến cho chúng có tính kỵ nước cao
hơn các vùng xuyên màng còn lại. Trên cấu trúc của các vùng xuyên màng thường
chứa cysteine tham gia vào tạo cầu disulfit [51].
GPCR đều có chung một cơ chế hoạt động. Khi một cấu tử mang tín hiệu
(hormone, photon, ...) liên kết với vùng đặc hiệu trong thụ thể trên bề mặt tế bào sẽ
làm thay đổi cấu hình của GPCR. Sự thay đổi đó kích hoạt G protein chuyển từ
trạng thái “tắt” – đang liên kết với GDP sang trạng thái “bật” – liên kết với GTP ở
tiểu đơn vị Gα. Ở trạng thái “bật”, phức Gα-GTP tách khỏi phức dimer Gβγ, khi đó
chúng sẽ kích hoạt các enzyme hình thành lên chất truyền tin thứ hai là cAMP hoặc


inositol triphosphate/diacetyl glycerol (IP3/DAG). Điều này phụ thuộc vào loại tiểu
đơn vị alpha trong G protein, từ đó tạo ra một dịng thác những tín hiệu được truyền
dẫn, kết quả cuối cùng là làm thay đổi hoạt động sinh lý, sinh hóa của tế bào [29,
38].

Về chức năng, GPCR và G protein cùng phối hợp với nhau để thực hiện vai
trị truyền dẫn các tín hiệu hormone, chất dẫn truyền thần kinh, hạt photon ánh sáng,
các phân tử mùi hương, các loại peptide, một số ion, ... từ môi trường bên ngồi vào
bên trong tế bào [51, 60]. Do có nhiều chức năng rất quan trọng trong q trình
truyền tín hiệu của tế bào nên hiện nay G protein và các thụ thể liên kết với chúng
đang là đích tách động cho nhiều liệu pháp chữa bệnh. Theo ước tính có khoảng
hơn một nửa số thuốc hiện nay có đích tác động là GPCRs [3, 4].
1.2

HỌ TACHYKININ Ở ĐỘNG VẬT CÓ VÚ

Tachykinin là một trong những họ neuropeptide lớn nhất được tìm thấy trong
cơ thể của tất cả các lồi động vật. Có hơn 40 loại tachykinin đã được phân lập từ
các nhóm động vật khơng xương và có xương sống [15, 45].
Trong họ tachykinin, chất P (SP) được mô tả lần đầu tiên năm 1931 bởi
Euler và Gaddum khi hai ông nghiên cứu dịch chiết não và ruột ngựa trong cồn.
Dịch chiết này có tác dụng kích thích hiệu quả hoạt động của ruột và gây giảm
huyết áp ở thỏ [21]. Tuy nhiên, rất nhiều thí nghiệm nhằm phân lập và tinh sạch SP
có hoạt tính từ các mẫu ruột ngựa đã không thành công. Bốn mươi năm sau đó (năm
1970), Chang và Leeman mới tinh sạch được SP từ vùng dưới đồi của bò [14] và
đến năm 1973, Studer và cộng sự đã phân lập, tinh sạch SP, đồng thời giải trình tự
gene mã hóa cho SP từ ruột ngựa [50]. Năm 1983, Kangawa và Kimura đã phân lập
được thêm hai tachykinin có hoạt tính dược học khác với SP là neurokinin A
(NKA) và neurokinin B (NKB) từ vùng thần kinh trung ương và ngoại vi [31, 33].
Hiện nay, tachykinin trong mơ động vật có vú đã được xác định gồm có chất P (hay
SP), neurokinin A (hay neuromedin L hoặc chất K) và neurokinin B (hay
neuromedin K). Riêng NKA được mở rộng thêm 2 dạng là neuropeptide K và
neuropeptide γ (Bảng 1).

Bảng 1: Trình tự amino acid đầu carboxyl của các tachykinin ở động vật có vú [61]
Peptide/Nguồn
SP
Vùng dưới đồi của
bị
NKA
Tủy sống
của lợn
NKB
Tủy sống
của lợn
Neuropeptide-γ
Ruột thỏ
Neuropeptide K

Não lợn

Trình tự amino acid đầu C

Tài liệu trích dẫn

Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-

Chang và cộng sự,
1971

Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2
His-Lys-Thr-Asp-SerPhe- Val-Gly-Leu-Met-NH2
Asp-Met-His-Asp-PhePhe-Val-Gly-Leu-Met-NH2
Asp-Ala-Gly-His-Gly-Gln-Ile-SerHis-Lys-Arg-Lys-Asp-SerPhe-Val-Gly-Leu-Met-NH2

Asp-Ala-Asp-Ser-Ser-Ile-GluLys-Gln-Val-Ala-Leu-Leu-LysAla-Leu-Tyr-Gly-His-Gly-GlnIle-Ser-His-Lys-Arg-His-GlyGln-Ile-Ser-His-Lys-Arg-Lys-Asp-Ser –
Phe-Val-Gly-Leu-Met-NH2

Kimura và cộng sự,
1983
Kangawa và cộng sự,
1983

Kage và cộng sự, 1988

Tatemoto và cộng sự,
1985

Các tachykinin ở động vật có vú đều được đặc trưng bởi trình tự đầu
carboxyl với cấu trúc bảo thủ: Phe-X-Gly-Leu-Met-NH2, trong đó X là một amino
acid béo (Val hoặc Ile) hoặc thơm (Phe hoặc Tyr) [20].


Gen PPT-A

Quá trình phiên mã

Dịch mã và tổng
hợp protein

Dịch mã và tổng
hợp protein
Dịch mã và tổng
hợp protein

Quá trình biến đổi sau dịch mã
Quá trình biến đổi sau dịch mã
Quá trình biến đổi sau dịch mã

Hình 3: Sơ đồ cắt-nối gen mã hóa cho tachykinin ở động vật có vú [37].

Các gen mã cho tachykinin ở người gồm TAC1 (hay PPT-A) định vị trên
NST số 7 và TAC3 (hay PPT-B) định vị trên NST số 12. Các gen này tương ứng với
gen Tac1 và Tac2 ở chuột. Gen TAC1 mã hóa cho SP, NKA, neuropeptide K,
neuropeptide- γ [3, 7]. Sở dĩ gene này mã hóa được cho một loạt sản phẩm là do
mRNA tổng hợp từ gen TAC1 đã trải qua quá trình cắt nối luân phiên để tổng hợp
các dạng preprotachykinin khác nhau: alpha (α-PPT), beta (β-PPT) và gamma (γPPT) [34]. Sau quá trình dịch mã, từ các tiền chất protein này sẽ tiếp tục được cắt
nối để tạo thành tachykinin SP, NKA, NKB. Chi tiết sơ đồ quá trình cắt nối được
trình bày trong Hình 3. Trong đó, dạng α-PPT-A mARN thiếu exon 6 được tìm thấy
chủ yếu ở trong não. Dạng γ-PPT-A mARN thiếu exon 4 và dạng β-PPT-A mARN
đủ cả 7 exon được tìm thấy chủ yếu ở các hạch thần kinh ngoại biên [36, 37]. Các


đoạn peptide tiền thân được nhận biết nhờ 6 nhóm enzyme thủy phân gọi là
convertase và cắt đặc hiệu tại các vị trí Lys-Arg, Arg-Arg hoặc Arg-Lys để tạo
thành các dạng tachykinin tương ứng [34, 47]. Trong đó cả ba dạng
preprotachykinin đều được sử dụng để tạo thành chất P còn dạng preprotachykinin
beta và gamma mới được sử dụng để hình thành lên các dạng peptide khác (NKA,
neuropeptide γ, neuropeptide K). Ở một số mô trong cơ thể, neuropeptide K và γ
thường có đầu amino dài hơn so với NKA [12]. Trong khi đó gen TAC3 (PPT-B)
mã hóa cho neurokinin B biểu hiện chủ yếu trong vùng dưới đồi và ruột [7].
Từ năm 2000, nhóm của Yu Zhang và cộng sự tiến hành nghiên cứu ở tế bào
lympho B ở chuột đã phát hiện dạng tachykinin thứ tư là hemokinin. Ở người,
hemokinin được mã hóa bởi gen TAC4 (PPT-C) định vị trên NST số 17 [39, 54].
Gen này có được cắt nối theo nhiều cách khác nhau để từ đó hình thành nên nhiều

dạng hemokinin và endokinin khác nhau trong cơ thể.
Tachykinin được tổng hợp trong các tế bào thần kinh (trung ương và ngoại
vi) và cả các tế bào không phải tế bào thần kinh. Sự phân bố này phụ thuộc vào
từng lồi và rất khó tìm ra quy luật phân bố của chất này. Có nhiều vị trí biểu hiện
tachykinin đến nay vẫn chưa biết chức năng. Khi phân bố ở tế bào thần kinh,
tachykinin hoạt động như một chất truyền dẫn tín hiệu thần kinh, trong khi ở các tế
bào không phải tế bào thần kinh, chúng có vai trị như những chất nội tiết, cận nội
tiết hoặc điều chỉnh hoạt động hệ nội tiết [27]. Ở động vật có vú, tachykinin chú yếu
được biểu hiện ở tế bào không phải tế bào thần kinh dưới dạng SP. Sau khi được
giải phóng vào máu, SP cùng với serotonin hoạt động như một chất cận nội tiết
hoặc một chất nội tiết tố thực sự. Khi đó chúng đóng vai trị như một tác nhân gián
tiếp gây giải phóng chất gây giãn mạch máu hoặc trực tiếp gây co cơ trơn [8, 21].
Khi liên kết với thụ thể tương ứng của mình, tachykinin có vai trị kích thích
các tế bào thần kinh, gợi những phản ứng thói quen, hành vi giới tính, dẫn truyền
cảm giác đau đớn và gây co trực tiếp hoặc gián tiếp cơ trơn, từ đó gây hiện tượng co
thắt ruột, gây giãn mạch máu và phản xạ nôn, gây viêm [6, 8, 40]. Dựa vào hiểu biết
về chức năng cuả tachykinin, nhiều nghiên cứu tập trung tìm kiếm các chất đối vận


với tachykinin để điều trị các điều kiện gây viêm như hen suyễn, triệu chứng kích
thích co thắt ruột [8, 16, 25]. Tuy nhiên, mục đích chính để sử dụng các loại thuốc
này là chống buồn nôn cho người và động vật [18, 19].
1.3

THỤ THỂ HỌ TACHYKININ VÀ THỤ THỂ NEUROKININ-1

1.3.1. Giới thiệu chung về thụ thể họ tachykinin
Thụ thể của họ tachykinin (TACR) thuộc lớp A trong họ thụ thể liên kết với
G protein (Hình 1). Tương tự như thụ thể rhodopsin, TACR có cấu trúc gồm 7 vùng
xuyên màng đặc trưng được nối với nhau bởi các vòng phía ngồi và phía trong

màng sinh chất (exoloop và cytoloop). Những vịng ở phía ngồi màng tế bào của
thụ thể liên kết với G protein có chức năng lựa chọn cấu tử gắn đặc hiệu trong khi
các vùng xuyên màng có chức năng quyết định hoạt tính của thụ thể. Người ta phân
loại TACR dựa vào sự sai khác trong các trình tự này [45].
Có ba dạng thụ thể của họ tachykinin ở động vật có vú đã được phát hiện là:
neurokinin 1 (NK1), neurokinin 2 (NK2) và neurokinin 3 (NK3) tương ứng với các
tachykinin SP, NKA và NKB. Trên thực tế, giữa các thụ thể và tachykinin có thể
liên kết chéo, nhưng ái lực liên kết thay đổi nhiều giữa thụ thể và cấu tử (Bảng 1)
[3, 9, 10, 35]. Riêng tachykinin endokinin và hemokinin đều ưu tiên gắn với thụ thể
NK1 [21].
Bảng 2: Ái lực liên kết giữa các tachykinin với các thụ thể của chúng [3]
Tachykinin

Ái lực liên kết

SP

NK1 > NK2 > NK3

NKA

NK2 > NK3 > NK1

NKB
Neuropeptide-γ
Neuropeptide K

NK3 >> NK2 > NK1
NK2 > NK1 >> NK3
NK2 > NK1 >> NK3

Ngoài ái lực liên kết với các tachykinin khác nhau, ba thụ thể NK1, NK2 và
NK3 còn phân biệt với nhau ở một số đặc điểm được thống kê trong Bảng 3.
Bảng 3: Một số đặc điểm sai khác giữa các thụ thể NK1, NK2 và NK3 ở người [3, 23, 28]


Đặc điểm

Thụ thể NK1

Thụ thể NK2

Thụ thể NK3

Gen mã hóa nằm trên NST

2

10

4

Số lượng acid amine
(chiều dài đủ)

398

407

465

Độ tương đồng

41% với NK3

47% với NK1

51% với NK1

Khối lượng phân tử

46,364

43,851

51,104

Các nghiên cứu đều chỉ ra rằng gen mã hóa cho 3 dạng thụ thể trên đều chứa
5 exon xen kẽ với 4 intron. Việc các gen mã hóa cho TACR chứa intron đã gợi ý
rằng các gen này có thể có nhiều cách cắt nối khác nhau, từ đó tạo nên tính đa hình
của thụ thể [22].
Khi nghiên cứu các thụ thể TACR người ta thấy có sự biến động về số lượng
acid amine giữa các lồi động vật. Trong đó NK1 ở tất cả các lồiđộng vật có vú
chứa 407 acid amine. NK2 ở người chứa 398 acid amine, trong khi ở chuột chứa
390 và ở lợn là 402 acid amine. Tương tự như thế với NK3 ở người chứa 465 acid
amine trong khi ở chuột là 452 và lợn là 440 acid amine [3].
Cả ba thụ thể của họ tachykinin ở người mặc dù có cấu trúc khác nhau nhưng
đều có chung cơ chế hoạt động. Sau khi tachykinin liên kết vào thụ thể tương ứng
của chúng, phức hợp thụ thể-cấu tử sẽ kích hoạt phân tử G protein, từ đó làm tăng
hàm lượng Ca2+ nội bào hoặc hoạt hóa phospholipase C làm phân hủy

phosphoinositol thành IP3/DAG. Một số nghiên cứu khác chỉ ra rằng phức hợp giữa
thụ thể tachykinin và tachykinin tương ứng cịn có khả năng kích hoạt G protein gây
hoạt hóa adenylate cyclase hình thành cAMP [26, 42].
Vai trị của TACR được phát hiện thơng qua các thí nghiệm gây đột biến làm
mất các gen tổng hợp tachykinin hoặc thụ thể của tachykinin ở động vật [16, 18,
55]. Nhìn chung, các TACR khi phối hợp hoạt động với G protein cho phép truyền
dẫn tín hiệu từ tachykinin vào trong tế bào, gây co thắt phế quản [23], tăng cường
vận chuyển khí ở mạch máu và tăng tiết dịch nhày, gây co thắt cơ trơn, gây phản
ứng viêm, .... Chất đối vận của thụ thể NK1 có cơ chế hoạt động tương tự như chất
P đã được chứng minh là có khả năng chống suy nhược [9, 10] trong khi chất đối


vận với thụ thể NK2 được chứng minh là có tác dụng chống lo âu [11, 12], còn chất
đối vận với thụ thể NK3 có chức năng chống lại sự rối loạn thần kinh [46, 14].
1.3.2. Thụ thể neurokinin – 1
Trong họ tachykinin, biểu hiện và đóng vai trị quan trọng nhất phải kể đến
SP. SP có khả năng liên kết với cả ba loại thụ thể NK1, NK2 và NK3 nhưng ái lực
mạnh nhất với thụ thể NK1. Khi biểu hiện cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1
ở dịng tế bào COS-7, ái lực liên kết giữa thụ thể NK1 với SP có giá trị Kd là
0.35±0.07, cao gấp 100 lần so với NKA và 500 lần so với NKB [24].
Như đã nói ở trên, NK1 là một thành viên trong họ thụ thể liên kết với G
protein, chúng chứa 7 vùng xuyên màng kỵ nước, trong đó có 3 loop xuyên ngoài
màng và ba loop xuyên trong màng, đầu carboxyl nằm trong tế bào chất trong khi
đầu amino nằm ngoài màng tế bào. Thụ thể này chứa 407 acid amine. Những cấu
trúc liên quan trực tiếp tới chức năng của thụ thể gồm cầu disulfit tạo thành giữa
Cys105-Cys180 thuộc TM 3 và TM4; đầu amino của NK1 bị glycosyl hóa tại vị trí
Asp14 và Asp18; đầu carboxyl bị palmityl hóa ở vị trí Cys322 [58]; trình tự AspArg-Tyr của TM3 và Lys/Arg-Lys/Arg-XX-Lys/Arg nằm ở đầu carboxyl của thụ
thể phía là nơi tương tác với G protein (Hình 4A).

Glycosyl hóa

Glycosyl hóa

Disulfit

Disulfit
Palmityl hóa
hóa

A. NK1 dài hồn chỉnh

B. NK1 bị xén cụt đầu carboxyl

Hình 4: Cấu trúc thụ thể NK1 mang chiều dài hịan chỉnh và NK1 có đầu carboxyl
bị xén cụt.

Gen mã hóa cho neurokinin-1 có hai cách cắt nối trong tự nhiên hình thành
nên dạng NK1 mang chiều dài hoàn chỉnh và dạng NK1 bị xén cụt đầu carboxyl tận
cùng ở người và ở lợn [5, 11, 22]. Cả hai dạng NK1 này phát hiện ra thấy ở tất cả
các vùng trong não, thậm chí mở rộng ra tới hệ thần kinh vùng ngoại vi trong ngũ
tạng. Nguyên nhân của sự xuất hiện dạng NK1 có đầu carboxyl bị xén cụt là do bị
lỗi trong quá trình cắt bỏ exon số 5 đã tạo ra sớm mã kết thúc [5]. Khi dịch mã sang
protein, dạng NK1 dài hoàn chỉnh chứa 407 acid amine, trong khi dạng NK1 bị xén
cụt chứa 311 acid amine. Hai dạng này khác nhau ở chiều dài đầu carboxyl tận cùng
– vị trí gây ra sự phosphoryl hóa trong q trình truyền tín hiệu của thụ thể NK1.
Do sự khác biệt về đầu carboxylnên khi biểu hiện ở dịng tế bào thận phơi người
HEK 293, hai dạng thụ thể NK1 này có nhiều điểm khác biệt về chức năng (Bảng 4)
[30]. Theo nghiên cứu của Fong và cộng sự cho thấy ái lực của NK1 bị xén cụt đầu
carboxyl giảm 10 lần so với NK1 có trình tự dài hịan chỉnh khi tương tác với chất

đồng vận SP [22]. Điều này gợi ý rằng cần phải có một lớp thuốc mới phù hợp với
dạng thụ thể này.


Bảng 4: Sự khác biệt trong chiều dài của đầu carboxyl liên quan tới chức năng của thụ thể
NK1 [30].

Đặc điểm
Số lượng acid amine
Biến đổi hàm lượng Ca nội bào
Phosphoryl hóa PK-Cδ
Sự hoạt hóa ERK
Hoạt hóa NF-κB
Sự biểu hiện mRNA IL-8

NK1 bị cắt cụt
NK1 mang chiều
dài hoàn chỉnh đầu tận cùng carboxyl
407
có

311
khơng

tăng
nhanh
có
tăng

giảm

chậm
khơng
giảm

Gần đây, có nghiên cứu cịn chỉ ra mối liên hệ giữa chiều dài thụ thể
neurokinin-1 với việc bị nhiễm virus HIV. Cụ thể là ở những người âm tính với
HIV biểu hiện dạng NK1 hồn chỉnh nhiều hơn đáng kể so với nhưng người dương
tính với virus HIV [48].
Cơ chế hoạt động của thụ thể NK1 có thể tóm tắt như sau: SP được giải
phóng ra từ các bóng synapse gắn vào thụ thể NK1 ở màng sau synapse tạo ra điện
thế hoạt động ở màng sau theo cơ chế phụ thuộc Ca2+. Khi thụ thể NK1 bị kích
thích, bản thân chúng tương tác với G protein, từ đó có thể tạo nên chất truyền tin
thứ hai theo ba phương thức: một là phụ thuộc hệ thống truyền tin thứ hai thông qua
phospholipase C phân hủy phosphatidyl inositol bên trong màng tế bào thành IP3 và
DAG. IP3 hòa tan vào tế bào chất và liên với thụ thể trên mạng lưới nội chất hạt dẫn
đến sự huy động Ca2+ vào trong tế bào chất, từ đó DAG trên cịn nằm lại trên màng
kích hoạt kinase C phụ thuộc Ca2+ gây hiện tượng phosphoryl hóa nhiều protein
đích. Đây là phương thức hoạt hóa chính của thụ thể TACR cũng như là TACR1.
Hai là sự huy động acid arachidonic thông qua phospholipase A2 và ba là gây ra sự
tích lũy cAMP thơng qua kích hoạt enzyme adenylate cyclase [35].
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng thụ thể NK1 ở người được mã hóa bởi một
gen đơn bản nằm trên NST số 2, kích thước của gen mở rộng lên tới 151 kb [13].
Trình tự cDNA mã hóa cho thụ thể NK1 ở người và chuột tương đồng tới 89% [28].
Theo ngân hàng dữ liệu, gen NK1 khi tiến hành phiên mã có thể cho ít nhất 4 dạng


mRNA khác nhau. Mỗi cách thức biểu hiện sẽ cho một dạng thụ thể NK1 có ái lực
với các chất đồng vận khác nhau. Quá trình này xảy ra ở những mô chuyên biệt
[13]. Tuy nhiên, cho đến nay, người ta mới chỉ phát hiện được 2 dạng biểu hiện của
gen này [30, 22].

Thụ thể NK1 được tìm thấy cả trong vùng thần kinh trung ương và ngoại vi
tương tự như SP, cụ thể là ở tế bào thần kinh, màng trong mạch máu, các tế bào cơ,
ruột-dạ dày, phổi, tế bào thuộc hệ miễn dịch, đảo giáp, … Sự liên kết giữa SP với
thụ thể NK1 cho phép truyền đi các tín hiệu stress, đau đớn, phản ứng viêm và co
rút cơ trơn, … [55].
1.4

ỨNG DỤNG CỦA THỤ THỂ NEUROKININ-1 TRONG ĐIỀU
TRỊ BỆNH

Từ những hiểu biết về chức năng của thụ thể neurokinin 1 hứa hẹn đây sẽ là
đích tác động hiệu quả cho các phương pháp điều trị một số căn bệnh có liên quan.
Do đó cũng khơng có gì ngạc nhiên khi nhiều hãng dược phẩm lớn tập trung nghiên
cứu về thụ thể tachykinin nhằm tìm ra các chất đối vận của chúng để ứng dụng
trong điều trị bệnh: làm thuốc giảm đau, chống lo âu, trầm cảm, chữa các bệnh
đường hô hấp,… Sự phát hiện ra các chất đối vận với thụ thể NK1 cũng là một mắt
xích quan trọng trong việc thay đổi hướng điều trị trong việc ngăn ngừa chứng buồn
nôn và sự nôn mửa do tác dụng của hóa trị liệu ung thư. Tuy đến nay các nghiên
cứu về chất đối vận với thụ thể tachykinin vẫn chưa đạt được kết quả như mong đợi
và gặp rất nhiều khó khăn, nhưng việc sử dụng thụ thể NK1 làm đích tác động của
thuốc vẫn là một bài tóan hay và khó cho nhiều nhà nghiên cứu. Trong đó
các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào những phân tử khơng có bản chất peptide có
khả năng thấm xuyên qua màng tế bào thần kinh. Trong tương lai, chất này hứa hẹn
sẽ cho phép điều trị bệnh liên quan tới chứng nghiện rượu [13], …
Kể từ khi tachykinin được phát hiện ra lần đầu tiên, người ta đã biết khá rõ
hoạt tính sinh học của chúng trong các trường hợp bệnh lý và sinh lý học. Tuy
nhiên, hiệu quả điều trị của các chất đối vận với tachykinin đến nay vẫn chưa được
hiểu biết một cách đầy đủ.

Chất đối vận của thụ thể là những chất có khả năng liên kết thuận nghịch với
thụ thể. Thông thường cả chất chủ vận và chất đối vận đều có thể liên kết với một
vùng nhất định trong thụ thể, nhưng chất đối vận thường không liên kết tại những vị
trí chính xác để kích hoạt cơ chế hoạt động của thụ thể. Do vậy, chất đối vận khơng
có hoạt tính sinh học nhưng có khả năng ức chế cạnh tranh làm giảm hoặc khóa
hoạt tính của chất đồng vận [41].
Từ những kết quả nghiên cứu về vai trò của các chất đối vận thụ thể NK1,
người ta đã đưa một số hợp chất vào sản xuất thành thuốc trên thị trường. Các chất
này đều có bản chất phi peptide, có vai trị chủ yếu trong việc điều trị chứng trầm
cảm, các biểu hiện stress, chứng đau nửa đầu, giảm đau, giảm triệu chứng tâm thần,
rối loạn thần kinh, giảm tình trạng nơn mửa đối với những bệnh nhân ung thư…
Theo công bố của viện ung thư quốc gia Hoa kỳ, khi tiến hành hóa trị liệu
cho các bệnh nhân ung thư, có tới hơn 75% các ca hóa trị liệu có phản ứng nơn mửa
chỉ sau 24h điều trị, 90% bệnh nhân bị nơn sau 2-5 ngày sau hóa trị. Điều này gây
ảnh hưởng lớn tới sức khỏe và tinh thần của bệnh nhân và làm giảm đáng kể số
bệnh nhân kiên trì điều trị theo phương pháp này. Theo báo cáo của Hội Điều
Dưỡng Xã Hội Về Ung Thư, có đến 50% số bệnh nhân ở giai đoạn CINV bỏ cuộc
vì lí do gặp phải các triệu chứng sau khi hóa trị. Năm 2003, Cục Quản Lý Dược Và
Thực Phẩm của Mỹ đã phê duyệt việc áp dụng các phương pháp liên quan đến thụ
thể NK1, dẫn đến việc sử dụng một lớp thuốc mới có tác dụng đối vận thụ thể NK1
trong phương pháp hóa trị liệu [41, 43]. Hiệu quả khả quan được chứng minh rõ khi
sử dụng các loại thuốc này trong phác đồ điều trị, chúng làm giảm và chậm đáng kể
quá trình xảy ra các triệu chứng CINV.
Một ứng dụng rộng rãi nữa của thuốc đối kháng thụ thể NK1 là tham gia vào
việc điều trị chứng tâm thần phân liệt. Theo các nghiên cứu về não bộ thì con đường
Mesolimbic liên quan trực tiếp đến các triệu chứng của nghiện, tâm thần phân liệt,
trầm cảm do chúng tham gia vào việc tăng lượng dopamine trong não bộ bằng các
cơ chế khác nhau [44]. Trong cơ thể, nếu chất chủ vận SP được truyền đi sẽ kích
hoạt con đường này dẫn đến tăng hoạt tính của dopamine ở các tế bào thần kinh. Vì

vậy, một trong những phương pháp điều trị là ngăn chặn sự tương tác của chất P với
thụ thể NK1 bởi các thuốc đối kháng liên kết với thụ thể này. Các hợp chất này tác
động làm điều chỉnh sự tiết ra dopamine ở các hệ thống Mesolimbic.
Theo một nghiên cứu mới vào năm 2012 đã chứng minh được vai trò của
NK1 cùng phối tử của chúng là chất P trong sự phát triển khối u ung thư. Chất P và
các hợp chất khác khi kích hoạt thụ thể NK1 dẫn đến sự thủy phân các
phosphoinositide, huy động Ca2+ và hoạt động của protein kinase kích hoạt q
trình phân bào. Hoạt động của NK1 được tìm thấy liên quan đến các quá trình phát
sinh ung thư như phân chia nguyên bào, sự di chuyển của các tế bào và di căn. Do
đó thụ thể NK1 cũng như chất P ảnh hưởng mạnh mẽ đến vi môi trường của khối u
trong ung thư [6].
Kể từ đó tới nay, các chất đối vận có bản chất phi peptide được nghiên cứu
rộng rãi và nhiều cấu trúc cũng như cơ chế tác dụng của chúng đã được làm sáng tỏ.
Năm 1998, Kramer và cộng sự đã công bố những nghiên cứu bệnh học về tác dụng
và tính an tồn của MK-869 ở bệnh nhân trong phần lớn các trường hợp rối loạn
trầm cảm. Năm 2003, lần đầu tiên chất đối vận NK1 là aprepitant (Emend) được
hiệp hội quản lý thuốc và thực phẩm (FAD) Hoa Kỳ phê chuẩn cho phép sản xuất
và lưu thông trên thị trường. Gần đây người ta phát hiện ra hợp chất T-2328 là một
chất đối vận thụ thể NK1 khơng có bản chất peptide. Chất này được đưa trực tiếp
vào tĩnh mạch để điều trị nơn cấp tính và nôn kéo dài trong điều trị ung thư. Người
ta đề xuất đưa chất này vào sản xuất thuốc chống buồn nơn qua hoạt động thụ thể
NK1 [3]. T-2328 có hiệu lực quan trọng, hàm lượng ức chế của chất này là dưới
nanomol và thấp hơn 16 lần so với aprepitant lưu hành trên thị trường. Sự ức chế
này có tính chọn lọc cao đối với thụ thể NK1 nên cũng được đưa vào làm thuốc trên
thị trường [43].
Tuy có ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực y, dược nhưng những nghiên cứu về
thụ thể neurokinin – 1 ở Việt Nam vẫn cịn rất ít hoặc chưa cơng bố. Theo một tài
liệu mới đây người ta đã thành công trong việc tách dịng cDNA mã hóa cho thụ thể
neurokinin-1 từ mẫu não của người Việt Nam. Tuy nhiên, khi đối chiếu với trình tự

cDNA được công bố trên ngân hàng dữ liệu NCBI (Mã số M81797.1) [59] phát
hiện thấy 5 điểm sai khác tại các vị trí 184, 333, 370, 641, 996 trong đó tất cả A
trong trình tự gốc đều bị thay thế bằng G tại các vị trí 184, 333, 641 và 996, cịn ở
vị trí 370, C bị thay bởi T. Kết quả là có acid amine đã bị thay đổi như trong Bảng
5.
Bảng 5: Sai khác về trình tự protein giữa cDNA mã hóa cho thụ thể neurkinin-1 ở người
Việt Nam so với trình tự protein cDNA NK1 trên NCBI
Acid amin
(cDNA NK1 mã số M81797.1)
R - Arginine (62)
T – Threonine (124)
Y – Tyrosine (214)
E - Glutamic acid (332)

Acid amin
(cDNA từ não ngƣời Việt Nam)
G - Glycine
A - Alanine
C - Cysteine
G - Glycine

Từ đó đặt ra câu hỏi rằng sự sai khác giữa trình tự acid amine trong cDNA
tách dịng từ não người Việt Nam với trình tự acid amine trong trình tự cDNA gốc
có phải là do tính đa hình của gen? Để trả lời câu hỏi đó chúng tơi quyết định tách
dịng lại cDNA hồn chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 từ mẫu phổi ở một cá
thể người Việt Nam khác. Từ nguồn gen này, chúng tôi thiết kế vector biểu hiện cho
cDNA mã cho thụ thể neurokinin-1 để biểu hiện chúng trên hệ thống tế bào động
vật, từ đó có thể chủ động được nguồn gen và các hệ thống sàng lọc thuốc có tính

đối vận với thụ thển neurokinin-1 từ nguồn dược liệu ở Việt Nam. Đây là lí do để
chúng tơi tiến hành đề tài “Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho
thụ thể neurokinin – 1 ở người Việt Nam”.
1.5

VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHO THỤ THỂ
NEUROKININ-1

Gen mã hóa cho thụ thể liên kết với G protein được dung hợp vào nhiều hệ
vector và nhiều dòng tế bào khác nhau. Người ta đã thử biểu hiện chúng trên cả tế
bào nhân sơ và cả trên tế bào nhân thực. Tuy nhiên, do thụ thể liên kết với G protein
thường được biến đổi sau dịch mã bằng cách gắn thêm carbonhydrate hoặc lipid